Αφηρημένο

Το μονοκλωνικό αντίσωμα (McAb) είναι το βασικό εργαλείο για την ανοσοδιάγνωση καρκίνου και ανοσοθεραπεία. McAb με βάση ανοσοθεραπεία που στοχεύει τα καρκινικά αντιγόνα είχε μεγάλη achivement. Σε αυτή τη μελέτη, ένα κύτταρο κλώνος που διατηρούνται εκκρίνουν υψηλού τίτλου IgG1 τύπου McAb ονομάζεται NJ001 έναντι ανθρώπινου μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα ελήφθη κυττάρων (NSCLC). Ο τίτλος του καθαρισμένου NJ001 ήταν 2 × 10

6. Το αντιγόνο που ονομάζεται SP70 του NSCLC που προσδιορίζονται συγκεκριμένα από NJ001 αποδείχθηκε ότι είναι μία πρωτεΐνη με την σχετική μοριακή μάζα (Mr) 70 kDa. Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημικής staining έδειξε ότι NJ001 θα έχει θετικό αντιδράσουν σε NSCLC, αλλά αδύναμη θετικά ή αρνητικά αντιδρούν στην ανθρώπινη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα (SCLC), πνευμονική pseudotumor και άλλων επιθηλιακών όγκων. Στην δοκιμασία μαλακού άγαρ, η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας σε ομάδες NJ001 μειώθηκαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Για τη συγκέντρωση των 100 μg /ml, 200 μg /ml και 400 μg /ml, η αναλογία αναστολή σχηματισμού αποικίας ήταν 23,4%, 62,5% και 100% αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, NJ001 προκάλεσε σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου και του βάρους του όγκου σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του πνεύμονα. Η αναλογία αναστολής της ανάπτυξης του όγκου σε 200 μg, 400 μg και 800 μg ομάδες NJ001 ήταν 10,44%, 37,29% και 44,04%, αντίστοιχα. NJ001 οδήγησε επίσης σε κυτταρομορφολογική αλλαγές και επάγεται σημαντικά την απόπτωση των ανθρώπινων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα γραμμή SPC-Α1. Η νεοαποκτηθέντα NJ001 αντέδρασε επιλεκτικά με NSCLC και επέδειξαν δράση κατά των όγκων και

in vitro

και

in vivo

. NJ001 έχει μεγάλη αξία όσον αφορά ανοσοδιαγνωστική και η ανοσοθεραπεία για NSCLC και κρατά την υπόσχεση για περαιτέρω έρευνα σχετικά με την εξέλιξη του μηχανισμού υποκείμενο όγκο των NSCLC

Παράθεση:. Παν S, Wang F, Huang P, Xu Τ, Zhang L, Xu J, et al. (2012) Η μελέτη σε νεοαποκτηθέντα McAb NJ001 Ειδικά για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και βιολογικά χαρακτηριστικά του. PLoS ONE 7 (3): e33009. doi: 10.1371 /journal.pone.0033009

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Νοεμ του 2011? Αποδεκτές: 2 Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Μάρτη 2012

Copyright: © 2012 Pan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30972821, 30901344 και 30901262), Βασικά Εργαστήριο Ιατρικής επαρχία Jiangsu της Κίνας, Ακαδημαϊκό προτεραιότητας του Προγράμματος Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο διαδεδομένες καρκίνους και είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο λόγω της έλλειψης επικυρωμένης ή αποτελεσματική προσέγγιση προσυμπτωματικού ελέγχου για την έγκαιρη διάγνωση. Η επιβάρυνση της δημόσιας υγείας είναι εμφανής σε όλο τον κόσμο με 1,5 εκατομμύρια πνεύμονα θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο το 2010 [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 85% του καρκίνου του πνεύμονα και οι περισσότεροι ασθενείς με NSCLC έχουν προχωρημένη νόσο κατά τη διάγνωση. Το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη, στην οποία δοκιμές διαλογής είναι διαθέσιμες, είναι τέσσερις έως έξι φορές περισσότερο από καρκίνο του πνεύμονα. Η υψηλή νοσηρότητα /θνησιμότητα και την αποτυχία να επιτευχθεί μια πρώιμη διάγνωση αποτέλεσμα στην μελαγχολική πρόγνωση [2], [3].

Οι θεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα βασίζεται κυρίως σε παραδοσιακές λειτουργίες, όπως η χειρουργική εκτομή, χημειοθεραπεία, και ακτινοθεραπεία; Εν τούτοις, η θεραπευτική επίδραση που λαμβάνεται είναι λιγότερο από ικανοποιητική [4] – [6]. Πρόσφατα, η ανοσοθεραπεία για τον καρκίνο έχει γίνει μια μέθοδος που χρησιμοποιείται ως συνέχεια στην παραδοσιακή θεραπεία. Τα αντισώματα καθίστανται ένα μεγάλο τροπικότητα φαρμάκου λόγω της υψηλής ειδικότητας και συγγένειας τους με τους στόχους. Πάνω από δύο δωδεκάδες θεραπευτικά μονοκλωνικά αντισώματα (McAbs) επί του παρόντος εγκριθεί για τη θεραπεία του καρκίνου και άλλων ασθενειών του ανθρώπου [7] – [9]. Ταυτοποίηση νέων αντιγόνων θα βελτιώσει περαιτέρω την ανοσοθεραπεία όγκου. ανοσοθεραπεία Antibody-based που στοχεύει καρκινικά αντιγόνα ή δείκτες κυτταρικής επιφάνειας έχει σημειώσει κάποια επιτυχία ως θεραπεία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του NSCLC, με παράγοντες όπως το cetuximab, panitumumab, matuzumab, και trastuzumab [10] – [14].

στην παρούσα μελέτη, παρήγαγε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που ορίζεται NJ001, που δημιουργούνται με ανοσοποίηση ποντικών με ανθρώπινο πνεύμονα adencarcinoma αντιγόνο ζωντανών κυττάρων SPC-Α1. Η αντινεοπλασματική δραστικότητα των McAb NJ001 εκτέθηκε τόσο

in vitro

και i

n vivo

.

Αποτελέσματα

Παραγωγή και Χαρακτηρισμός των NJ001

Μετά την ανοσοποίηση ποντικών BALB /c με ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα, 3 θετικών μονοκλωνικών κυτταρικές σειρές υβριδώματος (NM001, NM004, NM005) επιβεβαιώθηκαν με δοκιμή επαναλαμβάνεται έμμεση κύτταρο ELISA για να παράγουν συνεχώς αντισώματα και ήταν ως εκ τούτου επελέγησαν για επέκταση και επανακλωνοποίηση. αριθμούς χρωμοσωμάτων του κάθε καρυοτύπου υβριδώματος ήταν περισσότερο από 95. Το Σχήμα 1Α ήταν ο καρυότυπος του κυττάρου υβριδώματος NM001. Καθαρισμένο McAbs από ασκίτη αποκτήθηκαν από Protein A καθαρισμό συγγένειας. Η McAb από NM001 είχαν τον υψηλότερο τίτλο μεταξύ των τριών αντισωμάτων, φθάνοντας 2 × 10

6. NM001 και NM004 διατηρούνται εκκρίνουν IgG 1, κ- τύπου McAb, ενώ NM005 εκκρίνεται IgG2b, κ- τύπου McAb.

(Α) Καρυότυπος του NM001 υβριδωματική κυτταρική γραμμή (× 400). (Β) Δέσμευση δραστικότητα McAbs στην ανθρώπινη κακοηθών και nonmaligant κυττάρων σε καλλιέργεια. Αδιάλυτο υπερκείμενα από υβριδώματα NM001, NM004, NM005 ελέγχθηκαν εις τριπλούν με έμμεση ELISA κυττάρου όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Κάθε αριθμός αντιπροσωπεύει τη μέση απορρόφηση του τελικού υποστρώματος προϊόν στα 450 nm. Έλεγχοι χωρίς McAbs παρουσίασαν κατά μέσο όρο απορροφητικότητας του 0,02. NM001 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη, καθώς παρουσίασαν την μεγαλύτερη αναλογία πρόσδεσης με κύτταρα όγκου πνεύμονα και τη μεγαλύτερη εξειδίκευση για τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές γραμμές όγκου. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western για την αντίδραση του NJ001 παράγονται από υβρίδωμα NM001 με διαφορετικά κύτταρα (ανθρώπινα κακοηθών και nonmaligant κύτταρα) σε καλλιέργεια. (Λωρίδα 1, SPC-Α1? Λωρίδα 2, Α549? Λωρίδα 3, NCI-H520? Λωρίδα 4, ΝΟΙ-Η460? Λωρίδα 5, HepG2? Διαδρομή 6, ZR-75-30? Λωρίδα 7, COLO 205? Λωρίδα 8, WI-38? λωρίδα 9, PBMC? λωρίδα 10, Marker). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ήταν ειδική για NJ001 αντίσωμα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα γραμμές, όχι σε άλλα καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κανονικά κύτταρα. (D) Αντιπροσωπευτική θετικά και αρνητικά αποτελέσματα που προκύπτουν από IIF ανάλυση των αντίδραση της NJ001 με διαφορετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν με φθορισμό και συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση (× 400). (Α, SPC-Α1? B, ZR-75 με 30? C, HepG2? D, WI-38). Παρουσία NJ001 μπορεί να απεικονιστεί στην κυτταρική κυτταρόπλασμα των κυττάρων SPC-Α1, αλλά και άλλες κυτταρικές γραμμές δεν έδειξε φθορισμό. Εντοπισμός του αντιγόνου ειδικές για NJ001 μπορεί να είναι σε κυτταρικό κυτταρόπλασμα των κυττάρων SPC-Α1.

Η

Κάθε McAb χαρακτηρίζεται από τα αποτελέσματα της πρόσδεσης σε ένα πάνελ κανονικών και κακοηθών κυττάρων που παρατίθεται στην Εικόνα 1Β. Με ανάλυση ELISA, διαπιστώσαμε ότι McAbs που παράγονται από τις κυτταρικές σειρές υβριδωμάτων NM001, NM004 και NM005 εμφάνισαν υψηλότερες αναλογίες δέσμευσης με τις κυτταρικές γραμμές NSCLC SPC-Α1, Α549, ΝΟΙ-520 και ΝΟΙ-Η460, αλλά παρουσίασαν γενικά χαμηλότερη δέσμευση αναλογίες σε SCLC κυτταρική σειρά NCI-H446, άλλες γραμμές καρκίνο και φυσιολογικό κύτταρο. NJ001, που παράγεται από την κυτταρική σειρά υβριδώματος NM001, επελέγη για περαιτέρω μελέτη επειδή εμφάνισε την υψηλότερη ειδικότητα για το καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με άλλες κυτταρικές γραμμές όγκου.

αποτελέσματα ανάλυσης Western blot ήταν συνεπή (Σχήμα 1C) . Θα μπορούσε να ανιχνεύσει μόνο την έκφραση της πρωτεΐνης που ονομάζεται SP70 ειδικά για NJ001 σε κυτταρικές γραμμές NSCLC, αλλά όχι σε άλλες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κανονικά κύτταρα.

Έμμεση αποτελέσματα ανοσοφθορισμού φαίνεται στο σχήμα 1Δ. SP70, που αναγνωρίζεται από NJ001, εντοπίστηκε στο κύτταρο memberane και κυτταρική κυτταρόπλασμα των κυττάρων SPC-Α1, ενώ οι άλλες κυτταρικές σειρές δεν παρουσίασαν φθορισμό.

ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Η ανοσοϊστοχημική αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η έκφραση του SP70 ήταν ισχυρή θετική σε αδενοκαρκίνωμα πνευμονικό ιστό και πλακώδη καρκίνο του πνεύμονα ιστού (Σχήμα 2Α, 2Β), ενώ ασθενές θετικό ή αρνητικό έκφραση παρατηρήθηκε στον ιστό του SCLC, καρκίνωμα του μαστού, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο του παχέος εντέρου, του καρκίνου των ωοθηκών και του ήπατος καρκίνου (Σχήμα 2C, 2D, 2Ε, 2F, 2G, 2Η). SP70 δεν βρέθηκε στους ιστούς των πνευμονικών pseudotumor και των παρακείμενων nontumourous ιστούς των πνευμόνων (Εικόνα 2i, 2J)

αντιπροσωπευτικές περιοχές των τμημάτων όγκου από (Α) NSCLC πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα.? (Β) NSCLC καρκίνο εκ πλακωδών του πνεύμονα? (C) SCLC? (D) καρκίνωμα μαστού? (Ε) γαστρικό καρκίνο? (F) του καρκίνου του παχέος εντέρου? (G) του καρκίνου των ωοθηκών? (H) καρκίνο του ήπατος? (Ι) Πνευμονική pseudotumor? (J) Δίπλα nontumourous ιστούς των πνευμόνων.

Η

εκφράσεις SP70 στον ιστό του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα, SCLC, καρκίνωμα του μαστού, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο του παχέος εντέρου, καρκίνο των ωοθηκών, καρκίνο του ήπατος, πνευμονική pseudotumor και παρακείμενα nontumourous πνεύμονα ήταν 58/58, 48/48, 2/21, 3/21, 1/5, 0/5, 0/5, 1/5, 0/25 και 0/8 αντίστοιχα (Πίνακας 1).

Η

ανασταλτική δράση της NJ001 για SPC-Α1 διάδοση των πυρηνικών όπλων και Colony Σχηματισμός

Η επίδραση της NJ001 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SPC-Α1 αξιολογήθηκε μέσω ενός [

3Η ] δοκιμασία πολλαπλασιασμού θυμιδίνης. Σε σύγκριση με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν ελέγχου, το επίπεδο πολλαπλασιασμού των NJ001 κατεργασμένων κυττάρων SPC-A1 μειωθεί σημαντικά μετά από 48 ώρες και 72 ώρες (

P

& lt? 0.001,

P

& lt? 0.001) (Σχήμα . κύτταρα 3)

Σε σύγκριση με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν ελέγχου, το επίπεδο του πολλαπλασιασμού των NJ001 αγωγή SPC-A1 μειώθηκε σημαντικά μετά από 48 ώρες και 72 ώρες (**

P

& lt? 0.001).

Η

κύτταρα SPC-A1 απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ μήτρα, αντιμετωπίζονται με NJ001 ή MCA2849 (άσχετο McAb) (0, 100, 200, 400, 800, ή 1000 μg /mL) και επωάστηκε στους η κατάσταση των 37 ° C με 5% CO

2. Μετά από 14 ημέρες, ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες ελήφθησαν (Σχήμα 4). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, NJ001 ανέστειλε το σχηματισμό αποικιών με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, επιδεικνύοντας αναλογία αναστολή 23,4% στο /mL, 62.5% αναλογία παρεμπόδισης 100 μα σε 200 μg /mL. Όταν η συγκέντρωση έφθασε 400 μg /mL ή περισσότερο, δεν υπήρχαν αποικίες μεγαλύτερες από 50 κύτταρα, που δείχνει μια αναλογία αναστολής 100%. Ωστόσο, MCA2849 δεν αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών του SPC-Α1.

Τα εναιωρήματα κυττάρων (2 χ 10

4 κύτταρα) αναμιγνύεται με 0,3% αγαρόζη και διαφορετικές συγκεντρώσεις NJ001 ή MCA2849 στρώθηκαν επί το κορυφή του μέσου καλλιέργειας σε τρυβλία καλλιέργειας 6 φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 2 εβδομάδες πριν από μετρήθηκαν αποικίες. Εκπρόσωπος εικόνες αντίθεση έδειξαν. (Α) 0 μg /mL NJ001, (Β) 100 μg /mL NJ001, (C) 200 μg /mL NJ001, (D) 400 μg /mL NJ001, (Ε) 0 μg /mL MCA2849, (F) 100 μg /mL MCA2849, (G) 200 μg /mL MCA2849, (H) 400 μg /mL MCA2849.

η

Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι NJ001 αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SPC-A1

in vitro

.

ανασταλτική δράση της NJ001 στο ανθρώπινο SPC-Α1 αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα ποντίκι μοντέλο ξενομοσχεύματος

στην προκαταρκτική μελέτη, μετά από 3 εβδομάδες εμβολιασμού, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία. Οι ιστοί από το σημείο της ένεσης στην ομάδα επώαση και οι όγκοι στην ομάδα ελέγχου αποκόπηκαν. Ιστοπαθολογία δεν έδειξαν ανάπτυξη του όγκου στους ιστούς της ομάδας επώασης και την ανάπτυξη του όγκου σε ιστούς της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 5).

αντιπροσωπευτικές περιοχές των τμημάτων ιστού από τις περιοχές εμβολιασμό σε ομάδα NJ001 (Α) και των όγκων σε εκτομή ομάδα ελέγχου (Β).

Η

Το αποτέλεσμα του

in vivo

πείραμα δείχνεται στο Σχήμα 6Α. Η χορήγηση NJ001 προκαλείται διάφορους βαθμούς μείωσης στον όγκο του όγκου σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου έλαβαν αλατούχο διάλυμα. Οι όγκοι του όγκου στην ομάδα NJ001 400 μg και 800 μg ήταν σημαντικά μικρότερη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου 17 ημέρες μετά τον εμβολιασμό? Επιπλέον, η διαφορά παρέμεινε στο τέλος της θεραπείας (

P

= 0.004,

P

= 0,003). Μετά από 3 εβδομάδες θεραπείας, οι όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Σε 200 μg, 400 μg και 800 μg ομάδες NJ001, ανάπτυξη όγκου λόγος αναστολής [(C-T) /C%] ήταν 10,44%, 37,29% και 44,04%, αντίστοιχα. Ο λόγος αναστολής σε 400 μg και 800 μg ομάδα NJ001 ήταν στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 6Β,

P

= 0,032,

P

= 0,015). Στο τέλος της 3 εβδομάδες, το μέσο βάρος του όγκου στα 200 μg και 800 μg NJ001 ομάδα ήταν (1,51 ± 0,20) g και (0,94 ± 0,19) g, και η διαφορά μεταξύ των δύο θεραπειών ήταν επίσης στατιστικά σημαντική (

P

= 0,048).

(Α) καμπύλη ανάπτυξης όγκου. Τα ζώα εγχύθηκαν υποδορίως με 2 χ 10

6 κύτταρα SPC-Α1 και ενδοπεριτοναϊκή ένεση με φυσιολογικό ορό, 200 μg, 400 μg, ή 800 μg NJ001. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν σε διαστήματα 4 ημερών. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. (Β) Μέσο βάρος όγκου στις ομάδες αντίσωμα και ελέγχου. Μετά από 3 εβδομάδες θεραπείας, οι όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. ∧

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα NJ001 200 μg

Η

Η απόπτωση των SPC-Α1 κυττάρων που επάγεται από NJ001

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α, SPC -Α1 κυττάρων στην ομάδα NJ001 παρουσίασαν περιθώριο και συμπυκνωμένη χρωματίνη μήτρας, καθώς επίσης και συρρίκνωση και διόγκωση του κυτταροπλάσματος και κατακερματισμένη πυρήνες, τα οποία είναι τυπικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης. Σε αντίθεση, τα κύτταρα είτε σε ομάδα MCA2849 ή McAb ελεύθερη ομάδα διατήρησε μια φυσιολογική μορφολογία και διατηρούνται επαρκή ικανότητα να πολλαπλασιάζονται.

κύτταρα SPC-A1 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς 200 μg /mL NJ001 ή MCA2849 για 24 ώρες και 48 h. (Α) Μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα SPC-A1 παρατηρήθηκαν υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο (χ 100). a, 24 h NJ001? β, 24 ώρες MCA2849? γ, 24 ώρες McAb δωρεάν? d, 48 ώρες NJ001? e, 48 ώρες MCA2849? στ, 48 ώρες McAb δωρεάν. (Β) Η απόπτωση αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Κάθε ράβδος στήλη και λάθους αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (**

P

& lt? 0.001). Το ποσό των καθυστερημένων απόπτωση προσδιορίστηκε ως το ποσοστό της αννεξίνης V

+ /ΡΙ

+ κύτταρα.

Η

Σε σύγκριση με την ομάδα MCA2849 και McAb ελεύθερη ομάδα, τα υψηλά ποσοστά της αννεξίνης V

+ κυττάρων (σύνολο αποπτωτικό ποσοστό) στην ομάδα NJ001 παρατηρήθηκαν κατά το χρονικό σημείο της 24 h και 48 h (

P

& lt? 0.001 και για τα δύο χρονικά σημεία). Η διαφορά της συνολικής αποπτωτικών συντελεστή ομάδα NJ001 μεταξύ 24 h χρονικό σημείο και 48 h χρονικό σημείο ήταν επίσης στατιστικά σημαντική (

P

= 0.002, Εικόνα 7Β).

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7C, τα ποσοστά της αννεξίνης V

+ /ΡΙ

+ κύτταρα (τέλη αποπτωτικό ποσοστό) στην ομάδα NJ001, ομάδα MCA2849 και McAb ελεύθερη ομάδα ήταν 30,89%, 2,80% και 3,58% στις 24 ώρες χρονικό σημείο αντίστοιχα. Ο αείμνηστος αποπτωτικό ποσοστό στην ομάδα NJ001 ήταν επίσης υψηλότερη από τις άλλες δύο ομάδες στις 48 χρονικό σημείο h (

P

& lt? 0.001,

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, ο αείμνηστος αποπτωτικό ποσοστό στην ομάδα NJ001 αυξήθηκε σημαντικά μετά από 24 ώρες (από 24 ώρες σε 48 ώρες χρονικό σημείο) (

P

& lt? 0.001).

NJ001 προκάλεσε την απόπτωση των SPC- κελιά A1 σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

Συζήτηση

τεχνολογία παραγωγής είναι διαθέσιμο εργαλείο που δυνητικά μπορεί να παράγει αντισώματα κατά των όγκων και ταυτοποίηση νέων αντιγόνων όγκου. Κατά τα τελευταία χρόνια, σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στον εντοπισμό των αντιγόνων που σχετίζονται με όγκους που αναγνωρίζονται από McAbs ή αυτοαντισωμάτων από ασθενείς. Επί του παρόντος, έχουν πάνω από 1.000 αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους έχει αναφερθεί [15] – [20]

Στην παρούσα μελέτη, 3 McAbs παρήχθησαν από 3 θετικές μονοκλωνικά κυτταρικές σειρές υβριδώματος (NM001, NM004, NM005) που αντέδρασαν. σε διάφορους βαθμούς σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, φυσιολογικά κύτταρα, και τα άλλα καρκινικές κυτταρικές σειρές. McAb NJ001 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη, καθώς παρουσίασαν την υψηλότερη αναλογία σύνδεσης με καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και επίσης εμφάνισαν την μεγαλύτερη εξειδίκευση για τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, σε σύγκριση με τις άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημικής χρώσης έδειξαν ότι NJ001 μπορούσε θετικά αντιδρούν σε NSCLC, αλλά ασθενές θετικά ή αρνητικά αντιδρά σε ανθρώπινο καρκίνο μικρών κυττάρων του πνεύμονα (SCLC), πνευμονική pseudotumor και άλλα επιθηλιακά καρκινώματα.

Εκτός από την υψηλής συγγένειας και η ειδικότητα, NJ001 παρουσίασαν επίσης δραστικότητα κατά του όγκου τόσο

in vitro

και

in vivo

. Παρατηρήσαμε την επίδραση της NJ001 στον πολλαπλασιασμό των αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα γραμμή SPC-Α1. Αποτελέσματα δοκιμασία μαλακού άγαρ έδειξαν ότι η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας σε ομάδες NJ001 μειωμένη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η ξενομοσχεύματος ιδρύθηκε με υποδόρια ένεση κυττάρων SPC-Α1 και NJ001 χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε 3 διαφορετικές δόσεις. NJ001 προκάλεσε ποικίλους βαθμούς μείωση στον όγκο του όγκου και του βάρους του όγκου σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου. Επιπλέον, όταν εγχέεται την ίδια ποσότητα κυττάρων SPC-A1 καλλιεργήθηκαν με NJ001 για 2 ώρες με τον ίδιο τρόπο, δεν υπήρχε ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια. Βρήκαμε επίσης ότι NJ001 που προκαλείται από τις κυτταρομορφολογική αλλαγές και σημαντικά προκάλεσε την απόπτωση των κυττάρων SPC-Α1 σε έναν τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο. Αυτό πρότεινε ότι η απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από NJ001 είναι δυνητικά ο μηχανισμός της δραστικότητας κατά του όγκου. Διέγερση απόπτωσης διαμεσολαβείται είτε μέσω των υποδοχέων θανάτου (ένας εξωγενής οδός), ή στο μιτοχονδριακό επίπεδο (ένα ενδογενές μονοπάτι) [21] – [23]. Περαιτέρω ταυτοποίηση των αποπτωτικών οδών σηματοδότησης σε κύτταρα SPC-A1 κατεργάζεται με NJ001 θα ήταν χρήσιμη στην διαλεύκανση των μηχανισμών με τους οποίους NJ001 προκαλέσει αντικαρκινική δραστικότητα τόσο

in vitro

και

in vivo

. Ότι, λειτουργικές δοκιμασίες στη μελέτη μας έγιναν μόνο σε κύτταρα SPC-Α1 χρησιμοποιείται για την παραγωγή NJ001. Στην επόμενη μελέτη, θα κάνουμε περισσότερη δουλειά για να παρατηρήσουν την ανάπτυξη ανασταλτικές επιδράσεις της NJ001 παρατείνεται πέρα ​​από ένα μόνο κύτταρο γραμμή και να καταστήσει σαφές κατά πόσον η βιολογική δραστηριότητα είναι ειδικά για την κυτταρική γραμμή δοκιμάστηκε και αντιπροσωπεύει μια πιο γενικευμένη αντίδραση NSCLC.

Η σημασία των αντιγόνων όγκου έγκειται στην διαγνωστική και δυνητική θεραπευτική χρησιμότητα τους [24] – [33]. Επιπλέον, τα αντιγόνα όγκου μπορεί επίσης να παρέχουν προγνωστικές πληροφορίες για τους ασθενείς με καρκίνο [34]. Τα αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους του καρκίνου του ανθρώπινου πνεύμονα έχουν αναγνωριστεί εδώ και πολλά χρόνια? Ωστόσο, λίγες εκθέσεις έχουν ερευνήσει τα κοινά αντιγόνα ή κοινούς επίτοπους του καρκίνου του πνεύμονα [35], [36]. Σε αυτή τη μελέτη, το αντιγόνο που τελικά ονομάστηκε SP70 αναγνωρίζεται από NJ001 αποδείχθηκε ότι είναι μια πρωτεΐνη με ένα Mr 70 kDa. Οπτικοποίηση των NJ001 δέσμευσης με έμμεσο ανοσοφθορισμό έδειξε ότι SP70 βρισκόταν στο κυτταρόπλασμα του SPC-Α1. SP70 είναι μια πιθανή βιοδεικτών και θεραπευτικό στόχο για την ανοσοθεραπεία του NSCLC.

Για να διερευνήσουν τη λειτουργία του NJ001 και την αντίστοιχη Ag, χρειάζεται περισσότερη δουλειά για να αξιολογήσει την κλινική εφαρμογή. Επιπλέον, ο γάμος της αναγνώρισης στόχου με τις τεχνολογίες βελτίωσης αντίσωμα τελικά θα μεταφραστεί σε νέες και βελτιωμένες θεραπείες για τους ασθενείς με καρκίνο, παρέχοντας έτσι περαιτέρω υποστήριξη ως προς τη σημασία της συνεχούς μελέτης των NJ001 [7], [37] – [39].

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις προτάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγεία. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων Πείραμα του Πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing (Αριθμός Άδειας: 19A5-2373). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Τα μονοπύρηνα κύτταρα (PBMC) από ηπαρινωμένο περιφερικό αίμα ανακτήθηκαν από υγιείς ενήλικες δότες το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Για τη δοκιμασία ανοσοϊστοχημείας, NSCLC ιστούς (n = 106), SCLC ιστούς (n = 21), οι ιστοί καρκίνωμα μαστού (n = 21), γαστρικό καρκίνο ιστούς (n = 5), ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου (n = 5), των ωοθηκών καρκινικούς ιστούς (n = 5), των ιστών καρκίνου του ήπατος (η = 5), πνευμονικών ιστών pseudotumor (n = 25) και των παρακείμενων ιστών nontumourous πνευμόνων (n = 8) ελήφθησαν από το τμήμα της παθολογίας στο ίδιο νοσοκομείο, μεταξύ Ιουλίου 2009 Ιουνίου 2010 .

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της θεραπεία ανθρώπων του πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, και γραπτή συγκατάθεση ελήφθη επίσης από κάθε συμμετέχοντα.

κύτταρα και κυτταρικές γραμμές

Δέκα διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ή καλλιέργειες (που παρατίθεται στην Εικόνα 1Β) που αντιπροσωπεύουν διάφορους φυσιολογικούς και νεοπλαστικούς ιστούς χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό των αντισωμάτων σε αυτή τη μελέτη. Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την κυτταρική τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών στη Σαγκάη. Ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές SPC-Α1, NCI-H520, ΝΟΙ-Η460, και ΝΟΙ-Η446, του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή καρκινώματος COLO 205 και φυσιολογικό εμβρυϊκό πνεύμονα κυτταρική γραμμή WI-38 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν ) ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA). Ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές Α549, η κυτταρική γραμμή καρκινώματος του μαστού ZR-75-30, η κυτταρική γραμμή καρκινώματος του ήπατος HepG2 καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS. Μονοπύρηνα κύτταρα (PBMC) από ηπαρινωμένο περιφερικό αίμα ανακτήθηκαν από υγιείς ενήλικες δότες (από το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο) με φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας Ficoll-Hypaque.

Δημιουργία McAb

Τα μονοκλωνικά αντισώματα παρήχθησαν ως εξής. Ηλικίας 6-8 εβδομάδων θηλυκούς ποντικούς BALB /c ανοσοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή 1 × 10

6 κύτταρα SPC-A1 τρεις φορές σε ένα διάστημα 3-4 εβδομάδων, τότε σπλήνα κύτταρα υβριδοποιήθηκαν με SP2 /0 (BALB /c ποντίκια μυελώματος κυτταρική γραμμή) σε 50% PEG-4000 (Sigma, USA) αναπτύχθηκαν σε μέσο ΗΑΤ σε RPMI1640 (GIBCO, USA). Τα υπερκείμενα καλλιέργειας υποβλήθηκαν σε διαλογή για αντιδραστικότητα αντισώματος προς WI-38 και τα κύτταρα SPC-A1 χρησιμοποιώντας ένα ζωντανό κύτταρο, στερεάς φάσης ELISA. Τα κύτταρα στόχοι (1 χ 10

5), πρώτα επιστρώθηκαν σε 96 φρεάτια και επωάστηκαν για 18 ώρες έως 24 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2. Το μέσο ανάπτυξης στη συνέχεια αναρροφήθηκε και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 95% αιθανόλη. Οι κυτταρικές μεμβράνες έσπασαν σε Triton Χ-100 για 20 λεπτά και τα κύτταρα στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% BSA για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

Τα θετικά κύτταρα υβριδώματος υποκλωνοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια περιοριστική αραίωση. Μονοκλωνικά κύτταρα υβριδώματος με υψηλό σθένος έναντι κυττάρων SPC-A1 επεκτάθηκαν και μετάγγιση στην κοιλιακή κοιλότητα των ποντικών BALB /c για την παρασκευή των ασκιτών. Οι McAbs καθαρίστηκαν περαιτέρω από τους ασκίτες μέσω χρωματογραφία συγγένειας Πρωτεΐνης Α.

Το θετικό κύτταρο υβριδώματος υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κολχικίνη. Μετά από 10% Giemsa βαφή, παρατηρήσαμε ενδιάμεση πυρηνική κύτταρα και αναλύθηκε η καρυότυπος από το μικροσκόπιο.

Χαρακτηρισμός McAbs

Η σύνθεση βαριά και ελαφριά αλυσίδα από 3 McAbs προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το ISO Strip Kit (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA).

Η έκταση της McAbs δέσμευσης σε διάφορα φυσιολογικά και κακοήθη κύτταρα (που παρατίθεται στην Εικόνα 1Β) προσδιορίστηκαν με 0.1 mL υπερκειμένου καλλιέργειας από θετικά κύτταρα υβριδώματος και 1 × 10

5 κυττάρων στόχων με τη χρήση ELISA για την διαλογή που περιγράφεται παραπάνω, και η παραγωγή του υποστρώματος μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 450 nm.

Έμμεσος ανοσοφθορισμός Ανάλυση

έμμεσος ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε ως εξής. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή επί καλυπτρίδες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 95% αιθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, οι κυτταρικές μεμβράνες έσπασαν σε Triton Χ-100 για 20 λεπτά και αποκλείστηκαν με 5% BSA για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια επωάστηκαν με καθαρισμένο NJ001 (1:80) στους 37 ° C για 1 ώρα. Αυτό ακολουθήθηκε από επώαση με FITC συζευγμένο IgG αίγας-αντι-ποντικού (1:100) για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με Hoechest. αποτελέσματα χρώση ανοσοφθορισμού αποκτήθηκαν με τη χρήση φθορισμού και συνεστιακή μικροσκοπία (Zeiss LSM 710, Γερμανία).

Ανάλυση Western Blot

Για να εκτελέσει την ανάλυση της Western blot, οι κυτταρικές σειρές εννέα αρχικά ραγισμένα από το ρυθμιστικό λύσης RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% ΝΡ-40, 0.25% Na-δεοξυχολικό, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mg /ml απροτινίνη, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM NaF). Στη συνέχεια, 25 μg ολικής πρωτεΐνης από τις κυτταρικές σειρές εννέα υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 12% SDS-PAGE, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF (Amersham Pharmacia Life Science, USA). Μετά από αποκλεισμό με 10% μη λιπαρό γάλα εντός TBST, η μεμβράνη PVDF επωάστηκε με NJ001 (1:300) και ένα αντι-GAPDH αντίσωμα (Zhongshan Biological, Πεκίνο, Κίνα) όλη τη νύχτα στους 4 ° C για να επιβεβαιώσει ισοδύναμη πρωτεΐνη φόρτωση κάθε λωρίδα. Αυτό ακολουθήθηκε από επώαση με συζευγμένο με HRP αίγας-αντι-ποντικού IgG για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη PVDF πλύθηκε περαιτέρω 3 φορές με TBST για 15 λεπτά η κάθε μία, και τελικά αναπτύχθηκε με ECL (Amersham Life Science) σε φιλμ ακτίνων-Χ.

Ανοσοϊστοχημεία

NSCLC ιστούς (n = 106 ), SCLC ιστούς (n = 21), οι ιστοί καρκίνωμα μαστού (n = 21), γαστρικό καρκινικούς ιστούς (n = 5), ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου (n = 5), των ωοθηκών καρκινικούς ιστούς (n = 5), των ιστών καρκίνου του ήπατος ( n = 5), πνευμονικών ιστών pseudotumor (n = 25) και των παρακείμενων ιστών nontumourous πνευμόνων (n = 8) ελήφθησαν από το τμήμα της παθολογίας στο πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. NSCLC ιστών περιλαμβάνεται ιστούς πνευμονικού αδενοκαρκινώματος (n = 58) και πλακωδών ιστούς καρκίνου του πνεύμονα (n = 48). Τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξειδάση υδρογόνου 0,3% για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 30 min αποκλεισμό με φυσιολογικό ορό κατσίκας σε θερμοκρασία δωματίου. NM001 (1:200) εφαρμόστηκε στις μπλοκάρει τμήματα και επωάζεται όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι τομές επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C με HRP-σημασμένο αντίσωμα κατσίκας-αντι-ποντικού IgG (1:2,000) και τα θετικά σήματα κατέστησαν ορατά με ανάπτυξη σε διάλυμα διαμινοβενζιδίνης τετραϋδροχλωρική (DAB). Οι τομές παρατηρήθηκαν κάτω από μια κάμερα CCD Ολύμπου Ax-70 DMC Δηλαδή συνδεδεμένο σε μια οθόνη υπολογιστή.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

κύτταρα SPC-Α1 σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων σε 5.000 κύτταρα ανά φρεάτιο. Προστέθηκαν υπερκείμενα καλλιέργειας από τα θετικά κύτταρα υβριδώματος και κύτταρα SP2 /0. Κατά τις τελευταίες 16 ώρες από τους 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα δονήθηκαν με 0.5 μCi /φρεάτιο [

3Η] θυμιδίνης. ανιχνεύσεις πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκαν με μέτρηση υγρού σπινθηρισμού των συλλεχθέντων κυττάρων. Αποτελέσματα της SPC-Α1 μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρουσιάστηκαν ως την καταμέτρηση ανά λεπτό (cpm).

Soft Αγάρ Δοκιμασία

σχηματισμό

Colony αναλύθηκε με δοκιμασία μαλακού άγαρ. χρησιμοποιώντας την εξαρτώμενη από αγκύρωση, αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα κυτταρική γραμμή SPC-Α1 ως μοντέλο καρκινικού κυττάρου, σύμφωνα με τις διαδικασίες του Χονγκ KW [40]. Εν συντομία, ένα κάτω στρώμα από 0.5% αγαρόζη (Promega, U.S.A.) που περιέχει 2 ml μέσου καλλιέργειας αρχικά στερεοποιήθηκε σε μια πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων. Στη συνέχεια, 2 mL διαλύματος αγαρόζης 0,3% που περιέχει 2 χ 10

4 κύτταρα με διαφορετικές συγκεντρώσεις NJ001 ή MCA2849 (άσχετο McAb) (0, 100, 200, 400, 800, ή 1000 μg /ml) επιστρώθηκε στην κορυφή . Κάθε δόση δοκιμάστηκε εις τριπλούν. Μετά από επώαση στους 37 ° C με

2 ατμόσφαιρα για 2 εβδομάδες 5% CO, οι αποικίες που περιείχαν περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας και ο λόγος αναστολής της αποικίας υπολογίστηκαν ως τους ακόλουθους τύπους: αποδοτικότητα σχηματισμού αποικίας = (μέσος αριθμός αποικιών /μέσος αριθμός κυττάρων ανά εκβάθυνση) × 100%? αναλογία αναστολή του σχηματισμού αποικίας = (1- μέσος αριθμός των αποικιών σε NJ001 ή ομάδα MCA2849 /μέσος αριθμός των αποικιών σε McAb ελεύθερη ομάδα) χ 100%. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές.

Αντι-τετάνου McAb (MCA2849) (Abd Serotec, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε ως αλυσιτελής McAb σε αυτή τη μελέτη.

Ξενομοσχεύματος Πείραμα

Τριάντα θηλυκό BALB /c γυμνά ποντίκια ηλικίας 6 εβδομάδων αγοράστηκαν από τη Σαγκάη SLAC Εργαστήριο ζώων & ΣΙΑ ΕΠΕ (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα SPC-A1 διατηρήθηκαν σε 10% FBS μέσου RPMI1640 μέχρις ότου τα κύτταρα έφθασαν 80% συρροή. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας των ζώων και την Επιτροπή Χρήση της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Στην προκαταρκτική μελέτη, τα κύτταρα SPC-Α1 επωάστηκαν με NJ001 στους 37 ° C σε 5% CO

2 επωαστήρα για 2 ώρες. Έτσι κάθε 200 μl φυσιολογικού ορού που περιέχονται 2 × 10

6 κύτταρα SPC-Α1 και 400 μg NJ001. Η πλευρική μασχάλη 5 γυμνών ποντικών εμβολιάσθηκαν υποδορίως με το διάλυμα, και η ομάδα ελέγχου, που αποτελείται επίσης από 5 ποντικούς, εγχύθηκαν τις ισοδύναμες κύτταρα SPC-A1 στην ίδια θέση. Μετά από τρεις εβδομάδες από τον εμβολιασμό, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι ιστοί ελήφθησαν για την H & amp? Χρώση Ε

Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες, με 5 ποντίκια ανά ομάδα.. Η ξενομοσχεύματος ιδρύθηκε με υποδόρια ένεση 2 × 10

6 κύτταρα SPC-A1 /200 μL ανά ποντικό στην πλευρική μασχάλη. Τα αντισώματα χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε 3 διαφορετικές δόσεις (200 μg, 400 μg, ή 800 μg ανά ποντίκι). Η θεραπεία ξεκίνησε ταυτόχρονα με την εμφύτευση και αποτελούνταν από δύο βήματα: καθημερινά ένεση για την πρώτη εβδομάδα, ακολουθούμενη από ενέσεις δύο φορές την εβδομάδα για την διαδικασία δύο εβδομάδες. Η ομάδα ελέγχου έλαβε ενέσεις αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού με τον ίδιο τρόπο. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν για το μέγεθος του όγκου σε διαστήματα 4 ημερών. Ο όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε σύμφωνα με την ακόλουθη εξίσωση: Όγκος = πλάτος

2 χ μήκος /2 [28], [41]. Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία τρεις εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. αναστολή της ανάπτυξης του όγκου υπολογίσθηκε από τον τύπο: λόγος αναστολής της ανάπτυξης όγκου = (1-μέσο βάρος όγκου σε ομάδα NJ001 /μέσο βάρος όγκου της ομάδας ελέγχου) χ 100%. τοξικότητα θεραπείας εκτιμήθηκε από τη φυσική εμφάνιση των ζώων

Η &?. Ε χρώση

Οι ιστοί ελήφθησαν μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τα ενσωματωμένα ιστοί κόβονται στη συνέχεια σε 4 μm τομές και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες για Η &?. Ε χρώση

Προσδιορισμός απόπτωσης

κύτταρα SPC-A1 σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα SPC-A1 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς 200 μg /mL NJ001 ή MCA2849 για 24 ώρες και 48 ώρες. Κάθε χρονικό σημείο ελέγχθηκε εις τριπλούν. Οι μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων κατόπιν παρατηρήθηκαν και ο ρυθμός της απόπτωσης προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και επαναιωρήθηκαν σε 500 μL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 10 mmol /L HEPES-NaOH (ρΗ 7.4), 140 mmol /L NaCl, και 2,5 mmol /L CaCl

2 δεσμευτική. Στη συνέχεια, 5 μΐ αννεξίνης V-FITC (Bender MEDSYSTEMS, Αυστρία) και 5 μL διαλύματος ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Bender) προστέθηκαν και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στο σκοτάδι για 15 λεπτά.