Αφηρημένο

Εμείς εδώ δείχνουν μια νέα σχέση μεταξύ του ανθρώπινου p14ARF oncosuppressor και το MDM2 ογκοπρωτείνης. MDM2 υπερέκφραση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές προκαλεί μείωση p14ARF επαγωγής αποικοδόμησης του μέσω του πρωτεασώματος. Η επίδραση δεν απαιτεί την ουμπικιτίνη δραστικότητα λιγάσης της MDM2 και κατά προτίμηση λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με αναστολείς του PKC (Protein Kinase C) οδό και η χρήση μεταλλακτών φωσφορυλίωσης p14ARF υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση ARF θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στη μεσολάβηση MDM2 ARF αποικοδόμηση ενισχύοντας τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας ότι η φωσφορυλίωση ARF επηρεάζει τη σταθερότητα και βιολογική δραστικότητα. Η μελέτη μας αποκαλύπτει ένα νέο δυνητικά σημαντικό μηχανισμό μέσω του οποίου ARF και ΜϋΜ2 μπορεί να αντισταθμίσει ο ένας τον άλλο κατά τη διάρκεια της ογκογόνο διαδικασία

Παράθεση:. Vivo Μ, Matarese Μ, Sepe Μ, Di Martino R, Festa L, Calabro V, et al. (2015) MDM2-διαμεσολαβείται Υποβάθμιση της p14ARF: ένα νέο μηχανισμό για τον έλεγχο ARF επίπεδα στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (2): e0117252. doi: 10.1371 /journal.pone.0117252

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Θωμάς Γ Hofmann, γερμανικής Cancer Research Center, Γερμανία

Ελήφθη: 23, Ιούν 2014? Αποδεκτές: 19, Δεκ 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβ 2015

Copyright: © 2015 Vivo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από Legge Regionale (Regione Campania) χωρίς 5/2007 για AP και GLM και Progetto «Καμπανίας Έρευνα στην Experimental Medicine» (κρέμα). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η γνώση των μηχανισμών που διέπουν την ανισορροπία μεταξύ καταστολείς των όγκων και των ογκογονιδίων, είναι κρίσιμης σημασίας για την κατανόηση της παθογένειας και της εξέλιξης του καρκίνου.

μεταξύ των σημαντικότερων καταστολείς των όγκων, p14ARF (ποντίκι p19ARF) (Εναλλακτική ανάγνωση Frame) φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο, είναι η άμεση συμβολή του με τον καρκίνο αποδεικνύεται σε μεγάλο βαθμό τα τελευταία χρόνια [1,2].

ΤΑΠ εμπλέκεται σε ογκογόνο σημείο ελέγχου από την ευαισθητοποίηση αρχόμενη καρκινικά κύτταρα να υποστούν διακοπή αύξησης ή απόπτωση. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι ARF σηματοδότηση είναι πολύπλοκη, και περιλαμβάνει ρ53-εξαρτώμενη ή ανεξάρτητες οδούς με κύριο στόχο τον περιορισμό μη φυσιολογικής κυτταρικής ανάπτυξης και στη διατήρηση γονιδιωματική σταθερότητα. Η ανακάλυψη μιας πληθώρας ARF αλληλεπιδρούν και την παρατήρηση ότι, επίσης, ιούς, γονοτοξική, υποξικό και οξειδωτικό στρες ενεργοποιεί ένα ARF απάντηση, δείχνουν ότι ARF έχει ένα ευρύτερο ρόλο για την προστασία του κυττάρου [3]. Πρωτογενή κύτταρα σε κανονικές συνθήκες διατηρούν ARF σε χαμηλά επίπεδα? Ωστόσο, όταν τα κύτταρα διεγείρονται με ογκογόνο προσβολές, η συγκέντρωσή της στο κύτταρο αυξάνει δραστικά. Αυτό το φαινόμενο γενικά συνοδεύεται από παράλληλη διάσπαση του ανασταλτικού αλληλεπίδρασης μεταξύ Mdm2 και ρ53, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση του δραστικού μεταγραφικά p53 που διεγείρει την απόπτωση είτε ή διακοπή του κυτταρικού κύκλου [4, 5]. Η ισχυρή ARF επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων απαιτεί ότι τα κύτταρα πρέπει να έχουν αναπτύξει μηχανισμούς που μπορούν να μειώσουν άμεσα ΤΑΠ ενδοκυτταρικά επίπεδα όταν η δράση του να μην είναι απαραίτητη. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν ΤΑΠ κύκλου εργασιών είναι μόλις πρόσφατα πρόκειται να διαλευκανθεί. ARF αποδόμησης εξαρτάται, τουλάχιστον εν μέρει, από το πρωτεάσωμα και, αν και δεν έχει τα υπόλοιπα ARF λυσίνης στην αλληλουχία του, μπορεί να υποβληθεί σε Ν-τερματική ουβικουϊτινίωση ανεξάρτητα από Mdm2 και p53 [6]. Αρκετά πρόσφατα, ένας ειδικός ουβικιτίνης λιγάσης για ARF ονομάζεται ULF ταυτίστηκε [7]. Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν ενδείξεις ότι ARF μπορεί να αποικοδομηθεί

in vitro από

του πρωτεασώματος 20S απουσία ουβικιτινίωση και ότι αυτή η διαδικασία μπορεί να εξουδετερωθεί με ΤΒΡ-1 (Tat Πρωτεΐνη Δέσμευσης 1), ένα πολυλειτουργικό συνιστώσα της ρυθμιστικής υπομονάδος του πρωτεασώματος [8]. Επιπλέον, το REG γ πρωτεασώματος έχει ενοχοποιηθεί στην ουβικουϊτίνη ανεξάρτητη ρύθμιση του κύκλου εργασιών p19ARF, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι θα μπορούσε να ουμπικουιτίνωση όχι απαραίτητα εμπλέκεται σε ARF κύκλου εργασιών [9].

Είναι ενδιαφέρον, εμείς και άλλοι πρόσφατα απέδειξαν ότι , μετά από PKC (πρωτεΐνης κινάσης C α) την ενεργοποίηση, ΤΑΠ επίπεδα αυξάνουν [10, 11]. Επιπλέον, μια σημειακή μετάλλαξη που μιμείται τη φωσφορυλίωση στη συντηρημένη Thr8 επάγει ARF συσσώρευση κυρίως στο κυτταρόπλασμα και αναστέλλει τη βιολογική δραστικότητα του [11].

Μέχρι στιγμής, ARF υποκυτταρική εντόπιση φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην σταθερότητα της και βιολογικές λειτουργίες, αν και δεν είναι κατηγορηματικό τρόπο. Φαίνεται ότι πυρηνισκικό εντοπισμό του ΤΑΠ μπορεί να χρησιμεύσει για την αποθήκευση ή τη σταθεροποίηση [12,13] της. Στον πυρηνίσκο, ARF προϋποθέτει μια σταθερή δομή, χάρη στην ένωσή του με Β23 /NPM, ενώ στο πυρηνόπλασμα υποβάλλεται σε μια πιο γρήγορη κύκλου εργασιών. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η αύξηση των επιπέδων ARF προκαλεί Mdm2 να μετακινηθούν προς την πυρηνίσκο [14, 15] και αυτό έχει συνδεθεί με τη σταθεροποίηση p53. Άλλοι ανέφεραν ότι, αν και πυρηνισκικό εντοπισμό του ARF προκαλεί σταθεροποίηση του, αυτό δεν είναι απαραίτητο για τη ρύθμιση της δραστηριότητας ARF έναντι ρ53 [16, 17]. Είναι ενδιαφέρον, έχει αναφερθεί ότι οι μη-πυρηνισκικό μορφές ARF υποβάλλεται σε ταχεία αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα, με MDM2 παίζει ένα ρόλο στην διαμόρφωση του φαινομένου αυτού, αν και με μηχανισμούς πολύ από το να διευκρινιστεί πλήρως [18]. MDM2 έχει πολύπλευρη ρόλους στην πρωτεϊνική αποδόμηση. Στην πραγματικότητα, πέρα ​​καλά περιγράφεται ο ρόλος της ως Ε3-ουβικιτίνης λιγάση, MDM2 είναι σε θέση να p63 μεταφοράς με λεωφορείο προς το κυτταρόπλασμα διαμεσολάβηση αλληλεπίδραση της με τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται ειδικά στον κύκλο εργασιών της [19]. Επιπλέον, MDM2 έχει δειχθεί ότι διαμεσολαβούν πρωτεασώματος εξαρτώμενη αλλά ουμπικουϊτίνης-ανεξάρτητο αποικοδόμηση του p21WAF1 /Cip1 [20] και ρετινοβλάστωμα πρωτεϊνών [21]. Πιο πρόσφατα έχει αναφερθεί ότι MDM2 μπορεί να αλληλεπιδρά με τα συστατικά του πρωτεοσώματος 19S [22] υποστηρίζοντας μια ευρύτερη άποψη του μηχανισμού δράσης της. Εμείς εδώ διερευνήσει σε μια νέα σχέση μεταξύ ARF και Mdm2 στην οποία Mdm2 φαίνεται να εμπλέκεται στη ρύθμιση της ARF κύκλου εργασιών διαμεσολάβηση υποβάθμιση της μέσω του πρωτεασώματος.

Αποτελέσματα

Mdm2 υπερέκφραση προκαλεί υποβάθμιση p14ARF μέσω το πρωτεάσωμα

Για να αναλυθεί η πιθανή εμπλοκή του MDM2 στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σταθερότητας p14ARF υπερεκφράσαμε ένα πλασμίδιο έκφρασης ΜΌΜ2 σε διαφορετικές γραμμές του ανθρώπου και των κυττάρων ποντικού που υπάρχουν ή δεν έχουν ανιχνεύσιμα επίπεδα ρ53 ή /και MDM2. Όπως δεικνύει η Εικ. 1 δείχνει, p14ARF ενδογενή επίπεδα και στις δύο κύτταρα Η1299 και HeLa γραμμικά μειώνονται όταν αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου έκφρασης MDM2 επιμολύνθηκαν (Σχ. 1, Α και Β). Real-Time PCR ανάλυση επί RNA που εξάγεται από MDM2 επιμολυσμένα HeLa και Η1299 κύτταρα δεν δείχνει σημαντικές μεταβολές στην σχετική ποσότητα του ARF mRNA (Σχ. 1C) που δείχνει ότι η επίδραση MDM2 εξασκείται στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Επιπλέον, MDM2 αποτελέσματα υπερέκφραση επίσης σε μείωση του εξωγενώς εκφράζονται ARF πρωτεΐνη σε διάφορες ανθρώπινες και ποντικού κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 D, Ε και F) ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53, που δείχνει ότι MDM2 επηρεάζει ARF σταθερότητα πρωτεΐνης σε ένα ρ53-ανεξάρτητη τρόπο. Είναι σημαντικό ότι, η μείωση της ενδογενούς ενδοκυτταρικά επίπεδα MDM2 με siRNA προκαλεί αύξηση του ARF ενδογενή επίπεδα και στις δύο κύτταρα HeLa και Η1299, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω ότι η ενδογενής MDM2 μπορεί να ελέγξει p14ARF αφθονία (Εικ. 2). έτσι Ερευνήσαμε ARF σταθερότητα της πρωτεΐνης με την παρουσία ή απουσία του MDM2 υπερέκφραση μετά από έκθεση σε κυκλοεξιμίδιο για να εμποδίσει την πρωτεϊνική σύνθεση. Στους δεικνυόμενους χρόνους μετά την έκθεση στο φάρμακο, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με Western Blot. Σύκο. 3Α και Β δείχνει ότι η ενδογενής p14ARF ημίσειας ζωής χαμηλώνει εξής MDM2 υπερέκφραση.

Η1299 κύτταρα ήταν ψευδο-επιμολυσμένα (πρώτη λωρίδα) ή επιμολυσμένα με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου έκφρασης MDM2 (0.3-0.6-0.9 μg). Επίδραση επί ενδοκυτταρικά επίπεδα p14ARF εκτιμήθηκε με Western Blot σε ολόκληρα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με αντι-ARF και, ως έλεγχος, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης. κύτταρα Β HeLa επιμολύνθηκαν πλαστή ή επιμολυσμένα με πλασμίδιο έκφρασης MDM2 (0,3-0,6 μg) και αναλύθηκαν όπως στο

A

. C Real Time σχετική ποσοτικοποίηση του ΤΑΠ έκφρασης σε κύτταρα Η1299 και HeLa. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ηλεκτροδιάτρηση με MDM2 πλασμίδιο (4×10

6 κύτταρα /2.5 μg του πλασμιδίου έκφρασης MDM2) και υποβλήθηκε σε εκχύλιση RNA και ανάλυση qRT-PCR. επίπεδα ARF RNA ομαλοποιήθηκαν ως προς 18s RNA. Οι τιμές στο γράφημα αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τυπική απόκλιση φαίνονται. Δ U2OS, Ε Η1299 και F ΥΠΟΙΟ p53

– /- MDM2

– /- κύτταρα επιμολυσμένα με ένα προκαθορισμένο ποσό p14ARF εκφράζουν πλασμιδίου (0,3 μg πρώτη λωρίδα) μόνο του ή με αυξανόμενες ποσότητες MDM2 εκφράζουν πλασμιδίου (0,3 -0,6 έως 0,9 μg). Επίδραση στα επίπεδα p14ARF αξιολογήθηκε με Western Blot σε ολόκληρα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης, που ανιχνεύθηκε με αντι-ARF ή αντι-Xpress (για την ανίχνευση εξωγενώς εκφράζεται ARF) και, ως έλεγχος, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης. Western Blot που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. εντάσεις ζωνών ARF ποσοτικοποιήθηκαν με J Image λογισμικό, ακτίνη κανονικοποιημένη και εκφράζονται ως φορές αφορά τον εμπλουτισμό με τα μη επεξεργασμένα δείγματα αυθαίρετα οριστεί στο 1 (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες).

Η

Η1299 και HeLa κύτταρα κατεργάστηκαν με είτε MDM2 ή αρνητικού ελέγχου κατευθύνεται siRNA (10 ηΜ τελική συγκέντρωση) και, μετά από 72 ώρες επώασης, συλλέγονται και αναλύονται με κηλίδα Western και και qRT-PCR όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

η

A Half -Life ανάλυση σε παρουσία ή απουσία του MDM2 υπερέκφραση. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν ψευδο ή επιμολυσμένα με πλασμίδιο έκφρασης ΜΌΜ2 (0,6 μg). 24 ώρες μετά, προστέθηκε κυκλοεξιμίδιο και τα κύτταρα συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν με Western Blot με αντι-ARF, αντι-ακτίνης και αντι-MDM2. Β Η πλοκή παριστά ανάλυση ημιζωή του ARF σε παρουσία ή απουσία του MDM2 υπερέκφραση. εντάσεις μπάντα ποσοτικά με Image J λογισμικού και ακτίνη ομαλοποιηθεί πριν απεικονίζονται στο γράφημα. Η ποσότητα της πρωτεΐνης σε διαφορετικά χρονικά σημεία εκφράζεται ως ποσοστό της συνολικής πρωτεΐνης, δηλαδή ποσότητα πρωτεΐνης σε t0. Κάθε προφίλ αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων επιμολύνσεων και πειράματα Western Blot. Οι τυπικές αποκλίσεις δείχνονται επίσης. κύτταρα C U2OS επιμολύνθηκαν με μία σταθερή ποσότητα πλασμιδίου p14ARF έκφρασης (0,3 μg) και αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου έκφρασης MDM2 όπου υποδεικνύεται (0.3-0.6 μg). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ MG132 (διαδρομές 4-6) ή DMSO (διαδρομές 1-3). Επίπεδα p14ARF αναλύθηκαν με Western Blot σε ολόκληρη λύματα πρωτεΐνη, που ανιχνεύθηκε με αντι-ARF και, ως έλεγχο, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης.

Η

επόμενο ρώτησε αν η πρωτεασώματος εμπλέκεται σε MDM2 μεσολάβηση της υποβάθμισης p14ARF. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, επιμολύναμε U2OS κυττάρων με μια σταθερή ποσότητα p14ARF και αυξανόμενες ποσότητες MDM2 και τα επεξεργασμένα κύτταρα με το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος. Western Blot στο Σχ. 3C δείχνει σταθερά ότι η θεραπεία με τον αναστολέα πρωτεασώματος εξουδετερώνει την επίδραση MDM2, υποδεικνύοντας την πρωτεασώματος ως το τελικό τελεστή της δράσης MDM2 επί ARF.

ARF αποδόμηση από MDM2 απαιτεί αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης

Η φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ p14ARF και MDM2 έχει αποτελέσει αντικείμενο εντατικών μελετών και πολλαπλές περιοχές αλληλεπίδρασης έχουν ταυτοποιηθεί σε p14ARF που συμβάλλουν στη σύνδεση με MDM2 [14, 17, 23, 24]. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να αναλύσουμε ποιες περιοχές του ΤΑΠ είναι αναγκαίες για την παρακολούθηση της επίδρασης MDM2 σε p14ARF. Έτσι έκανε χρήση δύο διαφορετικών ΤΑΠ μεταλλάξεις διαγραφής, η ARF

1-65, που περιλαμβάνει εξόνιο 1β του p14ARF και το ΤΑΠ

65-132, που αντιστοιχεί σε ARF εξώνιο 2. συνανοσοκαθίζησης στα κύτταρα U2OS έδειξε ότι η ARF

1-65 μετάλλαξη είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με MDM2, ενώ ότι η διατήρηση μόνο εξόνιο 2 (ARF

65 έως 132) δεν είναι (Σχ. 4Α), επιβεβαιώνοντας σημαντικό ρόλο του εξονίου 1β στη σύνδεση MDM2 [23, 24]. Οι δύο μεταλλάξεις διαγραφής ARF μετά διαμολύνθηκαν μαζί με αυξανόμενες ποσότητες MDM2. Όπως δεικνύει η Εικ. 4Β και C δείχνουν καθαρά, το αμινο τερματικό ήμισυ του p14ARF (ARF

1-65) εμφανίζεται αποικοδομείται από MDM2 υπερέκφραση, ενώ το C-τερματικό ήμισυ (ARF

65-132) δεν επηρεάζεται, υποστηρίζοντας ένα ρόλο η σύνδεση μεταξύ των πρωτεϊνών στο MDM2 μεσολάβηση ARF υποβάθμιση.

Μια κύτταρα U2OS επιμολύνονται με ίση ποσότητα (1 μg) της MDM2 και είτε 3xFlagARF

1-65 ή 3xFlagARF

65-132 εκφράζουν πλασμίδια, όπως υποδεικνύεται. Ίσες ποσότητες εκχυλίσματος πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-MDM2 αντίσωμα και αποκάλυψε με Western Blot με αντι-MDM2 και αντι-Flag να αποκαλύψει ARF. κύτταρα Β U2OS επιμολύνθηκαν με 0.3 μα 3xFlagARF

1-65 (που εκφράζει το εξόνιο 1β του p14ARF) (πρώτη λωρίδα) μόνο ή με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου έκφρασης MDM2 (0.3-0.6-0.9 μg). Επίπεδα p14ARF αναλύθηκαν με Western Blot σε ολόκληρα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης, που ανιχνεύθηκε με αντι-ARF και, ως έλεγχος, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης. κύτταρα C U2OS επιμολύνθηκαν με 0.3 μα 3xFlag ARF

65-132 πλασμίδιο (που εκφράζει το εξόνιο 2 του p14ARF) (πρώτη λωρίδα) μόνο ή με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου έκφρασης MDM2 (0.3-0.6-0.9 μg). Επίπεδα p14ARF αναλύθηκαν με Western Blot σε ολόκληρα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με αντι-ARF και, ως έλεγχος, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης. κύτταρα D U2OS επιμολύνθηκαν με 1 μα τόσο ARFΔ

2-14 /82 με 101 και έκφραση ΜϋΜ2 πλασμίδιο όπως υποδεικνύεται. Ίσες ποσότητες εκχυλίσματος πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ARF αντίσωμα και αποκάλυψε με Western Blot με αντι-MDM2 και αντι-ARF. κύτταρα Ε U2OS επιμολύνθηκαν με 0.3 μg ARFΔ

2-14 /82-101 και αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου έκφρασης MDM2 όπου υποδεικνύεται (0,6-0,9 μg). Επίπεδα ενδογενούς p14ARF αναλύθηκαν με Western Blot σε ολόκληρα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με αντι-ARF και, ως έλεγχος, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης.

Η

Περαιτέρω, αναλύσαμε την ικανότητα του MDM2 να επάγει αποικοδόμηση ενός ARF μετάλλαγμα εξάλειψης (ARFΔ

2-14 /82 – 101) που στερείται τα πυρηνισκικός σήματα πυρηνικού /εντοπισμού [14]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτό το μετάλλαγμα εμφανίζει μια διαδεδομένη κυτταροπλασματική εντόπιση [14] και διατηρεί την ικανότητα να δεσμεύει (Εικ. 4D) και αποδομείται από MDM2 (Εικ. 4Ε).

αναιρέσει την καθιερωμένη ρόλο ως ουμπικουϊτίνης λιγκάσης, MDM2 μπορεί να επηρεάσει τον κύκλο εργασιών πρωτεΐνη επίσης μέσω ενός ανεξάρτητου μηχανισμού ουβικουϊτίνης, επάγοντας μια άμεση σύνδεση των πρωτεϊνών στόχων με το πρωτεάσωμα [22]. Για να διακρίνουν μεταξύ αυτών των πιθανοτήτων, αναλύσαμε την επίδραση ενός μεταλλαγμένου MDM2 στερείται της ουμπικουϊτίνης τομέα δαχτυλίδι λιγάση δακτύλου (MDM2

1-441) (Σχ. 5Α) [25] επίπεδα επί εξωγενώς εκφράζονται ARF. Είναι ενδιαφέρον, αυτό μετάλλαγμα είναι ικανό να επάγει ARF αποικοδόμηση όταν υπερεκφράζεται (Εικ. 5Β), υποδεικνύοντας ότι ο τομέας MDM2 ουβικιτίνης λιγάση του MDM2 δεν είναι απαραίτητη για την παρατηρούμενη επίδραση στην ARF. Στη συνέχεια, αναλύσαμε την επίδραση ενός μετάλλαξη διαγραφής MDM2 (MDM2Δ

150-230) (Σχ. 5Α) ότι, στερείται τόσο της εισαγωγής (NLS) και εξαγωγή σημάτων (NES) πυρηνικού εντοπισμού, δείχνει μια διαδεδομένη κυτταροπλασματική εντόπιση [25 ]. Όταν υπερεκφράζεται σε κύτταρα U2OS, το μεταλλαγμένο αυτό προκαλεί υποβάθμιση των εξωγενώς εκφράζονται ARF (Εικ. 5C) υποδεικνύοντας ότι η υποβάθμιση του ARF δεν απαιτεί MDM2 εντοπισμός στον πυρήνα. πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης υποδηλώνουν ότι και οι δύο μεταλλάκτες MDM2 είναι ικανά να συνδέονται ARF, ενισχύοντας την ιδέα ότι η σύνδεση μεταξύ των δύο πρωτεϊνών θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα ρόλο στην παρατηρούμενη επίδραση (Εικ. 5D).

Α Το σχήμα δείχνει MDM2 μεταλλάξεις που περιγράφονται σε αυτό το σχήμα [25]. κύτταρα Β U2OS επιμολύνθηκαν με μία σταθερή ποσότητα p14ARF εκφράζουν πλασμίδιο (0,3 μg) και αυξανόμενες ποσότητες MDM2

1-441 εκφράζει πλασμίδιο (0.3-0.6-0.9 μg). Επίπεδα p14ARF αναλύθηκαν με Western Blot σε ολόκληρα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με αντι-ARF και, ως έλεγχος, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης. κύτταρα C U2OS επιμολύνθηκαν με μία σταθερή ποσότητα p14ARF εκφράζουν πλασμίδιο (0,1 μg) και αυξανόμενες ποσότητες MDM2Δ

150-230 εκφράζουν πλασμίδιο (0.5-1-1.5-2-2,5-3 μg). Επίπεδα p14ARF αναλύθηκαν με Western Blot σε ολόκληρα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με αντι-ARF και, ως έλεγχος, με αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης. κύτταρα D U2OS επιμολύνθηκαν με ίση ποσότητα (1 μg) του p14ARF εκφράζουν πλασμιδίου και MDM2

1-441 ή MDM2Δ

150-230 εκφράζουν πλασμίδιο. Ίσες ποσότητες εκχυλίσματος πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ARF αντίσωμα και αποκάλυψε με Western Blot με αντι-MDM2 και αντι-ARF.

Η

Η MDM2 μεσολάβηση ARF αποικοδόμηση λαμβάνει χώρα κυρίως στο κυτταρόπλασμα

Η απόδειξη ότι ένα μεταλλαγμένο MDM2, αδυνατούν να εντοπίζεται στον πυρήνα, προκαλεί ARF αποικοδόμηση, μαζί με την παρατήρηση ότι ένας ARF μετάλλαγμα εμφανίζει μια κυρίαρχη κυτταροπλασματική εντόπιση (ARFΔ

2-14 /82-101) είναι επιρρεπές σε MDM2 μεσολάβηση αποικοδόμηση, να οδηγήσει στην πρόταση ότι MDM2 επάγεται ARF αποικοδόμηση κατά την MDM2 υπερέκφραση μπορεί να συμβεί στο κυτταρόπλασμα. Αυτό μας ώθησε να επαληθεύσει την ικανότητα του να αποικοδομείται MDM2 ARF σε κύτταρα κατεργασμένα με Leptomycin Β (ΕΜΒ), που είναι γνωστή για να εμποδίσει MDM2 μετακινούνται στο κυτταρόπλασμα [26]. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα U2OS επιμολύνονται με ένα σταθερό ποσό ARF υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με Leptomycin Β παρουσία ή απουσία έκτοπη MDM2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, θεραπεία Leptomycin Β όχι μόνο καθορίζει τη συσσώρευση του ΤΑΠ, αλλά, το πιο σημαντικό, εξουδετερώνει την επίδραση MDM2 στο ΤΑΠ, που δείχνει έντονα ότι η αναγκαστική εντοπισμού πυρηνικών MDM2 εμποδίζει την ικανότητά της να επηρεάζει p14ARF κύκλου εργασιών.

Μια κύτταρα U2OS επιμολύνονται με 0,5 μg του πλασμιδίου έκφρασης ARF μόνη (διαδρομές 1, 2) ή σε συνδυασμό με 1 μg του πλασμιδίου έκφρασης MDM2 (λωρίδες 3, 4). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Leptomycin Β (διαδρομές 1 και 3) ή μεθανόλη (λωρίδες 2 και 4). Οι συνολικές κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε Western Blot και αναλύθηκαν με αντι-ARF, αντι-MDM2 και αντισώματα αντι-ακτίνης. κύτταρα Β HeLa επιμολύνθηκαν με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου έκφρασης MDM2 (1 και 1,5 μg). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε DMSO, ΤΡΑ ή Bisindolylmalemide και αναλύθηκαν με αντι-ARF, αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης αντισωμάτων σε Western Blot. κύτταρα C HeLa επιμολύνθηκαν με ΡΚΟα siRNA ή αρνητικό μάρτυρα siRNA (siRNActrl). 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα ψευδο-διαμολυσμένα ή επιμολυσμένο με αυξανόμενες ποσότητες MDM2 εκφράζουν πλασμιδίου όπου υποδεικνύεται (0,6 και 0,8 μg πλασμιδίου DNA). Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με κηλίδα Western με αντι ARF, αντι-MDM2 και αντισώματα αντι-ακτίνης. κύτταρα D U2OS επιμολύνθηκαν με 0.3 μα είτε ARFT8A ή ARFT8D μόνο (πρώτος λωρίδες) ή σε συνδυασμό με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίων έκφρασης MDM2 (0.3-0.6-0.9 μg). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε Western Blot με αντι ARF, αντι-MDM2 και αντι-ακτίνης.

Η

MDM2 μεσολάβηση ARF αποικοδόμηση παρεμποδίζεται κατά την ενεργοποίηση της PKC.

Πρόσφατα απέδειξε ότι ΤΡΑ (ένας γνωστός ενεργοποιητής του ενζύμου μεταγωγής σήματος ΡΚΟα) αποτελέσματα της θεραπείας σε μία αύξηση του ARF κυτταροπλασματικής πισίνα [11]. Εδώ θα απευθύνεται κατά πόσον η ενεργοποίηση της PKC θα μπορούσε να επηρεάσει MDM2 μεσολάβηση ARF υποβάθμιση. Για το σκοπό αυτό επεξεργασμένα κύτταρα HeLa, επιμολυσμένα με αυξανόμενες ποσότητες MDM2, είτε με ΤΡΑ ή Bisindolylmalemide (Bim, ένας αναστολέας της ενεργοποίησης PKC). Σύκο. 6Β δείχνει ότι η θεραπεία Bim, όπως αναμένεται, προκαλεί μια μείωση της τάξης του ARF. Είναι ενδιαφέρον, MDM2 υπερέκφραση μειώνει περαιτέρω ARF επίπεδα σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Αντιστρόφως, η αγωγή με ΤΡΑ εξουδετερώνει κυρίως προκαλούμενη MDM2 αποικοδόμηση του p14ARF, γεγονός που υποδηλώνει ότι η οδός PKC δεν θα πρέπει να ενεργοποιηθεί για να ληφθεί αποτελεσματική MDM2 μεσολάβηση ARF αποικοδόμηση. Για την περαιτέρω ανάλυση του ρόλου PKC σε MDM2 μεσολάβηση ARF αποικοδόμηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία U2OS είτε με PKC α ειδικό siRNA ή ελέγχουν siRNA και επιμολύνθηκαν με αυξανόμενες ποσότητες MDM2 (Εικ. 6C). Η υπερέκφραση του MDM2 σε si-CTR εξαντλημένα κύτταρα επάγει ARF υποβάθμισης όπως αναμενόταν. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρούμε μια μείωση των επιπέδων ARF την εξάντληση PKC απουσία MDM2 υπερέκφραση (σύγκρινε διαδρομή 5 με λωρίδα 2). Αυτό είναι σε συμφωνία με την παρατήρηση ότι η ενεργοποίηση PKC προκαλεί αύξηση του ARF επίπεδα πρωτεΐνης και PKC αδρανοποίηση προκαλεί μείωση των επιπέδων ARF (Vivo et al., 2013 και το Σχ. 6Β). Είμαστε πραγματικά παρατήρησε ότι και τα επίπεδα MDM2 ρυθμίζονται αρνητικά από εξάντληση PKC, (συγκρίνετε λωρίδα 5 με λωρίδα 2). Είναι σημαντικό ότι, σε συμφωνία με τα προηγούμενα πειράματά μας, MDM2 υπερέκφραση PKC εξαντλημένα κύτταρα μπορούν ακόμα να μειώσουν τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΑΠ (συγκρίνετε λωρίδα 5 με λωρίδες 6 και 7).

Για να πάνε βαθύτερα μέσα στο δυνητικό ρόλο του ΤΑΠ φωσφορυλίωσης σε MDM2 μεσολάβηση ARF αποικοδόμηση, κάναμε χρήση δύο μεταλλάξεις σημείου, το ARFT8D και ARFT8A στην οποία Θρεονίνη 8 έχει υποκατασταθεί, για να μιμούνται, αντίστοιχα, μια φωσφορυλιωμένη και μη φωσφορυλιωμένη μορφή του ARF [11]. Είναι ενδιαφέρον ότι η αποφωσφορυλιωμένη μορφή του ARF (T8A μεταλλαγμένη) είναι πολύ ασταθής, με ένα σχετικά μικρό χρόνο ημισείας ζωής, ενώ η T8D εμφανίζεται εμπλουτισμένη με συνέπεια στην κυτταροπλασματικό διαμέρισμα [11].

Και οι δύο μεταλλάξεις διαμολύνθηκαν σε κύτταρα U2OS μαζί με αυξανόμενες ποσότητες MDM2. Είναι ενδιαφέρον ότι η φωσφο-μιμητικό T8D μεταλλαγμένο φαίνεται πιο ανθεκτικά στην MDM2 μεσολάβηση αποικοδόμηση, ενώ η μεταλλαγμένη T8A λογικότερο στο φαινόμενο MDM2 (Σχ. 6D και 1D), επιβεβαιώνοντας ότι η φωσφορυλίωση εξασκεί ένα προστατευτικό ρόλο επί ARF.

Αυτό το αποτέλεσμα θέτει την υπόθεση ότι η επικρατούσα πυρηνικό εντοπισμό του ARF (T8A και πρωτεΐνες WT) θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα ενός αποδοτικού κάθαρση της αποφωσφορυλιώθηκε, και έτσι ασταθής, ARF πρωτεΐνης από το κυτταρόπλασμα. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα U2OS, επιμολυσμένα με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 και ARF υποκυτταρική κατανομή αναλύθηκε με ανοσοφθορισμό. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α και Β που παρατηρήσαμε, κατά την κατεργασία MG132, μια σταθερή αύξηση του ARF κυτταροπλασματική χρώση και στις δύο WT και T8A επιμολυσμένα κύτταρα, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι ARF αποικοδόμηση λαμβάνει χώρα κατά κύριο λόγο στο κυτταρόπλασμα. Ομοίως, Western Blot των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων των U20S κυττάρων, επιμολυσμένα και επεξεργασμένο όπως παραπάνω, παρουσιάζει μια σταθερή αύξηση τόσο βάρος ARF και ARFT8A επίπεδα πρωτεΐνης στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα μετά από αναστολή του πρωτεασώματος (Εικ. 7C).

Α κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με 1,5 μα είτε βάρος ή μεταλλάξεις ARF εκφράζουν πλασμίδια. 16 ώρες μετά από την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε DMSO ή 10 μΜ MG132 για 5 ώρες και υποβάλλεται σε IF με αντι-ARF αντίσωμα. Αντιπροσωπευτικές εικόνες που δείχνουν ARF και ΤΑΠ μεταλλάξεις υποκυτταρικού εντοπισμού σε κύτταρα U2OS με ή χωρίς θεραπεία MG132 δείξει. Εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού Nikon σε παρόμοιες συνθήκες έκθεσης. Β Η ιστόγραμμα, που αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, αναφέρει το ποσοστό των επιμολυσμένων κυττάρων που δείχνει κάθε μοτίβο εντοπισμού. Οι τυπικές αποκλίσεις δείχνονται επίσης. Η ανάλυση στυπώματος Western C ίσων ποσοτήτων των δύο κυτταροπλασματικής (30 μg) και πυρηνική (6 μg) εκχυλίσματα πρωτεΐνης από επιμολυσμένα κύτταρα U2OS αγωγή ή όχι με MG132. Η αποτελεσματικότητα της κυτταρικής κλασμάτωσης ελέγχθηκε με αντι-λαμίνη A /C και αντι-τουμπουλίνης αντισώματα. Ομαλοποιημένη ARF εντάσεις μπάντα, εμφανίζεται κάτω από κάθε αντίστοιχη ζώνη, εκφράζονται ως φορές σε σχέση εμπλουτισμό με τα μη επεξεργασμένα δείγματα αυθαίρετα οριστεί στο 1 (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες).

Η

Συζήτηση

Η σπουδαιότητα της λειτουργικής αλληλεπίδρασης μεταξύ ARF και MDM2 βγήκε από την αρχική ανακάλυψη ότι ARF έχει τη δυνατότητα να δράσει ως καταστολέας όγκου με σύνδεση προς και αναστέλλοντας τον ανταγωνιστή p53 MDM2. Η γνώση αυτή ενισχύθηκε και βελτιώθηκε το πέρασμα των ετών, αν και με αντιπαραθέσεις σχετικά με το ρόλο του ΤΑΠ πυρηνισκικό εντοπισμό σε αυτή τη διαδικασία [16, 17, 27]. Από την άλλη πλευρά, η σημασία αυτής της αλληλεπίδρασης είναι σαφές από την παρατήρηση ότι η αδρανοποίηση /απελευθέρωση της ρ53-MDM2-ARF άξονας είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη των περισσότερων ανθρώπινων καρκίνων. Περιέργως, MDM2 υπερέκφραση και απώλεια p14ARF συσχετίζονται με μια πιο επιθετική φαινότυπο σε πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους του πνεύμονα οι οποίες χαρακτηρίζουν μια αντίστροφη σχέση μεταξύ των δύο σε ανθρώπινους όγκους [28]. Από την άλλη πλευρά, οι προηγούμενες παρατηρήσεις έδειξε ένα αμφιλεγόμενο αποτέλεσμα της δράσης MDM2 στις p14ARF: αποδείχτηκε ότι η απώλεια του Mdm2 θα μπορούσε είτε να καταστείλουν [29] ή την αποκατάσταση [14] την ικανότητα του ρ19 ARF ποντικού να διεγείρει ανεξάρτητη της ρ53 διακοπή του κυτταρικού κύκλου . Έτσι, ανάλογα με το πλαίσιο (κυτταρικών τύπων, ανάντη σήματα, επίπεδο έκφρασης), θα μπορούσε να συμπεριφερθεί Mdm2 είτε ως ένας μεσολαβητής ή αναστολέα της λειτουργίας p14ARF επάνω του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [28]. Τέλος πάντων, το πρώτο «ανάκαμψη» στο δρόμο μας για να εξετάσουμε το MDM2 /ΤΑΠ σχέση βγήκε από την παρατήρηση ότι μια σύντομη ΤΑΠ μεταλλαγμένο (aa2-29) εμφανίστηκε σταθεροποιηθεί σημαντικά μετά την φίμωση της MDM2 ή υπερέκφραση MDMX (ένα MDM2 σχετίζονται, παρεμβαίνοντας πρωτεΐνης), που οδηγεί σε ένα μοντέλο στο οποίο ARF σύνδεση με MDM2 προκαλεί, κατά κάποιο τρόπο, η αυτοκτονία του, επειδή η ίδια φέρνει στην υποβάθμιση ( «ενοχής από το μοντέλο σύνδεσης») [18]. Η μελέτη μας και ταιριάζει με αυτές τις παρατηρήσεις, αποδεικνύοντας ότι MDM2 ενδοκυτταρική αύξηση μπορεί, πράγματι, να προκαλέσει την καταστροφή ARF από την πρωτεασώματος. Έχουμε αποδείξει ότι η φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ ARF και MDM2 είναι απαραίτητη, αν και δεν είναι επαρκής για να παρατηρηθεί η επίδραση, καθώς ARFT8D μετάλλαξης είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με MDM2 [11], αλλά δεν αποικοδομείται. Το γεγονός ότι η περιοχή της αλληλεπίδρασης της MDM2 με MDMX (δηλαδή η περιοχή παράμεσος) δεν είναι απαραίτητη για το σκοπό αυτό προτείνει ότι, πράγματι, αυτή η πρωτεΐνη δεν εμπλέκεται. Από την άλλη πλευρά, η παρατήρηση ότι η παράμεσου /ουβικιτίνη τομέα λιγάσης του MDM2 είναι περιττό να επηρεάσει ARF επίπεδα, δείχνει ότι, αν και αυτό δεν μπορεί να αποκλειστεί επισήμως, ARF ουβικιτινίωση δεν απαιτείται [8, 9]. Από την άλλη πλευρά, Rodway et al. [18] αξιωματική ρόλο της MDM2 στη μεσολάβηση ARF παράδοση στον πρωτεασώματος χωρίς καμία απαίτηση για ουβικουϊτινίωση. Αυτό θα μπορούσε πιθανώς να διαμεσολαβείται από MDM2 άμεση αλληλεπίδραση με το πρωτεάσωμα [22]. Ειδικότερα, Mdm2 έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά άμεσα με πολλές υπομονάδες πρωτεασώματος μέσω και των δύο Ν-τερματικών και C-τερματικές περιοχές ενώ το κεντρικό τομέα του (aa200-300) φαίνεται να ασκεί αρνητική ρυθμιστική ελέγχου επί της δέσμευσης [22]. μεταλλάξεις MDM2 μας (MDM2

1-441 και MDM2Δ

150-230) διατηρούν τουλάχιστον μία από τις περιοχές που απαιτούνται για την αλληλεπίδραση με το πρωτεασώματος και οι δύο από αυτούς είναι σε θέση να προκαλέσουν ARF υποβάθμιση. Περιέργως, παρατηρούμε επίσης μια πιο αποτελεσματική ΤΑΠ μείωση με το MDM2Δ

150-230 μεταλλαγμένο, που δεν έχει την κεντρική περιοχή.

Ωστόσο, όπως ARF ουμπικουιτίνωση δεν έχει άμεση αντιμετωπιστεί στην παρούσα μελέτη, δεν μπορούμε αποκλείουν την παρέμβαση του ULF [7] ή οποιοδήποτε άλλο ακόμη μη ουμπικουϊτίνης λιγάση στο παρατηρούμενο φαινόμενο. Ωστόσο, ενώ ULF μεσολάβηση ARF αποσύνθεση φαίνεται ασκείται στο πυρηνόπλασμα, διαφορετικές παρατηρήσεις στο παρόν έγγραφο υποδεικνύουν ότι η επίδραση MDM2 εμφανίζεται στο κυτταρόπλασμα. Πρώτον, οι μεταλλάξεις σε αμφότερα ARF και MDM2 που αναγκάζουν εντόπιση τους στο κυτταρόπλασμα, δεν επηρεάζουν MDM2 μεσολάβηση ARF αποικοδόμηση. Επιπλέον, Leptomycin Β θεραπεία, που αναστέλλει MDM2 πυρηνικής εξαγωγής, προκαλεί ARF συσσώρευσης και εξουδετερώνει την επίδραση της υποβάθμισης MDM2 στο ΤΑΠ. Τέλος, τα πειράματα ανοσοφθορισμού δείχνουν σαφώς ότι η θεραπεία με MG132 σε μία αύξηση των επιπέδων ARF στο κυτταρόπλασμα, υποδηλώνοντας έντονα ότι, πράγματι, ο λόγος για τον οποίο ARF δεν είναι συνήθως ανιχνεύσιμη σε αυτό το υποκυτταρικό διαμέρισμα κατοικεί σε μια πιο γρήγορη εναλλαγή.

πρέπει να σημειωθεί ότι, από την αρχική ανακάλυψή του, ARF περιγράφηκε με ένα διαδεδομένο nucleo /πυρηνισκικό εντοπισμό. Κατά συνέπεια, έχει αναφερθεί ότι ένας προστατευτικός ρόλος σε ARF επίπεδα εξασκείται στον πυρηνίσκο με B23 /ΝΡΜ. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση με ΤΒΡ1, το οποίο προστατεύει από την αποικοδόμηση ARF πρωτεασώματος, λαμβάνει χώρα στον πυρήνα [8].

Πιο πρόσφατα, ARF έχει αναφερθεί ότι εντοπίζονται επίσης στο κυτόπλασμα αν και συνδέονται κυρίως στα μιτοχόνδρια, λόγω του ρόλου του στην αυτοφαγία [30]. Είναι ενδιαφέρον ότι, κυτταροπλασματική χρώση p14ARF έχει περιγραφεί σε μερικούς καρκίνους [28].

Τέλος, έχουμε πρόσφατα ανέφεραν ότι, μετά την ενεργοποίηση της PKC, ARF πρωτεΐνη είναι φωσφορυλιωμένη και συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα [11].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού της PKC από ΤΡΑ εξουδετερώνει δράση MDM2 ενώ η αναστολή της οδού είτε με επεξεργασία Bisindolylmalemide ή ΡΚΟα κατευθύνεται siRNA, προκαλεί μείωση των επιπέδων ARF και ενισχύει τη μεσολάβηση MDM2 ARF υποβάθμιση. Κατά συνέπεια, η μεταλλαγμένη T8D ARF που μιμείται την φωσφορυλιωμένη κατάσταση της πρωτεΐνης, αν και περισσότερο παρόντες στο κυτταρόπλασμα, φαίνεται να είναι λιγότερο ευαίσθητα σε θεραπεία MG132 και να MDM2 υπερέκφραση. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν προηγούμενη πρότασή μας ότι η φωσφορυλίωση ασκεί προστατευτική επίδραση στο ΤΑΠ. Φαίνεται ότι οι περισσότερες από μία μεταγραφή ανεξάρτητους μηχανισμούς που εμπλέκονται στη ρύθμιση του ARF πρωτεΐνης, δηλαδή πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης [6-8] και φωσφορυλίωση.

Συνολικά, οι παρατηρήσεις μας οδηγούν στην υπόθεση ότι σε ένα περιβάλλον στο ογκογόνο η οποία MDM2 υπερεκφράζεται, τα ARF επίπεδα διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα, λόγω της ταχείας κύκλο εργασιών που προκαλούνται από MDM2 προκάλεσε την υποβάθμιση. Αύξηση ARF αποικοδόμηση και /ή φωσφορυλίωση θα μπορούσε έτσι να είναι κοινές στρατηγικές που ένα κύτταρο ενορχηστρώνουν να διαφύγουν ταχέως ARF λειτουργίες καταστολής της ανάπτυξης είτε σε φυσιολογικές συνθήκες ή όταν τα κύτταρα αναγκάζονται να πολλαπλασιάζονται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Περαιτέρω πειράματα χρειάζονται για να διευκρινιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί που υπογραμμίζει αυτές τις παρατηρήσεις και τη σημασία τους για την ανάπτυξη του καρκίνου

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

μορφώματα

pcDNARF , 3xFlag ARF

1-65, 3xFlagARF

65 έως 132, ARFΔ

2-14 /82-101 περιγράφονται στο [8]. pcDNAARFT8A και T8D πλασμίδια που περιγράφεται στο [11]. pCMVMDM2 κ.β., pCMVMDM2

1-441, pCMVMDM2Δ

150-230 περιγράφονται στο [31].

κυτταροκαλλιέργειες, επιμολύνσεις

U2OS, Η1299, κυτταρικές σειρές Hela αγοράστηκαν από τις κυτταρικές γραμμές υπηρεσίας (CLS).

ΥΠΟΙΟ

p53 – /- MDM2 – /-

κυτταρική γραμμή που περιγράφεται στο [32]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (EuroClone, Life Science) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% (ν /ν) CO2 στον αέρα.

Cells επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Technology Life) [33] ή με RNAiMAX (Technology Life) [34] σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

για τα πειράματα που περιγράφονται στο Σχ. 7C, τα κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιώντας την επιμόλυνση System Νέον (Technology Life) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.