Αφηρημένο

είναι καρδιοτονωτικές στεροειδή χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της καρδιακής ανεπάρκειας και των αρρυθμιών και έχουν πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική δράση. Η prototypic καρδιοτονωτικά στεροειδή ουαμπαϊνη μπορεί επίσης να είναι μια ορμόνη που ρυθμίζει επιθηλιακά κυτταρική προσκόλληση. Η καρδιοτονωτική στεροειδή αποτελούνται από ένα πυρήνα στεροειδούς και ένα δακτύλιο λακτόνης, και βιολογικές επιδράσεις τους εξαρτώνται από τη σύνδεση προς τον υποδοχέα τους, Να, Κ-ΑΤΡάσης, μέσω των οποίων, αυτές αναστέλλουν Na

+ και Κ

+ ιόν μεταφορά και ενεργοποίηση αρκετών μονοπατιών ενδοκυτταρικής σηματοδότησης. Σε αυτή τη μελέτη, προσθέσαμε μια ομάδα στυρολίου στο δακτύλιο λακτόνης της καρδιοτονωτική στεροειδή διγοξίνη, για να ληφθεί η διγοξίνη 21-βενζυλιδενο (21-BD), και διερευνήθηκαν τα αποτελέσματα αυτού του συνθετικού καρδιοτονωτικά στεροειδή σε διάφορα μοντέλα κυττάρων. Μοριακή μοντελοποίηση δείχνει ότι 21-BD δεσμεύεται με τον στόχο του Na, K-ΑΤΡάσης με χαμηλή συγγένεια, υιοθετώντας μια διαφορετική φαρμακοφόρων διαμόρφωση όταν δεσμεύεται με τον υποδοχέα της από διγοξίνη. Επομένως, 21-DB, σε σχετικά υψηλές ποσότητες μΜ αναστέλλει τη δράση της Να, Κ-ΑΤΡάσης α

1, αλλά όχι α

2 και α

3 ισομορφές. Επιπλέον, 21-BD στοχεύει άλλες πρωτεΐνες εκτός του Na, Κ-ΑΤΡάσης, αναστέλλοντας την πολυφαρμάκου εξαγωγέας Pdr5p. Όταν χρησιμοποιείται σε ολόκληρα κύτταρα σε χαμηλές συγκεντρώσεις μΜ, 21-BD παράγει διάφορα αποτελέσματα, όπως: 1), 2) κυττάρων τα πάνω ρύθμιση του Na, έκφραση Κ-ΑΤΡάσης και δραστικότητα σε HeLa και RKO κύτταρα καρκίνου, η οποία δεν βρέθηκαν για διγοξίνη συγκεκριμένες αλλαγές στην βιωσιμότητα των κυττάρων, μειώνοντας το σε HeLa και RKO καρκινικά κύτταρα, αλλά αυξάνοντας το σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα MDCK, η οποία είναι διαφορετική από την απόκριση σε διγοξίνη, και 3) μεταβολές στην αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου, μεταβάλλοντας τη μοριακή σύνθεση του σφικτών συνδέσμων και ανύψωση διεπιθηλιακής ηλεκτρικής αντίστασης του μονοστοιβάδων MDCK, ένα αποτέλεσμα βρέθηκε προηγουμένως για ουαμπαϊνη. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η τροποποίηση του δακτυλίου λακτόνης της διγοξίνης προσφέρει νέες ιδιότητες στην ένωση, και δείχνει ότι η διαρθρωτική αλλαγή που εισήχθη θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό της καρδιοτονωτικό στεροειδές με νέες λειτουργίες

Παράθεση:. Rocha SC, Pessoa MTC, Neves LDR, Alves ΟΥΕ, Silva LM, Σάντος HL, et al. (2014) 21-βενζυλιδενο Digoxin: Μια προ-αποπτωτικών Cardenolide από τα καρκινικά κύτταρα που απορυθμίζει Na, K-ΑΤΡ και επιθηλιακά σφιχτών συνδέσεων. PLoS ONE 9 (10): e108776. doi: 10.1371 /journal.pone.0108776

Επιμέλεια: Shree Ram Singh, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7, Απρίλη του 2014? Αποδεκτές: 25 Αυγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 7 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Rocha et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από FAPEMIG (Fundação de Amparo ένα Pesquisa κάνει Estado de Minas Gerais) APQ-01114-12, APQ-02596 – 12 , CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό) 472394/2012 έως 6 και ΝΙΗ DK081431. Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες για την οικονομική και διαρθρωτική στήριξη που παρέχεται από το Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο μέσω του ΝΑΡ-CatSinQ (Έρευνα Πυρήνας στην Κατάλυση και χημική σύνθεση). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η καρδιοτονωτική στεροειδή είναι κοινές ουσίες στο φυτικό βασίλειο που παρέχουν ένα ανταγωνιστικό πλεονέκτημα έναντι λεηλασίας, είτε στο εργοστάσιο που τα συνθέτει, ή στα ζώα που τους συσσωρεύεται από τη διατροφή [1]. Ορισμένα πειραματικά στοιχεία δείχνουν ότι τα ζώα μπορούν να συνθέσουν ενδογενώς καρδιακή στεροειδή και ότι οι ουσίες αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πίεσης του αίματος, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του κυτταρικού θανάτου [2], [3]. Η βασική δομή του καρδιοτονωτικά στεροειδή αποτελείται από ένα στεροειδούς ραχοκοκαλιάς με ένα cis /trans /cis διαμόρφωση και ένα υπόλοιπο λακτόνης στη θέση 17β, επίσης γνωστή ως η αγλυκόνη. Επιπλέον, αυτές οι ενώσεις έχουν συχνά ένα σάκχαρο συνδέεται στη θέση 3β του στεροειδούς πυρήνα, για τα οποία είναι κοινώς γνωστά ως καρδιακά γλυκοσίδια. Η φύση του δακτυλίου λακτόνης διακρίνει τα καρδενολίδια, που έχουν ένα ακόρεστο δακτύλιο βουτυρολακτόνη, από τις bufadienolides, οι οποίες παρουσιάζουν ένα δαχτυλίδι α-πυρόνης. Η μόνη δομική διαφορά μεταξύ των δύο κύριων καρδενολίδια που χρησιμοποιούνται θεραπευτικά, διγοξίνη και διγιτοξίνη, είναι ένα ενιαίο επιπλέον υδροξυλομάδα (ΟΗ) στο διγοξίνη, η οποία μεταβάλλει σημαντικά τη φαρμακοκινητική της. Διγιτοξίνη, είναι περισσότερο λιπόφιλα, δείχνει ισχυρή σύνδεση με τις πρωτεΐνες του πλάσματος, είναι σχεδόν εξ ολοκλήρου μεταβολίζεται στο ήπαρ και παρουσιάζει πολύ μεγάλο χρόνο ημιζωής. Σε αντίθεση, η διγοξίνη οθόνες αδύναμη σύνδεση με τις πρωτεΐνες του πλάσματος, δεν μεταβολίζεται εκτενώς και εκκρίνεται σε ένα κυρίως αναλλοίωτη μορφή από τα νεφρά [2], [3].

Η κύρια φαρμακολογική δράση των θεραπευτικών δόσεων διγοξίνη και διγιτοξίνης είναι θετική ινότροπη δράση τους. Αυτό επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση της αναστολής της μυοκαρδιακής κυτταρικής Na, K-ATPase, η οποία οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων κυτοσολικό Na

+ και δευτερευόντως Ca

2+, λόγω μείωσης μεταφορά του Na

+ εξαρτάται Na

+ /Ca

2 + εναλλάκτη. Η αυξημένη Ca

2+ στο έμφραγμα κύτταρο κυτοσόλιο οδηγεί σε περαιτέρω πλήρωση του σαρκοπλασματικό δίκτυο με Ca

2+, το οποίο θα είναι άμεσα διαθέσιμα για την απελευθέρωσή του κατά τη διέγερση για να παράγει έντονη συστολή των μυών [3] – [5 ]

στο πλαίσιο της κυτταρικής βιολογίας, υπάρχουν δύο τομείς στους οποίους η καρδιακή στεροειδή είναι δυνητικού ενδιαφέροντος:. καρκίνο και προσκόλληση κυττάρου. Και τα δύο αυτά φαινόμενα συνδέονται στενά, όπως φαίνεται από την απώλεια της κυτταρικής συγκόλλησης που λαμβάνει χώρα κατά την διάρκεια του πολλαπλασιασμού του καρκίνου και μετάσταση. Η επίδραση της καρδιακής στεροειδών επί προσκόλλησης κυττάρου είναι ελάχιστα κατανοητή και είναι το επίκεντρο έντονης έρευνας [6] – [8]. Από τη δεκαετία του 1960, έχουν αρκετές ενδιαφέρουσες επιδράσεις κατά του όγκου έχουν παρατηρηθεί για δακτυλίτιδα [9], [10], καθώς και για άλλες καρδενολίδια [11] – [15] και οι σχετικές καρδιακές γλυκοσίδες, οι bufadienolides [16] – [19].

καρκίνος του Ανθρώπου επηρεάζει κυρίως επιθήλια [20], τα οποία κύτταρα είναι εξαιρετικά πολωμένο και συνδεδεμένο με το άλλο μέσω κομβική συγκροτήματα, συμπεριλαμβανομένων των σφιχτών συνδέσεων (TJS). Αυτή η τελευταία δομή προσδίδει επιθήλια ικανότητα τους να λειτουργούν ως αποτελεσματικά εμπόδια στον διαχωρισμό των βιολογικών διαμερισμάτων [21]. Απώλεια TJs εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [6], [22], για παράδειγμα, μια μείωση στην έκφραση της πρωτείνης σφικτής διασταύρωση κλαουδίνης (CLDN) -7, εμπλέκεται στην διάδοση των καρκινικών κυττάρων του μαστού [23] . Επιπλέον, η σημασία της Na, Κ-ΑΤΡάσης για τον σχηματισμό συνδετική συμπλοκών έχει εδραιωθεί [24], [25], όπως είναι η απαίτηση των επαφών κυττάρου-κυττάρου για την πολωμένη έκφραση της Νβ, Κ-ΑΤΡάσης σε πλευρικές μεμβράνη του πλάσματος των επιθηλιακών κυττάρων [26]. Είναι ενδιαφέρον ότι η β

1 υπομονάδα του Na, η ίδια Κ-ΑΤΡάσης λειτουργεί ως μόριο προσκόλλησης κυττάρου σε αστροκύτταρα [27] και επιθήλια [28] – [31]

Μια μείωση στην κυτταρική επιφάνεια έκφραση του. ο β

1 υπομονάδα έχει συσχετιστεί με επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση, διαδικασία που εμπλέκονται στην εισβολή όγκου και η μετάσταση [25], [32]. Η θεραπεία με διάφορους τύπους καρδιακής στεροειδών προκαλεί διάφορα αποτελέσματα επί των κυττάρων διασταυρώσεις. Υψηλές συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης (≥300 ηΜ) και άλλες καρδιακές στεροειδή διαταράσσουν σφιχτά, προσφύσεως και την επικοινωνία κόμβους καθώς και δεσμοσώματα των επιθηλιακών κυττάρων [24], [33], [34]. Αντίθετα, χαμηλές συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης (10 ηΜ) η αύξηση της σφράγισης του TJs [35], την επιτάχυνση των κυττάρων πολικότητα (όπως προσδιορίζεται από την ανάπτυξη του πρωτογενούς κροσσών [36]) και την αύξηση της επικοινωνίας των κυττάρων μέσω της επικοινωνίας κόμβων [30].

Αν και οι μελέτες σχετικά με τις βιολογικές επιδράσεις των διαθέσιμων καρδιακών στεροειδών σε κύτταρα όγκου ταχέως αναπτυσσόμενες, αυτό δεν είναι η περίπτωση για νεοσυντιθέμενες καρδιοτονωτικά στεροειδή. Ορισμένες συνθετικές καρδιοτονωτικά στεροειδή έχουν ελεγχθεί για αντικαρκινική δράση τους [17], [37] – [44]. Ολεανδρίνη και 9-υδροξυ-2 «oxovoruscharin, ένα ημι-συνθετικό καρδενολίδο, είναι υπό κλινικές δοκιμές και έχει επιδείξει αντικαρκινική δράση τόσο

σε

vitro

και

σε

vivo

, σε πολυανθεκτικότητάς καρκινικά κύτταρα καλλιέργειες [15], [43], [44]. Άλλες μελέτες απέδειξαν ότι ορισμένες τροποποιήσεις της μονάδος σακχάρου του διγοξίνη και διγιτοξίνη, μπορεί να αυξήσει την αντικαρκινική δράση αυτών των ενώσεων [45] – [48].

Αρκετοί συγγραφείς έχουν περιγράψει τη σύνθεση παραγώγων διγοξίνη στην οποία η προσθήκη των ομάδων στυρολίου προς την χαρακτηριστική ομάδα δακτυλίου λακτόνης που παράγεται κάποια ενδιαφέρουσα βιολογική δράση [49], [50]. Ωστόσο, υπάρχουν ακόμα αναφορές σχετικά με την αντικαρκινική δράση ή τις επιπτώσεις αυτών των παραγώγων διγοξίνης στη δραστηριότητα Na, K-ΑΤΡ.

Ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν να μελετήσει τις βιολογικές επιδράσεις της 21-βενζυλιδενο διγοξίνη (21 -BD), ένα παράγωγο διγοξίνης με μια πρόσθετη ομάδα στυρολίου στον άνθρακα C21 του δακτυλίου λακτόνης, σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Γενική διαδικασία για τη σύνθεση της 21- βενζυλιδενο διγοξίνη

Βενζαλδεΰδη (0,18 ml, 1,8 mmol), διγοξίνη (0,469 g, 0,6 mmol), άνυδρο Κ

2CO

3 (0.249 g, 1.8 mmol) και 60 ml μεθανόλης προστέθηκαν μέσα σε μια φιάλη στρογγυλού πυθμένα. Μετά από ανάδευση για 6 ώρες στους 70 ° C, ο διαλύτης εξατμίστηκε σε έναν περιστροφικό εξατμιστήρα. Το ακατέργαστο προϊόν αραιώθηκε με 20 ml νερού και εκχυλίζεται με θερμό οξικό αιθυλεστέρα (3 χ 30 ml). Η οργανική στιβάδα πλύθηκε με άλμη, στέγνωσε πάνω σε άνυδρο Na

2SO

4 και συμπυκνώθηκε υπό κενό. Το ακατέργαστο προϊόν στη συνέχεια καθαρίστηκε με χρωματογραφία στήλης διοξειδίου του πυριτίου (CH

2Cl

2 /MeOH 11:01). Μετά τον καθαρισμό, το καθαρό προϊόν διαλύθηκε σε tetrahidrofurano (THF), καταβυθίστηκε με εξάνιο και συμπυκνώθηκε υπό ελαττωμένη πίεση για να δώσει 21-BD (0.325 g, 0.37 mmol, 62%) ως ένα λευκό στερεό.

Κυτταροκαλλιέργεια

HeLa (ανθρώπινο καρκίνωμα τραχήλου? ATCC CCL2) και RKO-AS45-1 (καρκίνωμα του παχέος εντέρου? ATCC CRL-2579) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI ή DMEM /ΗΑΜ F-10 (1:01) μέσο (Sigma , St. Louis, ΜΟ, USA). ΟΗΟ-Κ1 (ATCC CCL61) και MDCK-ΙΙ κύτταρα (σκύλου νεφρική? ATCC CCL-34) αναπτύχθηκαν σε DMEM. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Hyclone) (CDMEM), 60 mg /ml στρεπτομυκίνη και 100 mg /ml πενικιλίνη. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα /cm

2 και επωάστηκαν σε μια υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε 48 ώρες για να αποφευχθεί η εξάντληση θρεπτικών ουσιών.

καλλιέργεια κυττάρων εντόμων και ιογενείς λοιμώξεις

Sf-9 κύτταρα εντόμου αναπτύχθηκαν σε μέσο Grace με 3,3 g /l υδρόλυμα λακταλβουμίνης, 3,3 g /l yeastolate, και συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 0.25 μg /ml Fungizone. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλλιέργειες εναιωρήματος και μεταφέρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού 150 mm πριν τη μόλυνση. Μολύνσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [51]. Μετά από 72 ώρες στους 27 ° C, τα κύτταρα ξύστηκαν από τις πλάκες καλλιέργειας, φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 χ

g

για 10 λεπτά και αιωρήθηκε σε 10 mM υδροχλωρική ιμιδαζόλη (ρΗ 7.5) και 1 mM EGTA. Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν επί πάγου χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή Potter-Elvehjem και το λύμα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 1000 χ

g

. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε, φυγοκεντρήθηκε για επιπλέον 10 λεπτά σε 12,000 χ

g

, και το τελικό σφαιρίδιο εναιωρήθηκε σε 250 mM σακχαρόζη, 0.1 mM EGTA, και 25 mM ιμιδαζόλιο HCl, ρΗ 7.4.

κυτταροτοξικότητας δοκιμασία

επίδραση Ενωση κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε με τη χρήση του ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) τετραζολίου χρωματομετρική μέθοδος (Sigma, St. Louis , ΜΟ, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C για να συρροή. Στη συνέχεια, τα φρεάτια πλύθηκαν με μέσο καλλιέργειας και διγοξίνη ή 21-BD προστέθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,05 έως 500 μΜ). Μετά από επώαση για 24 ή 48 ώρες, οι πλάκες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΜΤΤ. Αναγνώσεις έγιναν σε αναγνώστη μικροπλακός Spectramax M5e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) στα 550 nm. Η κυτταροτοξικότητα βαθμολογήθηκε ως το ποσοστό μείωσης της απορρόφησης, σε σχέση με καλλιέργειες ελέγχου χωρίς αγωγή [52]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος των LC

50 (η συγκέντρωση του φαρμάκου που μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα στο 50%).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Comet δοκιμασία.

Η δοκιμασία ηλεκτροφόρηση γέλης μονοκύτταρους (κομήτη δοκιμασία) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένα πρωτόκολλα [53], [54]. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα CHO-K1 υπέστησαν αγωγή με 20, 35 ή 50 μΜ διγοξίνη ή 21-DB, οι οποίες είναι οι συγκεντρώσεις που δεν επηρεάζουν την κυτταρική βιωσιμότητα σύμφωνα με την δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Οι επόμενες ημέρες τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και επωάστηκαν 3 ώρες με τις αντίστοιχες ενώσεις σε μέσα καλλιέργειας χωρίς ορό. Οι αρνητικές και θετικές ομάδες ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS, και μεθυλο μεθανοσουλφονικό (400 μΜ), αντιστοίχως. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ. Η θρυψίνη αδρανοποιήθηκε με 3.0 ml πλήρους μέσου, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 150 χ

ζ

). Το δισκίο ακολούθως εναιωρείται εκ νέου εντός 500 μΙ PBS, και δείγματα 30 μΐ των κυτταρικών εναιωρημάτων αναμίχθηκαν με 70 μλ αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως (0,5%). Αυτά τα μίγματα τοποθετήθηκαν σε πλάκες προ-επικαλύπτονται με κανονικό σημείο τήξης αγαρόζη (1,5%) και καλύπτονται με καλυπτρίδες. Οι καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν μετά από πέντε λεπτά, και τα πλακίδια εμβαπτίστηκαν όλη τη νύχτα σε διάλυμα λύσης (NaCl 2,5 Μ, EDTA 100 mM, Τρις 10 mM, ρΗ 10? Triton Χ-100 1% και DMSO 10%). Στη συνέχεια, τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS και διατηρήθηκε για 40 λεπτά σε ένα οριζόντιο κουτί ηλεκτροφόρησης γεμάτη με κρύο αλκαλικό ρυθμιστικό (EDTA 1 mM, Ν & ΟΗ 300 mM, ρΗ & gt? 13). Η ηλεκτροφόρηση διεξήχθη σε 0,86 V /cm και 300 mA (20 λεπτά) και τα πλακίδια ακολούθως εξουδετερώθηκε (0,4 Μ de Tris, ρΗ 7.5), σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Visual αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο φθορισμού [55], [56].

Phosphatidylserine μετατόπιση.

κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε τρυβλίων Petri διαμέτρου 60 χιλιοστών σε συρροή και επωάζονται όλη τη νύκτα σε CDMEM. Αυτά στη συνέχεια κατεργάστηκαν με 2μΜ διγοξίνη ή 50 μΜ 21-BD σε CDMEM για 6, 12 ή 24 ώρες. Μετά την επώαση, αναστέλλεται κύτταρα ανακτήθηκαν από το μέσο με φυγοκέντρηση στα 150 χ

g

, 20 ° C για 5 λεπτά. Επισυνάπτεται κύτταρα ελήφθησαν από μια ήπια κατεργασία πρωτεάσης 1 ml Accutase συν 3 ml PBS), φυγοκεντρούνται όπως αναφέρεται ανωτέρω και προστέθηκαν στα κύτταρα που λαμβάνονται από τα μέσα ενημέρωσης. Annexin-V συνδέεται με το εξωτερικό φύλλο της μεμβράνης πλάσματος μετρήθηκε με ένα comercial κιτ (κιτ Annexin-V-Fluos Stainig, Roche, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, κυτταρικό αιώρημα επωάζεται με ένα μίγμα αννεξίνης-F-FITC και ιωδιούχο προπίδιο σε ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα για 15 λεπτά. εναιώρημα των κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur, λογισμικό Φ.Ο.Β Jo).

τρανσεπιθηλιακές ηλεκτρικής αντίστασης (TER)

MDCK κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε διαπερατά Transwell στηρίγματα (3415, Corning Inc., NY, USA) το διεπιθηλιακής ηλεκτρική αντίσταση μετρήθηκε με ένα EVOM και το σύστημα EndOhm-6 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Τελικές τιμές ελήφθησαν με αφαίρεση της αντίστασης του διαλύματος κολύμβησης και το κενό ένθετο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ohms · cm

2 (Ω · cm

2) ως ποσοστό του ελέγχου.

ανοσοφθορισμού

Μετά από μετρήσεις ΔΣΕ, μονοστοιβάδες MDCK πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS /Ca

2+, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά στους 4 ° C, κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 για 5 λεπτά, αποκλείστηκαν για 30 λεπτά με 3% BSA και θεραπεία για 1 ώρα στους 37 ° C με ένα ειδικό πρωτογενές αντίσωμα. Οι μονοστιβάδες στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές με PBS /Ca

2+, επωάζεται με ένα κατάλληλο FITC ή TRICT-επισημασμένα αντισώματα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ξεπλένονται όπως αναφέρεται παραπάνω. Φίλτρα με τα κύτταρα αποκόπηκαν με νυστέρι και τοποθετήθηκαν σε Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Τα παρασκευάσματα εξετάστηκαν με ένα μικροσκόπιο Leica ομοεστιακό SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Οι εικόνες που έχουν ληφθεί εισήχθησαν ΦΙΤΖΙ, έκδοση 2.8 (National Institutes of Health, Βαλτιμόρη, ΗΠΑ), για να επιτευχθεί η μέγιστη προβολές και στο GNU Image Manipulation Program (GIMP) να ομαλοποιήσει τη φωτεινότητα και την αντίθεση σε όλες τις εικόνες και να κατασκευάσουν στοιχεία.

ανοσοαποτύπωσης

ανάλυση στυπώματος Western εκχυλισμάτων πρωτεΐνης ολικού κυττάρου διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [57]. Εν συντομία, MDCK και HeLa κύτταρα πλύθηκαν με PBS και διαλυτοποιήθηκαν με δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό [10 mM πιπεραζινο

N

,

N ‘

-δις (2-αιθανοσουλφονικό οξύ), ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM αιθυλενοδιαμινο-τετραοξικό οξύ (EDTA), 1% Triton Χ-100, 0.5% deoxicholate νάτριο, και 10% γλυκερίνη] που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Complete Mini? Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του προϊόντος λύσης κυττάρων μετρήθηκε (BCA αντιδραστήριο αποτίμησης πρωτεΐνης? Pierce Chemical, Rockford, IL) και προετοιμάστηκαν για ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) με βρασμό σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Οι επιλυθεί πρωτεΐνες electrotransfered σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Ηγοοηά-Ρ? GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Οι πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με την ειδική πολυκλωνικά ή μονοκλωνικά αντισώματα αναφέρεται σε κάθε περίπτωση, που ακολουθείται από συζευγμένο με υπεροξειδάση αντισώματα είδη κατάλληλη (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) και ανίχνευση χημειοφωταύγειας (ECL συν? GE Healthcare).

Ανίχνευση Na, Κ-ΑΤΡάσης και κλαουδίνης έκφραση μέσω πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

Για πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (RT-qPCR), ολικό RNA εξάγεται από το κύτταρο δείγματα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (τεχνολογίες ζωής, USA). Η συγκέντρωση υπολογίστηκε μέσω φασματοφωτομετρία με Nanodrop ND2000 (Thermo Scientific, USA). Όλες οι αντιδράσεις ανάστροφης μεταγραφάσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 5 μg του RNA με το κιτ Superscript III (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα ταυτόχρονα για να ελαχιστοποιηθεί η διακύμανση μεταξύ δοκιμασίας που σχετίζονται με την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα ανίχνευσης γρήγορη αλληλουχία ΑΒΙ Prism 7500 (Applied Biosystems) με τη χρήση Go Taq μάστερ μιξ qPCR (Promega, USA). Οι ακόλουθοι εκκινητές και οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται (Murphy κ.ά., 2004): Na, Κ-ΑΤΡάσης α

1 υπομονάδα (GenBank αριθμός πρόσβασης NM_000701): Fw (300 ηΜ): 5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3, Rv (300 ηΜ ): 5′-TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3 ‘? Να, Κ-ΑΤΡάσης β

1 υπομονάδα (GenBank αριθμός πρόσβασης NM_001677): Fw (300 ηΜ): 5′-ACC ΑΑΤ CTT ACC ATG GAC ACT GAA-3 ‘, Rv (300 ηΜ): 5’-CGG TCT TTC TCA CTG TAC CCA ΑΤ-3 ‘? CLDN-2 Fw GGTGGGCATGAGATGCACT, Rv CACCACCGCCAGTCTGTCTT? CLDN-4 Fw TGCACCAACTGCGTGGAGGATGAG, Rv ACCACCAGCGGGTTGTAGAAGTCC. Η εφαρμοζόμενη συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 50 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 1 λεπτό. Κάθε ένα από αυτά σύνολα αρχικών τεμαχίων παρήγαγε ένα μοναδικό προϊόν PCR, όπως επιβεβαιώνεται από τα ελήφθησαν καμπύλες τήξης. Οι δοκιμασίες PCR εκτελέστηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα συνενώθηκαν. Σχετική ποσοτική μέτρηση των επιπέδων του γονιδίου-στόχου διεξήχθη χρησιμοποιώντας την μέθοδο του ΔΔCt Livak et al. [58]. Όπως ενδογενή γονίδια ελέγχου καθαριότητας, χρησιμοποιήσαμε την γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH, GenBank αριθμός πρόσβασης NM_002046) και ριβοσωμικής 18S γονίδια υπομονάδα (GenBank αριθμός πρόσβασης NR_003286) [59]. Οι ακόλουθοι εκκινητές και οι συγκεντρώσεις χρησιμοποιήθηκαν: GAPDH Fw (300 ηΜ): 5’- ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3 ‘, GAPDH Rv (300 ηΜ): 5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′, 18S Fw (300 ηΜ): 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA- 3 ‘, 18S Rv (300 ηΜ): 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’.

αναλύει μοριακών μοντέλων

Αρχικά, διγοξίνη, ουαμπαϊνη και 21-BD (Σχήμα 1Α) παρήχθησαν και εξευγενισμένα μέσω της μεθόδου ημι-εμπειρικές ρΜ6 [60] εφαρμόζονται σε Gaussian λογισμικό 09 W [61]. Η κρυσταλλογραφική δομή του Na, Κ-ΑΤΡάσης (πρωτεΐνη-στόχος) σε σύμπλοκο με ουαμπαϊνη ελήφθη από την Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεΐνης (ΠΠ ID: 4HYT [62] με ανάλυση 3,40 Α, χρησιμοποιώντας το α

1 υπομονάδα του Na, Κ- ΑΤΡ). Το ιόν μαγνησίου και τρία μόρια νερού διάμεση κρατήθηκαν στη θέση σύνδεσης. Στη συνέχεια, ένα άκαμπτο νέου αποβάθρα ουαμπαϊνης διεξήχθη για την επικύρωση του συστήματος μας. Στη συνέχεια, διγοξίνη και 21-BD ήταν αγκυροβολημένο κατά της ΑΤΡ. Οι αναλύσεις σύνδεσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ΑυΤΌϋΟΟΚ Vina 1.0.2 [63]. Η εφαρμοζόμενη αλγόριθμος αναζήτησης έχει επαναληφθεί Τοπική Αναζήτηση Σφαιρική Optimizer για την παγκόσμια βελτιστοποίησης. Σε αυτή τη διαδικασία, μια διαδοχή βημάτων με μετάλλαξη και την τοπική βελτιστοποίηση (η μέθοδος Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno [BFGS]) διεξήχθησαν, και κάθε βήμα ακολούθησε το κριτήριο Metropolis [64]. Σε αυτή τη μελέτη, ένα κουτί πλέγμα κατασκευάστηκε διερευνώντας όλες τις ενεργές θέσεις, η οποία ορίστηκε ως ενός κύβου με το γεωμετρικό κέντρο σε ουαμπαϊνη, με διαστάσεις 20 × 20 × 24 Α, κατανεμημένα σημεία 1 Α και Χ, Υ και Ζ του -27.065, 20.469 και -69.469, αντίστοιχα. Όλα τα στοιχεία μοριακής μοντελοποίησης κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας DS Visualizer 3.1 [65].

(Α) Χημική δομή της ουαμπαϊνης, διγοξίνη, και 21-BD. (Β) Αριστερά: ολόκληρη η δομή του Na, Κ-ΑΤΡάσης (ΠΣΠ: 4HYT) έδειξαν σε στερεά αναπαράσταση κορδέλα, όπου οι άλφα-έλικα, β-φύλλα και τις στροφές είναι κόκκινο, μπλε και γκρι, αντίστοιχα? δεξιά: highlight του σημείου σύνδεσης με ουαμπαϊνη φαίνεται στην παράσταση σωλήνα. Διακεκομμένες κόκκινες γραμμές δείχνουν δεσμούς υδρογόνου. Μόνο πολικά άτομα υδρογόνου έδειξε για μια καλύτερη οπτικοποίηση. Φαρμακοφόρων διαμόρφωση, (C) διγοξίνη και (Δ) 21-BD? Οι πολικές και μη πολικές αλληλεπιδράσεις απεικονίζεται με ματζέντα και πράσινο χρώμα, αντίστοιχα. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν δεσμούς υδρογόνου. Υπόλειμμα αλληλεπιδράσεις χρωματική κωδικοποίηση, όπως αναφέρεται στο εισάγεται κλίμακα.

Η

Προετοιμασία Pdr5p μεμβράνες του πλάσματος

μεμβράνες του πλάσματος που περιέχει το υπερεκφρασμένο πρωτεΐνη Pdr5p παρασκευάστηκαν από το

Saccharomyces cerevisiae

μεταλλαγμένο στέλεχος AD124567 όπως έχει ήδη αναφερθεί [66].

η κλασματοποίηση των προϊόντων λύσης των κυττάρων και την προετοιμασία των κλασμάτων μεμβράνης

Ένα σύνολο 2,5 × 10

5 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 75 εκατοστά

2 μπουκάλια πολιτισμό και την αγωγή με διγοξίνη και 21-BD. Μετά από 48 ώρες επεξεργασίας, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS και διαλύονται από το μπουκάλι καλλιέργειας με ένα λαστιχένιο αστυνομικός σε ένα ρυθμιστικό παρασκεύασμα μεμβράνης (6 mM Tris [ρΗ 6,8], 20 mM ιμιδαζόλη, 0.25 Μ σακχαρόζη, 0,01% SDS, 3 mM EDTA και 2 mM PMSF). Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ομογενοποιητή Potter-Elvehjem, χρησιμοποιώντας δέκα Stokes σε πάγο. Στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε ηχητική επεξεργασία σε ένα υπερηχητικό διάρρηξης κυττάρων πάνω σε πάγο για 10 s στους 45% της ισχύος. Το δείγμα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 20,000 χ g για 90 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 250 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος παρασκευάσματος μεμβράνης. Τέλος, αυτό το δείγμα υποβλήθηκε σε υπερήχους για 10 s σε 25% ισχύ μέχρι την πλήρη ομογενοποίηση.

παρασκευή Na, Κ-ΑΤΡάσης από εγκέφαλο αρουραίου ημισφαίρια

ημισφαίρια του εγκεφάλου από ενήλικες αρσενικούς αρουραίους Wistar ταχέως συλλέχθηκαν μετά διαιθυλαιθέρα αναισθησία και αποκεφαλισμό. Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για τη χρήση των αρουραίων εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών για την Ηθική στη χρήση των ζώων, κωδικό διαδικασία DFBCICB011 και ήταν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου, που δημοσιεύτηκαν από αμερικανικό Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH δημοσίευσης αριθ . 85-23, αναθεωρήθηκε το 1996). Οι ιστοί του εγκεφάλου, που χρησιμοποιείται ως πηγή ουαμπαϊνης-ευαίσθητου (α

2 /α

3) Να, Κ-ΑΤΡάσης ισομορφές, ομογενοποιήθηκαν σε 250 mM ρυθμιστικό σακχαρόζη, 2 mM διθειοθρεϊτόλη, 0.1 mM PMSF και 5 mM Tris /HCl (ρΗ 7,4) με έναν κινητήρα που Teflon Potter-Elvehjem ομογενοποιητή. Στη συνέχεια, χαοτροπικών κατεργασία με 2 Μ ΚΙ διεξήχθη επί 1 ώρα υπό συνεχή ανάδευση, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση τρεις φορές σε 100.000 χ

g

για 1 ώρα. Το τελικό σφαιρίδιο επανααιωρήθηκε σε 250 mM σακχαρόζη, 0.1% δεοξυχολικό νάτριο και 20 mM μηλεϊνικής /Tris (ρΗ 7.4), στη συνέχεια αποθηκεύεται όλη τη νύχτα στους -20 ° C και υποβάλλεται σε διαφορική φυγοκέντρηση μετά την απόψυξη [67]. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς PMSF και αποθηκεύεται σε υγρό N

2.

Να, Κ-ΑΤΡάσης παρασκεύασμα από νεφρό ποντικού

νεφρικό ιστό απομονώθηκε από ενήλικα ποντίκια και ήταν ομογενοποιούνται σε 250 mM σακχαρόζη, 0.1 mM EGTA, και 25 mM ιμιδαζόλιο HCl, ρΗ 7.4, χρησιμοποιώντας μια μηχανοκίνητη Teflon Potter

–

Elvehjem ομογενοποιητή. Το δείγμα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 4500 χ

g

για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο που προέκυψε φυγοκεντρήθηκε στα 70.000 χ

g

για 1 ώρα. Το τελικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε διάλυμα ομογενοποίησης και χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις ενεργότητας Na, Κ-ΑΤΡάσης. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα που αφορούν τα ποντίκια είχαν εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο Θεσμικών Φροντίδα Ζώων και Επιτροπή Χρήσης.

ΝΤΡάσης Αναλύσεις

Η ενζυματική δραστηριότητα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ΑΤΡ ως υπόστρωμα σε πρότυπο μέσο (50 μl τελικός όγκος) που περιέχει 100 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 4 mM MgCl

2, 75 mM KNO

3, 7,5 mM NaN

3, και 0,3 mM μολυβδαινικού αμμωνίου σε παρουσία 3 mM ΑΤΡ. Η αντίδραση ξεκίνησε με την προσθήκη 13 μg /ml των παρασκευασμάτων μεμβράνης πλάσματος, κατόπιν διατηρήθηκε στους 37 ° C για 60 λεπτά και διακόπηκε με την προσθήκη 1% SDS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [68]. Η απελευθερωμένη ανόργανο φωσφορικό (Ρί) μετρήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [69]. Χρησιμοποιώντας τα μητρικά διαλύματα σε DMSO, 21-BD και διγοξίνη προστέθηκαν έως A /V τελική συγκέντρωση 5% κατά. Η διαφορά στην δραστικότητα ΑΤΡάσης παρουσία ή απουσία 3 μΜ ολιγομυκίνη αντιστοιχούσε σε Pdr5p-προκαλούμενη δραστικότητα ΑΤΡάσης.

Μέτρηση της επίδρασης της 21-BD επί Na, Κ-ΑΤΡάσης

Τα παρασκευάσματα ημισφαίριο του εγκεφάλου επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες σε μέσο που περιέχει 87,6 mM ΝαΟΙ, 3 mM KCI, 3 mM MgCl

2, 3 mM ATPNa

2, 1 mM EGTA, 10 mM αζίδιο του νατρίου και 20 mM μηλεϊνικό οξύ /Tris (ρΗ 7.4), και τα παρασκευάσματα κυτταρικής μεμβράνης επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα σε 120 mM NaCl, 20 mM KCl, 2 mM MgCl

2, 3 mM ATPNa

2 και 50 mM HEPES, (ρΗ 7.5), και οι δύο με την απουσία και παρουσία 1 mM ουαμπαϊνη ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις της 21-BD και διγοξίνη. Να, Κ-ΑΤΡάσης προσδιορίστηκε με μέτρηση της Pi απελευθερώνεται σύμφωνα με μία χρωματομετρική μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [69], και η ειδική δραστικότητα θεωρήθηκε ως η διαφορά μεταξύ του συνόλου και ουαμπαϊνη ανθεκτικά δραστηριότητες ΑΤΡάσης [70].

Ouabain

δεσμευτική

κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε 24 ερωτήσεις πολλαπλών φρεατίων σε συρροή και καλλιεργούνται τη διάρκεια της νύχτας. Οι μονοστοιβάδες στη συνέχεια ταχέως εκπλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ελεύθερο αλατούχου διαλύματος καλίου (140 mM NaCl, 1,8 mM ΟαΟ

2, 5 mM σουκρόζη, 10 mM Tris-HCl ρΗ 7,4 σε θερμοκρασία δωματίου) και επωάστηκαν 30 λεπτά με συνολικό διάλυμα δέσμευσης (0,1 × 10

-6

3Η-ουαμπαϊνης συν 0,9 × 10

-6 κρύο ουαμπαϊνης στην ελεύθερη ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα καλίου) κάτω από ήπια ανάδευση και σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, μονοστιβάδες πλύθηκαν τέσσερις φορές, 1 λεπτό κάθε φορά, με παγωμένο 0.1 Μ MgCl

2 και διαλύθηκαν με 400 μΙ SDS 1%.

δραστικότητα 3Η μετρήθηκε σε δείγματα των 350 μΙ με απαρίθμηση σπινθηρισμού. Σύνολο

3Η-ουαμπαϊνη πρόσδεσης ανταγωνίζεται με την προσθήκη με το συνολικό διάλυμα πρόσδεσης την απαραίτητη ποσότητα της 21-BD για να φτάσει τις συγκεντρώσεις που αναφέρονται στο αποτέλεσμα. Ένα υποσύνολο των μονοστιβάδων εκτέθηκε σε ανταγωνίστηκε διάλυμα δέσμευσης (συνολικά διάλυμα πρόσδεσης συν 0,5 × 10

-4 Μ κρύο ουαμπαϊνη) για τη μέτρηση της μη ειδική σύνδεση και αφαιρούμε τον στις συνολικής πρόσδεσης αξίες.

Στατιστικές αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό GraphPad Prism, έκδοση 5. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική σφάλμα του μέσου όρου. Η στατιστική σημαντικότητα σε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από την επιλεγμένη δοκιμή ζεύγη σύγκριση ενός Bonferroni, το ορίστηκε στο

P

& lt? 0,05 (*),

P

& lt? 0,01 (**), ή

P

& lt?. 0.001 (***) έναντι του κατάσταση ελέγχου, και το «η» αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ανεξάρτητων πειραμάτων

Αποτελέσματα

Συνθέσαμε 21-BD μέσω ενός απλού στέρεο εκλεκτική βινύλογο αντίδραση αλδόλης, σύμφωνα με Xu et al. [50], και χαρακτήρισε το τελικό προϊόν μέσω συμβατικών NMR, HRMS και ανάλυση IR (Σχήμα 1Α? Σχήμα S1 και δεδομένων S1).

Για να εκτελέσετε το μοριακής μοντελοποίησης αναλύει ξεκινήσαμε με τη γεωμετρική βελτιστοποίηση των υποκαταστατών, μέσω ένα ημι-εμπειρική προσέγγιση, για να διορθώσει γεωμετρικές παράμετροι, όπως μήκη δεσμού και να βελτιώσετε τη δομή. Η δομή εκ νέου προβλήτα που λαμβάνονται με το λογισμικό ΑυΤΌϋΟΟΚ Vina, δείχνει ότι η εκλεπτυσμένη και η κρυσταλλογραφική μερίδιο συνδέτη η ίδια διαμόρφωση στο ενεργό κέντρο, με ένα τετραγωνικό μέσο όρο απόκλισης των 2,24 Α για την καλύτερη λύση, η οποία έδειξε την ακρίβεια των μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε (βλέπε Εικόνα S2A). Το σχήμα 1Β δείχνει μια προσομοίωση της σύνδεσης ουαμπαϊνης στην θέση πρόσδεσης του στα α Na, Κ-ΑΤΡάσης

1 ισομορφή. Όπως φαίνεται, το ένζυμο διατηρεί τα δευτερεύοντα δομικά στοιχεία της οικογένειας ΑΤΡ (Σχήμα 1Β, αριστερά) και ότι το ενεργό κέντρο αποτελείται από Gln111, Glu 117, Pro118, Asn122, Leu125, Glu312, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Phe783, Phe786, Leu793, Ile800, Arg880 (Εικόνα 1Β, δεξιά), σε συμφωνία με τις γνωστές δομές [71].

Μετά από αυτά μοριακής μοντελοποίησης αναλύσεις που ελλιμενίζεται ουαμπαϊνη, διγοξίνη και 21-BD σε Na, K-ΑΤΡ ( Σχήμα S2B και το Σχήμα 1C και D). Προσομοιώσεις οδήγησε σε δεσμευτικές ενέργειες για ουαμπαϊνη, διγοξίνη, και 21-BD του -9,8, -1,9, και -10,0 kcal /mol, αντιστοίχως. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το 21-BD μπορεί να έχουν παρόμοια συγγένεια δέσμευσης με τον Na, Κ-ΑΤΡάσης από ουαμπαϊνη και η διγοξίνη. Ωστόσο, και οι δύο αυτές τελευταία ενώσεις εμφανίζουν διαφορετικές διαμορφώσεις φαρμακοφόρα στη θέση σύνδεσης, κυρίως στο επίπεδο του δακτυλίου λακτόνης. Τα σχήματα 1C και D αναδείξει τα πιο σημαντικά διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των συμπλοκοποιητών και της πρωτεΐνης-στόχου. Διγοξίνη δεσμεύεται στο ένζυμο μέσω δεσμών υδρογόνου με Thr797, Asp884 και Lys905 αμινοξέα. Η ηλεκτροστατική και υδρόφοβη αλληλεπίδραση συμβεί με Glu 117, Asn120, Asp121, Asn122, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Arg880, Asp884, Tyr901, Glu908 και Gln111, Leu125, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, Arg886, Phe909, Arg972, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). Σε αντίθεση με τα φυσικά καρδιακές γλυκοσίδες, τα σύμπλοκα 21-BD στο Na, Κ-ΑΤΡάσης μέσω δεσμών υδρογόνου Gln111, Glu312, και Thr797. Επιπλέον, ο αρωματικός δακτύλιος φθάσει σε ένα υδρόφοβο θύλακα που σχηματίζεται κυρίως από Cys104, Val322, Ala323, Glu327, Ile800 (Εικόνα 1D). Επιπλέον, η διαμόρφωση φαρμακοφόρα είναι εντελώς διαφορετική από εκείνη των φυσικών γλυκοζιτών, των οποίων η αρωματική χαρακτηριστική ομάδα συνδέεται με τα μόρια του νερού και ιόντων μαγνησίου.

Για να προσδιορισθεί απ ‘ευθείας σύνδεση του 21-BD στο ουαμπαϊνης θέση του Na, Κ- ATPase, πρώτα ελεγχθεί εάν το συνθετικό στεροειδές θα μπορούσε να ανταγωνιστεί με το

3Η-ουαμπαϊνη δέσμευσης σε κύτταρα HeLa, τα οποία εκφράζουν το α

1 ισομορφή του Na, Κ-ΑΤΡάσης [72]. Όπως φαίνεται στο Σχ.