Αφηρημένο

(-trihydroxystilbene trans-3,4,5 ‘) Η ρεσβερατρόλη είναι ένα ενεργό ένωση σε τρόφιμα, όπως τα κόκκινα σταφύλια, τα φιστίκια και τα μούρα. Η ρεσβερατρόλη παρουσιάζει ένα αντικαρκινικό αποτέλεσμα σε διάφορα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, ο μηχανισμός της ρεσβερατρόλης που προκαλείται αντικαρκινικό αποτέλεσμα σε μοριακό επίπεδο παραμένει να διευκρινιστεί. Σε αυτή τη μελέτη, ο μηχανισμός που υπογραμμίζει την αντικαρκινική δράση της ρεσβερατρόλης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (OVCAR-3 και Caov-3) ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές μοριακής βιολογίας, όπως κυτταρομετρία ροής, κηλίδωση Western, και παρεμβολή RNA, με μια σημαντική εστίαση στον πιθανό ρόλο των αυτοφαγία σε ρεσβερατρόλη που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Δείξαμε ότι η παραγωγή επάγεται ρεσβερατρόλη αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), η οποία ενεργοποιεί αυτοφαγία και την επακόλουθη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. που προκαλείται ρεσβερατρόλη έκφραση ATG5 και προωθείται διάσπαση LC3. Το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από τη ρεσβερατρόλη εξασθένισε τόσο από φαρμακολογικές και γενετικές αναστολή της αυτοφαγία. Η χλωροκίνη αναστολέα αυτοφαγία, το οποίο λειτουργεί κατά το τελευταίο στάδιο της αυτοφαγία, μείωσε σημαντικά ρεσβερατρόλη που προκαλείται κυτταρικό θάνατο και δραστικότητα κασπάσης 3 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Δείξαμε επίσης ότι η στόχευση ATG5 από siRNA κατέστειλε επίσης ρεσβερατρόλη που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι υπάρχει ένα κοινό μονοπάτι μεταξύ αυτοφαγία και την απόπτωση σε ρεσβερατρόλη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε OVCAR-3 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Παράθεση:. Lang F, Τσιν Ζ, Li F, Zhang Η, Fang Z , Hao Ε (2015) αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από ρεσβερατρόλη είναι μερικώς διαμεσολαβείται από την Autophagy Διαδρομή σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 10 (6): e0129196. doi: 10.1371 /journal.pone.0129196

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, Γαλλία

Ελήφθη: 31ης Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: 7η του Μάη 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιουνίου, 2015

Copyright: © 2015 Lang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα δεδομένα είναι προβλέπεται στο χειρόγραφο

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από την προαγωγικός ταμείο έρευνας για τους νέους και μεσήλικες οι επιστήμονες της επαρχίας Shandong (Grant Νο 07-21). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένα από τα σημαντικότερα κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται για τα θηλυκά και ένα υψηλό ποσοστό υποτροπής μετά από χειρουργική επέμβαση [1] [2]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η διάγνωση γίνεται σε προχωρημένα στάδια του καρκίνου, και γίνεται πρόκληση για χειρουργική εκτομή και ανάκτηση [2]. Έτσι, οι μελέτες για τα δραστικά συστατικά των προϊόντων τροφίμων θα μπορούσε να παράσχει χρήσιμη εναλλακτική λύση θεραπευτικές προσεγγίσεις για αυτή την κακοήθεια.

Η ρεσβερατρόλη είναι ένα ενεργό συστατικό από πηγές τροφίμων μας, όπως τα σταφύλια, τα φιστίκια, και τα μούρα, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Πολυάριθμες μελέτες έχουν καταδείξει τα ευεργετικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης σε καρδιαγγειακές παθήσεις, νευρική ασθένειες, παχυσαρκία, και φλεγμονώδεις διαταραχές [3-5]. Ένας από τους σημαντικότερους τομείς της έρευνας ρεσβερατρόλη είναι στην πρώτη γραμμή της έρευνας για τον καρκίνο [6, 7]. Είναι καλά γνωστό ότι μία υψηλή δόση της ρεσβερατρόλης αποτελέσματα σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [8-10]. Έχουν προταθεί αρκετοί μηχανισμοί θανάτου των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Η φωσφορυλίωση των Cdc2-Tyr15 με αποτέλεσμα θεραπεία ρεσβερατρόλη σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου από OVCAR-3 [9]. Κάτω ρύθμιση της Akt /GSK και ERK μονοπάτια σηματοδότησης έχει δειχθεί ότι είναι κρίσιμη για τον κυτταρικό θάνατο ρεσβερατρόλη μεσολάβηση [10]. Πρόσφατα, Lin et al. περιγράφεται το σημαντικό ρόλο του κηραμιδίου και COX-2 σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο με ρεσβερατρόλη σε OVCAR-3 [8].

Autophagy είναι μια συντηρητική μονοπάτι αυτο-αποδόμηση στην οποία τα συστατικά κυτοσολικό απορροφάται στα λυσοσώματα για αποικοδόμηση και ανακύκλωση [11]. Σε υγιείς ιστούς, αυτή είναι μια διαδικασία της εκκαθάρισης των κατεστραμμένων οργανίδια. Ωστόσο, είναι μια σύνθετη διαδικασία σε καρκινικά κύτταρα όπου μπορεί είτε να καταστείλει ή να επάγουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, ανάλογα με το κυτταρικό μικροπεριβάλλον [12].

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο των αυτοφαγία σε ρεσβερατρόλη που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα OVCAR-3. Βρήκαμε ότι η θεραπεία ρεσβερατρόλη επαγόμενη παραγωγή και την απόπτωση ROS, καθώς και η ενεργοποίηση του μονοπατιού αυτοφαγία σε OVCAR-3 κύτταρα. Αναστολή της autophagy από φαρμακολογική αναστολέα ή siRNA κατά ATG5 σημαντικά εξασθενημένο ρεσβερατρόλη διαμεσολαβείται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Έτσι, η μελέτη μας ιδρύθηκε σημαντικό ρόλο της αυτοφαγία σε ρεσβερατρόλη απόπτωση στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η ρεσβερατρόλη, NAC (Ν ακετυλο κυστεΐνη ), χλωροκίνη, κασπάσης 3 κιτ δοκιμασίας, και το αντίσωμα LC3 αγοράστηκαν από την Sigma (USA). Η ρεσβερατρόλη διαλύθηκε σε DMSO (Sigma, USA) και παρασκευάζεται προσφάτως κάθε φορά πριν από την κυτταρική θεραπεία. Αντι-ATG5 αντίσωμα αγοράστηκε από το Πεκίνο Βιοσύνθεση Βιοτεχνολογίας, ATG5-ATG12 συμπλόκου αντισώματος ήταν από Abd Serotec, και αντίσωμα αντι-διασπασμένη κασπάση 3 διατάχθηκε από τεχνολογίες κυψελών Signal. siRNA εναντίον ATG5 ελήφθησαν από τη Σαγκάη GenePharma ΣΙΑ Ε.Π.Ε. Z-VAD-FMK αγοράστηκε από την R & amp? D

Κυτταρική καλλιέργεια

OVCAR-3 και Caov-3 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. ελήφθησαν από την ATCC (USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Technology Life, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, ινσουλίνης, και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Η κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Ανθρώπινου ωοθηκικού Surface επιθηλιακά κύτταρα κύτταρα (HOSEpiC) αναπτύχθηκαν με ωοθηκών Επιθηλιακά μέσο κυτταρικής παρέχονται από τον κατασκευαστή (ScienCell Research Laboratories). θεραπεία ρεσβερατρόλη περιγράφηκαν στο κείμενο και σχήματα.

προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας

Κυτταρική βιωσιμότητα διεξήχθη χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη ή άλλες ενώσεις όπως υποδεικνύεται για 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο και ΜΤΤ προστέθηκε 6 ώρες πριν από το τελικό σημείο, και η απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακός.

Προσδιορισμός απόπτωσης χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής

Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος ήταν μετρήθηκε με χρώση με Sytox Green και αννεξίνης V-APC (Technology Life, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [13].

Κινητή ROS προσδιορισμούς

Σύνολο ενδοκυτταρική ROS μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το H2DCFDA βαφή σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Technology Life, USA).

Προσδιορισμός των μιτοχονδριακών ηλεκτρονίων πιθανή αλλαγή

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ζωντανών κυττάρων με τη φθορίζουσα χρωστική λιπόφιλη κατιονική TMRE (Sigma )). Αυτή η χρωστική είναι ένα κύτταρο διαπεράσεως χρωστική ουσία που συσσωρεύεται εύκολα σε δραστικές μιτοχόνδρια λόγω της σχετικής αρνητικό φορτίο τους. Μετά από OVCAR-3 κύτταρα θεραπεία βάφτηκαν με 500 ηΜ TMRE για 30 λεπτά στους 37 ° C, μετά πλύθηκαν δύο φορές σε μέσο και επανα-εναιωρήθηκαν σε PBS. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα flowcytometer στο κανάλι FL2 και η μέση ένταση χαράσσεται. itochondrial δυναμικό ανέλυσε επίσης από μια άλλη χρωστική JC-1. Μετά τη θεραπεία, όπως περιγράφεται στο κείμενο, οι εικόνες φθορισμού ελήφθησαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα Zeiss AX10 ανεστραμμένη πεδίο (Carl Zeiss μικροαπεικόνισης Inc., Γερμανία).

Προσδιορισμός των 4HNE προσαγωγών Πρωτεΐνη

4- επίπεδο ΗΝΕ στα κυτταρολύματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη OxiSelect ΗΝΕ το προϊόν προσθήκης ELISA Kit (Cell Biolabs) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κηλίδα Western πραγματοποιήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-ΗΝΕ (Abcam)

κηλίδωση Western αναλύσεις

Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Sigma, USA) που περιέχει έναν αναστολέα πρωτεάσης. κοκτέιλ (Roche, Germany). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης (Βίο Rad, USA), και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) φορτώθηκαν σε κάθε φρεάτιο 4-20% ή 12% SDS-PAGE. Αφού οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, τα στυπώματα αποκλείστηκαν με 5% γάλα, που ακολουθείται από επώαση με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο τη διάρκεια της νύχτας. Μετά από τρεις πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒδ-Τ, τα στυπώματα επωάστηκαν με κατάλληλα αραιωμένο συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα για 2 ώρες. Τα ανοσοαποτυπώματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ SuperSignal West Femto (Fisher Scientific, USA).

παρεμβολή RNA

κύτταρα OVCAR διαμολύνθηκαν είτε με μη ειδικά ή ATG5 siRNA χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη (τεχνολογίες Life, USA) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα επωάστηκαν 48 ώρες πριν από τη θεραπεία με ρεσβερατρόλη για μέγιστη παρεμπόδιση της έκφρασης ATG5.

κασπάσης 3 δραστηριότητα

κασπάσης 3 ενεργότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας κασπάσης 3 (Sigma, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε ένα 96-φρεατίων για την δοκιμασία κασπάσης 3.

δραστηριότητα PARP

δραστηριότητα PARP, χρησιμοποιήσαμε το HT κιτ προσδιορισμού καθολική Χρωματομετρική PARP από Trevigen. Η δραστηριότητα ΡΑΚΡ προσδιορίζεται από την ποσότητα του PAR εναποτίθεται πάνω ακινητοποιημένες πρωτεΐνες ιστόνης. Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Ζωντανή απεικόνιση κυττάρων με δείκτη αυτοφαγία βαφή

αυτοφαγικά ροή επίσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ζωντανή απεικόνιση κυττάρων με fluroscent υποστρώματος κασπάσης

η ενεργοποίηση της κασπάσης προσδιορίστηκε με χρήση αντιδραστηρίου CellEvent κασπάσης-3/7 Πράσινο Ανίχνευση (τεχνολογίες ζωής, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος με τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τέσσερις φορές εις διπλούν για όλα τα πειράματα. έλεγχος τ ή μονόδρομη ΑΝΟνΑ πραγματοποιήθηκαν όπως ενδείκνυται για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας. Η σημασία ορίστηκε σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η ρεσβερατρόλη που επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο

OVCAR-3 είναι ένας χημειο ανθεκτικών κυτταρική σειρά καρκίνου ιδρύθηκε από έναν ασθενή αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών. Χρησιμοποιήσαμε OVCAR-3 κύτταρα ως

vitro

μοντέλο καρκινικού κυττάρου, για να δοκιμαστούν οι αντικαρκινικές επιδράσεις της ρεσβερατρόλης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η θεραπεία με ρεσβερατρόλη σε συγκέντρωση 1 μΜ έως 100 μΜ για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Η θεραπεία με 30 μΜ και 100 μΜ ρεσβερατρόλη έδειξε στατιστικά σημαντική απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων στις 48 ώρες.

A. κύτταρα OVCAR3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 έως 100 μΜ ρεσβερατρόλης για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ. Τα στοιχεία ελήφθησαν από ένα μέσο όρο τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, η = 4 /ομάδα. Β Αντιπροσωπευτικές κυτταρομετρίας ροής διαγράμματα στιγμών για τη μέτρηση της απόπτωσης σε κύτταρα OVCAR-3. Η ρεσβερατρόλη απόπτωση μετρήθηκε με χρώση με Sytox Πράσινη χρωστική (άξονας Υ, FL 1) και αννεξίνης V-APC (Χ-άξονας, FL4). C. Ποσοτικός προσδιορισμός των πρώιμων αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου όπως ο αριθμός των κυττάρων αννεξίνης ν-θετικής με Sytox πράσινο-αρνητικά κύτταρα, και αργά αποπτωτικών /νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο καθώς ο αριθμός των αννεξίνης ν-θετικής και Sytox πράσινο-θετικά κύτταρα.

Οι επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στην αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των κυττάρων OVCAR-3 εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας Sytox Green (FL1H) και αννεξίνη V- Αλλοφυκοκυανίνη (FL4H). Η θεραπεία με 100 μΜ της ρεσβερατρόλης για 48 ώρες επάγεται σημαντική πρώιμη αποπτωτική και αργά αποπτωτικών /νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 1Β και 1Γ). Η θεραπεία με 30 μΜ της ρεσβερατρόλης για 48 ώρες προκάλεσε επίσης σημαντική πρώιμη αποπτωτική και αργά αποπτωτικών /νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο (Σχ 2Α και 2Β), αλλά το αποτέλεσμα ήταν μικρότερη σε σύγκριση με 100 μΜ.

A. Αντιπροσωπευτικά κηλίδωση Western αναλύσεις OVCAR-3 συνολικά κυτταρολύματα με αντισώματα ATG5, LC3, και ρ62. β-ακτίνη και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης. Τρία όμοια δείγματα φορτώθηκαν για κάθε ομάδα θεραπείας. Β κασπάσης 3 ενεργοποίηση μετρήθηκε από κυτταρολύματα και εκφράζονται ως φορές μεταβολής. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, n = 4 /ομάδα

Η

Η ρεσβερατρόλη που προκαλείται από αυτοφαγία στα ανθρώπινα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση της ρεσβερατρόλης στην αυτοφαγία. αξιολογήθηκαν βασικούς δείκτες της αυτοφαγία. Όπως φαίνεται στο Σχ 2C και σχήμα 3Α, η ρεσβερατρόλη ainduced LC3-ΙΙ και Ρ62 σε OVCAR-3 κύτταρα. Western αναλύσεις κηλίδωση αποκάλυψε μια αύξηση στην ειδική αυτοφαγικά ATG5 δείκτη, η οποία είναι απαραίτητη για το σχηματισμό autophagosome (Σχήματα 2Α και 3Α). Επιπλέον, η δραστηριότητα της κασπάσης 3 ήταν σημαντικά αυξημένη σε ρεσβερατρόλη-επεξεργασμένα κύτταρα OVCAR-3 (Σχήματα 2D και 3Β).

A. OVCAR-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 30 μΜ ρεσβερατρόλη για 48 ώρες, και ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε με κυτταρομετρία ροής. B. ποσοτικό αποτέλεσμα της κυτταρομετρίας ροής. Γ Αντιπροσωπευτικά κηλίδωση Western αναλύσεις OVCAR-3 συνολικά κυτταρολύματα με ATG5, LC3, και αντισώματα Ρ62 με β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης.

Η

Η ρεσβερατρόλη που προκαλείται οξειδωτικό στρες σε OVCAR-3 ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα

στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν η θεραπεία ρεσβερατρόλη είχε οποιεσδήποτε επιπτώσεις στο οξειδωτικό στρες επίπεδα στα καρκινικά κύτταρα. Στην πρώτη προσέγγιση, χρησιμοποιήσαμε ένα κύτταρο-διαπεράσεως 2 ‘, 7’-διοξική dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA) βαφής για τη μέτρηση της ενδοκυτταρικής ROS, και βρήκαν ότι η ρεσβερατρόλη σε 30 μΜ είχε ως αποτέλεσμα significantincrease στην ενδοκυτταρική παραγωγή ROS στα κύτταρα OVCAR3 (Σχήμα 4Α). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση του αποτελέσματος αυτού, χρησιμοποιήσαμε επίσης μια δωρεάν μέθοδος για τη μέτρηση της οξειδωτικής αποτύπωμα μετρώντας προσαγωγές πρωτεΐνη ΗΝΕ (4-Hydroxynonenal). Συνεπής με τα δεδομένα ενδοκυτταρική ROS, ΗΝΕ προσαγωγές πρωτεΐνη αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με κύτταρα OVCAR υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 4Β και 4C). Επιπλέον, δείξαμε ότι η ρεσβερατρόλη επίσης μειώθηκε σημαντικά το μιτοχονδριακό ηλεκτρονίων δυναμικό (Σχήμα 4D).

Μια

. Ενδοκυτταρική ROS από OVCAR-3 μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας H

2DCFDA και εκφράζονται ως φορές μεταβολής. Η ρεσβερατρόλη σε 30 μΜ που προκαλείται στατιστικά σημαντική ROS. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, η = 4 /ομάδα.

Β

. Το οξειδωτικό στρες 4HNE δείκτη τροποποιημένων πρωτεϊνών καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας ELISA από τα προϊόντα λύσης κυττάρου του οχήματος και ρεσβερατρόλη φάρμακο (30 μΜ) OVCAR-3 κύτταρα. Οι ποσοτικοί τροποποιημένες πρωτεΐνες εκφράστηκαν ως% των δειγμάτων ελέγχου του οχήματος. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, η = 4 /ομάδα. Γ Εκπρόσωπος κηλίδωση Western δείχνει η ρεσβερατρόλη που προκαλείται ανύψωση των προσαγωγών ΗΝΕ. Δ μιτοχονδριακού ηλεκτρονίων πιθανή αλλαγή θεραπείας μετά από ρεσβερατρόλη προσδιορίστηκε με ποσοτική κυτταρομετρία ροής και ανοσοφθορισμό.

Η

Η ρεσβερατρόλη παρόμοια επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών Caov-3

Για να προσδιοριστεί εάν η επίδραση της ρεσβερατρόλης είναι κυτταρική γραμμή ειδική, χρησιμοποιήσαμε ένα άλλο ανθρώπινο καρκίνο ωοθηκική κυτταρική γραμμή Caov-3. Συνεπής με την επίδραση που παρατηρείται σε OVCAR-3 κύτταρα, η ρεσβερατρόλη επήγαγε επίσης απόπτωση και αυτοφαγία σε Caov-3 κύτταρα (Σχήμα 5). Ωστόσο, η ρεσβερατρόλη στο ίδιο πλαίσιο δόση και ο χρόνος δεν προκάλεσε πρώιμη απόπτωση σε πρωτογενή ανθρώπινα επιφανειακά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών HOSEpiC αν υπάρχει αυξήσει ελαφρώς στα τέλη αποπτωτικών /νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο (S1 Σχήμα).

Α. Caov-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 30 μΜ ρεσβερατρόλη για 72 ώρες, και ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε με κυτταρομετρία ροής. B. ποσοτικό αποτέλεσμα της κυτταρομετρίας ροής. Γ Αντιπροσωπευτικά κηλίδωση Western αναλύσεις Caov-3 συνολικά κυτταρολύματα με LC3, και αντισώματα ρ62.

Η

Η φαρμακολογική αναστολή της autophagy εξασθενημένου ρεσβερατρόλης κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε OVCAR-3 κύτταρα

για να ελέγξετε αν αυτοφαγία είναι ένας σύνδεσμος σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, θα αντιμετωπίζονται OVCAR-3 κύτταρα με χλωροκίνη (CQ), μια φαρμακολογική αναστολέα αυτοφαγία, πριν από τη θεραπεία ρεσβερατρόλη. Η απόπτωση και θάνατο των κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Sytox Πράσινο και Αηηβχίην-Αλλοφυκοκυανίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ 6Α, ο κυτταρικός θάνατος με ρεσβερατρόλη σε 30 μΜ ήταν σημαντικά εξασθενημένος δια προκατεργασίας με 2 μΜ CQ. Η ρεσβερατρόλη μείωσε σημαντικά το συνολικό κυτταρικό θάνατο με αναστολή αυτοφαγία. Επίσης αναλύθηκαν επάγεται ρεσβερατρόλη δεικτών απόπτωσης δραστικότητα κασπάσης 3 και PARP δραστηριότητα και οι δύο εξασθενημένα με επεξεργασία CQ (Σχήμα 6C). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι δείκτες autophagosome ρεσβερατρόλη που προκαλείται LC3II και ρ62 επίσης εξασθενημένα με επεξεργασία CQ (Σχήμα 6D).

Μια

. Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής διαγράμματα τελεία αντιπροσωπεύει το καθένα κύτταρα OVCAR-3. Κυτταρική απόπτωση μετρήθηκε με την ίδια μέθοδο όπως στο Σχήμα 1. Η χλωροκίνη μείωσε την κυτταρική θανάτωση επίδραση της ρεσβερατρόλης. B. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των συνολικών κυτταρικού θανάτου, το οποίο εκφράστηκε ως το ποσοστό των συνολικών κυττάρων. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος? # Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με δείγματα ρεσβερατρόλη φάρμακο. n = 4 /ομάδα. Γ κασπάσης 3 και τις δραστηριότητες PARP προσδιορίστηκαν και απεικονίζονται ως φορές μεταβολής. Δ Αντιπροσωπευτικά κηλίδωση Western αναλύσεις OVCAR-3 συνολικά κυτταρολύματα με LC3, και αντισώματα ρ62.

Η

Αναστολή της autophagy από ATG siRNA που βελτιώνεται ρεσβερατρόλη κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε OVCAR-3 κύτταρα

ATG5 είναι το σήμα κατατεθέν της αυτοφαγία και ένας βασικός παράγοντας στη διαμόρφωση της αυτοφαγοσώματα. Εκτός από την φαρμακολογική αναστολέα, χρησιμοποιήσαμε μία γενετική προσέγγιση με να χτυπήσει κάτω έκφραση ATG5 χρησιμοποιώντας ένα συγκεκριμένο siRNA και εξετάστηκαν επίδρασή της στην ρεσβερατρόλη που προκαλείται από τον καρκίνο του κυτταρικού θανάτου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, ο κυτταρικός θάνατος με ρεσβερατρόλη (30μΜ) μειώθηκε από 27,9% σε 16,22% κατά ATG5 siRNA. Ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε επίσης σε δραστικότητα κασπάσης 3 και LC3 κηλίδα western (Σχήμα 7Β και 7C). Η αποτελεσματικότητα της τεχνολογίας siRNA επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western αναλύσεων, η οποία έδειξε μία σημαντική μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ATG5 (Σχήμα 7Α). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι τα κύτταρα επεξεργάζονται με ATG5 siRNA σε συνδυασμό με Z-VAD-FMK (50μΜ) προστατεύονται περισσότερο σημαντικά από ρεσβερατρόλη κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με είτε αναστολέα μόνο (Σχήμα 7Ε). Εμείς που απασχολούνται επίσης νέα τεχνολογία απεικόνισης ζωντανών κυττάρων χρησιμοποιώντας Cyto-ID βαφής για αυτοφαγία ροή και επιβεβαιώθηκαν τα παραπάνω αποτελέσματα.

Α. έκφραση πρωτεΐνης ATG5 προσδιορίστηκε από κυτταρολύματα που λαμβάνονται από OVCAR-3 κύτταρα φορτωμένα με είτε ελέγχουν τυχαία siRNA ή ATG5 siRNA. Β κασπάσης 3 δραστηριότητες προσδιορίστηκαν από κυτταρολύματα που λαμβάνονται από OVCAR-3 κύτταρα φορτωμένα με είτε ελέγχουν τυχαία siRNA ή ATG5 siRNA. Οι δραστηριότητες εκφράστηκαν ως πολλαπλάσια μεταβολή. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, # Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με δείγματα ρεσβερατρόλη φάρμακο. n = 4 /ομάδα. Γ Αντιπροσωπευτικά κηλίδωση Western αναλύσεις OVCAR-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με όχημα (Veh) ή ρεσβερατρόλη σε 30 μΜ (RV) με και χωρίς siATG5 και συνολικό προϊόντα λύσης κυττάρου ήταν anlyzedwith LC3 και β-ακτίνης D. ζωντανό κύτταρο εικόνας από συνεστιακό μικροσκόπιο (με 20Χ στόχος) χρησιμοποιώντας Cyto-Id βαφής φορτώνονται για 15 λεπτά μετά την αγωγή με ρεσβερατρόλη σε 30 μΜ σε OVCAR-3 κύτταρα μετασχηματισμένα με τυχαία ή ATG5 siRNA. Ε Ποσοτικός προσδιορισμός κυτταρικού θανάτου σε OVCAR κύτταρα χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Η ρεσβερατρόλη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο είναι εξασθενημένος σε siATG5 επεξεργασμένου και siATG5 συν Z-VAD-FMK (50μΜ) κατεργασμένων κυττάρων OVCAR-3. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος? # Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με δείγματα ρεσβερατρόλη φάρμακο. n = 4 /ομάδα.

Η

Χρησιμοποιήσαμε ζωντανή απεικόνιση κυττάρων για αυτοφαγικά ροή και κασπάσης 3 βαφή υπόστρωμα (δείκτη για πρώιμη απόπτωση) χρησιμοποιώντας μικροσκοπία (Σχήμα 8Α και 8Β). Ήταν προφανές ότι αυτοφαγικά ροή ξεκίνησε νωρίτερα (12 ώρες) από απόπτωση (24 ώρες), όταν έλαβαν θεραπεία με 30M ρεσβερατρόλη, η οποία είναι σε συμφωνία με τα προαναφερθέντα στοιχεία ATG5 siRNA. Πραγματοποιήσαμε επίσης μια μελέτη χρονικής πορείας με κηλίδα Western αναλύσεις χρησιμοποιώντας δύο σύνολα δειγμάτων από ανεξάρτητα πειράματα σε κάθε χρόνο σημεία (Σχήμα 8C) και διαπίστωσε ότι autophagy ενεργοποιήθηκε νωρίτερα από την απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι η αυτοφαγία είναι ανάντη της απόπτωσης στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών αντιμετωπίζονται με ρεσβερατρόλη. Ωστόσο, υπάρχουν επικάλυψη μεταξύ των δύο διαδικασιών που είναι ένα τυπικό πρότυπο για κάθε πληθυσμό καρκινικών κυττάρων.

A. Ζωντανά απεικόνισης κυττάρων με συνεστιακή μικροσκοπία (με αντικειμενικό φακό 10Χ) με Cyto-ID βαφής σε OVCAR-3 κύτταρα σε επεξεργασία με 30 μΜ ρεσβερατρόλη σε 0, 12, 24 και 48 ώρες χρόνος σημεία. Β Ζωντανό κύτταρο απεικόνισης με συνεστιακή μικροσκοπία (με αντικειμενικό φακό 10Χ) με κασπάσης 3 χρωστική πράσινο ανίχνευση σε OVCAR-3 κύτταρα σε 0, 12, 24 και 48 ώρες χρόνος σημεία. C. κύτταρα OVCAR-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30 μΜ της ρεσβερατρόλης για 12 ώρες, 24 ώρες, και 48 ώρες. Western κηλίδωση του συνολικά κυτταρολύματα έγιναν με αντι-ATG5-ATG12, LC3, και κασπάσης 3 αντισώματα. Δεν παρατηρήθηκε διάσπαση της ATG5. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν ένα πείραμα, στο οποίο αναπαράγονται κάθε χρονικό σημείο της θεραπείας.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η ρεσβερατρόλη κυτταρικό θάνατο που επάγεται στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων διαμεσολαβείται τόσο από απόπτωση και αυτοφαγία. Η ρεσβερατρόλη που προκαλείται σημαντική ενδοκυτταρική παραγωγή ROS και το οξειδωτικό στρες στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία είχαν ως αποτέλεσμα την έναρξη του μονοπατιού κυτταρικού θανάτου. Τα χαρακτηριστικά της αυτοφαγία, LC3 και ATG5, οι δύο υπερεκφράζεται σε ρεσβερατρόλη που έλαβαν καρκινικά κύτταρα. Έχουμε επίσης δείξει ότι η φαρμακολογική αναστολή της αυτοφαγία με χλωροκίνη εξασθενημένα ρεσβερατρόλη κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε OVCAR-3, και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα με το φράξιμο έκφραση ATG5 χρησιμοποιώντας siRNA.

Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει κάποια ενδιαφέροντα μονοπάτια που διαμεσολαβούν ρεσβερατρόλη που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Vergara et al. περιγράφεται το σηματοδότησης ERK ρόλο και μονοπάτια AKT /GSK σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο χρησιμοποιώντας μια πρωτεομική προσέγγιση [10]. Σε μια άλλη μελέτη κομψό, Lin et al. κατέδειξε ότι η ρεσβερατρόλη απόπτωση που επάγεται από κοινού παρόμοιες πορείες με κεραμίδιο επαγόμενη COX-2-εξαρτώμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [8]. ere, έχουμε δείξει ότι το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των OVCAR-3 που επάγεται από ρεσβερατρόλη είναι πολύ πιο πολύπλοκη και autophagy διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε αυτή τη διαδικασία.

Ένα από βασικές παρατηρήσεις μας ήταν η παραγωγή ενδοκυτταρικών ROS και οξειδωτική στρες σε ρεσβερατρόλη που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο σε OVCAR-3 κύτταρα. ROS εμπλέκεται στη ρύθμιση διαφόρων οδών, συμπεριλαμβανομένης της οδού σηματοδότησης ERK [14-16]. Περιέργως, ROS θα μπορούσε να προκαλέσει την αυτοφαγία σε ρεσβερατρόλη επεξεργασμένα κύτταρα OVCAR-3 [17]. Η ρεσβερατρόλη είναι γνωστό ότι έχει ευεργετικές αντιοξειδωτικές επιδράσεις επί των υγιών κυττάρων [18], αλλά αυτές οι αντιοξειδωτικές δραστηριότητες έχουν διαφορετικές επιπτώσεις σε εντόνως πολλαπλασιαστικά καρκινικά κύτταρα. Αντιοξειδωτικά, συμπεριλαμβανομένου ρεσβερατρόλη, έχουν αποδειχθεί ότι συμβάλλουν στην ROS κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων [19, 20]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η παραγωγή ROS από ρεσβερατρόλη σε κύτταρα OVCAR-3 συνδέεται με τον καρκίνο των κυττάρων απόπτωσης, η οποία είναι συνεπής με τα ευρήματα που λαμβάνονται σε προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν στις παχέος εντέρου και του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα.

Σε γενικές γραμμές, αυτοφαγία αναστέλλει το επαγωγή της απόπτωσης, και την ενεργοποίηση της κασπάσης-απόπτωση σχετίζεται σβήνει τη διαδικασία αυτοφαγία. Ωστόσο, υπάρχουν πολλές περιπτώσεις όπου και οι δύο αυτές διαδικασίες συμβαίνουν ταυτόχρονα ή συν-ενεργοποιεί να προκαλούμενη παραγωγή ROS τόσο αυτοφαγία και απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα [21]. η ίδια αυτοφαγία μπορεί να προκαλέσει θάνατο των κυττάρων, μια διαδικασία γνωστή ως αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο [22]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η επαγωγή της autophagy διευκολύνει την ενεργοποίηση της απόπτωσης [23]. Puissant et al βρήκαν ότι τόσο autophagy και την απόπτωση εμπλέκονται σε ρεσβερατρόλη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε ένα μυελογενούς λευχαιμίας κυτταρική γραμμή [24-26]. Σε MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού, η ρεσβερατρόλη που επάγεται Beclin-1 εξαρτώμενη και ανεξάρτητη autophagy [27] .Here, παρατηρήσαμε επίσης τόσο κασπάσης υπάρχει εξαρτώμενη και ανεξάρτητη οδό για επάγεται ρεσβερατρόλη κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Είτε αναστολείς κασπάσης ή αυτοφαγία δεν ήταν σε θέση να αποκαταστήσει την επαγόμενη ρεσβερατρόλη κυτταρικό θάνατο. Ένα από τα βασικά πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία είναι η ρ53 πρωτεΐνη καταστολέας όγκων και τα επίπεδα πρωτεΐνης του στο κυτταρόπλασμα ενεργοποίηση διαμορφώνει ή αναστολή της αυτοφαγία [28, 29]. Πυρηνική μετατόπιση της ρ53 είναι επίσης σημαντική για αποπτωτική επαγωγή. Έχει δειχθεί ότι η ρ53 είναι ζωτικής σημασίας για ρεσβερατρόλη μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα OVCAR-3 [8]. Άλλα κοινά μεσολαβητές τόσο αυτοφαγία και την απόπτωση είναι αρκετά ΒΗ3-μόνο (BCL-3 ομολογία 3) πρωτεΐνες. Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν άμεσα με την οικογένεια Bcl-2, φίμωση έτσι την αντι-αποπτωτική ρόλο και την τόνωση της απόπτωσης. Αρκετές ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, όπως κακό και BNIP3 μπορεί επίσης να προωθήσει την αυτοφαγία με ανταγωνιστική αναστολή μεταξύ Beclin1 και αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 [30-32]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο BCL2 και Bad έχουν δειχθεί να απορυθμίζεται σε OVCAR-3 κύτταρα [8].

Η ρ62 συμμετοχή σε επαγόμενη ρεσβερατρόλη κυτταρικό θάνατο σε λευχαιμική κυτταρική σειρά είναι κρίσιμη [25]. Παρατηρήσαμε επίσης επαγωγή του ρ62 σε καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα σε απόκριση σε θεραπεία ρεσβερατρόλη.

Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι η αναστολή της εξασθενεί αυτοφαγία (αλλά όχι εντελώς καταργεί) ρεσβερατρόλη που προκαλείται από τον καρκίνο των ωοθηκών κυτταρικό θάνατο. Πραγματοποιήσαμε επίσης μια μελέτη πορεία του χρόνου, και διαπίστωσαν ότι η ρεσβερατρόλη ενεργοποιεί αυτοφαγία νωρίτερα από την απόπτωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αυτοφαγία είναι ανάντη της απόπτωσης. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ρεσβερατρόλη προκαλεί απόπτωση εν μέρει μέσω αυτοφαγία. Συμφωνούμε ότι κάποιοι πιο κλασικό μηχανισμοί είναι πιθανόν εμπλέκονται επίσης στην ρεσβερατρόλη απόπτωση.

Η αυτοφαγία αποτελεί ζωτικής σημασίας μηχανισμό επιβίωσης για τα καρκινικά κύτταρα κάτω από αυστηρές προϋποθέσεις για την κάλυψη θρεπτικών αναγκών τους. Ταυτόχρονη αναστολή της autophagy κατά τη διάρκεια της θεραπείας κατά του καρκίνου είναι ευεργετική σε ουρολογικές καρκίνο [33]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τον αναστολέα στάδιο autophagy χλωροκίνη αργά και διαπίστωσε ότι autophagy μεσολαβεί OVCAR-3 κυτταρικού θανάτου που επάγεται από τη ρεσβερατρόλη, η οποία επιβεβαιώθηκε από την επιμόλυνση ενός siRNA κατά ATG5. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι δεν θα είναι ευεργετική για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με έναν αναστολέα αυτοφαγία εκτός από ρεσβερατρόλη. Συνδυασμός της ρεσβερατρόλης με μια σκανδάλη αυτοφαγία θα μπορούσε ενδεχομένως να ενισχύσει την αντικαρκινική δράση. Αυτό θα ήταν μια ενδιαφέρουσα και σημαντικό θέμα που αξίζει περαιτέρω μελέτης. Σημαντικά, προηγούμενες μελέτες σε οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων απέδειξαν το αντίθετο αποτέλεσμα με αναστολή της αυτοφαγία σε κυτταρικό θάνατο ρεσβερατρόλη που προκαλείται [34]. Αυτό μπορεί να οφείλεται εν μέρει στις διαφορετικές δοσολογίες και τους τύπους των καρκινικών κυττάρων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, και αυτοφαγία είναι μια σύνθετη διαδικασία που λειτουργεί σαν δίκοπο μαχαίρι όταν αξιοποιηθεί ως ένας τρόπος για την καταπολέμηση του καρκίνου [35-39].

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Η ρεσβερατρόλη δεν προκάλεσε απόπτωση σε υγιή κύτταρα επιφάνεια επιθηλιακών ωοθηκών. Κυτταρομετρίας ροής

αναλύσεις των Ανθρωπίνων Ωοθηκών επιφανειακών επιθηλιακών Κύτταρα κύτταρα (HOSEpiC), που αναπτύχθηκαν με ωοθηκών Επιθηλιακά μέσο κυτταρικής παρέχονται από τον κατασκευαστή (ScienCell Research Laboratories). θεραπεία ρεσβερατρόλη διεξήχθη στα 100 μΜ για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Αηηβχίην και sytox πράσινο για πρώιμη απόπτωση και νεκρωτικές δείκτες κυτταρικού θανάτου αντίστοιχα αργά απόπτωση /. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των κυτταρομετρία ροής δεδομένων δεν έδειξαν σημαντική διαφορά στις αρχές του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου δείκτες αλλά λίγο σημαντική αύξηση στα τέλη απόπτωση /νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο δείκτες. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος? n = 3 /ομάδα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0129196.s001

(TIFF)