Abstract

Ασθενής προσκόλλησης κυτταρικής επιφάνειας των κυτταρικών σειρών σε επιφάνειες καλλιέργειας ιστού είναι ένα κοινό πρόβλημα και παρουσιάζει τεχνικούς περιορισμούς στο σχεδιασμό των πειραμάτων. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, έχουν διάφορα πρωτόκολλα επίστρωση επιφανείας έχουν αναπτυχθεί. Ωστόσο, μια συγκριτική και ακριβή σε πραγματικό χρόνο μέτρηση της επίπτωσής τους στη συμπεριφορά των κυττάρων δεν έχει διεξαχθεί. Η κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη LNCaP, που προέρχεται από ένα μετάσταση λεμφαδένα ασθενούς, είναι ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο πρότυπο σύστημα για την έρευνα του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, χαρακτηριστικά χαλαρή προσάρτηση των κυττάρων στην επιφάνεια του δοχεία καλλιέργειας ιστού και καλυπτρίδες έχει εμποδίσει τη χειραγώγηση και την ανάλυσή τους και τη χρήση σε λεπτομερή εξέταση υψηλής απόδοσης. Για να βελτιωθεί η προσκόλληση των κυττάρων LNCaP στην επιφάνεια της καλλιέργειας, συγκρίναμε διαφορετικά αντιδραστήρια επίστρωσης (πολυ-L-λυσίνη, πολυ-L-ορνιθίνη, κολλαγόνο τύπου IV, φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη) και συνθήκες καλλιέργειας και αναλύθηκαν οι επιπτώσεις τους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, πρόσφυση, μορφολογία, η κινητικότητα και έκφραση του γονιδίου που χρησιμοποιούν τεχνολογίες σε πραγματικό χρόνο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ινονεκτίνη, πολυ-L-λυσίνη και πολυ-Ε-ορνιθίνη κύτταρα LNCaP βελτιωμένη πρόσφυση και προκάλεσε μεταβολές της κυτταρικής μορφολογίας, όπως αύξηση των πυρηνικών και κυτταρικής περιοχής. Αυτά τα αντιδραστήρια επικάλυψης που προκαλείται επίσης μια υψηλότερη έκφραση του F-ακτίνης και μειωμένη κινητικότητα των κυττάρων. Σε αντίθεση, η λαμινίνη και κολλαγόνο τύπου IV δεν βελτιωθεί η προσκόλληση αλλά προώθησε τη συσσωμάτωση των κυττάρων και επηρεάζονται μορφολογία των κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία της λαμινίνης εμφανίζονται μεγαλύτερη κινητικότητα από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου. Όλες οι συνθήκες επικάλυψης επηρεάζονται σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων? Ωστόσο, δεν επηρέασε την έκφραση των γονιδίων ανδρογόνου υποδοχέα ρυθμιστεί. συγκριτική Τα ευρήματά μας παρέχουν σημαντικές γνώσεις για την επιλογή του ιδανικού αντιδραστηρίου επικάλυψης και τον πολιτισμό τους όρους των καρκινικών κυτταρικών σειρών σε σχέση με την επίδρασή τους στο ρυθμό πολλαπλασιασμού, προσκόλληση, τη μορφολογία, τη μετανάστευση, μεταγραφική απόκριση και ρύθμιση κυτταρική κυτταροσκελετού.

Παράθεση: Liberio MS, Sadowski MC, Soekmadji C, Davis RA, Νέλσον CC (2014) Διαφορικές Επιδράσεις των ιστών Πολιτισμού Επίστρωση υποστρώματα για τον καρκίνο του προστάτη προσκόλληση των κυττάρων, Μορφολογία και Συμπεριφορά. PLoS ONE 9 (11): e112122. doi: 10.1371 /journal.pone.0112122

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 12 του Οκτωβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Liberio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση για τη μελέτη που προβλέπεται από Eskitis Ινστιτούτο Griffith University και το αυστραλιανό προστάτη Cancer Research Centre-Κουίνσλαντ με χρηματοδότηση από την Αυστραλιανή Κυβέρνηση Υπουργείο Υγείας . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πολυκύτταρο οργανισμό ιστούς εξωκυτταρικό χώρο που περιβάλλει τα κύτταρα είναι γεμάτο με ένα πολύπλοκο μίγμα μακρομορίων αναφέρεται ως η εξωκυττάρια μήτρα (ECM). Η ECM αποτελείται από πολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες, όπως λαμινίνη, ινωδονεκτίνη, ελαστίνη, κολλαγόνο, και η σχετική ποσότητα τους είναι συγκεκριμένο ιστό. Αυτές οι πρωτεΐνες ενσωματωμένα σε ένα πολυσακχαρίτη γέλη. [1] Παρά τις αρχικές σκέψεις που εξυπηρετεί απλώς ως ένα ικρίωμα για τα κύτταρα, είναι πλέον γνωστό ότι η ECM δεν είναι απλώς δομικό αλλά διδακτικό, είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση της κυτταρικής συμπεριφοράς και επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό, το σχήμα, τη λειτουργία, τη μετανάστευση, την επιβίωση και την ανάπτυξή τους [2] – [5].

Πολλές από τις πρωτεΐνες ECM έχουν σημαντική λειτουργία προσκόλληση. [1] Τα περισσότερα κύτταρα είναι εξαρτώμενα από αγκίστρωση και πρέπει να συνδεθεί με την ECM, προκειμένου να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν. [6] Οι ιντεγκρίνες είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες με τη μορφή αβ ετεροδιμερή αναπόσπαστο για την προσάρτηση πρωτεΐνη-κυττάρου ECM. Αυτή η αλληλεπίδραση δημιουργεί μια αλληλουχία από ενδοκυτταρικά σήματα που μπορούν επίσης να ελέγχουν διαφορική γονιδιακή έκφραση. [7], [8] Η απόκριση σηματοδότηση σχετίζεται με την μοριακή σύνθεση ECM που αλλάζει ανάλογα με το κύτταρο απόκριση σε μικρο-περιβάλλον τους. [9], [10] Με τον τρόπο αυτό, η ECM είναι σε συνεχή αλλαγή για να διευκολύνει τις απαιτήσεις των κυττάρων του αναπτυξιακή πλαστικότητα. [11] Παρ ‘όλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για τις μοριακές λεπτομέρειες που εμπλέκονται στην μεταγωγή σήματος. Η κυτταρική απόκριση προς τα συστατικά ECM είναι μεταβλητή και εξαρτάται από τις οποίες ιντεγκρίνης υπομονάδες εκφράζονται από τα κύτταρα. Πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν χρησιμοποιήσει διαφορετικές πρωτεΐνες ECM σε ιστοκαλλιέργεια να τροποποιήσουν τη συμπεριφορά των κυττάρων, κυρίως προσκόλληση των κυττάρων. [12] – [15] Ωστόσο, εκτός από την αύξηση συνημμένο, οι πρωτεΐνες επικάλυψης μπορεί να επηρεάσει άλλες πτυχές της κυτταρικής βιολογίας, που επηρεάζουν τα τελικά αποτελέσματα της δοκιμασίας [16]

ανδρογόνου ευαίσθητο ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. κυτταρική γραμμή, LNCaP, είναι ένα από τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα συστήματα μοντέλο σε καρκίνο προστάτη (PCA) έρευνα. Προήλθε από ένα μεταστατικό βλάβης στο λεμφαδένα ενός 50 ετών καυκάσιος αρσενικό το 1977. [17] Ασθενής προσκόλλησης κυτταρικής επιφάνειας των κυτταρικών σειρών είναι ένα κοινό πρόβλημα της έρευνας καλλιέργειας ιστού και παρουσιάζει τεχνικούς περιορισμούς στο σχεδιασμό των πειραμάτων . χαρακτηριστικά αδύναμο προσήλωσή τους στην επιφάνεια των δοχείων καλλιέργειας ιστού και καλυπτρίδες έχουν εμποδίσει τη χειραγώγηση, την ανάλυσή τους και τη χρήση σε εξέταση υψηλής απόδοσης, δεδομένου LNCaP κύτταρα μπορούν εύκολα να αποσπαστούν με μέτριες μηχανικές δυνάμεις όπως η διατμητική τάση ρευστού. Για να βελτιωθεί η προσκόλληση των κυττάρων LNCaP στην επιφάνεια της καλλιέργειας, συγκρίναμε διαφορετικά αντιδραστήρια επίστρωσης (πολυ-L-λυσίνη, πολυ-L-ορνιθίνη, κολλαγόνο IV, ινονεκτίνη, λαμινίνη και) και συνθήκες καλλιέργειας, π.χ. πυκνότητα των κυττάρων, και αναλύθηκαν οι επιπτώσεις τους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την προσκόλληση, την κινητικότητα και τη μορφολογία με έναν αναλυτή κυττάρων σε πραγματικό χρόνο (RTCA). Τα ευρήματά μας είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την επιλογή των ιδανικές συνθήκες αντιδραστηρίων και του πολιτισμού επίστρωση για την κυτταρική σειρά LNCaP σε σχέση με την επίδρασή τους στο ρυθμό πολλαπλασιασμού, προσκόλληση, τη μορφολογία και διάταξη κυτταρική κυτταροσκελετού.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

LNCaP κύτταρα (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε RPMI μέσο ανάπτυξης χωρίς ερυθρό της φαινόλης (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS (Invitrogen) . LNCaP κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν για όχι περισσότερο από 40 περάσματα.

συνθηκών Επίστρωση

Όλα τα αντιδραστήρια επικάλυψης παρασκευάστηκαν όπως συνιστάται από τους κατασκευαστές. Ο όγκος και η συγκέντρωση των ουσιών που χρησιμοποιούνται για την επικάλυψη των φρεατίων ήταν 1,3 μλ λαμινίνη (LAM, 0,5 mg /mL σε H

2O, Invitrogen), 1 μί κολλαγόνου από ανθρώπινο τύπου πλακούντα IV (COL, 1 mg /mL σε H

2O, Invitrogen), 0,4 μί ινωδονεκτίνη (FN, 1 mg /mL σε H

2O, Invitrogen), και 0.32 μι πολυ-L-λυσίνη (PLL, 1 mg /mL σε H

2O, Invitrogen). Αυτά τα αντιδραστήρια επικάλυψης αναμίχθηκαν με H

2O σε έναν συνολικό όγκο 50 μL ανά φρεάτιο ενός 96 φρεατίων πλάκα. 50 μι πολυ-L-ορνιθίνη (ΟΑΠ, 0,01% σε H

2O, Sigma-Aldrich) προστέθηκαν άμεσα στα φρεάτια, και οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε 5% CO

2. Ο χρόνος επώασης για LAM και FN ήταν 4 h χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω. Τα επικαλυμμένα φρεάτια πλύθηκαν μία φορά με DPBS που ακολουθείται αμέσως από κυτταρική σπορά. Ο όγκος των ουσιών επικάλυψης προσαρμόζεται ανάλογα με την περιοχή ανάπτυξης, όταν χρησιμοποιούνται διαφορετικά δοχεία καλλιέργειας.

αναλυτή κυττάρων σε πραγματικό χρόνο (xCELLigence System)

Ο αναλυτής κυττάρων σε πραγματικό χρόνο σύστημα (RTCA) xCELLigence ( Roche Applied Science) περιλαμβάνει τέσσερα κύρια μέρη: ο αναλυτής RTCA, ο σταθμός RTCA SP, το οποίο παραμένει μέσα σε ένα φυτώριο καλλιέργειας ιστού, ο υπολογιστής RTCA με ενσωματωμένο λογισμικό, και ένα 96-καλά E-πλάκα. Το κάτω μέρος του διαθέσιμου 96 φρεατίων E-πλάκα είναι περίπου 80% που καλύπτεται με το χρυσό μικροηλεκτρόδια που παρακολουθούν την ηλεκτρονική αντίσταση, την ανίχνευση φυσιολογικών μεταβολών των κυττάρων. Κύτταρα σε επαφή με το ηλεκτρόδιο θα ενεργήσει ως μονωτές, οδηγώντας σε αύξηση της σύνθετης αντίστασης. Έτσι, οι αλλαγές σύνθετη αντίσταση του ηλεκτροδίου αναλογικά με μεταβολές στον αριθμό, το μέγεθος και την τήρηση των κυττάρων που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα [18], [19].

Οι αλλαγές στην αντίσταση μεταφράζεται ως αδιάστατη όρο

δείκτης κυττάρων

(CI). CI = (Zi-Z0) /15, όπου Zi είναι η αντίσταση σε μεμονωμένο σημείο του χρόνου κατά τη διάρκεια του πειράματος και Z0 είναι η αντίσταση κατά την έναρξη του πειράματος. Έτσι, το CI είναι μια ποσοτική και σύνθετο μέτρο του συνολικού κατάσταση των κυττάρων σε ένα ηλεκτρόδιο που περιέχει καλά [18], [19].

Κατ ‘αρχάς, 100 μλ πλήρους μέσου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για μέτρηση του φόντου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα LNCaP σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων E-πλάκα μη επικαλυμμένα ή επικαλυμμένα με τα υποδεικνυόμενα αντιδραστήρια όπως περιγράφεται παραπάνω σε μια πυκνότητα μεταξύ 9,4 × 10

3 και 6,25 × 10

4 κύτταρα /cm

2 εις τριπλούν. Το E-πλάκα αφέθηκε να επωαστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και τοποθετούνται σε αναγνώστη στον επωαστήρα για συνεχή καταγραφή του δείκτη κυττάρου. Το E-πλάκα επωάστηκε για 96 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2, και η προσκόλληση των κυττάρων παρακολουθήθηκε μέσω του CI για 4 ώρες κάθε 2 λεπτά. Μετά την περίοδο αυτή, η CI μετρήθηκε κάθε ώρα για 92 ώρες.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με επίχρισμα ή χωρίς τις υποδεικνυόμενες αντιδραστήρια σε πυκνότητα 1,25 × 10

4 κύτταρα /cm

2. Η ανάπτυξη σε συνάρτηση με την αύξηση της συμβολής μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το ζωντανό περιεχόμενο του συστήματος IncuCyte HD απεικόνισης κυττάρων (Έσσεν BioScience). Εικόνες ελήφθησαν με 10x στόχου σε διαστήματα από 2 ώρες από 3 ξεχωριστά φρεάτια ανά συνθήκη επικάλυψης, και η μέση ± SD ποσοστών συρροή υπολογίστηκε. Η μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων που καλλιεργούνται για τα διάφορα επιχρίσματα μετρήθηκε με alamarBlue μετά από 96 ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, USA). Η κινητική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με GraphPad Prism (GraphPad Software). Μέσες τιμές των εις τριπλούν υπολογίστηκαν μετά τη διόρθωση υποβάθρου.

Πρόσφυση και ποσοτικοποίηση των μορφολογικών παραμέτρων

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα, μη επικαλυμμένα ή επικαλυμμένα με τα υποδεικνυόμενα αντιδραστήρια σε πυκνότητα 3,12 × 10

4 κύτταρα /cm

2. Μετά από 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες και 96 ώρες τα κύτταρα στερεώθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε πάγο, διαπερατά με 0,2% (ν /ν) Triton Χ-100 /PBS για 10 λεπτά, και χρωματίστηκαν με CellMask Deep Stain Red πλάσματος μεμβράνης (2.5 μg /mL, Invitrogen) και 1 μg /mL ϋΑΡΙ (Invitrogen). Η εκτίμηση της προσκόλλησης κυττάρου διεξήχθη μέτρηση του αριθμού των κυττάρων που παραμένουν συνδεδεμένοι με το πιάτο μετά τα στάδια πλύσης χρησιμοποιώντας το Content System Imaging Οπερέτα Υψηλή (PerkinElmer). Η μορφολογική περιοχή παραμέτρων των κυττάρων και πυρήνες περιοχή ήταν ποσοτικά.

Time-lapse απεικόνιση

Οι επιφάνειες των 6 και /πλάκα καλύφθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω. LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1,58 × 10

4 κύτταρα /cm

2 και παρακολουθήθηκε για 96 ώρες. Κάθε 15 λεπτά μια εικόνα λήφθηκε με ένα ελαφρύ μικροσκόπιο Zeiss Axio Παρατηρητής (στόχος 20 ×) για να ακολουθήσει το σχήμα αλλαγές και τη μετανάστευση κατά τη διάρκεια του χρόνου. Τα βίντεο μπορούν να βρεθούν, όπως βίντεο S1-S6.

Κατανομή των F-ακτίνης

LNCaP κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες χωρίς επικάλυψη και επικάλυψη με τα υποδεικνυόμενα αντιδραστήρια για 24 ώρες και 96 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά, όπως περιγράφεται παραπάνω, που ακολουθείται από χρώση με ροδαμίνη-φαλλοϊδίνη (1:40 Invitrogen) και 1 μg /mL ϋΑΡΙ (Invitrogen). Τα σύμπλοκα ανοσοφθορισμού έγιναν ορατά με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο της Olympus (FV1000 Spectral) χρησιμοποιώντας ένα φακό 60 ×. Οπτική τομής πραγματοποιήθηκε από την απόκτηση μια στοίβα από εικόνες σε διαφορετικά εστιακά θέσεις κατά μήκος του z-άξονα.

Ξυστό πληγή δοκιμασία

κύτταρα LNCaP (3,12 × 10

4 κύτταρα /cm

2) σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων Essen ImageLock (Essen BioScience) μη επικαλυμμένα ή επικαλυμμένα όπως περιγράφηκε προηγουμένως, και αναπτύχθηκαν προς συρροή σε CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα. Μετά από 24 ώρες, η αρχή έγινε με τη χρήση του WoundMaker 96-pin (Έσσεν BioScience). εικόνες πληγή ελήφθησαν κάθε 1 ώρα για 36 ώρες, και τα δεδομένα αναλύθηκαν από το ολοκληρωμένο μετρικό Σχετική πληγή Πυκνότητα μέρος του ζωντανού περιεχομένου IncuCyte σύστημα απεικόνισης κυττάρων HD (Έσσεν BioScience). Το πείραμα έγινε εις τριπλούν.

Ευαισθησία σε σιμβαστατίνη

Η επιρροή του FN, ΟΑΠ και επικάλυψη PLL στην ευαισθησία των κυττάρων προς σιμβαστατίνη διερευνήθηκε. LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν και αναπτύχθηκαν σε 96-φρεατίων E-πλάκες όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις σιμβαστατίνης (Sigma-Aldrich) και να παρακολουθείται κάθε 1 ώρα για 60 ώρες με τη χρήση του συστήματος RTCA. Το IC

50 για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες της θεραπείας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 5 (GraphPad Software).

qRT-PCR

επιφάνειες ενός 6 καλά πλάκα επικαλύφθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και τα κύτταρα LNCaP σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1,05 × 10

4 κύτταρα /cm

2. Μετά από 72 ώρες, το μέσο ανάπτυξης αντικαταστάθηκε με ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο RPMI μέσο (ανδρογόνο εξαντλημένο) ορό (CSS, Invitrogen, USA) συμπληρωμένο με 5% (ν /ν) CSS και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Τέλος, τα κύτταρα LNCaP υπέστησαν κατεργασία με 20% (ν /ν) αιθανόλης ως έλεγχος ή τα ανδρογόνα R1881 (1 ηΜ) και DHT (10 ηΜ) για 30 ώρες.

Το ολικό RNA ελήφθη χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα και η ποιότητα του RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop υν φασματοφωτόμετρο (ThermoFisher Scientific, USA). Δείγματα με 260/280 αναλογία μεγαλύτερη από 2.0 χρησιμοποιήθηκαν για επακόλουθες διαδικασίες. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNAse Amp βαθμού Ι, και 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σύνθεσης cDNA για το κιτ qPCR (Invitrogen). QRT-PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR Green κύριο μείγμα (Invitrogen) χρησιμοποιώντας την 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό SDS2.3 (Applied Biosystems). Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA υπολογίστηκαν με τη μέθοδο ΔΔCt και κανονικοποιούνται σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης του σπιτιού κρατώντας γονίδιο (GAPDH ή RPL32) της αντίστοιχης θεραπείας και υπολογίζεται σε σχέση με το μη επικαλυμμένο αιθανόλη ελέγχου. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Αποτελέσματα

FN, PLO και PLL βελτίωση της προσκόλλησης των κυττάρων-υποστρώματος

Ο αναλυτής κυττάρων σε πραγματικό χρόνο (RTCA) xCELLigence είναι μια ετικέτα χωρίς μεθοδολογία που μετρά ρυθμό πολλαπλασιασμού, προσκόλληση και η μορφολογία με βάση τις αλλαγές της σύνθετης αντίστασης. Οι αλλαγές στην αντίσταση μεταφράζεται ως αδιάστατη όρο

δείκτης κυττάρων

(CI). Πραγματοποιήσαμε RTCA ανάλυση των κυττάρων LNCaP σπάρθηκαν σε φρεάτια προ-επεξεργασμένα με τις διάφορες επικαλύψεις σε πυκνότητες κυττάρου μεταξύ 9,4 × 10

3 – 6,25 × 10

4 κύτταρα /cm

2 σε μια πλάκα 96 φρεατίων, και διερευνηθεί τόσο η φάση προσάρτησης (24 ώρες μετά την επικάλυψη) (Εικ. 1) και η φάση πολλαπλασιασμού (24 ώρες έως 96 ώρες μετά την επικάλυψη) της κυτταρικής καλλιέργειας (Εικ. 2). Θεωρήθηκε ότι η προσκόλληση των κυττάρων από το εναιώρημα επί του υποστρώματος και των αλλαγών που η μορφολογία των κυττάρων που σχετίζεται με αυτή τη διαδικασία είναι οι κύριοι συντελεστές στο CI κατά τις πρώτες 24 ώρες του πειράματος (Σχ. 1). Ως εκ τούτου, η συμβολή του πολλαπλασιασμού στην CI για την περίοδο αυτή θεωρήθηκε οριακή, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι τα κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται κάτω από παρόμοιες συνθήκες εμφάνισε χρόνο διπλασιασμού 36 h. [20] Πράγματι, η σύγκριση των διαφορετικών πυκνοτήτων σπορά του ελέγχου και των αντιδραστηρίων επικάλυψης σε 3,12 × 10

4 κύτταρα /cm

2 σε μια πλάκα 96 φρεατίων μετά από 24 ώρες έδειξε ότι PLL αύξησε την CI με ένα παρόμοιο βαθμό ως διπλασιασμό του αριθμού των σπαρμένα κύτταρα, δηλαδή από 3,12 × 10

4 – 6,25 × 10

4 κύτταρα /cm

2 (Εικ. S1). Σε όλες τις κυτταρικές πυκνότητες, επίστρωση με ινονεκτίνη (FN) είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη CI μετά από 24 ώρες, που ακολουθείται από πολυ-L-λυσίνη (PLL) και πολυ-Ε-ορνιθίνη (ΟΑΠ). PLL και ΟΑΠ αύξησε το CI σε πολύ παρόμοια ποσοστά έως 3.12 × 10

4 κύτταρα /cm

2, ενώ ΟΑΠ μειώθηκε η κλίση σε όλες τις πυκνότητες κυττάρων (Εικ. 2). Η επικάλυψη λαμινίνη (LAM) δεν επηρέασε την CI, σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ το κολλαγόνο τύπου IV (COL) προκάλεσε την CI να αυξάνεται πιο αργά. Είναι ενδιαφέρον, αυτή η σειρά δεν επηρεάστηκε από την αύξηση του αριθμού των σπαρμένων κυττάρων. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι FN, PLL και ΟΑΠ βελτιώθηκε σημαντικά την προσκόλληση των κυττάρων LNCaP, με την πρωτεΐνη ECM είναι ανώτερο από τα πολυ-αμινοξέα.

Τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν για 24 ώρες για να αναλύσει προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος από οι χρονικές κύτταρα προστέθηκαν στα φρεάτια (t = 0) χρησιμοποιώντας ένα αναλυτή κυττάρων σε πραγματικό χρόνο (xCELLigence, Roche). Κάθε σημείο δεδομένων αναπαρίσταται με τη βοήθεια της (n = 3) ± SD.

Η

Τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν για 72 ώρες για να αναλυθούν τα αποτελέσματα των επιστρώσεων σε κύτταρα LNCaP από 24-96 h με πραγματικό -Ώρα αναλυτή κυττάρων (xCELLigence, Roche). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκε στις 24 ώρες για τη σύγκριση των πρανών. Κάθε σημείο δεδομένων αναπαρίσταται με τη βοήθεια της (n = 3) ± SD.

Η

Η φάση πολλαπλασιασμός παρακολουθήθηκε από 24 ώρες μετά την σπορά των κυττάρων σε 96 ώρες (Εικ. 2). Οι κύριοι συντελεστές αυτής της φάσης στις μεταβολές του CI είναι κυτταρικού πολλαπλασιασμού, προσκόλληση και τη μορφολογία. Σε όλες τις πυκνότητες των κυττάρων που ελέγχθηκαν, LNCaP κύτταρα καλλιεργούνται σε LAM εμφανίζεται ένα ποσοστό αύξησης CI που δεν διέφερε από εκείνη του ελέγχου. Σε αντίθεση, τα κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται επί υποστρώματος COL έδειξε μία φάση υστέρησης, όπου ο CI δεν αυξήθηκε έως και 48 ώρες μετά την σπορά, και μία συνολική μείωση του ρυθμού αύξησης CI (Σχ. 2Β-Ε). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν ανεξάρτητα από τον αριθμό των σπαρμένων κυττάρων. Σε όλες τις κυτταρικές πυκνότητες το υπόστρωμα PLL προκάλεσε ανιχνεύσιμη επιβράδυνση στην αύξηση CI. Η ίδια επίδραση ήταν ορατή στην PLO υπόστρωμα στο υψηλότερο σπορά πυκνότητα (6,25 × 10

4 κύτταρα /cm

2, Σχ. 2Ε), ενώ ο ΚΚΠ αυξήθηκε ταχύτερα στην ΟΑΠ-επικαλυμμένο υπόστρωμα σε χαμηλότερες πυκνότητες σποράς (Εικ . 2Α και Β). Εκτός από τη χαμηλότερη πυκνότητα των κυττάρων (9.4 × 10

3 κύτταρα /cm

2), η αύξηση των επιτοκίων CI των κυττάρων που αναπτύσσονται σε FN υποστρώματος ήταν σταθερά υψηλότερες από τον έλεγχο (Σχήματα 2B-Ε.)? ένα αποτέλεσμα το οποίο φαίνεται να επηρεάζεται από την αύξηση του αριθμού των σπαρμένων κυττάρων. Στο σύνολό τους, υψηλές πυκνότητες κυττάρων (& gt? 4,69 × 10

4 /cm

2) επηρέασε αρνητικά την CI όταν τα κύτταρα LNCaP αναπτύχθηκαν σε υποστρώματα επικαλυμμένα με πολυ-αμινοξέα (PLL και PLO), αλλά δεν επηρεάστηκαν με ECM πρωτεΐνες (COL, LAM και FN). Αυτή η παρατήρηση έχει ιδιαίτερη σημασία για τα πειράματα καλλιέργειας κυττάρων όπου ένα υψηλό κύτταρο συρροή είναι επιθυμητή. Επιπλέον, μια πυκνότητα σποράς 9,4 × 10

3 κύτταρα /cm

2 ήταν συνολικά επιζήμια για κυτταρικής καλλιέργειας των κυττάρων LNCaP, με αποτέλεσμα την έλλειψη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η οποία οφειλόταν πιθανώς σε μια σπανιότητα των επαφών κυττάρου-κυττάρου.

Ολοι οι συνθήκες επικάλυψης μειώνεται πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά δεν επηρέασε έντονα LNCaP κυτταρικής βιωσιμότητας

Ο δείκτης κύτταρο είναι ένα συνδυασμένο μέτρο του ρυθμού πολλαπλασιασμού, προσκόλληση και η μορφολογία των κυττάρων. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα των αντιδραστηρίων επικαλύψεως επί κάθε μία από αυτές τις παραμέτρους ερευνήθηκαν ξεχωριστά. Η πυκνότητα των κυττάρων των επικαλυμμένων φρεάτων αυξήθηκε πιο αργά από τα μη επικαλυμμένα φρεάτια. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε FN, PLL, PLO και LAM εμφανίζεται παρόμοια ποσοστά αύξησης (Εικ. 3Α). κολλαγόνου τύπου IV ήταν η ουσία επίστρωση που επηρέασαν αρνητικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό περισσότερο. Εξέταση της βιωσιμότητας /μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων LNCaP αναπτύχθηκαν για 96 ώρες για τα διάφορα υποστρώματα επίχρισης με δοκιμασία alamarBlue αποκάλυψε ότι όλα τα αντιδραστήρια επικάλυψης μειώνεται η βιωσιμότητα των κυττάρων, με COL ελαφρώς χειρότερη από τις άλλες επιστρώσεις (Σχ. 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν παρόμοιο με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν για καλά συρροή σε διαφορετικές επιστρώσεις (Εικ. 3Α). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αντιδραστήρια επικάλυψης που επηρεάζονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη δραστηριότητα του μεταβολισμού των κυττάρων LNCaP.

κύτταρα LNCaP σπάρθηκαν στα 1,25 χ 10

4 κύτταρα /cm

2 σε πολυστυρόλιο 96 φρεατίων -plate μη επικαλυμμένα ή επικαλυμμένα με πολυ-Ε-ορνιθίνη, πολυ-L-λυσίνη, κολλαγόνο τύπου IV, λαμινίνη ή ινωδονεκτίνη. (Α) Wells συμβολή παρακολουθούνταν κάθε 2 ώρες για 96 ώρες με τη χρήση του συστήματος IncuCyte. (Β) Μεταβολική βιωσιμότητα δραστικότητα /κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία alamarBlue μετά από 96 ώρες. Κάθε σημείο δεδομένων αναπαρίσταται με τη βοήθεια της (n = 3) ± SD. Σημαντικά αποτελέσματα (p & lt? 0,05). Σημειώνονται με αστερίσκο

Η

COL και προκάλεσε LAM κύτταρα LNCaP να συναθροιστούν

IncuCyte εικόνες αποκάλυψαν ότι τα κύτταρα LNCaP συνδέθηκαν στην επιφάνεια σε όλες τις επίστρωση συνθήκες μετά από 24 ώρες (Σχ. 4Α). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φρεάτια προ-επικαλυμμένα με FN, PLL, ΟΑΠ, LAM, καθώς και ο έλεγχος επέδειξαν παρόμοια με ινοβλάστη σχήμα τυπικό για τα κύτταρα LNCaP. [21] Σε αντίθεση, τα κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν επί COL είχε ένα σχήμα στρογγυλεμένο. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε COL και LAM έτειναν επίσης να συναθροιστούν. Επιπλέον, τα φρεάτια επικαλυμμένα με LAM και FN περιείχε περισσότερα στρογγυλά κύτταρα σε σύγκριση με τα άλλα υποστρώματα επίχρισης (Σχ. 4Α). Το ίδιο παρατηρήθηκε μετά από 96 ώρες (Εικ. 4Β). Μετά από 96 ώρες, τα περισσότερα κύτταρα απέκτησε ατράκτου σχήμα σε όλες τις συνθήκες επίστρωσης. Κύτταρα για COL μεγάλωσε σε αδρανή υλικά σε 96 ώρες (Εικ. 4Β).

LNCaP κυττάρων απεικονίστηκαν μετά από 24 ώρες (Α) και 96 ώρες (Β) με το σύστημα IncuCyte, 10 ×. Κλίμακα bar = 300 μm. (C) Στιγμιότυπα από την 96 η time-lapse μικροσκοπία βίντεο των κυττάρων LNCaP. Τα βέλη δείχνουν ελασματοπόδια της πολωμένα κύτταρα. μπαρ κλίμακας = 50 μm (20 ×, Zeiss Axio Παρατηρητής).

Η

Για να διερευνηθεί η επίδραση των αντιδραστηρίων επίστρωση για την κινητικότητα των κυττάρων και της μορφολογίας πιο λεπτομερή σε πραγματικό χρόνο, τα κύτταρα LNCaP μελετήθηκαν με μεγάλη μεγέθυνση time-lapse μικροσκοπία. Παρόμοια με το πείραμα IncuCyte, μικροσκοπία time-lapse έδειξε ότι COL και LAM (Εικ. 4C) προκάλεσε LNCaP κύτταρα να σχηματίσουν συσσωματώματα. Επιπλέον, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φρεάτια LAM-επικαλυμμένα επέδειξε την παρουσία πολυάριθμων πολωμένα κύτταρα, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία ασύμμετρων κυττάρων. Οι PLL- και ΟΑΠ-επεξεργασμένα δείγματα παρουσίασαν παρόμοια μορφολογία σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ωστόσο, LNCaP σπέρνεται σε αυτά τα υποστρώματα φάνηκε να αποδίδουν γρηγορότερα από τα κύτταρα ελέγχου και μεταναστεύουν λιγότερο. Βίντεο από το time-lapse μικροσκοπία σε μια περίοδο 96 h μπορεί να βρεθεί σε βίντεο S1-S6.

κύτταρα LNCaP αποδίδουν καλύτερα σε επιφάνειες επικαλυμμένες με FN, PLO και PLL, οι οποίες επηρεάζουν επίσης μορφολογία κυττάρων

Συνημμένο και η μορφολογία των κυττάρων, τα οποία συνθέτουν μέρος της CI, ερευνήθηκαν από υψηλή περιεκτικότητα σε διαλογή (HCS). HCS κυττάρων LNCaP μετρηθεί μια σημαντικά υψηλότερη πυκνότητα κυττάρου (καλύτερη προσκόλληση) μετά από προ-επεξεργασία των φρεατίων με ΟΑΠ ή PLL σε σύγκριση με τον έλεγχο, FN, COL ή LAM σε όλα τα χρονικά σημεία (Εικ. 5Α). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία του FN επισυνάπτονται καλύτερα από τα κύτταρα ελέγχου σε 72 ώρες και 96 ώρες. Σε σχέση με τις αλλαγές της κυτταρικής μορφολογίας, η περιοχή του πυρήνα και το συνολικό εμβαδόν των κυττάρων επηρεάστηκαν από όλες τις επικαλύψεις (Σχ. 5Β και 5C). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί ΟΑΠ PLL και FN για 96 ώρες έδειξαν αυξημένη πυρηνική και κυτταρική περιοχές τουλάχιστον 8% και 18%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Σε σχέση με τον έλεγχο, COL και LAM μείωσε τις πυρηνικές και κυτταρικές περιοχές κατά 7% και 10%, και 15% και 14%, αντίστοιχα.

Τα κύτταρα αναλύθηκαν για πυκνότητα κυττάρου (Α), την πυρηνική περιοχή (Β ) και η κυτταρική περιοχή (C) σε τέσσερα διαφορετικά χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας ένα όργανο υψηλής περιεκτικότητας διαλογής (Οπερέτα).

Η

τα διάφορα αντιδραστήρια επίστρωσης επηρεάζεται F-ακτίνης οργάνωση

Για να διερευνήσει τις αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία και την κινητικότητα των κυττάρων LNCaP με περισσότερες λεπτομέρειες, εκτελέσαμε συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού και διερευνήθηκε η F-ακτίνη οργάνωση των κυττάρων LNCaP, όπως η παρουσία του ελασματοπόδια στις 24 ώρες (Εικ. 6Α) και 96 h (Εικ. 6Β) μετά την σπορά. Οι δομές αυτές αποτελούνται από νήματα παράλληλα πακέτο ακτίνης που εξετάζουν το υπόστρωμα για να αποφασίσει πού και πώς θα πρέπει να καθοριστούν οι εστιακές συμφύσεις για τη σύνδεση. Επιπλέον, αυτά τα νήματα συμβάλλουν στον σχηματισμό της ακτίνης ινών στρες. [22], [23] Η προσκόλληση και η εξάπλωση των κυττάρων περιλαμβάνει την αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού. Δυναμικές δομές που ονομάζονται εστιακές επαφές σχηματίζονται γύρω από ιντεγκρίνες στις θέσεις προσκόλλησης. Οι ιντεγκρίνες δεσμεύονται στα συστατικά ECM στη μία πλευρά, και να νημάτια ακτίνης ονομάζεται ίνες στρες από την άλλη πλευρά. Η εφαρμογή της δύναμης σε μία αντίδραση πλευρά αιτία από την άλλη, και αυτό, μαζί με ιντεγκρίνη μονοπατιών σηματοδότησης, καθορίζει το σχήμα των κυττάρων. [3] Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν στο πείραμα μικροσκοπία time-lapse, παρατηρήσαμε πολλά πολωμένα κύτταρα μετά από 24 ώρες σε FN- και LAM-αγωγή ολισθήσεις γυάλινο κάλυμμα (Σχ. 6Α). Επιπλέον, μετά από 96 ώρες, παρατηρήθηκε ότι οι ίνες έγινε πιο αποδιοργανωμένη με κάποια φλοιώδη συσσώρευση ακτίνης γύρω από το σώμα των κυττάρων και μείωση του αριθμού των ινών στρες παρουσία του FN (Εικ. 6Β). Επιπλέον, FN προκάλεσε σημαντική αύξηση χρώση ακτίνης, και τα κύτταρα έχασαν την πολικότητα τους (Σχ. 6Β).

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες χωρίς επικάλυψη (έλεγχος), ή επικαλυμμένη με ινονεκτίνη (FN), λαμινίνη (LAM), πολυ-L-λυσίνη (PLL), πολυ-L-ορνιθίνη (ΟΑΠ), ή κολλαγόνο τύπου IV (COL IV). Μετά από 24 ώρες (Α) ή 96 ώρες (Β), τα κύτταρα χρωματίστηκαν για F-ακτίνη με ροδαμίνη-φαλλοϊδίνη, αντίθετα με ϋΑΡΙ, και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού (60 ×, η Olympus). Τα βέλη δείχνουν ελασματοπόδια των πολωμένα κύτταρα και το βέλος κεφάλια σηματοδοτήσει filopodia. Κλίμακα ράβδου = 50 μm.

Η

Κύτταρα που αναπτύσσονται στην παρουσία του PLL και ΟΑΠ (Εικ. 6) εμφανίζεται ένα πιο διάχυτο πρότυπο ακτίνης με κάποιο πυκνό χρώση ακτίνης στην κυτταρική περιφέρεια 24 h και 96 h . Παρατηρήθηκαν Η παρουσία πολλών ακτίνης δέσμες και ακτινικά επεκταθεί νημάτια ακτίνης γύρω από τα κύτταρα, τα οποία ονομάζονται filopodia,. Οι πυρήνες των κυττάρων που καλλιεργούνται σε PLL εμφανίζεται μια ισχυρή ένταση DAPI στις 24 ώρες (Εικ. 6Α), το οποίο μειώθηκε κατά 96 ώρες (Εικ. 6Β). Επιπλέον, οι πυρήνες αυξηθεί σε μέγεθος μετά από 96 ώρες.

Στις 24 ώρες, τα κύτταρα στα φρεάτια επικαλυμμένα με COL (Εικ. 6Α) έδειξε ένα πρότυπο ακτίνης παρόμοιο με το μάρτυρα. Παρ ‘όλα αυτά, μετά από 96 ώρες ανάπτυξης, τα νημάτια ακτίνης έγινε πιο οργανωμένη από το μάρτυρα (Σχ. 6Β).

PLL, ΟΑΠ, ή FN-επικαλυμμένα φρεάτια αυξάνουν την προσκόλληση των κυττάρων LNCaP και ελαφρώς μειωμένη κινητικότητα κύτταρο , ενώ LAM αυξάνει τα μετανάστευση

οι μορφολογικές αλλαγές που συνήθως συνδέονται με μεταβολές άλλων χαρακτηριστικών των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων της κινητικότητας, της διαφοροποίησης και της μεταβολικής δραστηριότητας. [24] Για να αντιμετωπιστεί αυτό το ενδεχόμενο, η κινητικότητα των κυττάρων LNCaP αναπτύσσονται σε πολυστυρένιο σε επεξεργασία με τα διάφορα αντιδραστήρια επικάλυψης, αξιολογήθηκε σε μία δοκιμασία επούλωσης τραύματος (Εικ. 7). LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν επί 24 ώρες σε φρεάτια επικαλυμμένα με FN, LAM, PLL, ΟΑΠ ή COL, και η κυτταρική μονοστιβάδα γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα 96-pin WoundMaker. Η ποιότητα των τραυμάτων που δημιουργούνται επί των PLL, ΟΑΠ, ή FN-επικαλυμμένα φρεάτια ήταν ανώτερες προς τον έλεγχο (χωρίς επικάλυψη) και LAM, όπως κρίνεται από τη σχετική ομαλότητα των ακμών του μηδέν, καθώς και μια πολύ παρόμοια περιοχή τραύματος (Εικ . S2). Μια άλλη παρατήρηση ήταν ότι τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε LNCaP ΟΑΠ ή PLL επεξεργασμένα φρεάτια αποικίσει την καλά σε μια ημι-οργανωμένη μοτίβο, όπου οι επιμήκεις κυτταρικών σωμάτων ευθυγραμμίστηκαν παράλληλα (Σχ. S2). Προεπεξεργασία με LAM δεν βελτίωσε την προσκόλληση των κυττάρων LNCaP σε σύγκριση με τον έλεγχο, και η WoundMaker δημιουργούνται πληγές με ανώμαλες άκρες και των διαφορετική περιοχή. LNCaP κύτταρα αποσπώνται ως μεγάλα φύλλα των κυττάρων από φρεάτια COL-αγωγή όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με το WoundMaker (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι COL ήταν κατώτερη μη επικαλυμμένα φρεάτια και δεν είναι κατάλληλο για αυτή την εφαρμογή. Ανάλυση της πυκνότητας σε σχέση πληγή έδειξε ότι τα κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία της LAM μετανάστευσαν 62% ταχύτερα στην περιοχή του τραύματος από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου μετά από 36 ώρες (Εικ. 7). Σε σύγκριση, PLL, ΟΑΠ και FN προκαλούνται LNCaP κύτταρα να μεταναστεύουν βραδύτερα από τον έλεγχο, εμφανίζοντας μια μείωση της πυκνότητας του τραύματος κατά 15%, 33% και 20% αναπτύχθηκαν υπό αυτές τις συνθήκες, αντίστοιχα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα κύτταρα LNCaP εμφανίζεται ένα χρόνο διπλασιασμού περίπου 36 ώρες, όπως παρατηρήθηκε στα πειράματα RTCA, [20]

πυκνότητα γεγονός που υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενες επιπτώσεις στην πυκνότητα πληγή προκλήθηκε κατά κύριο λόγο από τη μετανάστευση των κυττάρων και όχι τον πολλαπλασιασμό. Σχετική πληγή σε διαφορετικά χρονικά σημεία των κυττάρων LNCaP σε περίοδο 36 h. Οι μετρήσεις είναι από τις πληγές πραγματοποιείται σε μονοστιβάδα κυττάρων LNCaP καλλιεργήθηκαν παρουσία διαφορετικών θεραπειών επικάλυψης και ελέγχου.

Η

PLL ευαισθητοποιεί κύτταρα LNCaP για τον αναστολέα HMGCR σιμβαστατίνης

Προηγούμενες μελέτες έχουν φαίνεται ότι η προ-επικάλυψη με ECM συστατικά μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία των κυττάρων σε διάφορα φάρμακα. Για παράδειγμα, LAM και FN έχουν αναφερθεί ότι αυξάνουν την αντίσταση σε ιονίζουσα ακτινοβολία και το κυτταροτοξικό φάρμακο Ukrain σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά

σε

vitro

. [25] Επιπλέον, αναφέρθηκε ότι προσκόλληση σε ένα σύνθεσης της χοληστερόλης που επάγεται υπόστρωμα FN μέσω της ενεργοποίησης του HMGCR και επίσης αυξημένη σύνθεση λιπαρών οξέων σε ανθρώπινους ινοβλάστες και κύτταρα ηπατώματος αρουραίου, ενώ ένα υπόστρωμα ΡΙ_Ι_ ή FN σε διάλυμα δεν είχε καμία επίδραση σε αυτά τα μονοπάτια [ ,,,0],26].

Ως εκ τούτου, η επίδραση των αντιδραστηρίων επικαλύψεως PLL, ΟΑΠ και FN με την ευαισθησία των κυττάρων LNCaP με την σιμβαστατίνη αναστολέα HMGCR ερευνήθηκε από RTCA, και το IC

50 υπολογίστηκε για περιόδους αγωγής 24 ώρες, 48 ώρες, και 72 ώρες (Εικ. S3). LAM και COL αποτελέσματα δεν αναλύθηκαν γιατί αυτά τα αντιδραστήρια επικάλυψης είχε δυσμενείς επιπτώσεις στην LNCaP κυτταρική επιφάνεια προσκόλλησης και προκάλεσε συσσώρευση των κυττάρων. Ενώ το IC

50 για τη σιμβαστατίνη ήταν σχετικά παρόμοιες μεταξύ των τεσσάρων συνθήκες επικάλυψης στις 24 ώρες, PLL αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων LNCaP στον αναστολέα HMGCR από δύο φορές μετά από 48 ώρες της θεραπείας σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. S3) . Στις 72 h, τα κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται σε ένα υπόστρωμα PLL εμφανίζεται μια τριών φορές χαμηλότερη IC

50. Ομοίως, ΟΑΠ και FN αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων LNCaP να σιμβαστατίνης από δύο φορές σε σχέση με τον έλεγχο σε 72 ώρες. Ωστόσο, έχει παρατηρηθεί ότι ΟΑΠ PLL και FN μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά ένα τρίτο σε 96 ώρες (Εικ. 3Β). Ως εκ τούτου, η ευαισθητοποίηση των κυττάρων LNCaP με ΟΑΠ και FN να σιμβαστατίνη μπορεί να είναι στην πραγματικότητα το αποτέλεσμα αυτών των επικαλύψεων στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Σε αυτή την περίπτωση, μόνο PLL μπορεί να ευαισθητοποιήσει σημαντικά κύτταρα LNCaP για τη σιμβαστατίνη αναστολέα HMGCR σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

ανδρογόνων ανταπόκριση και σηματοδότηση AR ήταν σε γενικές γραμμές δεν επηρεάζονται από τις συνθήκες επικάλυψης

ο υγιής ενήλικας ανθρώπινος επιθήλιο του προστάτη, της έκφρασης AR και προσκόλληση κυττάρων στο υπόστρωμα συμβεί σε χωριστά στρώματα κυττάρων, δηλαδή σε αυλού και βασικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, τα μονοπάτια του AR σηματοδότησης και κυτταρική προσκόλληση είναι απίθανο να αλληλεπιδρούν άμεσα. [29] Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη, κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα αυλού αλλάζουν από προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου προς προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος, και σήματα από κυτταρική προσκόλληση και AR συν-εκφράζονται. [27] Η κυτταρική γραμμή LNCaP είναι ένα σημαντικό πρότυπο σύστημα για τη μελέτη του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) μεσολάβηση σηματοδότησης στον καρκίνο του προστάτη. Δείχθηκε πρόσφατα ότι οι αλλαγές στις επαφές κυττάρου-κυττάρου και η εξωκυτταρική μήτρα μετέβαλε την απόκριση των κυττάρων LNCaP στα ανδρογόνα.