Αφηρημένο

Ιστορικό

μικροσωληνίσκων φάρμακα είναι αποτελεσματικά αντικαρκινικά μέσα, κυρίως λόγω της ικανότητάς τους να προκαλούν μιτωτική σύλληψη και μετέπειτα κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, ορισμένα καρκινικά κύτταρα είναι εγγενώς ανθεκτικά ή να αποκτήσουν μια αντίσταση. Η έλλειψη απόπτωσης μετά μιτωτικής σύλληψη θεωρείται ότι συμβάλλει στην αντίσταση στο φάρμακο που περιορίζει την αποτελεσματικότητα των μικροσωληνίσκων-στόχευση αντικαρκινικών φαρμάκων. Γενετική ή φαρμακολογικών παραγόντων που διευκολύνουν επιλεκτικά την απόπτωση των μιτωτικής συνελήφθη κυττάρων που υπάρχουν ευκαιρίες για να ενισχυθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Αναφέρουμε ένα Celastrol φυσικό προϊόν στοχεύει τουμπουλίνης και διευκολύνει την μιτωτική κυτταρικό θάνατο προκαλούνται από φάρμακα μικροσωληνίσκων. Πρώτον, σε ένα μικρό μόριο προσπάθεια διαλογής, εντοπίζουμε Celastrol ως αναστολέας της χημειόταξης των ουδετερόφιλων. Μεταγενέστερες απεικόνισης time-lapse αναλύσεις αποκαλύπτουν ότι η αναστολή των κυτταρικών διεργασιών μικροσωληνίσκων μεσολάβηση, συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης των κυττάρων και μιτωτική ευθυγράμμιση χρωμόσωμα, είναι οι πρώτες εκδηλώσεις που επηρεάζονται από Celastrol. Αποδιοργάνωση, δεν αποπολυμερισμού των μιτωτικών ατράκτων φαίνεται να είναι υπεύθυνη για μιτωτική ελαττώματα. Celastrol επηρεάζει άμεσα τις βιοχημικές ιδιότητες της τουμπουλίνης ετεροδιμερούς

in vitro

και μειώνει το επίπεδο της πρωτεΐνης του

in vivo

. Στο κυτταρικό επίπεδο, Celastrol επάγει μια συνεργιστική απόπτωση όταν συνδυάζεται με τα συμβατικά φάρμακα μικροσωληνίσκους στόχευσης και εκδηλώνει μια αποτελεσματικότητα προς ταξόλη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα. Τέλος, με time-lapse απεικόνιση και παρακολούθηση των κυττάρων αγωγή με φάρμακο μικροσωληνίσκων, δείχνουμε ότι Celastrol επάγει προνομιακά απόπτωση μιτωτικών συνελήφθησαν κυττάρων σε ένα κασπάσης-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτή η επιλεκτική δράση δεν οφείλεται στην αναστολή της γενικής κυτταρικής επιβίωσης ή μιτωτική κινάσες που έχουν αποδειχθεί ότι ενισχύει μικροσωληνίσκων του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από φάρμακα.

Συμπεράσματα και Σημασία

Παρέχουμε αποδείξεις για νέες κυτταρική οδούς που, όταν διαταράσσεται, επιλεκτικά επάγει την απόπτωση των μιτωτικών συνελήφθησαν καρκινικών κυττάρων, προσδιορίζοντας μια πιθανή νέα στρατηγική για την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των συμβατικών μικροσωληνίσκους στόχευση αντικαρκινικών φαρμάκων

Παράθεση:. Jo H, Loison F, Hattori η, Silberstein LE, Yu η Luo HR (2010) Φυσικό Celastrol προϊόντων αποσταθεροποιεί τουμπουλίνης Heterodimer και διευκολύνει Μιτωτικά κυτταρικού θανάτου Διέγερση από μικροσωληνίσκων στόχευση αντικαρκινικά φάρμακα. PLoS ONE 5 (4): e10318. doi: 10.1371 /journal.pone.0010318

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 17 Νοέμ, 2009? Αποδεκτές: 4 Μαρ του 2010? Δημοσιεύθηκε: 23 Απρ 2010

Copyright: © 2010 Jo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Η. Jo υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) Εκπαίδευση Grant HL066987. Η Luo υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις NIH HL085100, AI076471, HL092020, και GM076084 και Έρευνας Μελετητή Επιχορήγηση από American Cancer Society. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι μικροσωληνίσκοι (MTS), νηματοειδή πολυμερή άλφα- και βήτα-τουμπουλίνης ετεροδιμερές, είναι απαραίτητα δομές κυτταροσκελετού που ελέγχουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η κυτταρική διαίρεση, η μετανάστευση, η ενδοκυτταρική μεταφορά και τη σηματοδότηση (για επισκόπηση [1]) . ΜΤ είναι δυναμικές στη φύση και συνεχώς υποβάλλονται σε φάσεις συρρίκνωση και την εκ νέου ανάπτυξη, μια διαδικασία γνωστή ως «δυναμική αστάθεια». Αυτή η δυναμική ιδιοκτησία κρύβεται πίσω από τη συντριπτική πλειοψηφία των ΜΤ-με βάση τις κυτταρικές διεργασίες [1]. Οι συνολικές δυναμική της ΜΤ ποικίλουν σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων και κυτταρικών περιεχομένων και ρυθμίζονται σε πολλαπλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της ίδιας της τουμπουλίνης και αλληλεπιδράσεις με μια ευρεία ποικιλία των ΜΤ πρωτεϊνών σύνδεσης [2], [3], [4] , [5], [6].

Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η πιο δραματική αναδιοργάνωση του ΜΣ συμβαίνει κατά την έναρξη της μίτωσης, όταν οι μεσόφαση ΜΣ αποδιοργανώνεται και repolymerized να σχηματίσουν μιτωτικών ατράκτων. Το συγκρότημα χωροχρονικά και δυναμική συμπεριφορά της μιτωτικής ατράκτου είναι κρίσιμης σημασίας για τη σωστή ευθυγράμμιση και το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων αντιγραφεί, τυχόν αστοχία των οποίων οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο ή γενωμική αστάθεια (για επανεξέταση [7]). Οι μιτωτικές άτρακτοι είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε διάφορα φυσικά και συνθετικά ναρκωτικά ΜΤ που εξασθενούν τη συναρμολόγηση και τις λειτουργίες τους, που οδηγούν σε μιτωτική σύλληψη και μετέπειτα κυτταρικό θάνατο. Λόγω αυτής της δραστικότητας, MT φάρμακα που χρησιμοποιούνται πιο ευρέως για τη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, ορισμένα καρκινικά κύτταρα είναι εγγενώς ανθεκτικά και τα ναρκωτικά εκτεθειμένα τα καρκινικά κύτταρα συχνά αποκτούν μια αντίσταση.

ανακάλυψη και εκμετάλλευση των δομικά διαφορετικών νέων τύπων παράγοντες κατά ενδέχεται να ξεπεράσουν αυτό το πρόβλημα. Για παράδειγμα, η κλινική χρησιμότητα των δομικά διαφορετικών σταθεροποιητών ΜΤ για να ξεπεραστεί η ταξόλη-αντίσταση έχει αναφερθεί [8], [9], [10]. Οι συμπληρωματικές προσεγγίσεις μπορεί να περιλαμβάνουν μια συνδυασμένη αναστολή με άλλους κυτταρικούς παράγοντες, όπως μιτωτικούς κινάσες και κινητικών πρωτεϊνών [11]. Παρ ‘όλα αυτά, δεδομένου οι βασικές λειτουργίες της ΜΤ σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, μερικές μοίρες κυτταροτοξικότητας με τα φυσιολογικά κύτταρα εμφανίζονται αναπόφευκτες.

Έχει αναφερθεί ότι η σχετική αντίσταση των διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών σε κοινές αντιμιτωτικά μέσα συσχετίζεται με έλλειψη κυτταρικού θανάτου παρά μιτωτική σύλληψη [12]. Η διαπίστωση αυτή είναι σύμφωνη τόσο με κλινικές παρατηρήσεις και πειράματα σε ζώα μοντέλο που προσδιόρισε το βαθμό του κυτταρικού θανάτου μετά από αγωγή ταξόλη προσδιορίζεται το συνολικό αποτέλεσμα της αποτελεσματικότητάς της [13], [14]. Ως εκ τούτου, γενετικές ή φαρμακολογικών παραγόντων που διευκολύνουν επιλεκτικά απόπτωση των μιτωτικής συνελήφθησαν κυττάρων (δηλαδή πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα) που υπάρχουν ευκαιρίες για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της MT φάρμακα, με μικρή επίπτωση στο ναρκωτικά εκτεθειμένα ενδιάμεσης κύτταρα (δηλαδή μη διαιρούμενα φυσιολογικά κύτταρα).

Κατά τη διάρκεια της προσπάθειας διαλογή μικρού μορίου (αδημοσίευτο αποτέλεσμα), ταυτοποιήσαμε ένα φυσικό προϊόν Celastrol, παραδοσιακά γνωστή για την αντι-φλεγμονώδη και αντι-καρκινικών δραστηριοτήτων του, ως ένας αναστολέας της χημειοταξίας ουδετερόφιλων. Χρησιμοποιώντας μια σειρά πειραμάτων που περιλαμβάνουν την time-lapse απεικόνιση της κυτταρικής μετανάστευσης και της ευθυγράμμισης χρωμόσωμα καθώς και βιοχημικών και κυτταρικών βιολογικών προσεγγίσεων, αποκαλύψαμε ότι η αναστολή των λειτουργιών του ΜΤ ήταν ένα από τα πρώτα κυτταρικά γεγονότα επηρεάζονται από τη νέα δραστηριότητα τουμπουλίνης-στόχευσης της Celastrol. Δείξαμε επίσης ότι αυτή η μοναδική δραστηριότητα θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για να επάγει απόπτωση των ταξόλη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα, και για τη διευκόλυνση επιλεκτικά το μιτωτικό κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων ΜΤ-φάρμακο συλληφθεί. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν μια μοριακή εξήγηση για την αντι-φλεγμονώδη και αντικαρκινική δράση του Celastrol, και να παρουσιάσει μια πιθανή στρατηγική για να ενισχύσει το μιτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγονται από συμβατικούς μικροσωληνίσκους στόχευση αντικαρκινικών φαρμάκων.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και την παραγωγή του ΤβχοΙ ανθεκτική κυτταρική γραμμή

κυτταρικές σειρές ΗΕΚ293 Τόσο και HeLa λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC), και διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% πενικιλίνη ορό και 1% στρεπτομυκίνη και κάτω από 5% CO

2.

για να δημιουργήσετε ένα ανθεκτικό σε ΤβχοΙ κυτταρική γραμμή, κύτταρα HeLa που εκφράζουν σταθερά την EGFP σε σύντηξη με ιστόνη 2Β δημιουργήθηκαν. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε 60 τρυβλίο mm-καλλιέργειας (1 × 10

6) με την παρουσία 0.5 ηΜ της ταξόλης. Μετά από 72 ώρες, τα ζωντανά κύτταρα συλλέχθηκαν και επανα-επιστρώθηκαν παρουσία της ίδιας συγκέντρωσης του φαρμάκου. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές για μια δεδομένη συγκέντρωση φαρμάκου. Η συγκέντρωση της ταξόλης αυξήθηκε βαθμιαία σε μία τελική συγκέντρωση 5 ηΜ. Τα ανθεκτικά κύτταρα χαρακτηρίζονται ως Η2Β-TxR διατηρήθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν σε παρουσία 5 ηΜ ταξόλης.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Celastrol αγοράστηκε από EMD Biosciences και όλα τα άλλα χημικά εκτός εάν ορίζεται ήταν από την Sigma Aldrich και Tocris Bioscience. Mouse μονοκλωνικά αντισώματα για γάμμα-τουμπουλίνη (T3320), αλφα-τουμπουλίνης (T6199), και βήτα-τουμπουλίνη (T4026) ήταν από την Sigma Aldrich? Κουνέλι πολύκλωνα αντισώματα για άλφα τουμπουλίνης (ab18251) και βήτα-τουμπουλίνης (ab6046) ήταν από Abcam. Οι συζευγμένο με HRP δευτερογενή αντισώματα αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού ήταν από την Amersham Biosciences? Όλα τα άλλα αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology.

καθαρισμό και ουδετερόφιλων EZ-taxiscan δοκιμασία χημειόταξης

Ανθρώπινα ουδετερόφιλα περιφερικού αίματος καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Ο θάλαμος EZ-taxiscan (ενεργού κυττάρου Institute, Tokyo, Japan) συναρμολογήθηκε με ένα ευρύ 260 μm × 4 μm πάχους τσιπ πυριτίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο αναστολέας επεξεργασμένα ουδετερόφιλα (3 × 10

6 /ml) αναμίχθηκαν σε RPMI (0,1% BSA) και φορτώθηκαν στον κάτω θάλαμο (3000 κύτταρα ανά φρεάτιο). Ένα μικρολίτρο fMLP (100 ηΜ τελική) προστέθηκε στον άνω θάλαμο. Τα μεταναστευτικά ουδετερόφιλα προς το ανώτερο θάλαμο απεικονίστηκαν κάθε 30 δευτερόλεπτα για 20 λεπτά. Η ταινία αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΔΙΑΣ (Solltech, Oakdale, ΙΑ) για τον υπολογισμό της ταχύτητας.

Western blot και immnunostaining.

Προετοιμασία του συνόλου των προϊόντων λύσης των κυττάρων, κηλίδα Western, και άλλο πρότυπο μοριακής βιολογίας τεχνικές ήταν ουσιαστικά η ίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Για την ανάλυση των μιτωτικών πυρήνων, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με την παρουσία 3% PFA (προθερμασμένο) για 5 λεπτά πριν από τη χρώση ϋΑΡΙ. Για ανοσοχρώση των μικροσωληνίσκων, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλίο πυθμένα 35 μμ-γυαλί (MatTek Corp.) και σταθεροποιήθηκαν για 5 λεπτά σε προ-ψυχθέν (-20 ° C) μεθανόλης. Μετά από πλύση τρεις φορές με PBS-Triton Χ-100 (0,05%), οι σταθερές κύτταρα διαπερατά για 30 λεπτά σε 5% κανονικό ορό κατσίκας που περιέχει 0.3% Triton Χ-100. Το αραιωμένο αντίσωμα (1:2000 για την πρωτογενή και 1:1000 για δευτερεύον αντίσωμα) με τον ίδιο διάλυμα προστέθηκε και επωάστηκε για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση τρεις φορές με PBS-Triton Χ-100, το φθόριο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με βαφή Alexa προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η χρώση οπτικοποιήθηκε υπό το φθορίζον μικροσκόπιο (Olympus IX71) και η εικόνα λήφθηκε χρησιμοποιώντας το 100 Χ αντικειμενικό φακό. Για την εξέταση τα ελαττώματα της τοποθέτησης των δύο κεντροσωμάτια σε σχέση με υπόστρωμα σε Celastrol επεξεργασμένα μιτωτικών κυττάρων, δύο εικόνες με διαφορετικά εστιακά επίπεδα, επικεντρώθηκε στην γ-τουμπουλίνης χρώση κάθε πόλου, ελήφθησαν μαζί με αλφα-τουμπουλίνης χρώση στις ατράκτους (Σχήμα S1B).

βιοχημικές δοκιμασίες για τουμπουλίνες

Τα εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα ΗΕΚ293 συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά σε PBS. Το κυτταρικό ίζημα καταψύχθηκε σε ξηρό πάγο για 15 λεπτά και λύθηκαν εντός του ρυθμιστικού διαλύματος δοκιμασίας που περιέχει 0.3% CHAPS, 200 μΜ GTP, και ο αναστολέας πρωτεάσης κοκτέιλ (Sigma Alderich) σε PBS. Το προϊόν λύσης κρατήθηκε σε ξηρό πάγο για 15 λεπτά και αποψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την απόψυξη, το λύμα των κυττάρων φυγοκεντρήθηκε αμέσως στις 14,000 rpm για 5 λεπτά στους 4 βαθμό. το πρόσφατα παρασκευασμένο κυτταρολύματος (2-4 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε μόνο στο

in vitro δοκιμασία

ολιγομερισμού, τυπικά σε έναν όγκο αντίδρασης 50 μΙ. Μετά την προ-επώαση με την παρουσία του φαρμάκου επί 10 λεπτά επί πάγου, το λύμα επωάστηκε στους 37 ° C για 15 έως 60 λεπτά. Η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη ενός ίσου όγκου από 2 ρυθμιστικού Χ LDS και έβρασαν για 5 λεπτά πριν από την SDS-PAGE. Για τη δοκιμασία με το καθαρισμένο τουμπουλίνης (& gt? 99% από την Cytoskeleton, Inc), το διάλυμα τουμπουλίνης αραιώθηκε σε συγκέντρωση 10 μg /ml σε ρυθμιστικό διάλυμα δοκιμασίας, και η αντίδραση πραγματοποιείται ουσιαστικά το ίδιο με το προϊόν λύσης κυττάρου. Για ανοσοκαθίζηση, κύτταρα ΗΕΚ293 λύθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό όπως παραπάνω (συνήθως 1 ml ανά 60 mm τρυβλίο καλλιέργειας). Το κυτταρόλυμα διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση και επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά παρουσία διαφόρων φαρμάκων. Το πολυκλωνικό άλφα τουμπουλίνης αντίσωμα (ab18251, Abcam) προστέθηκε (5 μg αντισώματος ανά 1 mg πρωτεΐνης ανά δείγμα) και επωάστηκε για 1 ώρα σε κρύο δωμάτιο πριν την προσθήκη του G Α-αγαρόζη πολτός πρωτεΐνης /(30 μl ανά δείγμα) . Μετά από επώαση για επιπλέον 2 ώρα, το ανοσοσύμπλεγμα πλύθηκε τρεις φορές στο ρυθμιστικό διάλυμα δοκιμασίας παγωμένου στους 4 ° C πριν από SDS-PAGE.

δραστηριότητα κασπάσης, τη βιωσιμότητα των κυττάρων, και η δραστικότητα πρωτεοσώματος δοκιμασία

Η δοκιμασία χρωματομετρική δραστηριότητα κασπάσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ακατέργαστο κυτταρικό εκχύλισμα με την παρουσία του υποστρώματος κασπάσης, Ac-DEVD-ρΝΑ (Biomol International). Τα κύτταρα που κατεργάστηκαν φάρμακο συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά σε PBS. Τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 10 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.1% CHAPS, 50 mM HEPES (ρΗ 8.0), 12.5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, και 5 mM DTT προσφάτως πρόσθεσε. Το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στα 14, 000 rpm στους 4 βαθμό. Το καθαρισμένο προϊόν λύσης (περίπου 200-400 μg πρωτεΐνης) αναμίχθηκε με το Ac-DEVD-ρΝΑ (200 μΜ τελική) σε 100 μΐ όγκο αντίδρασης σε μια 96 φρεατίων πλάκα δοκιμασίας. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C και η δραστικότητα του ενζύμου μετρήθηκε με ανάγνωση της απορρόφησης στα 405 nm για κάθε 1 ώρα χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλάκας (TriStar LB 941, Berthold Technologies). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Για τη μέτρηση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος, ΗΕΚ293 κύτταρα (1 χ 10

6) υποβλήθηκαν σε αγωγή με κάθε χημικών ουσιών (5 μΜ) για 1 ώρα, και λύθηκαν επί πάγου για 15 λεπτά σε 200 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (20 mM TrisHCl, ρΗ 7.5? 150 mM NaCl? 1 mM EDTA? 1 mM EGTA? 1 mM βητα-γλυκεροφωσφορικό? 1% Triton- X100). Μετά την εκκαθάριση συντρίμμια κυττάρων με φυγοκέντρηση στους 4 βαθμό, το εκχύλισμα υποβλήθηκε σε δοκιμασία δραστηριότητας του πρωτεασώματος με τη χρήση της δοκιμασίας χυμοθρυψίνη πρωτεασώματος-Glo ™ (Promega).

Time-lapse απεικόνιση ζωντανών κυττάρων

για τη δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων, κύτταρα HeLa που εκφράζουν ιστόνης Η2Β EGFP (HeLa-Η2Β) τοποθετήθηκαν μέσα σε ένα δίσκο καλλιέργειας 35-mm (4 × 10

5) και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Το μηδέν έγινε χρησιμοποιώντας την άκρη στη μέση του πιάτου και πλύθηκαν μία φορά σε μέσο L15 προθερμασμένο Leibovitz συμπληρωμένο με 0,5% FBS. Μετά από 10 λεπτά επούλωσης στο ίδιο μέσο, ​​το φάρμακο προστέθηκε και η ταινία time-lapse ελήφθη κάθε 15 λεπτά για 150 λεπτά με τη χρήση του λογισμικού IPLab. Η περιοχή μετανάστευση προσδιορίστηκε αφαιρώντας την περιοχή που καταλαμβάνεται από τα κύτταρα κατά τη στιγμή 150 λεπτά, με εκείνη της κατά το χρόνο 0 λεπτό για κάθε φάρμακο. Η σχετική περιοχή της μετανάστευσης ήταν υπολογίζονται ομαλοποίηση κατά της ομάδας ελέγχου (DMSO-θεραπεία). Για μιτωτική ευθυγράμμιση χρωμόσωμα, κύτταρα HeLa-Η2Β απλώθηκαν σε ένα κάτω δίσκο 35 μμ-υάλου σε 20% συρροή και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο L15 Leibovitz συμπληρωμένο με 0,5% FBS. Αμέσως μετά την προσθήκη του κάθε φαρμάκου, τα κύτταρα πρόφαση ταυτοποιήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού και η ταινία time-lapse ελήφθη κάθε 5 λεπτά για 90 λεπτά. Για αποπτωτικό θάνατο των μιτωτικών συνελήφθησαν κύτταρα, κύτταρα HeLa-Η2Β αυξάνεται εκθετικά (ή περίπου 70% συρροή) σε 35 μμ-πιάτο αντικαταστάθηκαν με 2 ml L15 Leibovitz του (0,5% FBS) μέσο που περιέχει 10 ηΜ βινβλαστίνη και καλλιεργήθηκαν για 4 ώρες. Μετά την προσθήκη του κάθε φαρμάκου, η ταινία time-lapse ελήφθη κάθε 15 λεπτά επί 4 ώρες. Η αποπτωτικό θάνατο του μόνο τα «προ-συνέλαβε» μιτωτικά κύτταρα, όπως προσδιορίζονται από γύρο μορφολογία σε χρόνο 0, ήταν σκόραρε και χαρακτηρίζονται ως «μιτωτικής θανάτου» (βλέπε Εικόνα S4). Το μη-μιτωτικοί κυτταρικός θάνατος ορίστηκε ως προσκολλημένα και επίπεδη κύτταρα (φάρμακο εκτίθεται μεσόφαση κύτταρα) πέθαναν μέσα στις επόμενες δύο πλαίσια (εντός 30 λεπτών). Η αποπτωτικό θάνατο των «πρόσφατα συνελήφθη» μιτωτικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της απεικόνισης time-lapse δεν μετρήθηκε. Για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της Celastol στην μιτωτική κύτταρα, που συγχρονίζονται και εμπλουτίζεται μιτωτικά κύτταρα HeLa-Η2Β από το «διπλό θυμιδίνης μπλοκ» [17]. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 20-30% συρροή και καλλιεργήθηκαν για 19 ώρες παρουσία του θυμιδίνης (2 mM), και επωάστηκαν για 10 ώρες χωρίς θυμιδίνης. Το δεύτερο μπλοκ διεξήχθη με καλλιέργεια για 17 ώρες με θυμιδίνη (2 mM). Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν για 5 ώρες χωρίς θυμιδίνη, και το μέσο αντικαταστάθηκε με L15 Leibovitz του (0,5% FBS) μέσο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 4 επιπλέον ώρες πριν από την προσθήκη Celastrol, και η μοίρα της μιτωτικής κύτταρα παρακολουθούνται από time-lapse video.

Αποτελέσματα

Celastrol αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων

Celastrol είναι μια από τις ενεργές ενώσεις που προέρχονται από εκχυλίσματα φυτών που χρησιμοποιούνται παραδοσιακά για τη θεραπεία των συμπτωμάτων φλεγμονής [18]. Πρόσληψη ανοσοκυττάρων στην θέση της φλεγμονής προηγείται ενός καταρράκτη κυτταρικών γεγονότων που οδηγούν σε φλεγμονώδεις αποκρίσεις, και η αναστολή αυτού του ευρέσεως εργασίας μπορεί μετριάσει τα φλεγμονώδεις διεργασίες. Κατά τη διάρκεια ενός μικρού διαλογής μόριο, Celastrol ταυτοποιήθηκε ως ένας αναστολέας των fMLP-χημειοταξίας ουδετερόφιλων (αδημοσίευτα αποτελέσματα). Celastrol έχει δειχθεί ότι αναστέλλουν τη δράση του πρωτεασώματος και διαμορφώνουν την πρωτεΐνη θερμικού σοκ (HSP) 90 μονοπατιού [19], [20], [21]. Επομένως, εξετάσαμε τις επιδράσεις των γνωστών αναστολέων αυτών των οδών, για 17AAG HSP90 και MG132 για πρωτεασώματος, υπό τις ίδιες πειραματικές ρύθμιση. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, τα Celastrol αγωγή ουδετερόφιλα παρουσίασαν μείωση κατά 50% περίπου σε μεταναστεύουν ταχύτητα προς μια κλίση πηγή fMLP (Ταινία S1 και S2). Ωστόσο, καμία ανιχνεύσιμη επίδραση παρατηρήθηκε σε παρουσία άλλων χημικών προϊόντων. Επιπλέον, Gedunin, η οποία έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την οδό HSP90 παρόμοια με Celastrol [20], έδειξε επίσης καμία ανασταλτική επίδραση (Σχήμα 1Α και Β). Επιπλέον, όταν δοκιμάζονται σε ολόκληρη την δοκιμασία προϊόντος λύσης κυττάρου, Celastrol έδειξε μια πολύ μικρή ανασταλτική δράση έναντι του πρωτεασώματος (Σχήμα 1Β). Έτσι, η επίδραση της Celastrol στη χημειοταξία των ουδετερόφιλων δεν προκαλείται από την αναστολή της δραστηριότητας του πρωτεασώματος.

(Α-Β) Celastrol αναστέλλει fMLP προκαλούμενη χημειόταξη ουδετεροφίλου. (Α) Προσφάτως απομονωθέντα ανθρώπινα ουδετερόφιλα περιφερικού αίματος προ-επεξεργασία με κάθε χημικό για 30 λεπτά, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε fMLP-χημειόταξη για 20 λεπτά με τη χρήση της EZtaxiscan. Η πρώτη και η τελευταία εικόνες από τα βίντεο παρουσιάστηκαν για κάθε φάρμακο. fMLP (100 ηΜ), Celastrol (2 μΜ), 17AAG (4 μΜ), MG132 (10 μΜ), και Gedunin (20 μΜ) χρησιμοποιήθηκαν στην υποδεικνύεται συνδυασμό. (Β) Αριστερό πάνελ είναι η ποσοτικοποίηση της ταχύτητας μεταναστεύουν μετά από κάθε φαρμακευτική αγωγή. Δεξιός πίνακας είναι ολόκληρη η κυτταρική ανάλυση λύμα της δραστηριότητας του πρωτεασώματος σε επεξεργασία με κάθε φάρμακο για 1 ώρα. Η συγκέντρωση όλων των χημικών ήταν 5 μΜ. (C-D) Celastrol μειώνει επιθηλιακών κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων. (Γ) Η συρρέοντα κύτταρα HeLa ήταν γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα άκρο. Μετά από 10 λεπτά της ανάκτησης, κάθε φάρμακο προστέθηκε και οι εικόνες time-lapse ελήφθησαν κάθε 15 λεπτά για 150 λεπτά. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες ακόμη του πρώτου (χρόνος 0) και το τελευταίο (χρόνος 150) χρονικά σημεία έδειξαν. Για το δείγμα του «Celastrol-πλύση», τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-αγωγή με Celastrol για 3 ώρα πριν ξύσιμο? και η ταινία time-lapse λήφθηκε σε ένα μέσο χωρίς ναρκωτικά. (Δ) Ποσοτικοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης. παρουσιάστηκε η σχετική έκταση της μετανάστευσης κατά τον έλεγχο (DMSO-θεραπεία). * Υποδηλώνει p & lt?. 0.05 από Student t-test

Η

Στη συνέχεια, θα διερευνηθεί εάν η διαπίστωση αυτή θα μπορούσε να επεκταθεί και σε άλλους τύπους κυττάρων. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ανέστειλε Celastrol TNF άλφα-επαγόμενη εισβολής καρκινικών κυττάρων μέσω αναστολής της έκφρασης του γονιδίου που ελέγχεται από μονοπατιού ΝΡ-κ Β [22]. Ωστόσο, λόγω της μεγαλύτερης διάρκειας έκθεσης στο φάρμακο σε αυτή τη μελέτη, έστω Celastrol επηρεάζονται άμεσα η κινητικότητα των επιθηλιακών κυττάρων δεν μπορούσε να προσδιοριστεί. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε το άμεσο αποτέλεσμα της Celastrol για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση ενός επούλωση πληγών δοκιμασία. Τα κύτταρα σε συρροή Hela ήταν γδαρμένο, και ελήφθησαν time-lapse εικόνες της μετανάστευσης προς την πληγωμένη περιοχή. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά της επί χημειοταξία των ουδετερόφιλων, Celastrol ανέστειλαν αποτελεσματικά την κυτταρική μετανάστευση, κατά μέσο όρο μείωση κατά 60% σε σχέση με τη χρονική πορεία του 150 λεπτά (Ταινία S3 και S4). Για να αποκλεισθεί η πιθανότητα ότι αυτό το ανασταλτικό αποτέλεσμα ήταν λόγω της γενικής τοξικότητας των κυττάρων, έχουμε προ-επεξεργασμένα κύτταρα με Celastrol για 3 ώρες. Κατά την απομάκρυνση του φαρμάκου, η ικανότητα μετανάστευση κυττάρων αποκαταστάθηκε πλήρως, δείχνοντας ότι αυτό ανασταλτική δράση ήταν αναστρέψιμη και δεν προκλήθηκε από τη γενική τοξικότητα (Σχήμα 1 C και D). Παρόμοια με ό, τι παρατηρήθηκε σε ουδετερόφιλα, αναστολή είτε πρωτεασώματος ή HSP90 μονοπάτι δεν είχε καμία ανασταλτική επίδραση στο πλαίσιο της παρούσας πειραματική συνθήκη (Σχήμα 1 C και D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την παρουσία του κυτταρικού στόχου (ες) του Celastrol, ευαίσθητη στην αναστολή του πρωτεασώματος ή HSP90 οδού.

Celastrol εξασθενίζει μιτωτική πρόοδο αναστέλλοντας

ευθυγράμμιση χρωμόσωμα

Η δυναμική και συντονισμένη ρύθμιση της δίκτυο κυτταροσκελετού, όπως νημάτια ακτίνης και μικροσωληνίσκους, είναι κρίσιμη για τη μετάβαση των κυττάρων. Οι ανασταλτικές επιδράσεις στην κυτταρική μετανάστευση και στις δύο χημειοταξία των ουδετερόφιλων και επιθηλιακά επούλωση πληγών προτείνει μια πιθανότητα που Celastrol μπορεί να αλληλεπιδράσει με το δίκτυο κυτταροσκελετό. Κατά τη διάρκεια της μίτωσης, MT δυναμική παίζει κρίσιμο ρόλο στην ευθυγράμμιση και το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Επομένως, εξετάσαμε για ανωμαλίες του ποσοστού των μιτωτικών φάσεων κατά την κατεργασία Celastrol. Ενώ οι DMSO-κατεργασμένα κύτταρα HeLa έδειξε μια παρόμοια αναλογία χρωμοσωμάτων προμεταφασικά, μετάφασης, και ανάφαση /τελόφασης, πάνω από το 70 τοις εκατό των χρωμοσωμάτων στα Celastrol επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν το «προμεταφασικά-όπως ‘φαινότυποι (Σχήμα 2Α). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση του αποτελέσματος αυτού, πραγματοποιήσαμε μια προμεταφασικά-σύλληψη και απελευθέρωση του πειράματος (Σχήμα 2Β). Εμείς συνελήφθησαν πρώτα κύτταρα στο προμεταφασικά με επεξεργασία Νοκοδαζόλη, και τα συνέλαβε κύτταρα συλλέχθηκαν πατώντας την πλάκα. Μετά την αφαίρεση των Νοκοδαζόλη, οι μιτωτικής ατράκτου εκ νέου συναρμολόγηση, που ευθυγραμμίζουν τα χρωμοσώματα στο επίπεδο μετάφασης για τα επόμενα μιτωτική προόδους να συμβεί. Αυτό το πείραμα απελευθερώσεωε διεξήχθη με την παρουσία διαφόρων χημικών ουσιών την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων τους επί των μιτωτικών λειτουργίες ατράκτου. Στην ομάδα ελέγχου, σχεδόν οι μισοί από τους συλληφθέντες κύτταρα έχουν προχωρήσει σε ανάφαση κατά τη διάρκεια 30 λεπτών απελευθέρωσης (επώασης) περίοδο. Ωστόσο, με την παρουσία του Celastrol, η πλειονότητα των κυττάρων συνελήφθησαν στην προμεταφασικά, ενώ η αναστολή της HSP90 δεν είχε καμία επίδραση. Η αναστολή του πρωτεασώματος με MG132 ελαφρώς συσσωρευμένα κύτταρα στη μετάφαση (Σχήμα 2Β). Για την επικύρωση περαιτέρω αυτές τις παρατηρήσεις, πραγματοποιήσαμε μια ζωντανή απεικόνιση μιτωτικών κυττάρων (Σχήμα 2C και D). Αμέσως μετά την προσθήκη του κάθε χημική ουσία, τα κύτταρα πρόφαση, όπως προσδιορίζονται από τις συνοπτικές χρωματίδες, απεικονίστηκαν ως αυτά υφίστανται ευθυγράμμιση των χρωμοσωμάτων και διαχωρισμού (Ταινία S5 και S6). Στην ομάδα ελέγχου, οι πρόφαση κύτταρα προχώρησαν σε ανάφαση εντός 60 λεπτών. Ωστόσο, με την παρουσία του Celastrol, δεν κατάφεραν να προχωρήσουν και έμεινε σε ένα προμεταφασικά κατάσταση που μοιάζει. Συνεπής με τα αποτελέσματα από την προμεταφασικά-σύλληψη και απελευθέρωση πείραμα, η αναστολή της HSP90 δεν είχε εμφανή ελαττώματα. Είναι αξιοσημείωτο ότι μια μακροπρόθεσμη αναστολή της HSP90 θα επηρεάσει μιτωτική πρόοδο αλλοιώνοντας τα centrosomal λειτουργίες [23], [24], [25]. Ωστόσο, σύμφωνα με αυτό το σύντομο χρονικό διάστημα της κατάστασης αναστολής, δεν ανιχνεύθηκε προφανές ελάττωμα. Όπως αναμενόταν, η αναστολή της πρωτεασώματος καθυστέρησε την εξέλιξη να ανάφαση, αφού δραστηριότητά της είναι απαραίτητη για χρωμόσωμα διαχωρισμού (Σχήμα 2C και D).

(Α) ΗΕΚ293 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Celastrol (2 μΜ) για 1 ώρα πριν στερέωση και χρώση με ϋΑΡΙ. Τα μιτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν και βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με χρωμοσωμική μορφολογία τους. Η αναλογία κάθε μιτωτικών στάδιο επί του συνολικού αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν παρουσιάστηκε. κύτταρα (Β) HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Νοκοδαζόλη (100 ηΜ) επί 6 ώρες. Τα συνελήφθησαν κύτταρα συλλέχθηκαν πατώντας την πλάκα, πλύθηκαν σε PBS, και απλώνονται εκ νέου σε ένα ελεύθερο ορού μέσο. Μετά από 15 λεπτά προσάρτησης (χρόνος 0), το κάθε φάρμακο προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά πριν από καθήλωση και χρώση με ϋΑΡΙ. Ο μέσος αριθμός των κυττάρων σε κάθε στάδιο από τετραπλούν δείχθηκε. «ND» δηλώνει τη μη-μιτωτική ή νεκρά κύτταρα. κύτταρα (C) Hela υπερεκφράζουν πρωτεΐνη EGFP-Η2Β υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνύεται φάρμακα. Αμέσως μετά την προσθήκη του φαρμάκου, οι πρόφαση κύτταρα ταυτοποιήθηκαν και οι εικόνες time-lapse ελήφθησαν κάθε 5 λεπτά για 90 λεπτά. Οι μεγεθύνεται ακόμα εικόνες από τις αντιπροσωπευτικές ταινίες προβλήθηκαν. (Δ) Η περίληψη των ταινιών time-lapse για μιτωτική ευθυγράμμισης των χρωμοσωμάτων σε C). Ο βαθμός της προόδου της μιτωτικής προφάσης κυττάρων σε 60 λεπτά παρουσία του κάθε χημικού προσδιορίστηκε με βάση την χρωμοσωμική σχήμα, και υποδείχθηκε από οριζόντια ράβδο. Οι αριθμοί δείχνουν τον αριθμό των κυττάρων που εξετάστηκαν. Τα αντιπροσωπευτικά χρωμοσωμικές σχήματα των κυττάρων ελέγχου σε διάφορα στάδια της μιτωτικής παρουσιάστηκαν στο κάτω πίνακα ως αναφορά.

Η

Celastrol αποδιοργανώνει μιτωτικής ατράκτου

Για την καλύτερη κατανόηση των επιπτώσεων της Celastrol σε κυτταρικό επίπεδο , εξετάσαμε αν η δομή του ΜΤ επηρεάστηκε σε επεξεργασμένα κύτταρα. Παραδόξως, σε συγκέντρωση Celastrol (2-4 μΜ) που ανέστειλαν την κυτταρική μετανάστευση και την ευθυγράμμιση χρωμόσωμα, βρήκαμε ένα σχετικά άθικτο δομή ΜΤ σε μεσόφαση κύτταρα (Σχήμα 3Α και Β). Ωστόσο, μια σημαντική αποδιοργάνωση του μιτωτικής ατράκτου παρατηρήθηκε σε μιτωτικά κύτταρα (Σχήμα 3 Α και Β). Κατά τη διάρκεια της προμεταφασικά, οι μιτωτικές ατράκτους και οι σχετικές κινητήρα πρωτεΐνες βοηθούν align χρωμοσώματα στο επίπεδο μετάφαση. Σε αυτό το στάδιο, εκτός από το centrosomal εντοπισμού, γ-τουμπουλίνης είναι επίσης εντοπισμένη στις ατράκτους για να βοηθήσουν τη συναρμολόγηση τους [1]. Σε επιθηλιακά κύτταρα, ο μιτωτικής ατράκτου συναρμολογείται παράλληλα με υπόστρωμα [26]. Σύμφωνα με αυτή την έκθεση, στα περισσότερα από τα κύτταρα HeLa ελέγχου (95%, n = 25), δύο κεντροσωμάτια ως ορατό με χρώση γάμμα-τουμπουλίνης παρατηρήθηκαν στο ίδιο εστιακό επίπεδο 100 χ αντικειμενικού φακού (Σχήμα 3Α και Σχήμα S1 Α). Ωστόσο, σε Celastrol-επεξεργασμένα κύτταρα, η άτρακτος εντοπισμός του γ-τουμπουλίνης ήταν σημαντικά καταργήθηκε (93%, n = 42/45) και του επιπέδου των δύο πόλων σε σχέση με υπόστρωμα ήταν σοβαρά παραμορφωμένη, αφήνοντας δύο κεντροσωμάτια δύσκολα στο ίδιο εστιακό αεροπλάνο (78%, n = 35/45), ή τοποθετώντας τα δίπλα στο άλλο (22%, n = 10/45) (Σχήμα 3Β και Σχήμα S1B). Τα ελαττώματα αυτά φαίνεται να είναι διαφορετικές από εκείνες που προκαλούνται από βινμπλαστίνη, ένα ΜΤ depolymerizer, ή ταξόλη σταθεροποιητή ΜΤ, οι οποίες επηρεάζουν κυρίως πολυμερισμό /αποπολυμερισμό της ΜΤ (σχήμα 3C και D). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι Celastrol αποδιοργανώνει τις μιτωτικές ατράκτους χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό μηχανισμό.

Ο εκπρόσωπος ανοσοχρώση μικροσωληνίσκων (α- τουμπουλίνης) και κεντροσωμάτων (γάμμα-τουμπουλίνης) της ατράκτου μεσόφαση και τη μορφολογία των κυττάρων HeLa μιτωτικού θεραπεία για 1 ώρες με τις υποδεικνυόμενες φάρμακα? Celastrol (4 μΜ), βινβλαστίνη (10 ηΜ), και ταξόλη (10 ηΜ).

Η

Celastrol προκαλεί δομικά ελαττώματα της τουμπουλίνης

in vitro

και μειώνει το επίπεδο του

σε vivo

η

Οι Celastrol που προκαλείται από λειτουργικές ανωμαλίες του ΜΣ θα μπορούσε να προκληθεί από την αναστολή πολλών κυτταρικών παραγόντων. Δοκιμάσαμε μια πιθανότητα ότι η τουμπουλίνη η ίδια θα μπορούσε να είναι ένας άμεσος στόχος. Εκτός από καθιερωμένη πολυμερισμού του

in vitro

, η οποία απαιτεί μια υψηλή συγκέντρωση (πάνω από 1-2 mg /ml) και GTP, το ετεροδιμερές τουμπουλίνης εκδηλώνεται μια ποικιλία άλλων βιοχημικών ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της GTP-ανεξάρτητο ολιγομερισμού , ενδο- και δια-μοριακών δισουλφιδικό δεσμό, μη δισουλφιδικό δεσμό διασταυρούμενη σύνδεση, και μη-ενζυματική διάσπαση [27], [28], [29], [30], [31]. Εξετάσαμε εάν Celstrol θα μπορούσε να επηρεάσει οποιαδήποτε από αυτές τις βιοχημικές ιδιότητες. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η επώαση καθαρισμένου τουμπουλίνης οδήγησε σε ολιγομερισμό (ή συμπλοκών υψηλού μοριακού βάρους) ανιχνεύσιμο σε μη-αναγωγικές συνθήκες (Σχήμα 4Α). Η πλειονότητα, αλλά όχι όλα από αυτά τα ολιγομερή εξαφανίστηκε σε ένα αναγωγικό κατάσταση (Σχήμα S2A). Τα ποσά των υπόλοιπων ολιγομερών τουμπουλίνης ήταν μεταβλητή σε κάθε πείραμα και μπορεί να αντιπροσωπεύει SDS-ανθεκτικό και μη-δισουλφιδικά διασταυρωμένα τουμπουλίνες [31]. Η προσθήκη του GTP, η οποία σταθεροποιεί την δομή της τουμπουλίνης, αλλά όχι ΑΤΡ, αύξησε το επίπεδο των ολιγομερών σε δύο προϊόντα λύσης ΗΕΚ293 κυττάρων και καθαρισμένου τουμπουλίνες, υποδεικνύοντας αυτή ολιγομερισμού μπορεί να απαιτήσει κάποιο βαθμό δομικής σταθερότητος (Σχήμα S2B). Χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία με κυτταρικό λύμα ΗΕΚ293, βρήκαμε ότι Celastrol ανέστειλε το σχηματισμό ολιγομερών τουμπουλίνης, ενώ 18 βήτα-γλυκυρρετικού οξύ (18-βGCA), ένα τριτερπενίου δομικά όμοια με Celastrol, έδειξε μια πολύ ασθενέστερη ανασταλτική επίδραση (Σχήμα 4Α). Ένα παρόμοιο ανασταλτικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης όταν καθαρίζεται τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα S3).

(Α) κυτταρολύματα ΗΕΚ293 επωάστηκαν με την παρουσία του την ενδεδειγμένη ποσότητα του Celastrol ή 18-βήτα GCA για 15 λεπτά πριν από την SDS-PAGE σε μη αναγωγικές συνθήκες. Η μεμβράνη κηλιδώθηκε με την άλφα-τουμπουλίνης (επάνω) ή αντίσωμα βήτα-τουμπουλίνης (κάτω). (Β) Τα κυτταρολύματα από τον έλεγχο ΗΕΚ293 κύτταρα παρασκευάστηκαν και εξίσου διαιρείται σε τέσσερα διαφορετικά σωληνάρια, και ανοσοκαθίζηση διεξήχθη με πολυκλωνικό α-τουμπουλίνης αντίσωμα σε παρουσία DMSO ή υποδεικνύονται ποσότητες Celastrol. Μετά την SDS-PAGE, το ανοσοσύμπλεγμα κηλιδώθηκε με το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι του α-, β-, ή γ-tubuln. Η ποσότητα του άλφα-τουμπουλίνης (άνω πίνακας) χρησιμεύει ως μάρτυρας φόρτωσης. (Γ) Η ανοσοκαταβύθιση και Western blot πραγματοποιήθηκε όπως στο Β) υπό την παρουσία διαφόρων χημικών ουσιών. (D) Κύτταρα ΗΕΚ293 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναφερόμενες ποσότητες Celastrol για 1 ώρα, και το σύνολο κυτταρολύματα αναλύθηκαν για τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές πρωτεΐνες. Τα ίδια προϊόντα λύσης κηλιδώθηκαν με το αντίσωμα υπόστρωμα φωσφο-CDK (δεξί πάνελ).

Η

Αυτή η ανασταλτική δράση μπορεί να οφείλεται σε αποσταθεροποίηση (δηλ ξεδίπλωμα) του τουμπουλίνες παρουσία Celastrol. Αν αυτή είναι η περίπτωση, τότε Celastrol ενδέχεται να διαταράξει τη διμερή αλληλεπίδραση μεταξύ alph- και βήτα-τουμπουλίνης. Για να εξεταστεί άμεσα η δυνατότητα αυτή, παρασκευάσαμε πρώτα κυτταρολύματα από τον έλεγχο ΗΕΚ293 κύτταρα, και η άλφα-τουμπουλίνης ανοσοκαταβυθίστηκε με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα σε παρουσία διαφορετικών ποσοτήτων Celastrol. εξετάστηκε το επίπεδο των β- και γ- τουμπουλίνης στο προκύπτον ανοσοσύμπλεγμα. Περιέργως, η ποσότητα βήτα-τουμπουλίνης μειώθηκε με τρόπο που εξαρτάται Celastrol δόσης, ενώ εκείνη της γ-τουμπουλίνης παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστη (Σχήμα 4Β). Όταν δοκιμάστηκε υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες, τα άλλα φάρμακα ΜΤ δεν έδειξε τέτοια επίδραση (Σχήμα 4C), υποδεικνύοντας ότι Celastrol μπορεί να επηρεάσει την δομική ακεραιότητα της τουμπουλίνης ετεροδιμερούς.

Η βιογένεση της τουμπουλίνης ετεροδιμερούς ρυθμίζεται στενά, και ο τα κατεστραμμένα τουμπουλίνες υποβάλλονται σε αποικοδόμηση ή ανακύκλωση μονοπάτι που περιλαμβάνει τα τουμπουλίνης ειδικών συμπαράγοντες [32].