Αφηρημένο

Ιστορικό

Ένας όγκος θεωρείται μια ετερογενής συγκρότημα σε ένα τρισδιάστατο περιβάλλον που είναι στο ίδιο επίπεδο με παθοφυσιολογικές και εμβιομηχανική σήματα. αλληλεπιδράσεις κυττάρου-στρώματος καθοδηγήσουν την ανάπτυξη και την παραγωγή των όγκων. Εδώ, θα αξιολογήσει τις εισφορές των φυσιολογικών ινοβλαστών με καρκίνο του στομάχου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Με τη συγκαλλιέργεια φυσιολογικούς ινοβλάστες σε μονοστοιβάδες BGC-823 γαστρικά καρκινικά κύτταρα, τα καρκινικά κύτταρα σποραδικά αναπτύχθηκε σύντομο, άτρακτο -όπως μορφολογικά χαρακτηριστικά και επέδειξε ενισχυμένη πολλαπλασιασμό και επεμβατικές δυνατότητες. Επιπλέον, τα μετασχηματισμένα κύτταρα του όγκου καταδεικνύεται μειωμένο σχηματισμό όγκου και αυξημένη lymphomatic και εντερική μεταστατικό δυναμικό. Μη μετασχηματισμένα κύτταρα BGC-823, σε αντίθεση, κατέδειξε πρωτογενή σχηματισμό όγκων και καθυστερημένη εντερική και λέμφου εισβολή κόμβο. Παρατηρήσαμε επίσης την απώλεια Ε-καδερίνης και την προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης βιμεντίνης στα μετασχηματισμένα κύτταρα του όγκου, η οποία αναφέρθηκε ότι η αύξηση στη μετάσταση προκλήθηκε από επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση.

Συμπέρασμα

Συλλογικά , τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η κανονική ινοβλάστες διεγείρει επαρκώς επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση σε καρκινικά κύτταρα, οδηγώντας έτσι σε μετάσταση

Παράθεση:. Xu W, Hu Χ, Chen Ζ, Zheng Χ, Zhang C, Wang G, et al. (2014) φυσιολογικούς ινοβλάστες Προκαλέστε E-καδχερίνη Απώλεια και Αύξηση μετάσταση λεμφαδένα στον καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10.1371 /journal.pone.0097306

Επιμέλεια: Elad Katz, AMS Biotechnology, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 10 Δεκ 2013? Αποδεκτές: 16 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 20, 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ειδικό Ταμείο Υγείας Key (https://program.most.gov.cn? No.200802112), της Επιτροπής Εθνικό Ταμείο Επιστημών (https://www.nsfc.gov.cn? γενικό σχέδιο αριθ .81372302 No.81272120), το Ταμείο Υπουργείο Υγείας (https://program.most.gov.cn? No.2007A093), το Έργο Κλειδί της επαρχίας Zhejiang (https://www.zjkjt.gov.cn? Όχι. 2013C030445 2009C030125). Το Ταμείο Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang (https://www.zjnsf.gov.cn? No.Y2080001, Y12H160121, και Z2080514), και την Παραδοσιακή Κινέζικη Ιατρική Ταμείο Bureau (https://wst.zj.gov.cn? No.2007ZA019). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι μεταστάσεις είναι υπεύθυνες για το 90% της θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με. Πολλοί ασθενείς οι οποίοι επιδεικνύουν καμία ένδειξη μετάστασης κατά την αρχική διάγνωση θα αναπτύξουν τελικά μετάσταση. Αν και μεταστάσεις προκαλούν τα περισσότερα των θανάτων από καρκίνο, η διαδικασία αυτή παραμένει μια από τις πιο αινιγματικές πτυχές της νόσου.

μεταστατικά καρκινικά κύτταρα εισέλθουν ιστό μέσω εξαγγείωση. Ο ιστός, όμως, υφίσταται σαφής διαδικασίες με τις οποίες τα κύτταρα ενσωματωμένο στη μήτρα του ιστού και να έρθουν σε άμεση επαφή με τα στρωματικά κύτταρα, τα περισσότερα των οποίων είναι φυσιολογικά ινοβλάστες. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν κάθε ευκαιρία να έρθουν σε επαφή με τα στρωματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των νεοπλασματικών και μεταστατικών κυττάρων [1]. Αυτό οδηγεί σε αμοιβαία cross-talk με φυσιολογική ινοβλάστες στον ιστό.

Οι ινοβλάστες είναι τα πιο άφθονα στρωματικά κύτταρα, και διεγείρουν το μικροπεριβάλλον και να χρησιμεύσει ως μια πλούσια πηγή για την παρακρινή οδό κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και της εξέλιξης. Οι επιδράσεις των φυσιολογικών ινοβλαστών στα κύτταρα του όγκου αμφισβητείται. Έχει αναφερθεί ότι η κανονική ινοβλάστες καταστέλλουν τον κακοήθη μετατροπή των αθανατοποιημένων επιθήλιο προστάτη [2], ενώ σε όγκους του μαστού, οι ινοβλάστες μετατρέπουν πορογενές καρκίνωμα σε διηθητικό καρκίνωμα [3].

Αυτή η διαφωνία υποδεικνύει ότι η επίδραση των ινοβλαστών στα κύτταρα του όγκου είναι διαφορετική από ό, τι για CAFS (καρκίνος που σχετίζεται ινοβλάστες). Για τη μελέτη αυτή, μπορούμε συγκαλλιεργούνται καρκινικά κύτταρα με τη φυσιολογική ινοβλάστες σε τρυβλία Petri για να μιμηθεί τον τρόπο τα καρκινικά κύτταρα ινοβλαστών σε επαφή με. Έχουμε επικεντρωθεί στην συμβολή των φυσιολογικών ινοβλαστών με καρκίνο του στομάχου. Καλλιεργήσαμε τις κανονικές ινοβλάστες για να σχηματίσουν πυκνά μονοστοιβάδες, τα οποία στη συνέχεια διαδίδονται με καρκινικά κύτταρα, προκειμένου να μιμηθεί μεταστατικά κύτταρα όγκου. Υποθέσαμε ότι η υψηλή αναλογία των ινοβλαστών στα κύτταρα του όγκου θα μπορούσε να μιμούνται τους ιστούς όπου μετάσταση κυττάρων όγκου κατοικούν. Έτσι, δερματικούς ινοβλάστες από υγιή άτομα χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή του κυτταρικού περιβάλλοντος. Η γαστρική κυτταρική σειρά καρκίνου, BGC-823, χρησιμοποιήθηκε εδώ, επειδή είναι μορφολογικά διαφέρει από ινοβλάστες.

Ηθικοί Υλικά και Μέθοδοι

Η

Πρωτοβάθμια ανθρώπινων δερματικών ιστών ελήφθησαν από τα παιδιά που υποβλήθηκαν σε περιτομή μετά από γραπτή συγκατάθεση από τους φροντιστές τους, η οποία είχε συμπεριληφθεί στην ιατρικά αρχεία τους. Αυτό το πείραμα εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της δεύτερης συνδεδεμένες νοσοκομείο της Zhejiang University School of Medicine (κώδικα ηθικής κριτικής: Έρευνα 2013-047). Οι ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη ήταν εφοδιασμένο με ένα αντίγραφο γραπτή συγκατάθεση και έδωσε την άδεια να δημοσιεύσει.

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου του Συμβουλίου, της Επιστήμης και της Τεχνολογίας της Κίνας. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή Animal Care and Use του Πανεπιστημίου Zhejiang.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

πενικιλλίνη G /στρεπτομυκίνη, φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS), Triton Χ-100, βοοειδών λευκωματίνη ορού, κολλαγενάση τύπου Ι, και θρυψίνη αγοράστηκαν από JiNuo (Κίνα). DMEM High-γλυκόζη ελήφθη από την Gibco (Κίνα), και ορό εμβρύου μόσχου (FBS) αγοράστηκε από την Gibco (SA). Η σισπλατίνη, 5-φθοριοουρακίλη, πουρομυκίνη, και κολλαγόνο τύπου Ι αγοράστηκαν από την Sigma (USA). Cisplatin διαλύθηκε σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF), 5-φθοροουρακίλη σε DMSO, και πουρομυκίνη σε PBS προκειμένου να γίνει διαλύματα παρακαταθήκης τα οποία στη συνέχεια αποθηκεύονται στους -20 ° C. κολλαγόνο τύπου Ι (5 mg /mL) αραιώθηκε σε 1 mg /mL. ΫΑΡΙ (4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη · HCl) σε PBS ελήφθη από τη Roche, και κατσίκα αντι-ποντικού και κουνελιού IgG, δευτερεύον αντίσωμα-TIRTC και δευτερογενή αντισώματα λήφθηκαν από ZSGB-Bio (Κίνα). Αντιανθρώπινο-Ε-καδερίνης κουνελιού (ab40772), αντιανθρώπινο-βιμεντίνη κουνελιού (ab92547), και τα αντισώματα κουνελιού αντιανθρώπινο-β-κατενίνης (ab9274) ελήφθησαν από Abcam (UK). Αντιανθρώπινο-παν-CK αντίσωμα ποντικού (C11) και αντίσωμα κουνελιού Ν-καδερίνης (C4061) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Κίνα), και αντι-ανθρώπου-β-ακτίνης και τα αντισώματα αντι-κουνελιού δευτερογενή κατσίκας ελήφθησαν από Boster (Κίνα) . Αντισώματα αραιώθηκαν με 5% FBS σε επεξεργασίες συγκεντρώσεις εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Cell Culture

Η καθιερωμένη κυτταρική σειρά, ανθρώπινα γαστρικού καρκίνου BGC-823 κύτταρα που χρησιμοποιούνται στο πείραμα μας αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων της Guangzhou Ινστιτούτο Βιοϊατρικής και Υγείας. Τα κύτταρα αποψύχθηκαν και περάστηκαν για 4-5 φορές και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα συν-καλλιέργειας. Πρωτοβάθμια δερματικούς ινοβλάστες ελήφθησαν από τα χειρουργικά δείγματα των παιδιών που είχαν υποβληθεί σε περιτομή και υπό την προϋπόθεση ενημερωμένη συγκατάθεση. Οι ινοβλάστες χρησιμοποιήθηκαν μετά την τρίτη δίοδο (μέσα σε 50 περάσματα), καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης που περιέχει 10% FBS, και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή (5% CO

2) στους 37 ° C. Το μέσο των κυττάρων αντικαταστάθηκε κάθε δεύτερη μέρα.

Για την παραγωγή των TBGCs, οι ινοβλάστες (FBS) και BGC-823 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με αναλογία 10:01 για επιπλέον 10 ημέρες μετά τις καλλιεργημένα κύτταρα έφθασαν συρροή. σχηματισμό Dome παρατηρήθηκε στο σύστημα συγκαλλιέργειας. Το μίγμα κυττάρου στη συνέχεια ανακαλλιεργήθηκε με θρυψινοποίηση με φρέσκο ​​ινοβλάστες (1 × 10

6 κύτταρα /mL). Κατά τη διάρκεια του δεύτερου και μεταγενέστερων περάσματα, σχηματισμός προφανή μοίρας και αιωρούμενων στρογγυλού σχήματος κύτταρα εμφανίστηκαν τα οποία εμφάνισαν ποικίλα μορφολογικά χαρακτηριστικά και παρατεταμένη προσκόλληση μετά τη διέλευση. Μετά τον πέμπτο πέρασμα των μικτών αιωρούμενα κύτταρα και πυκνό κανονικούς ινοβλάστες, ομοιόμορφη, σύντομη, ατρακτοειδόμορφα κύτταρα ονομάζονται «TBGCs» παρήχθησαν και δεν επιδεικνύουν μορφολογικές επαναφορά σε BGC-823 κυττάρων έως & gt?. 10-15 περάσματα

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων για επιπλέον 6 ημέρες επώασης στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε σε quintuplicate κάθε μέρα με σιφωνισμό 20 μί CellTiter 96 Υδατικό Αντιδραστήριο One Solution (Promega, USA) σε κάθε φρεάτιο που περιείχε DMEM 100 μL υψηλής γλυκόζης, τότε τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 2 ώρες πριν από τον προσδιορισμό της σχετικής απορρόφησης στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου.

Drug Δοκιμασία αναστολής

Πέντε επαναλήψεις εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με διάφορες συγκεντρώσεις φαρμάκων (0-80 μΜ) και καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες. Η τοξικότητα του φαρμάκου αξιολογήθηκε με μέτρηση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πολλαπλασιασμού που περιγράφεται ανωτέρω.

Scratching Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν σε συρροή. συμβουλές με σιφώνιο χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθούν γρατσουνιές. PBS χρησιμοποιήθηκε για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων και στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με FBS μέσο ελεύθερο. Εικόνες ελήφθησαν για 3 διαδοχικές ημέρες. Το πλάτος του μηδέν μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ 1,47 λογισμικό για Windows (https://rsb.info.nih.gov/ij/) και καταγράφεται ως η απόσταση μηδέν ανά ημέρα.

Μετανάστευση και Δοκιμασία εισβολή

η κυτταρική κινητικότητα δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας Transwell ένθετα (μέγεθος πόρων 8 μm) (Corning, USA). Κύτταρα-GFP (Green Fluorescent Protein) (1 × 10

5/500 μί) εναιωρήθηκαν σε FBS μέσο ελεύθερο και τοποθετήθηκαν πάνω από τα ένθετα εις τριπλούν, με μέσο καλλιέργειας 800 μΙ φορτώνονται κάτω. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα ένθετα πλύθηκαν 3 χ με PBS και σκουπίζεται με βρεγμένη πατσαβούρα παραπάνω όπου σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA κάτω και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Japan). Η ίδια διαδικασία χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της δοκιμασίας εισβολή, αλλά χρησιμοποιήθηκαν ένθετα που είχαν προεπικαλυμμένα με Matrigel (BD, ΗΠΑ). Αμφότερες οι δοκιμασίες προσδιορίστηκαν ποσοτικά ως ο αριθμός των κυττάρων που μετρήθηκαν σε 5 τυχαία πεδία (200 × μεγέθυνση).

Προσδιορισμός απόπτωσης

κύτταρα

Τα αποπτωτικά μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το V-FITC κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνη (Keygen, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με φάρμακα για 24 ώρες, και στη συνέχεια συλλέγονται, πλένονται δύο φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 5 μL FITC-Annexin V και 5 μL ΡΕ δέσμευσης, και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας την RNeasy μίνι κιτ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δείγματα καθαρισμένο RNA (1 μg) σε DEPC ύδατος αντίστροφη μεταγραφή με τη χρήση του PrimeScript II 1ο Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Κίνα). RT-PCR και ενίσχυση εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ SYBR Premix Ex Taq II (Takara).

Ένα σύστημα αντίδρασης 20 μL που περιέχει 1 μλ αραιωμένα δείγματα cDNA, 10 μL SYBR Premix Ex Taq II (2 χ), 0.4 μι ROX Dye αναφοράς (50 ×), 7 μί στείρο δισαπεσταγμένο H

2O, και 1 μL εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι S1) παρασκευάστηκαν και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση καμπύλης τήξης και τον κύκλο συγκριτική κατωφλίου (Ct) μέθοδος. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες κύκλων: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 58 ° C για 1 λεπτό. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο ελέγχου.

Ανάλυση Western Blot

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα και πρωτεύοντες ιστούς. Τα εκχυλίσματα υπέστησαν ζέση σε ρυθμιστικό φόρτωσης, διαχωρίστηκαν σε 10% Τπδ-ΗΟΙ πηκτές SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Millipore, USA) χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με χρήση 5% χωρίς λιπαρά γάλα σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween-20 (TBST) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με TBST και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης (1:5000), βιμεντίνη (1:5000), β-κατενίνης (1:5000), Ν-καντερίνη (1:1000), και β-ακτίνη (1:1000). Μετά την πλύση 3 χ με TBST, δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (1:1000) προστέθηκε και επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, ανοσοσύμπλοκα έγιναν ορατά με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας ECL (Electro Chemical Luminescence) (Millipore). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη.

Η ιστολογική και ανοσοϊστοχημική Αναλύσεις

Τα δείγματα καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο, φυλαγμένο στους -80 ° C, μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA, και χωρισμένο σε ένα πάχος 10 μm (LEICA, Germany).

για τη χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ), οι αποπαραφινωθείσες πλακίδια χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη για 15 λεπτά, πλύθηκαν 3 χ με PBS, οξύ αλκοόλ για 5 δευτερόλεπτα, τότε ηωσίνη για 5 λεπτά (Boster, Κίνα).

για ανοσοϊστοχημική χρώση, τα πλακίδια επανυδατώθηκαν και θερμότητα προκαλούμενη ανάκτηση επιτόπου διεξήχθη σε κιτρικό ρυθμιστικό χρησιμοποιώντας μία χύτρα ταχύτητας (20 λεπτά στους 80 ρΚΑ), αποκλείστηκαν με 3 % Η

2O

2 για 15 λεπτά, και στη συνέχεια φυσιολογικό ορό κατσίκας εφαρμόστηκε (30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου). Τα πλακίδια επωάστηκαν στους ακόλουθους πρωτογενή αντισώματα: αντι-Ε-καδερίνης (1:250), αντι-βιμεντίνη (1:250), αντι-β-κατενίνης (1:250), και αντι-παν-CK (1:250 ). Τα δείγματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C, ξεπλένονται δύο φορές με PBS, και επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα για 2 ώρες στους 37 ° C. DAB Plus Χρωμογόνο κιτ (Boster) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση όλων των αντιγόνων. Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται, και τοποθετείται με καλυπτρίδες χρησιμοποιώντας ουδέτερο μπαλάτα. Και οι δύο αναλύσεις ξεχωριστά εκτελούνται από παθολόγους και τους κλινικούς γιατρούς που ήταν τυφλός προς τις ομάδες του δείγματος. Διαφορών επιλύθηκαν με συναίνεση.

ανοσοφθορισμού και Ομοεστιακή Μικροσκοπία

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες θαλάμου, καθώς και οι κατεψυγμένες τομές μονιμοποιήθηκαν με 4% PFA και διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100. Τα πλακίδια αποκλείστηκαν με φυσιολογικό ορό κατσίκας για 1 ώρα στους 37 ° C, ξεπλύθηκαν και επωάστηκαν για μία νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 ° C, στη συνέχεια μεταφέρθηκαν και επωάστηκαν με αντισώματα αίγας αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού-TIRTC για 1 ώρα στους 37 ° C στο σκοτάδι. Διαφάνειες πλύθηκαν χρησιμοποιώντας γλυκερίνη και τοποθετείται με καλυπτρίδες. Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός συνεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ (Olympus). Οι αποπαραφινωθείσες κατεψυγμένες τομές χρωματίστηκαν με DAPI και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού.

ζωικό μοντέλο

Ογδόντα τεσσάρων εβδομάδων θηλυκά ποντίκια BALB /c αγοράσθηκαν από το Κέντρο Έρευνας Ζώων της Σαγκάης και διατηρείται σε πειραματικό κέντρο ζώο της Zhejiang Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών. Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου του Συμβουλίου, της Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας, όλα τα ζώα κρατήθηκαν κάτω από άσηπτες συνθήκες αποστείρωσης και χορηγείται σε αυτόκαυστο τροφή και νερό σε συμμόρφωση με τις αρχές του Εργαστηρίου Animal Care του Πανεπιστημίου Zhejiang. Σαράντα-τέσσερις ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν στον υποδόριο μοντέλο, και διαιρέθηκαν ομοιόμορφα σε ομάδες ελέγχου και πειράματος. Οι BGC-GFPs χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος, όπου οι TBGC-GFPs ήταν χρήσεις όπως το πείραμα. Τα καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης, και αιωρήθηκε σε FBS μέσο ελεύθερο (1 × 10

6 κύτταρα /mL). Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν με πιπέτα σε μονά-κυτταρικά εναιωρήματα, και κάθε διάλυμα 500 μL εμβολιάσθηκε υποδόρια και στις δύο πλευρές του θώρακα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία κάθε 2 εβδομάδες έως 10 εβδομάδες, και παθολογικές εξετάσεις διεξήχθησαν. Όλα τα ποντίκια ζυγίστηκαν κάθε 3 ημέρες. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγιναν κάτω από 1% πεντοβαρβιτάλη νάτριο, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Τριάντα έξι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν στην ομάδα ένεσης φλέβα για την εκτίμηση της κατανομής του καρκίνου (18 ποντικούς στην BGC-GFP ομάδα ελέγχου και 18 ποντίκια στην ομάδα πείραμα TBGC-GFP). 500 κυτταρικό εναιώρημα μι (5 × 10

5 κυττάρων) εγχύθηκε στην ουραία φλέβα των γυμνών ποντικών. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε 2

ου, 5

ου, 8

ου και 10

ου εβδομάδες για παθολογική εξέταση.

Στατιστική Ανάλυση

συλλέχθηκαν πειραματικά δεδομένα και τέθηκε σε υπολογιστικά φύλλα. δοκιμασίες Κανονικότητα διεξήχθησαν πριν από τη σύγκριση των δεδομένων. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν & gt? 3 ομάδες, και η μέθοδος Tukey χρησιμοποιήθηκε για

post hoc συγκρίσεις των

ομάδων. Σε αυτή τη μελέτη,

σ

& lt? 0,05 θεωρείται στατιστικά σημαντική. SPSS 20.0 για Windows (IBM SPSS Statistics, https://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει όλες τις στατιστικές αναλύσεις. R (ggplot2) (https://www.r-project.org/? https://www.r-project.org/) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει όλες τις γραφικές παραστάσεις

Αποτελέσματα

1. Μορφολογικές αλλαγές στα BGC-823 κύτταρα μιμούνται στρωματικών κυττάρων

ινοβλάστες (FBS) και BGC-823 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με αναλογία 10:01 για επιπλέον 10 ημέρες μετά τα καλλιεργημένα κύτταρα έφθασαν συρροή. Το μίγμα κυττάρου στη συνέχεια ανακαλλιεργήθηκε με θρυψινοποίηση με φρέσκο ​​ινοβλάστες (1 × 10

6 κύτταρα /mL) (Σχήμα 1.1). σχηματισμός θόλου στα κύτταρα BGC-823 παρατηρήθηκε μετά την πρώτη δίοδο. Κατά τη διάρκεια του δεύτερου και μεταγενέστερων περάσματα, αναστέλλεται στρογγυλό σχήμα κύτταρα εμφανίστηκαν στο καλλιεργημένο σύστημα: μερικοί συγκεντρώνονται σε συστάδες ή συστάδες και ήταν χαλαρά συνδεδεμένο με την επιφάνεια των ινοβλαστών. Οι παράλληλες-καλλιεργημένα κύτταρα BGC-823 επέδειξε μόνο μερικά στρογγυλό σχήμα κύτταρα στη βάση όταν η καλλιέργεια έγινε υπερπλήρη. Η Μικτή αιωρούμενα κύτταρα εκτίθενται ποικίλα μορφολογικά χαρακτηριστικά και παρατεταμένη προσκόλληση μετά το πέρασμα. Αυτά τα κύτταρα αποδεικνύεται είτε ένα πλακόστρωτο που μοιάζει με εμφάνιση παρόμοια με BGC-823 κύτταρα ή μικρής ατράκτου όπως χαρακτηριστικά. Uniform, σύντομη, ατρακτοειδόμορφα κύτταρα που παράγονται από την διέλευση των μικτών αιωρούμενα κύτταρα και πυκνό φυσιολογικών ινοβλαστών. Σε αντίθεση, η διέλευση του υπερκειμένου των κυττάρων BGC-823 επέδειξε μόνο συντρίμμια μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, στην οποία μικρές ποσότητες κύτταρα επιβίωσαν για να σχηματίσουν λιθόστρωτο-σαν κλώνοι που είναι παρόμοια με τα γονικά κύτταρα BGC-823 (Σχήμα 1.3A-Η).

Σχήμα 1.1. Σχηματική του πειραματικού πρωτοκόλλου. Σχήμα 1.2. Καταγωγή των υπερκείμενο κυττάρων. (Α) GFP-επισημασμένο BGC-823 κύτταρα (πράσινο). (Β) BGC-823 κύτταρα τα οποία είχαν συν-καλλιεργήθηκαν με ινοβλάστες (κόκκινο). (C) BGC-823 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συστάδες και απέδειξε στρογγυλά σχήματα σε αναστολή. (D) TBGCs προκλήθηκαν με τη συγκαλλιέργεια. Μεγέθυνση 100 ×. Σχήμα 1.3. Μετατροπή από BGC-823 κύτταρα να TBGCs κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. (Α-Δ) BGC-823 κύτταρα σε ένα πυκνό σύστημα καλλιέργειας μπορούν να σχηματίσουν ομάδες και να ρίξει μακριά τα κύτταρα μέσα στο αιώρημα. (Ε-Η) Διέλευση αιωρούμενων κυττάρων όγκου. Σχήμα 1.4. χρώση ανοσοφθορισμού του παν-CK (κόκκινο), Ε-καδερίνης (κόκκινο), βιμεντίνη (κόκκινο) και Ν-καδερίνης (κόκκινο). BGC-823 κύτταρα (ανωτέρω) και TBGCs (κάτω) σημάνθηκαν με GFP (πράσινη). Ο πυρήνας χρωματίστηκε με ϋΑΡΙ (μπλε). Σχήμα 1.5. οικόπεδο Θερμική προφίλ γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας φθορισμό ποσοτικής RT-PCR. Το βάθος του χρώματος υποδηλώνει σχετική γονιδιακή έκφραση. Σχήμα 1.6. Western blots των πρωτεϊνών. Σχήμα 1.7. Bar οικόπεδο έκφρασης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Μπαρ δηλώνουν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας IOD. Οι κάθετες γραμμές δείχνουν βασικές διαφορές. ** P & lt?. 0.01

Η

Τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η πηγή των αιωρούμενων κυττάρων στο συνκαλλιεργημένα σύστημα. BGC-823 κύτταρα και ινοβλάστες διαμολύνθηκαν με κασέτα GFP-puro και κασέτα RFP-puro, αντίστοιχα, και το όνομά του BGC-GFP και FB-RFP, αντιστοίχως. Μετά την συν-καλλιέργεια, BGC-GFP αυξήθηκε σε πολυστρωματικών και σχηματίζεται μια δομή θόλο-όπως. Εν τω μεταξύ, οι στρογγυλό σχήμα ή σφαιροειδές κύτταρα που είχαν ανασταλεί στα μέσα ενημέρωσης μεταφέρθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας και επισημαίνονται με πράσινο φθορισμό, αποδεικνύοντας ότι η μακροπρόθεσμη συν-καλλιέργεια με ινοβλάστες προκαλεί μετασχηματισμό BGC. Γύρος και σφαιροειδή κύτταρα που αιωρήθηκαν σε μέσο παρατηρήθηκαν επίσης με τη χρήση πράσινου φθορισμού και θα μπορούσαν να περνιούνται χωρίς την προσθήκη των ινοβλαστών (Σχήμα 1.2Α-D). Μετά από αρκετούς διαδοχικούς γύρους συν-καλλιέργεια, μετασχηματισμένα κύτταρα BGC-823 (TBGCs) ελήφθησαν που εμφανίστηκαν πιο ομοιόμορφη, σύντομη, και ατρακτοειδόμορφα. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια περάστηκαν χωρίς την προσθήκη των ινοβλαστών. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα κύτταρα ήταν περισσότερο επιρρεπή σε σχηματισμό δομών σφαιροειδής από τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε συρροή και δεν επιδεικνύουν μορφολογικές επαναφορά σε BGC-823 κυττάρων έως & gt?. 10-15 περάσματα

Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι ινοβλάστες αναστέλλει η ανάπτυξη των άλλων κυττάρων όταν συν-καλλιεργήθηκαν

in vitro

από τον μηχανισμό της αναστολής επαφής [4]. Στα πειράματά μας, ωστόσο, η κανονική ινοβλάστες δεν contact-αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των BGC-823 κύτταρα. Αντ ‘αυτού, FB-RFPs σταδιακά έχασαν τη ζωή τους με τον πολλαπλασιασμό BGC-GFP όταν η καλλιέργεια επεκτάθηκε σε 10 ημέρες. Ως εκ τούτου, διαδοχικές συμπλήρωση FB ήταν υποχρεωμένη να δίοδο και να διατηρήσουν τη σταθερή παραγωγή των TBGCs. Παρατηρήσαμε επίσης ότι όταν μια μικρή ποσότητα TBGCs προστέθηκε στο φύλλο ινοβλαστών συρροή, τα κύτταρα όγκου που μεγάλωσε έξω ωθήθηκαν μακριά από τους ινοβλάστες. Στο κέντρο της αποικίας όγκου, τα κύτταρα στρογγυλό σχήμα, με μόνο χαλαρά συνημμένα στη βάση (Σχήμα 1.3A-Η).

2. Επιθηλιακά-μεσεγχυματικά Μετάβαση από BGC-823 κυττάρων σε TBGC

Σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης του mRNA. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν αξιοσημείωτα κατιούσα ρύθμιση μαζί με την προς τα πάνω ρύθμιση του βιμεντίνη σε TBGCs. Εν τω μεταξύ, οι εκφράσεις της συστροφής, σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας, και Ν-cadherin ήταν όλα ρυθμίζεται προς τα πάνω (Σχήμα 1.5). χρώση ανοσοφθορισμού και Western blot επιβεβαιώνουν απώλεια Ε-καδερίνης και η αυξημένη έκφραση του βιμεντίνης, Ν-cadherin, και β-κατενίνη (Σχήμα 1.4), επιβεβαιώνοντας έτσι ότι η μακροπρόθεσμη επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) συμβαίνει σε TBGCs. E-cadherin είναι μια δοκιμασμένη σήμα κατατεθέν της ΕΜΤ και διατηρεί προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου στο επιθήλιο. απώλεια Ε-καδερίνη θα μπορούσε να οδηγήσει στον όγκο απόπτωση περισσότερα κύτταρα μακριά από την μάζα του όγκου.

3. Πολλαπλασιασμό, εισβολή, και την κινητικότητα των TBGCs

πολλαπλασιασμό TBGC αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS. TBGCs αποδειχθεί ένα επιταχυνόμενο ρυθμό πολλαπλασιασμού (

σ

& lt? 0,01) (Σχήμα 2.1). Η κυτταρομετρία ροής (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι S1) δείχνει ότι το 13% των TBGCs διατηρήθηκαν στη φάση S, σε αντίθεση με μόνο το 7% του BGC-823 κύτταρα (Σχήμα S1.3). Η δοκιμασία δείχνει ότι το ξύσιμο TBGC κινητικότητα αυξήθηκε σε σύγκριση με την πατρική κύτταρα BGC-823 (Σχήμα 2.2-2.3A-Η). TBGC αναστόμωση απαιτείται 3 ημέρες μετά την έναρξη των γρατσουνιές, ενώ & gt? 4 ημέρες χρειάστηκαν για BGC-823 κύτταρα (

σ

& lt? 0,05). (Σχήμα 2.2)

Σχήμα 2.1. οικόπεδο Γραμμή της δοκιμασίας πολλαπλασιασμού. Οι κάθετες γραμμές δείχνουν βασικές διαφορές. ** P & lt? 0,01. Σχήμα 2.2. οικόπεδο Γραμμή της δοκιμασίας ξύσιμο. Οι κάθετες γραμμές δείχνουν βασικές διαφορές. ** P & lt? 0,01. Σχήμα 2.3. Ξύσιμο δοκιμασία της BGC-823 κύτταρα (παραπάνω) και TBGCs (παρακάτω) κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. (Α-Δ, Ε-Η) Χρόνος από την αρχική έως 72 ώρες. Σχήμα 2.4. Θηκόγραμμα των επεμβατικών και της μετανάστευσης δοκιμασίες. Οι διαφορές μεταξύ των BGC-823 κύτταρα και TGBCs είναι σημαντικές (ρ & lt? 0,01). Σχήμα 2.5. Οι κορυφαίοι 2 φωτογραφίες δείχνουν τα αποτελέσματα της επεμβατικής τροποποιημένη δοκιμασία transwell με Matrigel. Αντιπροσωπευτικές εικόνες από τους προσδιορισμούς εισβολής transwell για το (Α) BGC και (Β) TBGC. Τα κύτταρα εισβάλλουν στην κάτω πλευρά του ενθέτου transwell απεικονίζεται. Οι κάτω 2 φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες από τις δοκιμασίες μετανάστευσης transwell για το (C) BGC και (Δ) TBGC. Τα κύτταρα μεταναστεύουν προς την κάτω πλευρά του ενθέτου transwell απεικονίζεται.

Η

Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών εισβολής Matrigel δείχνουν ότι TBGCs είναι πιο επιθετικοί από BGC-823 κύτταρα. Συνολικά, 683,67 ± 170,83 TBGCs διεισδύσει την Matrigel σε σύγκριση με 188,33 ± 58,62 BGC-823 κυττάρων στην ομάδα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 2.4, σχήμα 2.5A, Β). Ωστόσο, TBGCs επέδειξε μια σημαντική μείωση στην μετανάστευσαν κύτταρα: 2-φορές λιγότερο από ό, τι BGC-823 κύτταρα σύμφωνα με την δοκιμασία μετανάστευσης transwell (

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 2.4, σχήμα 2.5c, D). Η αναστολή φύση των TBGCs μπορεί να ευθύνεται για τη μείωση αυτή, το ποσοστό τήρησης ήταν μόλις 68,33 ± 10,41% σε TBGCs στο Matrigel, ενώ 99,77% ± 6,25% στην BGC-823 κύτταρα, έδειξε αργή σύνδεση με την επιφάνεια του Matrigel σε TBGCs (Πίνακας S1) .

για την καλύτερη μιμούνται

in vivo

συμπεριφορά του όγκου, κολλαγόνο τύπου Ι gel χρησιμοποιήθηκε για να διαπιστωθεί η σχέση μεταξύ των ινοβλαστών και των επεμβατικών δυνατοτήτων του BGC-823 κύτταρα και TBGCs. γέλη κολλαγόνου τύπου Ι παρασκευάστηκε στα ένθετα transwell με ινοβλάστες (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι S1). πηκτές ινοβλαστών φορτωμένα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες, και στη συνέχεια GFP-σημασμένο καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν πάνω στην πηκτή και καλλιεργήθηκαν για τις επόμενες 7 ημέρες. Επιθεώρηση της εσοδείας γελών αποκάλυψε ότι τα κύτταρα του όγκου είχαν διεισδύσει μέσα στις γέλες κολλαγόνου. Όταν οι πηκτές φορτώθηκαν με ινοβλάστες, TBGCs εκτίθενται πιο ενισχυμένη επεμβατική χωρητικότητα από BGC-823 κυττάρων, όπως υποδεικνύεται από τον αριθμό των κυττάρων που διείσδυσε των πηκτωμάτων (Σχήμα S1.2).

4. TBGCs εκτίθενται Cisplatin Αντίσταση

Στη συνέχεια, αξιολόγησε την ευαισθησία της TBGCs με το πρότυπο γαστρικό χημειοθεραπευτικά καρκίνου. Βιώσιμα BGC-823 κύτταρα και TBGCs προσδιορίστηκαν μετά από 24 ώρες έκθεσης σε σισπλατίνη (0, 20, 40, 60, 80 μΜ) με μέτρηση της ενσωμάτωσης των MTS. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TBGCs επέδειξαν αξιοσημείωτη αντοχή στη σισπλατίνη, ενώ λίγα κύτταρα BGC-823 επέζησαν όταν η συγκέντρωση σισπλατίνης ήταν αυξημένα σε 40 μΜ (

ρ

& lt? 0.001) (Σχήμα 3.1). Βιώσιμα TBGCs θα μπορούσε ακόμη και να ανιχνευθούν όταν η συγκέντρωση σισπλατίνης ανυψώθηκε μέχρι 200 ​​μΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής για την επικύρωση αντίσταση σισπλατίνη. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ποσοστό επιβίωσης των TBGCs ήταν περίπου 42,40% σε σύγκριση με το 13,80% για BGC-823 κύτταρα μετά από θεραπεία με 40 μΜ σισπλατίνης για 24 ώρες (Εικόνα 3.3 – 3.4). Ωστόσο, όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με 5-FU, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην αναστολή όγκου μεταξύ TBGCs και BGC-823 κύτταρα σύμφωνα με την δοκιμασία MTS (Εικόνα 3.2). Και τα δύο καρκινικά κύτταρα απέδειξαν χημειοαντίσταση με 5-FU (Σχήμα 3.2).

Σχήμα 3.1. Είκοσι τέσσερις ώρες πλοκή γραμμή της δοκιμής σισπλατίνη αναστολής. ** P & lt? 0,01. Σχήμα 3.2. Είκοσι τέσσερις ώρες πλοκή γραμμή της δοκιμής αναστολής 5-FU. Σχήμα 3.3. Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της απόπτωσης σε κύτταρα BGC και TBGC μετά την έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης (20, 40 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC (δείκτης απόπτωσης) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (δείκτης των νεκρών κυττάρων). Σχήμα 3.4. Bar οικόπεδο σισπλατίνη απόπτωση σε BGC-823 κύτταρα και TBGCs. ιστόγραμμα που δείχνει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής. ** Ρ & lt?. 0.01 vs κυττάρων στα πηγαδάκια ελέγχου διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO)

Η

5. TBGCs εκθεσιακός

vivo

Τάση κόμβο Λεμφικού

Για να προσδιορίσετε το

in vivo

διανομή TBGCs, 5 × 10

5 BGC-823 κύτταρα ή TBGCs ενέθηκαν σε στην ουραία φλέβα ποντικών BALB /c. Δύο εβδομάδες μετά την ένεση, διακύμανση σε βοηθητικά και τραχηλικούς λεμφαδένες μετάσταση παρατηρήθηκε και στις δύο ομάδες, όπως υποδεικνύεται από την αξιολόγηση ενός φθορίζοντος ιχνηθέτη (Σχήμα 4.3α-F). GFP-θετικά κύτταρα βρέθηκαν στο βοηθητικό και βουβωνική λεμφαδένων και στις δύο ομάδες (Σχήμα 4.3α, B, D, E). Ωστόσο, GFP-θετικά κύτταρα εμφανίστηκαν μόνο στους πνεύμονες των ποντικών στην ομάδα BGC (Σχήμα 4.3c, F).

Σχήμα 4.1. Σωρευτική κίνδυνος των λεμφαδένων μετάστασης σε διαφορετικές ομάδες που έλαβαν ενέσεις στην φλέβα της ουράς. Σχήμα 4.2. HE χρώση (στο 10 εβδομάδες) των οργάνων στην ομάδα που έλαβε φλέβα ενέσεις. Θετικότητα παρατηρήθηκε στα έντερα και των δύο ομάδων και στους πνεύμονες των ομάδων BGC. Δεν εμφανής ηπατική ή νεφρική μεταστάσεις βρέθηκαν. Σχήμα 4.3. Φθορισμού ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων κατά την εβδομάδα 2, στις ομάδες που έλαβαν ενέσεις στην φλέβα της ουράς. Κύτταρα όγκου σημάνθηκαν με πράσινο φθορισμό όπως υποδεικνύεται από τα βέλη κίτρινο. Ο πυρήνας χρωματίστηκε με ϋΑΡΙ (μπλε). Μεγέθυνση 100 ×. Σχήμα 4.4. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για Ε-καδερίνη και β-κατενίνης στα λεμφογάγγλια των ομάδων που έλαβαν ενέσεις στην φλέβα της ουράς σε κάθε χρονικό σημείο. Μεγέθυνση 200 ×. Σχήμα 4.5. Bar πλοκή των σχετικών επιπέδων έκφρασης Ε-καδερίνης και β-κατενίνης στα λεμφογάγγλια των ομάδων που έλαβαν ενέσεις στην φλέβα της ουράς σε κάθε χρονικό σημείο. ** P & lt? 0,01? * Ρ & lt?. 0.05

Η

Την εβδομάδα 5, εκτός από την εκτεταμένη εισβολή σε λεμφαδένες, η διήθηση όργανο παρατηρήθηκε επίσης. Πιο λεμφαδένων εισβολή παρατηρήθηκε στην ομάδα TBGC από την ομάδα ελέγχου BGC σε κάθε χρονικό σημείο (Σχήμα 4.1, Βίντεο S1). Αυτές οι λεμφαδένες ήταν αποφασισμένοι να παν-CK θετικά (Σχήμα Σ2.1). Παρατηρήσαμε επίσης διαφορετικές TBGC και διανομή BGC στα όργανα. TBGCs περιορίστηκαν στους ιστούς γαστρεντερικό, ενώ BGCs εγκαταστάθηκαν στους πνεύμονες και τα έντερα (Σχήμα 4.2α-Η). Την εβδομάδα 5, εντερική μετάσταση παρατηρήθηκε για πρώτη φορά σε 3/4 ποντίκια που είχαν εμβολιαστεί με TBGCs, ενώ μόνο το 25% ποντίκια απέδειξαν ορατό εντερική μεταστάσεις μετά την ένεση BGC (Σχήμα S2.3).

Καθώς αναπτύσσονται οι όγκοι, ο μέσος αριθμός των εντερικών μεταστάσεων TBGC αυξημένη (5.6 ± 3.911

vs

3.5 ± 1.914 BGCs την εβδομάδα 8? 6,33 ± 1,52

vs

5.6 ± 1.342 την εβδομάδα 10) (Σχήμα S4.2) . Είναι ενδιαφέρον, 3 από 5 ποντικούς στην ομάδα TBGC κατέδειξε megascopic νεοπλάσματα στο gastrum μετά από 10 εβδομάδες, η οποία δεν παρατηρήθηκε στην ομάδα BGC. Megascopic πνευμονικών μεταστάσεων βρέθηκαν σε 3 από τους 4 ποντικούς BGC κατά την εβδομάδα 8. Ωστόσο, δεν υπάρχουν μεταστάσεις στους πνεύμονες ορατά TBGC παρατηρήθηκαν την εβδομάδα 10 (Σχήμα 4.2α-Η). Η μικροσκοπική εξέταση αποκάλυψε η διείσδυση της TBGCs στο τραχήλου της μήτρας και μασχαλιαίους λεμφαδένες ήδη από την 1η εβδομάδα μετά την ένεση σε φλέβα ουράς, ενώ BGCs απαιτείται περισσότερος χρόνος (3 εβδομάδες) για να εισάγετε αυτά τα λεμφαδένες (Σχήμα 4.1). Πέντε εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων, των πνευμόνων διήθηση παρατηρήθηκε στην ομάδα BGC. Ωστόσο, δεν TBGCs ανιχνεύθηκαν σε όργανα μέχρι 10 εβδομάδες μετά την ένεση (Σχήμα 4.2β, F, Εικόνα S2.3).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε την σταδιακή αύξηση της Ε-καδερίνης στους λεμφαδένες της ομάδας TBGC , ενώ η έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε ελαφρά στην ομάδα BGC (

σ

& lt? 0,01) (Σχήμα 4.4A-P). Οι διαφορές ήταν σημαντικές σε 8 και 10 εβδομάδες, όταν η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν πολύ υψηλότερη στην ομάδα TBGC σύγκριση με την ομάδα BGC (Εικόνα 4.5). Η έκφραση της β-κατενίνης επίσης αυξήθηκε με το χρόνο στην ομάδα TBGC, που κορυφώθηκε στις 8 εβδομάδες και στη συνέχεια μειώθηκαν ελαφρά (Εικόνα 4.5). * P & lt? 0,05. ** P & lt? 0,01.