Αφηρημένο

χημειοαντίσταση είναι η κύρια αιτία της αποτυχίας της θεραπείας σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Ωστόσο, μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτό το φαινόμενο παραμένει να αποκαλυφθούν. Σε μια προηγούμενη εργασία εντοπίσαμε χαμηλά επίπεδα PKM2 ως υποθετικό δείκτη οξαλιπλατίνη αντοχή σε κυτταρικές σειρές ΗΤ29 CRC, αλλά και σε ασθενείς. Προκειμένου να αξιολογηθεί πώς PKM2 επηρεάζει απάντηση οξαλιπλατίνη στα κύτταρα CRC, θα σιγήσει PKM2 χρησιμοποιώντας ειδικά siRNAs στο ΗΤ29, SW480 και HCT116 κύτταρα. δοκιμή ΜΤΤ έδειξαν ότι PKM2 σίγασης που προκαλείται από την αντίσταση στην ΗΤ29 και SW480 κυττάρων και την ευαισθησία των κυττάρων HCT116. Ίδια πειράματα στα ισογονικών null κύτταρα HCT116 ρ53 και διπλό σίγηση του ρ53 και PKM2 σε κύτταρα ΗΤ29 δεν έδειξε κάποια επίδραση της ρ53. Με τη χρήση trypan κυάνωση και δοκιμών /ΡΙ FITC-αννεξίνης V διαπιστώσαμε ότι PKM2 knockdown σχετίστηκε με μια αύξηση στην βιωσιμότητα των κυττάρων, αλλά όχι με μια μείωση στην ενεργοποίηση της απόπτωσης σε κύτταρα ΗΤ29. μικροσκοπία φθορισμού αποκάλυψε PKM2 πυρηνική μετατόπιση σε απόκριση σε οξαλιπλατίνη σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα HTOXAR3 οξα-ανθεκτικά. Τέλος, με τη χρήση ενός Array qPCR αποδείξαμε ότι οξαλιπλατίνη και PKM2 φίμωσης αλλαγμένη πρότυπα γονιδιακής έκφρασης κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του BMF, η οποία ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα ΗΤ29 σε απόκριση σε οξαλιπλατίνη, σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά όχι σε siPKM2 -HT29 και HTOXAR3 κύτταρα. BMF γονιδιακή σίγηση σε κύτταρα ΗΤ29 οδηγήσει σε μείωση της οξαλιπλατίνη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας αναφέρετε νέα μη γλυκολυτικό ρόλους των PKM2 σε απάντηση γενοτοξική βλάβη και προτείνει BMF ως πιθανό γονίδιο στόχο της PKM2 να συμμετέχουν σε απάντηση οξαλιπλατίνη και αντοχή στα κύτταρα CRC

Παράθεση:. Ginés Α , Bystrup S, Ruiz de Porras V, Guardia C, Musulén E, Martínez-Cardus A, et al. (2015) PKM2 κυτταρικός εντοπισμός εμπλέκεται στην οξαλιπλατίνη Αντίσταση Εξαγορά στην ΗΤ29 Ανθρώπινου καρκίνο του παχέος εντέρου Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 10 (5): e0123830. doi: 10.1371 /journal.pone.0123830

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 16η Σεπτεμβρίου του 2014? Δεκτές: 7 Μαρτίου 2015? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2015

Copyright: © 2015 Ginés et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από beca bianual de la Fundación Όλγα Torres 2008-2009 (https://www.fundacioolgatorres.org/beques_d-investigacio/) για να EMB AGM AA AMC EM JLM

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) παραμένει μία από τις πιο συχνές. αιτίες θανάτου σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Το ποσοστό συνολικής επιβίωσης 5-ετών είναι λιγότερο από 10% σε προχωρημένα στάδια της νόσου θεραπεία και χημειοθεραπεία παραμένει ουσιώδης για αυτούς τους ασθενείς. Παρά τη διαθεσιμότητα νέων θεραπειών στόχου εναντίον του EGFR ή VEGF, συνδυασμοί οξαλιπλατίνη (OXA) με φθοριοπυριμιδίνες παραμένουν τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενη πρώτη γραμμή σχήματα στο μεταστατικό πλαίσιο [1, 2]. Η κυτταροτοξικότητα του OXA παράγεται κυρίως μέσω του σχηματισμού ενώσεων προσθήκης λευκοχρύσου-ϋΝΑ με αποτέλεσμα την μεταγραφή του DNA και αποκλεισμός αντιγραφή. Κατά συνέπεια, ενεργοποιεί διάφορες οδούς σηματοδότησης που οδηγούν στην επιδιόρθωση του DNA ζημιά και /ή την ενεργοποίηση των προγραμμάτων κυτταρικού θανάτου [3], η οποία με τη σειρά της εξαρτάται, μεταξύ άλλων παραγόντων, από την κατάσταση μεταλλάξεων του κατασταλτικού γονιδίου των όγκων ρ53 [4-6]. Ωστόσο, είναι προφανές ότι δεν είναι όλοι οι ασθενείς ωφεληθούν από τη θεραπεία με OXA διεργασίες αντίσταση που αντιπροσωπεύει το κύριο εμπόδιο της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Χημειοαντίσταση με παράγοντες πλατίνας είναι μια πολύπλοκη και πολυπαραγοντική διαδικασία στην οποία διάφοροι μηχανισμοί, όπως η εισροή ναρκωτικών /εκροής τροποποιήσεις, αλλαγές στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA, μείωση της ενεργοποίησης κυτταρικού θανάτου, αυτοκρινείς επιβίωσης σηματοδότησης ή υψηλή δραστηριότητα αποτοξίνωσης θα μπορούσαν να λάβουν μέρος [7-10]. Δυστυχώς, οι περισσότερες από τις μελέτες που αφορούν την αντίσταση φάρμακα λευκόχρυσου έχουν επικεντρωθεί στην σισπλατίνη και την πραγματική βιολογική συμπεριφορά και τους μηχανισμούς ανταπόκρισης σε OXA στην παχέος κύτταρα είναι ως επί το πλείστον άγνωστη.

Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έχουν στρέψει την προσοχή τους στην μεταβολισμός του όγκου των κυττάρων ως μηχανισμός προσαρμογής κυττάρου σε ευαισθησία φαρμάκου [11, 12]. Σε αυτή τη γραμμή, έχουμε βρεθεί σε μια προηγούμενη μελέτη ότι η ισομορφή Μ2 του πυροσταφυλική κινάση του ενζύμου (PKM2) συνδέεται με την απόκτηση αντίσταση OXA σε

in vitro

μοντέλο και ήμασταν σε θέση να μεταφράσει τα αποτελέσματά μας σε μια μικρή ομάδα μεταστατικό ασθενείς CRC που είχαν λάβει OXA /5-FU χημειοθεραπεία [8]. Άλλοι συγγραφείς ανέφεραν ότι η έκφραση και η δραστικότητα PKM2 συνδέεται με σισπλατίνη αντίσταση στο γαστρικό κύτταρα όγκου [13], και καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα με επίκτητη αντοχή σε 5-FU θεραπεία [14]. Αυτά τα γεγονότα δείχνουν ότι το ένζυμο αυτό θα μπορούσε να έχει ένα σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες απόκτησης αντίσταση σε διαφορετικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι μερικές από τις PKM2 βιολογικές λειτουργίες εξαρτώνται από την πυρηνική μετατόπιση του ενζύμου η οποία προωθείται από διαφορετικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως φωσφορυλίωση τυροσίνης [15-17], την ακετυλίωση της λυσίνης [18], ή τροποποίησή της με SUMO [19] σε απάντηση στην παραγόντων EGFR [20], η IL-3 [21] ή Oct-4 [22], αντίστοιχα. Ενώ στην πλειοψηφία των προαναφερθέντων περιπτώσεων PKM2 αποτελέσματα μετατόπιση στη διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, έχει αποδειχθεί ότι μετά από άλλα είδη ερεθισμάτων, όπως βλάβη του DNA ή οξειδωτικό στρες, PKM2 μετατοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων που οδηγεί στην ενεργοποίηση του κυτταρικού θανάτου σε κασπάσες και Bcl-2 ανεξάρτητο τρόπο [23].

στην εργασία παρουσιάζονται εδώ, θελήσαμε να φωτιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί PKM2 που σχετίζονται με την ευθύνη για την απόκτηση αντίστασης OXA σε

in vitro

μοντέλο που περιγράφεται προηγουμένως από εμάς [24]. Όπως θα δειχθεί, η ρύθμιση της έκφρασης PKM2 ευαισθησίας μεταβληθεί OXA όχι μόνο σε αυτό το κυτταρικό μοντέλο, αλλά και σε άλλες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC. Δείχνουμε ότι PKM2 μετατοπίζεται στον πυρήνα σε απόκριση σε γενοτοξικό ζημία που προκαλείται από OXA σε ευαίσθητες, αλλά όχι σε κυτταρικές σειρές με επίκτητη αντίσταση στο φάρμακο και ρυθμίζει το μοτίβο έκφρασης των γονιδίων κυτταρικού θανάτου όπως BMF, η οποία έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των αποπτωτικών και μη-αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Υλικά και Μέθοδοι

Υπεγράφη ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή, και η κλινική έρευνα επιτροπή δεοντολογίας από το Νοσοκομείο Γερμανούς Trias I Pujol παρέχεται έγκριση για τη μελέτη.

οι κυτταρικές σειρές

κύτταρα καρκινώματος κόλου HCT116 και ισογονικούς παραγώγου της με μια στοχευμένη απενεργοποίηση του p53 ήταν ένα δώρο του Δρ Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine). SW480 και ΗΤ29 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Το τελευταίο χρησιμοποιήθηκε ως τα γονικά κύτταρα του οξα-ανθεκτική υπογραμμή HTOXAR3, το οποίο ελήφθη ως αποτέλεσμα της συνεχούς και αυξημένη έκθεση σε OXA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν ως μονοστοιβάδες σε DMEM (ΗΤ29, SW480 και HTOXAR3? Invitrogen, Life Technologies) ή RPMI 1640 (HCT116 και HCT116 ρ53 null? Invitrogen, Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FCS (Reactiva), 400 μονάδες /ml πενικιλλίνης, 40 μg /ml γενταμυκίνης, και 2 mM L-γλουταμίνη (Sigma) και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Τα κύτταρα ελέγχονται περιοδικά για μόλυνση από

Mycoplasma

και οι επικυρώνονται από μικρή διαδοχική επανάληψη προφίλ.

Ναρκωτικά

OXA παρασκευάστηκε σε νερό (1 mM) ως διάλυμα παρακαταθήκης και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Περαιτέρω αραιώσεις του φαρμάκου έγιναν σε μέσο καλλιέργειας σε τελικές συγκεντρώσεις πριν από τη χρήση.

siRNA επιμολύνσεις

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 60% συρροή σε μέσο Optimem ορό και ελεύθερο από αντιβιοτικά (Invitrogen) σε 6 , 12 και 96 φρεατίων, ανάλογα με τα ακόλουθα πειράματα. PKM2 ήταν παροδικά σιγήσει με τη χρήση τριών διαφορετικών siRNAs που στοχεύουν PKM2 (αρ NM_002654?. NM_182470? NM_182471? Ambion). P53 και η αναστολή BMF πραγματοποιήθηκε με πισίνες από 4 διαφορετικά siRNAs (Smartpool On-στόχο plus:

TP53

, # L-003329?

BMF

, # L-004393-00, Dhamacon, GE). Ως παράγοντα μορφομετατροπής Lipofectamine χρησιμοποιήσαμε RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα αρνητικό έλεγχο μεταγραφής σιγαστήρα (Cat Νο AM4611? Ambion) εισήχθη σε κάθε πείραμα. Μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης, το μέσο αντικαταστάθηκε με πλήρες DMEM ή RPMI 1640 μέσα συμπληρωμένα με ορό και αντιβιοτικό. Επικύρωση PKM2, p53 και BMF νοκ ντάουν αξιολογήθηκε με qPCR και κηλίδας Western (WB), μόνο από την Παγκόσμια Τράπεζα και μόνο με qPCR, αντίστοιχα. Σε πειράματα τελειοποιήσουν, siGAPDH 3 nM θετικό μάρτυρα (NM_002046? Ambion) και μη-επιμολυσμένα κύτταρα (Mock) εισήχθησαν για να εξασφαλιστεί ότι η επιμόλυνση είχε ελάχιστες επιπτώσεις στη γονιδιακή έκφραση, τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των κυττάρων (S1 Σχήμα)

κηλίδος Western

τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε RIPA συν ρυθμιστικό [ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS)? ΝΡ-40 1%? Na deoxycolate 0,5%? SDS 0,1%? EDTA 1 mM? NaF 50 mM? NaVO

3 5 mM] που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης χωρίς ΕϋΤΑ (Roche). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford με τη χρήση του BCA Protein Assay Kit (Pierce) και αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο. Είκοσι μικρογραμμάρια πρωτείνης φορτώθηκαν και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 10% γέλες SDS-PAGE (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Bio Rad). Μετά από 1 ώρα αποκλεισμού (licor Biosciences) μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-PKM2 πρωτογενές αντίσωμα (κυτταρική σηματοδότηση? 1: 1000) ή με ένα αντι-ρ53 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Abcam? 1: 500). Κουνέλι μονοκλωνικό αντι-ακτίνης (1: 2000) και-τουμπουλίνης αντι-α αντισώματα ποντικού μονοκλωνικό (1: 15.000) (αμφότερα από την Sigma Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με IRDye κουνελιού και δευτερογενή αντισώματα ποντικού (1: 15.000) (licor Biosciences) για 45 λεπτά προστατευμένο από το φως. Οι μεμβράνες σαρώθηκαν με τη χρήση του συστήματος απεικόνισης Οδύσσεια και αναλύθηκαν με λογισμικό v2.0 Οδύσσεια (licor Biosciences).

qPCR

πειράματα γονιδιακής έκφρασης διεξήχθησαν όπως περιγράφεται σε προηγούμενη εργασία [24]. Ανάδρομης μεταγραφής πραγματοποιήθηκε με MMLV ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκκινητές και ανιχνευτές για PKM2 (δοκιμασία όχι. Hs00762869_s1) και ανάλυση έκφρασης mRNA BMF (Hs.00372938_m1) αγοράστηκαν προσχεδιασμένα από την Applied Biosystems. Το μέγεθος του προϊόντος PCR που δημιουργούνται με αυτά τα εναύσματα ήταν 62 bp για PKM2 και 59 bp για BMF. Σχετική ποσοτικοποίηση έκφρασης γονιδίου υπολογίστηκε σύμφωνα με τη συγκριτική μέθοδο Ct όπως περιγράφεται αλλού χρησιμοποιώντας 18S (Stratagene) ή β-ακτίνης (Applied Biosystems) ως ενδογενή έλεγχο. Σε όλα τα πειράματα, τριπλούν μόνο με μια τιμή Ct μικρότερη από 0,20 SD έγιναν δεκτές. Επιπλέον, για κάθε δείγμα προς ανάλυση, ένας έλεγχος retrotranscriptase μείον διεξήχθη στην ίδια πλάκα για να εξασφαλιστεί απουσία γενωμικού μόλυνση DNA.

ΜΤΤ

Η κυτταροτοξικότητα των OXA αξιολογήθηκε με το 3- ( 4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) βρωμιούχου 2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) δοκιμής. Κύτταρα σπάρθηκαν και επιμολύνθηκαν σε πλάκες μικροτίτλου 96 φρεατίων (Nunc) σε μια πυκνότητα από 1,000 (ΗΤ29 και SW480) και 2000 κύτταρα /φρεάτιο (HCT116). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, OXA προστέθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις? η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε 24 ώρες μετά την επώαση με τη δοκιμασία ΜΤΤ (Roche Diagnostics) [25]. Ανασταλτικές συγκεντρώσεις (ICs, που κυμαίνονται από 10% έως 90% της βιωσιμότητας των κυττάρων) προσδιορίστηκαν σε κάθε κυτταρική σειρά με τη μέθοδο γραμμή μέσου-αποτελέσματος. Τα δεδομένα που αναφέρονται αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Trypan μπλε κηλίδα

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 12 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 15 μΜ OXA για 24 ώρες. Μετά την έκθεση στο φάρμακο κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο DMEM σε μια 1×10 συγκέντρωση

5 κύτταρα /ml. Η κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας βαφή κυανούν τρυπανίου. Δέκα μικρολίτρα 0,05% κυανούν τρυπανίου (Invitrogen) αναμίχθηκε με 10 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος, απλώνεται πάνω σε ένα θάλαμο Neubauer και καλύπτεται με μία καλυπτρίδα. Ενώ βιώσιμα κύτταρα αποκλείουν τη χρωστική ουσία και φαίνεται ημιδιαφανές, μη βιώσιμα κύτταρα εμφανίζονται μπλε χρωματισμένο. Βιωσιμότητα και η θνησιμότητα των τουλάχιστον 3 επαναλήψεις της κάθε πειραματική συνθήκη ποσοτικοποιήθηκαν.

αννεξίνης V /ιωδιούχου προπιδίου δοκιμή

Η απόπτωση προσδιορίστηκε με χρήση Κιτ Ανίχνευσης FITC Αηηβχίη V απόπτωση I (BD Pharmingen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τουλάχιστον 10

4 κύτταρα ανά δείγμα αναλύθηκε με τη χρήση ροής FACS Canto II κυτταρόμετρο (Becton Dickinson Immunocytometry System). Τουλάχιστον 3 επαναλήψεις ανά πειραματική συνθήκη αναλύθηκαν. Θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες (ρυθμιστικό δεσμευτική μόνο, ιωδιούχου προπιδίου (PI) μόνο, FITC-αννεξίνης V μόνο) χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσει τις κατάλληλες συνθήκες για να αντισταθμίσει ανιχνευτές και τεταρτημόρια. Οξα-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μετά από γονιδιακή σίγηση BMF μετρήθηκε με τη χρήση PI. BMF σίγησε χρησιμοποιώντας siRNA που στοχεύει BMF όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά τη θεραπεία οξαλιπλατίνη 72 ώρες, ΗΤ29 κύτταρα συλλέχθηκαν με Accutase (Αρ. A11105-01, Invitrogen) και επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό PBS με συγκέντρωση ΡΙ 3μΜ. Ο φθορισμός ΡΙ προσδιορίσθηκε με ροής FACSCanto II κυτταρόμετρο (Becton Dickinson Immunocytometry System). γονιδιακή σίγηση BMF επιβεβαιώθηκε με qPCR.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για να αξιολογηθεί κύτταρα διανομή του κυτταρικού κύκλου συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 1 ml 70% παγωμένης αιθανόλης και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C για τουλάχιστον 30 λεπτά. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 0.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος 0.1 Μ HCl και επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 37 ° C. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με 2.5 ml PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 1 ml διαλύματος χρώσης ΡΙ (30 μΜ (Applichem)? RNAse Α 200 μg /ml (Sigma)) επί τουλάχιστον 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Ένα ελάχιστο 10000 κυττάρων αναλύθηκε για την περιεκτικότητα σε DNA, χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACS Canto II (Becton Dickinson Immunocytometry System). Η αναλογία των κυττάρων σε G 1, S φάση και G2 /M προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας v9.2 FlowJo Λογισμικού.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

PKM2 υποκυτταρική εντόπιση ανιχνεύθηκε με ανοσοφθορισμό. Μετά από 24 ώρες προσάρτησης σε διαφάνειες θαλάμου κυψελίδας (Millipore), κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με OXA και στερεώνεται σε καλυπτρίδες σε ψυχρή ακετόνη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Blocking και διαπερατότητας έγινε με ΡΒδ-Τ /FBS 10%. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-PKM2 πρωτογενές αντίσωμα (ΟβΙΙ Signaling? 1: 100) για 1,5 ώρα και στη συνέχεια, με αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα Alexa-568 (Invitrogen? 1: 200). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI αντιδραστήριο χρυσού αντιξεθωριάσματος (Invitrogen). Οι καλυπτρίδες παρατηρούνται με ένα μικροσκόπιο φθορισμού Axiovision Ζ1, χρησιμοποιώντας σύστημα Apotome σε 40χ φακό ελαίου εμβάπτισης (Carl Zeiss, Heidelberg, Germany). Πολλαπλές εικόνες ελήφθησαν σε διαφορετικές αποστάσεις εστίασης με τη χρήση z-στοίβαξης (πάχος διάστημα: 0,750 έως 1 μm). Για τον εντοπισμό PKM2 σε διαφορετικά εστιακά βάθη

array qPCR

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου ( qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Ανθρώπου κυτταρικού θανάτου Διαδρομή Finder PCR Array 384 HT (PAH-212Z, SA Biosciences), ένα Array qPCR περιέχει γονίδια θανάτου που σχετίζονται με 84 κυττάρων. Εν συντομία, ολικό RNA συλλέχθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας EZNA ολικό RNA Kit Ι (Omega) και επεξεργάστηκε με ϋΝΑση (Ambion). Το RNA ποσοτικοποιείται με Nanodrop TM ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific). ακεραιότητα του RNA και η έλλειψη γονιδιωματικών μόλυνσης εκτιμήθηκαν με τρέξιμο δειγμάτων σε πηκτώματα 1% αγαρόζης. Ένα σύνολο από 500 ng RNA χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη μεταγραφή με RT

2 First Strand Kit (ΑΕ Biosciences). Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του RT

2 profiler σειρά PCR προαναφέραμε και RT

2 σε πραγματικό χρόνο SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Α.Ε. Biosciences) σε 7900HT γρήγορο σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο (Applied Biosciences) και μετά από κατασκευαστή οδηγίες. Σχετική αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

^ – μέθοδος ΔCt (κύκλος κατωφλίου). της επιλογής των housekeeping γονίδια που δεν παρουσιάζουν μεταβλητότητα μεταξύ πειραματικές συνθήκες που πρέπει να περιλαμβάνονται στη συστοιχία (RPLP0 και ACTB) να ομαλοποιήσει ανέρχεται το cDNA. Τρεις ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις έγιναν.

Η στατιστική ανάλυση

Στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση στατιστικών PASW 18 (IBM), εκτός από την ανάλυση καμπύλες δόσης-απόκρισης, η οποία πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα PRISM4 ( Graphpad Software). Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ IC

50 προσδιορίστηκαν με γραφική παράσταση των καμπυλών δόσης-απόκρισης και η επακόλουθη ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης και δοκιμασία F. δοκιμή U-Mann Whitney χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί διαφορές κατανομής του κυτταρικού κύκλου. Οι συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων πειραματικών συνθηκών qPCR Array και πειράματα έκφρασης BMF διεξήχθησαν μέσω της δοκιμής Τ-Σπουδαστών. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

P & lt? 0

.

05

.

Αποτελέσματα

γονίδιο PKM2 αποσιώπηση αλλάζει OXA ευαισθησία του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα

Σε μια προηγούμενη εργασία βρήκαμε κάτω επίπεδα πρωτεΐνης PKM2 και mRNA έκφραση σε κύτταρα CRC με επίκτητη ανθεκτικότητα σε OXA (HTOXAR3) και σε όγκους από OXA ασθενείς μη ανταποκριθέντες, ιδιαίτερα σε εκείνους με μεταλλαγμένο p53 [8]. Για να εκτιμηθεί η επίδραση της προς τα κάτω ρύθμιση PKM2 με την ανταπόκριση OXA σε γονικά κύτταρα, εμείς ειδικά ανέστειλε την έκφραση του γονιδίου PKM2 χρησιμοποιώντας siRNA ολιγονουκλεοτίδια σε κύτταρα ΗΤ29. Ευαισθησία σε OXA στον έλεγχο (siNTC) και νοκ ντάουν κύτταρα PKM2 (siPKM2) συγκρίθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την αδρανοποίηση των γονιδίων, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με δόσεις κυμαινόμενες OXA 0-30 μΜ. PKM2 knockdown αποδοτικότητα ήταν υψηλότερη από 95% τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης και διήρκεσε για 96 ώρες ή περισσότερο (S1 Εικ). Όπως μπορεί να φανεί στο σχήμα 1, σε κύτταρα ΗΤ29, PKM2 σίγηση οδήγησε σε αύξηση πάνω από 40% στην αντίσταση OXA σε σύγκριση με κύτταρα siNTC (fold = 1,42? Ρ & lt? 0,0001) που επιβεβαιώνει την επίδραση της PKM2 μειορύθμιση στην αντίσταση οξαλιπλατίνη σε αυτά τα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν σε κύτταρα SW480 (fold = 1,61 ρ & lt? 0,0001), αλλά όχι σε HCT116 όπου PKM2 knockdown συνδέθηκε με υψηλότερη ευαισθησία για OXA (fold = 0,80? P = 0,007) (Σχήμα 1). Υποθέσαμε ότι PKM2 επηρεάζεται η απάντηση των καρκινικών κυττάρων να OXA ανάλογα με πρόσθετο παράγοντα /s. Μία μια δυνατότητα θα μπορούσε να είναι η κατάστασης μεταλλάξεων του p53 δεδομένου ότι όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές έχουν ανώμαλη EGFR μονοπάτι σηματοδότησης (ΗΤ29 λιμάνια μεταλλάξεων στο BRAF και PI3K, HCT116 σε KRAS και PI3K και SW480 σε KRAS), αλλά το σημερινό καθεστώς διαφορετικό ρ53 μεταλλάξεων (ΗΤ29 και SW480 είναι p53 μεταλλαχθεί και HCT116 είναι ρ53 κ.β.). Για να καταδειχθεί αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε ένα παράγωγο ισογονιδιακές HCT116 με στοχευμένη απενεργοποίηση του ρ53 (ρ53 HCT116 – /-) [26]. null κύτταρα p53 ήταν πολύ ανθεκτικά σε οξαλιπλατίνη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [27] αλλά η αναστολή της γονιδιακής έκφρασης οδήγησε PKM2 πάλι σε μείωση της αντίστασης οξαλιπλατίνη (σχήμα 2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν μια πιθανή επίδραση όχι, ανάλογα με wt ρ53 αλλά σε κέρδος-of-λειτουργίας (GOF) μετάλλαξη του ρ53. Σύμφωνα με αυτό, περιμέναμε μια αλλαγή στην οξαλιπλατίνη ευαισθησία στα κύτταρα ΗΤ29-siPKM2 μετά την φίμωση της έκφρασης του γονιδίου p53. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, το γονίδιο p53 γκρεμίζω σε κύτταρα ΗΤ29 (siNTC) οδήγησε σε μια μειωμένη αντίσταση σε οξαλιπλατίνη, αλλά κάτω από αυτές τις συνθήκες η έλλειψη έκφρασης PKM2 αυξήθηκε επίσης αντίσταση σε αυτά τα κύτταρα. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο ρόλος των PKM2 σε οξαλιπλατίνη ευαισθησία είναι κυτταρική γραμμή εξαρτώμενη και ότι άλλοι παράγοντες, διαφορετικούς από μεταλλαγμένο ρ53

per se

, αλλά πιθανώς σχετίζεται με την ρ53-μεταλλαγμένη καρκινογόνες πλαίσιο, θα μπορούσε να είναι επηρεάζοντας η διαφορετική συμπεριφορά που παρατηρείται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές μετά από γονιδιακή αποσιώπηση PKM2. Περαιτέρω πειράματα δικαιολογημένη προκειμένου να αποδείξει αυτό το σημείο.

Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης για ΗΤ29, SW480 και HCT116 κυτταρικές σειρές μετά από γονιδιακή σίγηση PKM2 και θεραπεία OXA σε 0-140 μΜ και 0-32 μΜ για 24 ώρες. Καμπύλες αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Κάθετες μπάρες στα γραφικά αντιπροσωπεύουν ± SD. Ένθετα δείχνουν PKM2 inmunoblotting μετά siRNA-σκηνοθεσία αναστολή. Ειδικές τιμές IC50 για οξαλιπλατίνη σε όλες τις συνθήκες που εμφανίζονται στον πίνακα. Οι τιμές IC50 για Mock συνθήκες (χωρίς επιμόλυνση) ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα της siNTC και δεν φαίνονται. * P-τιμές είναι αποτέλεσμα της σύγκρισης με την κατάσταση siNTC.

Η

Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν την IC50 ± SD (μέσες τιμές από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα) για οξαλιπλατίνη για κάθε κατάσταση. Ένθετα δείχνουν PKM2 και p53 inmunoblotting μετά από γονιδιακή αποσιώπηση PKM2. Ειδικές τιμές IC50 για οξαλιπλατίνη σε όλες τις συνθήκες που εμφανίζονται στον πίνακα. Οι τιμές IC50 για Mock συνθήκες (χωρίς επιμόλυνση) ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα της siNTC και δεν φαίνονται. * P-τιμές είναι αποτέλεσμα της σύγκρισης με την κατάσταση siNTC. *

P- αξία

& lt? 0.05. **

P-value & lt?

0,01? ***

P-value & lt?

0.001

Η

γονίδιο PKM2 σίγηση σε κύτταρα ΗΤ29 συνδέεται με μια αύξηση στην βιωσιμότητα των κυττάρων, αλλά όχι με μία μείωση στην απόπτωση μετά από έκθεση OXA

Μετά τον κύριο στόχο μας, θα θέλαμε να γνωρίζουμε εάν η επίδραση του γονιδίου PKM2 αποσιώπηση σχετικά με την αντίσταση οξαλιπλατίνη σε μας

in vitro

μοντέλο, οφείλεται στην αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, σε μείωση της απόπτωσης ή και οι δύο. PKM2 σίγησε σε κύτταρα ΗΤ29 πριν την επεξεργασία τους με 15 μΜ OXA για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα κύτταρα ελέγχου αντιμετωπίζεται με τον ίδιο τρόπο. Με τη χρήση trypan blue χρώση, τα ποσοστά βιωσιμότητας μεταξύ OXA αγωγή (Τ) και μη κατεργασμένα κύτταρα (ΝΤ) υπολογίστηκαν για 0, 24 και 48 φορές ανάκτηση h (μετά τη θεραπεία με oxalplatin, τα κύτταρα αφέθηκαν να ανανήψουν για 0, 24 και 48 h, αντίστοιχα). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη θεραπεία (σημείο 0h ώρα) ανιχνεύθηκε μία σαφής επίδραση του OXA. Κυττάρων πληθυσμός κυττάρων siNTC και siPKM2 μειώνεται προοδευτικά μετά την θεραπεία 48 ώρες. Ωστόσο, η βιωσιμότητα ήταν ελαφρώς υψηλότερη σε κύτταρα siPKM2 συγκριτικά με κύτταρα siNTC σε όλα τα χρονικά σημεία, τα οποία ήταν στατιστικά σημαντική σε 0 h (Σχ 3Α και 3Β). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι PKM2 επηρεάζει απόκριση OXA σε αυτά τα κύτταρα. Για να διερευνηθεί περαιτέρω κατάντη μηχανισμούς που σχετίζονται με PKM2 σχετίζονται αύξηση στην βιωσιμότητα σε απόκριση σε OXA, αναλύσαμε την επίδραση επί της απόπτωσης χρησιμοποιώντας το αννεξίνης V ΡΙ δοκιμασία /διπλή χρώση (Σχήμα 3C). Η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από OXA δεν μεταβάλλει σημαντικά τα επίπεδα της επαγόμενης πρώιμη απόπτωση έως 48 ώρες μετά από συνεχή έκθεση (Σχήμα 2D). Επιπλέον, δεν βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην ενεργοποίηση της απόπτωσης μεταξύ σιγήσει PKM2 και τον έλεγχο των κυττάρων παρουσία OXA αλλά υπήρχε μια τάση που τα κύτταρα siNTC πέθανε σε μεγαλύτερο ποσοστό από ό, τι τα κύτταρα siPKM2. Αυτά τα αποτελέσματα ενισχύουν την ιδέα ότι PKM2 συμμετέχει στην αντίσταση OXA και ότι η απόπτωση δεν είναι η κύρια οδός εμπλέκεται σε κυτταρικό θάνατο ενεργοποιούνται μετά την έκθεση OXA σε αυτή την κυτταρική γραμμή.

Μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία siRNA με 15 μΜ για 24 OXA περίοδος h, παρατηρήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο σε 0, 24 και 48 ώρες μετά το τέλος της έκθεσης στο φάρμακο (0 h αναφέρεται σε κύτταρα σε αγωγή για 24 ώρες? 24 h αναφέρεται σε κύτταρα σε αγωγή για 24 ώρες και αφέθηκε να αναρρώσουν για άλλες 24 h) (Α ) και ποσοτικοποιούνται με βαφή κυανούν τρυπανίου (Β). ενεργοποίηση απόπτωση μετά από 24 και 48 ώρες έκθεσης OXA 10 μΜ προσδιορίστηκε με διπλή χρώση με FITC Annexin V /PI (C) και μετράται ως αναλογία μεταξύ ποσοστών των αποπτωτικών αγωγή (Τ) και μη κατεργασμένα κύτταρα (ΝΤ) (D) . Κάθετες μπάρες στα γραφικά αντιπροσωπεύουν ± SD. *

P-value

& lt? 0.05. ΝΤ: μη-κατεργασμένα κύτταρα. Οπτική μικροσκοπία:. Αντικειμενικός 10χ μεγέθυνση

Η

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου μετά από έκθεση OXA μεταβάλλεται με PKM2 knockdown σε ΗΤ29 αλλά όχι κύτταρα HCT116

OXA έχει αναφερθεί να τροποποιεί την πρωτεϊνική έκφραση και τη σταθερότητα του p53 οδηγεί σε σύλληψη των κυττάρων στο G1 και /ή G2 /M κυρίως ανάλογα με την κατάστασης μεταλλάξεων του [5, 27-29]. Προκειμένου να αξιολογηθεί αν η έκφραση PKM2, όξα και κατάσταση ρ53 μεταλλακτική οδήγησε σε διαφορές στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, μελετήσαμε τη διανομή του κυτταρικού κύκλου σε όλη 72 ώρες σε PKM2 σιγήσει και ΗΤ29 ελέγχου και κύτταρα HCT116 μετά από συνεχή αγωγή με 10 μΜ OXA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν την ίδια κατανομή του κυτταρικού κύκλου, με την παρουσία ή απουσία PKM2, πράγμα που σημαίνει ότι αυτή η πρωτεΐνη δεν έχει καμία επίδραση στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου

per se

. Ωστόσο, OXA επάγεται διαφορετικές αποκρίσεις στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με OXA διατηρήθηκαν κυρίως στην G1 και G2 /M φάσεις κατά τη διάρκεια 72 ώρες συνεχούς έκθεσης στο φάρμακο πλατίνας και PKM2 εκτομή δεν είχαν σημαντική επίδραση στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου. Αντίθετα, η θεραπεία σε κύτταρα ΗΤ29, οδήγησε τους που διατηρείται για S και G2 /M φάσεις κυρίως. Αυτά τα κύτταρα επηρεάστηκαν σημαντικά από PKM2 νοκ ντάουν στα τελευταία 48 και 72 ωρών από την έκθεση (κύτταρα φάσης S: 67,2% siNTC vs 48% siPKM2? P = 0,05? G2 φάσης κύτταρα /Μ: 66,5% siNTC vs 39,7% siPKM2? P = 0.05). κύτταρα siPKM2-ΗΤ29 δεν κατέχει περισσότερο από 24 ώρες σε οποιαδήποτε φάση του κυτταρικού κύκλου, αποφεύγοντας έτσι τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι τα κύτταρα CRC ανταποκρίνονται σε OXA τροποποίηση του κυτταρικού κύκλου τους ανάλογα με την κατάσταση της ρ53 μεταλλάξεων και η έκφραση PKM2.

οι δύο κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν ή /και εκτέθηκαν σε 10 μΜ OXA για 8, 24, 48 και 72 ώρες . Μετά χρώση με ιωδιούχο προπίδιο, η αναλογία των κυττάρων σε φάσεις κυτταρικού κύκλου G1, S και G2 /M μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής και ποσοτικοποιείται με λογισμικό v9.2 FlowJo. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

P-τιμές

≤ 0,05 εκπροσωπούνται ως *.

Η

PKM2 μετατοπίζεται στον πυρήνα σε απάντηση OXA σε ευαίσθητες, αλλά όχι σε κύτταρα ανθεκτικά

Έχει αποδειχθεί ότι γονοτοξικές βλάβη που προκαλείται από υπεριώδη ακτινοβολία και οξειδωτικό στρες διεγείρει PKM2 πυρηνικής μετατόπισης για την προώθηση κυτταρικό θάνατο [23]. Εξαιτίας των φαρμακολογικών χαρακτηριστικών και του μηχανισμού δράσης του OXA, θα ήθελα να ξέρω αν θα μπορούσε να προκαλέσει παρόμοιες αλλαγές στην PKM2 υποκυτταρικό εντοπισμό. Εμείς αντιμετωπίζονται HCT116, ΗΤ29 και HTOXAR3 κυττάρων με διαφορετικές δόσεις του φαρμάκου (1,65, 10 και 30 μΜ) σε όλη 72 ώρες και παρατηρήσαμε PKM2 εντοπισμό χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, στο βασικές συνθήκες PKM2 διανεμήθηκε στο κυτταρόπλασμα όλων των κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν. Ωστόσο, η έκθεση σε OXA που προκαλούνται σημαντικές αλλαγές στη PKM2 εντοπισμό σε HCT116 και κυττάρων ΗΤ29 γραμμές, αλλά εντυπωσιακά, οι αλλαγές αυτές δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HTOXAR3. Παροδική πυρηνική μετατόπιση του PKM2 παρατηρήθηκε σε κύτταρα HCT116 στις πρώτες 24 ώρες μετά την έκθεση OXA 1,65 μΜ. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, PKM2 μεταφέρθηκε και πάλι στο κυτταρόπλασμα. Αυτή τη στιγμή, τα περισσότερα κύτταρα εμφανίστηκε συρρικνωθεί και αποκολλήθηκαν συσχετίζεται με μια αύξηση στην ποσότητα του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από τον de φαρμάκου. Σε κύτταρα ΗΤ29, OXA προκάλεσε προοδευτική και αυξανόμενη πυρηνική συσσώρευση του PKM2 μήκος 72 ώρες τόσο σε 10 ή 30 μΜ. Κύτταρα με PKM2 στον πυρήνα έδειξε ένα σημαντικά αυξηθεί σε μέγεθος και την εμφάνιση μιας Διακοπτόμενης πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης. Σε αντίθεση, PKM2 παρέμεινε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων HTOXAR3 μέσω όλων των θεραπεία χρονικά σημεία σε χαμηλή (10 μΜ) και IC

50 (30 μΜ) δόσεις του παράγοντα πλατίνας. Σημαντικά, τα κύτταρα HTOXAR3 έδειξε λιγότερο χρώση PKM2 από ΗΤ29 κύτταρα που επιβεβαιώνουν τα προηγούμενα αποτελέσματα μας [8]. κύτταρα ΗΤ29 siPKM2 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος της χρώσης αντισώματος ειδικότητας (S2 Εικ).

ανοσοφθορισμού χρώση PKM2 (κόκκινο) καταδεικνύει πυρηνική συσσώρευση σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα μετά την επεξεργασία με OXA σε έναν χρόνο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο αλλά όχι σε κύτταρα ανθεκτικά HTOXAR3. Οι πυρήνες βάφτηκαν με μπλε χρώμα. ΝΤ: μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αντικειμενικό φακό: 40x λάδι κατάδυσης. μπαρ κλίμακα:. 10 μm

Η

Έχει αναφερθεί ότι τα πυρηνικά PKM2 και τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης της β-κατενίνης συσχετίζεται με τους βαθμούς της γλοίωμα κακοήθειας και την πρόγνωση [30]. Άλλοι συγγραφείς έχουν επίσης αναφέρει βασικοκυτταρικό πυρηνικού εντοπισμού PKM2 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές από διαφορετική προέλευση, συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού καρκίνου [31]. Για να επιβεβαιώσετε PKM2 υποκυτταρικού εντοπισμού σε ανθρώπινους όγκους παχέος εντέρου και την πιθανή σχέση της με το σύνολο των β-κατενίνης, αναλύσαμε τις αντίστοιχες immunohystochemical χρώση τους σε μια μικροσυστοιχία ιστό των 41 δείγματα όγκων από μεταστατικό ασθενείς CRC που είχε προηγουμένως χρησιμοποιηθεί από εμάς [8]. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν σαφώς PKM2 κυτταροπλασματική χρώση σε όλους τους όγκους που αναλύθηκαν (S3 Εικ). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτές οι παρατηρήσεις έγιναν με τη χρήση των 2 διαφορετικών αντισωμάτων (βλέπε S1 File). PKM2 και β-κατενίνης ήταν άκρως εκφράζονται σε περισσότερες από τους όγκους που αναλύθηκαν αλλά δεν μπορούσε να βρει καμία θετική συσχέτιση μεταξύ PKM2 και β-κατενίνης πυρηνικού εντοπισμού.

γονίδιο PKM2 αποσιώπηση μεταβάλλει τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων του κυτταρικού θανάτου σε CRC κυτταρικές σειρές σε ανταπόκριση προς OXA

Όπως έχει δειχθεί σε αυτό το έργο, PKM2 μετατοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων ΗΤ29 σε απόκριση σε αυτό το μέσο πλατίνας ενώ σε παράγωγα κύτταρα οξα-ανθεκτικά του δεν το κάνει. Λαμβάνοντας υπόψη τα προηγούμενα αποτελέσματα συσχετίζοντας πυρηνική μετατόπιση του PKM2 και την ενεργοποίηση των οδών κασπάσης-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου [23], μπορούμε εικάζουν ότι PKM2 προάγει μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόκριση σε OXA. Με τη χρήση ενός RT

2 Profiler qPCR Array αναλύσαμε την έκφραση της 84 βασικά γονίδια που σχετίζονται με διαφορετικούς μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου (απόπτωση, νέκρωση και αυτοφαγία), ώστε να διευκρινιστούν οι οποίες μονοπάτι κυτταρικού θανάτου /s ή γονίδιο /s διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε απάντηση OXA και αν το γονίδιο PKM2 σίγηση επηρεάζει τις σχετικές μοτίβα μεταγραφής. Για να γίνει αυτό, ΗΤ29 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ειδικές siRNAs όπως περιγράφηκε πριν, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με OXA 10 μΜ για 48 ώρες ώστε να εξασφαλιστεί υψηλών επιπέδων πυρηνικής PKM2 (Σχήμα 5). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε απόκριση προς OXA ήταν αρκετά διαφορετική μεταξύ των κυττάρων ΗΤ29, siPKM2-ΗΤ29 και HTOXAR3. Όπως αναμενόταν, το ποσοστό των απελευθερωμένης γονιδίων, ως επακόλουθο της έκθεσης OXA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα ΗΤ29 σε σύγκριση με HTOXAR3 από τις 10 μΜ OXA αντιστοιχεί στο IC

50 των ευαίσθητων κυττάρων και περίπου στο IC

25 για κύτταρα HTOXAR3. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα siPKM2 επέδειξε μια «ενδιάμεση» πρότυπο έκφρασης γονιδίων κυτταρικού θανάτου. Όπως φαίνεται καθαρά στο χάρτη θερμότητας στο σχήμα 6Β, μετά τη θεραπεία OXA, το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων siPKM2 ήταν πιο κοντά με εκείνη των κυττάρων HTOXAR3 από με εκείνη των ευαίσθητων κυττάρων. Είκοσι οκτώ αυτών των γονιδίων έδειξε την υψηλότερη (πολλαπλή μεταβολή) ή /και στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των πειραματικών συνθηκών που αναλύθηκαν (Πίνακας 1 και S1 πίνακα). 0.05.