Αφηρημένο

Ιστορικό

Η μοριακή βάση και τα χαρακτηριστικά της οικογενειακής μη μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς είναι ελάχιστα κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε microRNA (miRNA) των χαρακτηριστικών των οικογενή και σποραδικά δείγματα θηλώδους όγκου του καρκίνου του θυρεοειδούς.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Γονιδιώματος ευρύ miRNA προφίλ της σποραδικής και οικογενούς θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς διεξήχθη . Διαφορικά εκφρασμένων miRNAs επικυρώθηκαν από ποσοτική RT-PCR. Η έκτοπη έκφραση του miR-886-3p σε σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς διεξήχθη για να προσδιορίσει οδών στο στόχαστρο της miRNA, καθώς και, για να προσδιοριστεί η επίδρασή της επί των κυττάρων του όγκου βιολογία. Βρήκαμε τέσσερις διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ οικογενή και σποραδικά δείγματα όγκων του καρκίνου του θηλώδους του θυρεοειδούς. MiR-886-3p και miR-20a επικυρώθηκαν να εκφράζονται διαφορικά από 3 και 4 φορές, αντίστοιχα. ανάλυση μονοπατιού των δεδομένων έκφρασης γονιδιώματος-ευρεία σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την ανάλυση miR-886-3p και πρόβλεψη στόχου έδειξε γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και τις οδούς εστιακής προσκόλλησης ρυθμίζονταν από miR-886-3p. Η υπερέκφραση του miR-886-3p σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς ανέστειλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ο αριθμός και το μέγεθος των σφαιροειδών και κυτταρικής μετανάστευσης. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-886-3p αύξησε τον αριθμό των κυττάρων στη φάση S.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα ευρήματά μας για πρώτη φορά δείχνουν ότι το miR-886-3p παίζει σημαντικό ρόλο σε θυρεοειδούς βιολογία κυττάρου όγκου του καρκίνου και ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και εστιακή προσκόλληση. Έτσι, miR-886-3p μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην έναρξη και ή εξέλιξη του θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς

Παράθεση:. Xiong Υ, Zhang L, Holloway AK, Γου Χ, Su L, Kebebew Ε (2011) MiR-886-3p Ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, και δυσρυθμισμένη σε οικογενής μη μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς. PLoS ONE 6 (10): e24717. doi: 10.1371 /journal.pone.0024717

Συντάκτης: Marian Ludgate, Πανεπιστήμιο του Cardiff, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 10, Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 17, Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Οκτ, 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του θυρεοειδούς είναι μία από τις ταχύτερα αναπτυσσόμενες διαγνώσεων καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες με περισσότερες από 44.000 νέες περιπτώσεις εκτιμάται ότι θα συμβεί το 2011 [1]. Η οικογενής μη μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς (FNMTC) μπορεί να παρουσιαστεί ως ένα δευτερεύον συστατικό της οικογενούς σύνδρομα καρκίνου (, νόσο του Cowden, το Carney συγκρότημα τύπου 1, το σύνδρομο Werner, McCune-Albright σύνδρομο Gardner) είτε ως χαρακτηριστικό κυριαρχούν [2]. Οι περισσότερες περιπτώσεις FNMTC είναι ο καρκίνος του θυρεοειδούς θηλώδες και έχουν ένα αυτοσωματικό κυρίαρχο μοτίβο κληρονομικότητας με ατελή διεισδυτικότητα. FNMTC λογαριασμών για έως και 8% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς [2], [3], [4], [5], [6]. Στα οικογενή σύνδρομα καρκίνος αναφέρθηκε παραπάνω, οι ασθενείς εμφανίζουν διακριτά εξωθυρεοειδική αλλοιώσεις και τα γονίδια ευαισθησίας υπεύθυνα για αυτά τα σύνδρομα γνωστές. Ωστόσο, η πλειοψηφία (& gt? 95%) των περιπτώσεων FNMTC εμφανίζονται ως απομονωμένες οικογενή nonmedullary περιπτώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς για τις οποίες το γονίδιο (-α) επιδεκτικότητα είναι άγνωστη

FNMTC ορίζεται ως όταν δύο ή περισσότερες συγγενείς πρώτου βαθμού. επηρεάζονται με μη μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς. Η γενετική βάση της FNMTC είναι ελάχιστα κατανοητή. Σε μελέτες σύνδεσης, αρκετές ομάδες έχουν εντοπίσει χρωμοσωμικές θέσεις που σχετίζονται με FNMTC: 1q21, 2q21, 6q22, 8p23.1-Ρ22, και 19p13.2 [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Η ανάλυση της μεταλλαγής έδειξε ότι συγγενικούς κύκλους με FNMTC δεν έχουν μεταλλάξεις βλαστικής στο

BRAF

,

RAS

, και

PTC

γονιδίων RET /που συνήθως μεταλλαγμένο σωματικά σε καρκίνους του θυρεοειδούς της θυλακιώδη κύτταρα προέλευσης [2]. Επιπλέον, η ανάλυση των σωματικών μεταλλάξεων (

BRAF

,

RAS

, και

RET /PTC

) σε σποραδική και οικογενή δείγματα όγκων θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς δεν έδειξε καμία διαφορά στην τιμή και το είδος των μεταλλάξεων σε αυτά τα ιστολογίες [2], [6], [14]. Έτσι, είναι άγνωστο αν το μοριακό προφίλ της σποραδικής έναντι οικογενούς καρκίνου του θυρεοειδούς είναι διαφορετική. Επιπλέον, είναι επίσης άγνωστο αν υπάρχει μοριακή βάση για την μικρότερη ηλικία έναρξης και πιο επιθετική συμπεριφορά που παρατηρείται σε ασθένεια FNMTC σύγκριση με σποραδική ασθένεια [6], [15], [16].

Τα microRNAs ( miRNAs) είναι μικρές (-21-νουκλεοτίδιο μήκους) μη κωδικοποιητική RNAs, τα οποία ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση και παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ογκογένεσης [1] – [2]. Ένα ειδικό miRNA μπορεί να λειτουργεί είτε ως ένα ογκογονίδιο ή ως καταστολέας όγκων με τη ρύθμιση της έκφρασης του ογκογονιδίου (ες) στόχο και γονίδιο (α) καταστολέα όγκου, αντίστοιχα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, miRNAs προσδένονται σε 3′-αμετάφραστες περιοχές (3′-UTRs) των mRNA στόχου, οδηγώντας σε υποβάθμιση mRNA ή καταστολή της μετάφρασης. Στον καρκίνο του θυρεοειδούς, ένα κοινό πολυμορφισμό μονού νουκλεοτιδίου σε προ-miR-146a έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την έκφραση ώριμου miRNA και να αυξήσει τον κίνδυνο ανάπτυξης θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς [17]. Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχουν μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σύγκριση των προφίλ miRNA της οικογενειακής και σποραδικές καρκίνων γενικότερα και ειδικά για τον καρκίνο του θυρεοειδούς.

Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε miRNA προφίλ των οικογενειακών και σποραδικές δείγματα όγκων του καρκίνου του θηλώδους του θυρεοειδούς. Βρήκαμε ότι miR-886-3p ήταν προς τα κάτω σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, σε σύγκριση με την κανονική και εκφράζονται διαφορικά στην οικογενή θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, σε σύγκριση με σποραδικές θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς. ανάλυση μονοπατιού των δεδομένων έκφρασης γονιδιώματος-ευρεία σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την ανάλυση miR-886-3p και πρόβλεψη στόχου έδειξε γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και εστιακή πρόσφυση της οδού ρυθμίζονταν από miR-886-3p. Πράγματι, η υπερέκφραση του miR-886-3p σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς ανέστειλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ο αριθμός και το μέγεθος των σφαιροειδών και μετανάστευσης.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα θυρεοειδούς ιστού

δείγματα ιστού του θυρεοειδούς καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο κατά τη στιγμή της θυρεοειδεκτομή. Το διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου έχουν εγκριθεί αυτό το πρωτόκολλο έρευνας μετά από ενημέρωση γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Όλα τα δείγματα ιστού υποβλήθηκαν σε πρόσθετες ιστολογική εξέταση από μια ενδοκρινική παθολόγο για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση και τον εντοπισμό δειγμάτων με καρκινικά κύτταρα μεγαλύτερη από 80%. Χρησιμοποιήσαμε 28 συμβατικά δείγματα θηλώδους όγκου καρκίνου του θυρεοειδούς (21 σποραδικές, 7 οικογενής) και 10 δείγματα φυσιολογικό θυρεοειδικού ιστού για τη συστοιχία προφίλ miRNA. Ένα ερωτηματολόγιο οικογενειακό ιστορικό χρησιμοποιήθηκε για να εξακριβωθεί εάν οι όγκοι θα πρέπει να χαρακτηριστεί ως σποραδική ή οικογενής. FNMTC ορίστηκε όταν 2 ή περισσότερα συγγενείς πρώτου βαθμού έχουν προσβληθεί από καρκίνο του θυρεοειδούς ωοθυλακίων κυττάρων προέλευσης. Περιπτώσεις καρκίνου του θυρεοειδούς επιβεβαιώθηκαν σε προσβεβλημένα μέλη της οικογένειας. Όλα τα δείγματα όγκων FNMTC ήταν από διαφορετικές οικογένειες. Σε 5 από 7 δείγματα όγκων του FNMTC υπήρχαν τρεις συγγενείς πρώτου βαθμού που επλήγησαν και σε 2 από 7 υπήρχαν δύο συγγενείς πρώτου βαθμού που επηρεάζονται. Τα δείγματα όγκων αντιστοιχήθηκαν για την ηλικία (+/- 2 έτη), το φύλο και το στάδιο του καρκίνου ΤΝΜ (σε αναλογία 3:01 της σποραδικής-to-οικογενειακές υποθέσεις).

Mirna μικροσυστοιχιών

ένα σύνολο των 28 μικροσυστοιχίες (Exiqon ™) έτρεξαν σύγκριση τόσο οικογενειακό και σποραδικούς καρκίνους του θυρεοειδούς θηλώδες σε μια πισίνα του φυσιολογικού θυρεοειδικού ιστού. Το

2 αναλογία καταγραφής του Cy5 με Cy3 σημάτων ένταση υπολογίστηκε για κάθε miRNA σε κάθε σειρά (χωρίς αφαίρεση υποβάθρου) και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκε με την εκτύπωση άκρη loess εξομάλυνση [18], [19]. Από μεμονωμένες miRNAs εκπροσωπήθηκε από τέσσερις ανιχνευτές στη συστοιχία, η διάμεση κανονικοποιημένη log

2 αναλογία των ανιχνευτών επανάληψη (για εκείνους με περισσότερα από ένα unflagged ανιχνευτής) χρησιμοποιήθηκε ως τιμή για το miRNA. Η συνοψίζονται ημερολόγιο

2 αναλογίες για κάθε πείραμα χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια σε μετριάστηκε t-στατιστικών στοιχείων και υπολογισμού p-τιμή χρησιμοποιώντας το πακέτο limma στην Ε /Bioconductor [20], [21] με προσαρμογή για ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη χρησιμοποιώντας το Benjamini-Hochberg μέθοδο [22]. Mirna δεδομένα μικροσυστοιχιών, η οποία είναι συμβατή MIAME, έχει κατατεθεί στη βάση δεδομένων GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).

Οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου θυρεοειδούς FTC-133 (θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς) και TPC-1 (θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς) διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM) με 4.500 mg /L D-γλυκόζη, L-γλουταμίνη, και 110 mg /L πυροσταφυλικό νάτριο) συμπληρωμένο με 10% ορό, του θυρεοειδούς ορμόνης (TSH) (10 mU /ml), πενικιλλίνη (10000 U /ml), στρεπτομυκίνη (10.000 U /mL), Fungizone (250 mg /ml) και ινσουλίνη ( 10 (μg /mL) σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 και 95% O

2 ατμόσφαιρα. και οι δύο κυτταρικές σειρές εγκατεστημένος και επικυρώνονται καρκινικές κυτταρικές γραμμές του θυρεοειδούς [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. Η κυτταρική γραμμή TPC-1 παρεσχέθη από τον Dr. Nabuo Satoh (Ιαπωνία) και FTC-133 κυτταρική γραμμή που παρέχεται από τον Dr. Peter Goretzki (Γερμανία). άνευ ορού μέσο (DMEM- F12 media) συμπληρωμένο με 4 ορμόνες (ινσουλίνη [10 μg /mL], σωματοστατίνη [10 ng /mL], τρανσφερρίνη [5 μg /mL], και υδροκορτιζόνη [0,36 ng /mL]) χρησιμοποιήθηκε για τις λειτουργικές μελέτες.

miRNA Επιμόλυνση

πρόδρομος Ώριμη miRNA (προ-miR-886-3p, Applied Biosystems, Foster City, CA) διαμολύνθηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή . Μία τυχαία ακολουθία προ-miR (προ-miR-αρνητικός έλεγχος) (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (MIR-NC).

Απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. TaqMan miRNA Αναλύσεις (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί το επίπεδο έκφρασης των miRNAs. Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με ένα miRNA-ειδικό εκκινητή, ακολουθούμενη από PCR πραγματικού χρόνου με ανιχνευτές TaqMan. U6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος. Η σχετική ποσότητα των mRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον Προσδιορισμό TaqMan (Applied Biosystems) σε ένα σύστημα HT ΑΒΙ 7900, χρησιμοποιώντας ανθρώπινο GAPDH ως ένας ενδογενής έλεγχος. Η μέθοδος ΔΔ Ct χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό των επιπέδων έκφρασης.

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού CyQUANT κυττάρων (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

δοκιμασία Μετανάστευση

Η μεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς αξιολογήθηκε με την δοκιμασία πληγή γρατσουνιά σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε μονοστοιβάδα. Περίπου 150.000 κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-886-3p (25 ηΜ) ή miR-NC (25 ηΜ) και στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν για 44 ώρες. Στη συνέχεια, τρεις κάθετες τραύματα έγιναν με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας 10 μΙ και μία οριζόντια γραμμή έγινε στις τρεις γραμμές για να επιτρέψει την παρατήρηση των κυττάρων στο ίδιο σημείο. Τα κύτταρα επιθεωρήθηκαν κάθε 6 ώρες και μετρήσεις που λαμβάνονται μέχρι και 22 ώρες από την αρχική πληγή.

Genome κλίμακα μικροσυστοιχιών mRNA έκφραση

TPC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-886- 3p και προ-miR-NC. Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Ολικό RNA παρασκευάσθηκε από τριπλές καλλιέργειες κυττάρων χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ποιότητα του RNA εξασφαλίζεται, πριν επισήμανση, με τη χρήση της Agilent RNA 6000 Νανο kit και το Bioanalyzer 2100. Εκατόν πενήντα ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του cDNA αντίστροφη μεταγραφή, τη σύνθεση, την ενίσχυση, τον κατακερματισμό και τερματικό επισήμανσης με την επισήμανση που GeneChip WT Sense Target και Ελέγχου Αντιδραστήρια (Affymetrix, Santa Clara, CA). Περίπου 25 ng /μΙ cDNA υβριδοποιήθηκε στο Affymetrix Human Gene 1,0 ST Array GeneChip. Οι συστοιχίες πλύθηκαν και χρωματίζονται χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο ρευστών διαδικασία FS450_0007 σε ένα ρευστών Σταθμός Affymetrix 450. Οι εντάσεις καθετήρα σαρώθηκαν από τον σαρωτή GeneChip 3000. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκε και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Partek Γονιδιωματική Σουίτα (Partek Inc., St Louis, MO , ΗΠΑ). Η ανάλυση της διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των εν λόγω σύνολα ανιχνευτή σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδων. Ο κατάλογος γονίδιο διηθείται με πολλαπλή μεταβολή αποκοπής 2. Αυτό οδήγησε στην παραγωγή του καταλόγου γονιδίου με γονίδια τα οποία έχουν σημαντικές διαφορική έκφραση σε P≤0.001 και 2-φορές ή περισσότερες διαφορές. ανάλυση της οδού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των πόρων βιοπληροφορικής DAVID.

ροής κυτταρικού κύκλου ανάλυση κυτταρομετρίας

Τα αποτελέσματα του miR-886-3p υπερέκφραση για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, TPC-1 και FTC-133 κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-886-3p ή προ-miR-NC για 72 ώρες έως 120 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (500 U /mL) άνευ ϋΝάσης RNase και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. Τα κυτταρικά δείγματα αναλύθηκαν σε ένα FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA), και G

0G

1, S και G

κλάσματα φάση 2Μ προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFitLT (Topsham, ΜΕ).

ροής η απόπτωση ανάλυση κυτταρομετρίας

Τα αποτελέσματα του miR-886-3p υπερέκφραση σε κυτταρικό θάνατο αξιολογήθηκαν με Αννεξίνη V- FITC και ροής ιωδιούχου προπιδίου κυτταρομετρίας χρησιμοποιώντας ApoAlert αννεξίνη V κιτ (Clontech, Mountain View, CA). TPC-1 και κύτταρα FTC-133 μορφομετατράπηκαν με προ-miR-886-3p ή προ-miR-NC για 72 ώρες έως 120 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V- FITC και ιωδιούχο προπίδιο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δείγματα κυττάρων αναλύθηκαν σε FACSCalibur, και προσδιορίστηκαν αποπτωτικά κλάσματα.

Δοκιμασία λουσιφεράσης

Το ζεύγος βάσεων 1160 3′-UTR του

CDC6

κλωνοποιήθηκε στην κενή λουσιφεράσης φορέα ρεπόρτερ pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), δημιουργώντας ένα άγριου τύπου

CDC6

κατασκεύασμα λουσιφεράσης UTR (pEZX-WT-UTR). Μεταλλάξεις στο 3′-UTR του

CDC6

σχεδιάστηκαν για τα πρώτα τέσσερα νουκλεοτίδια (CACC να GTGG) ή τα τρία τελευταία νουκλεοτίδια (CGC GCG να) της περιοχής σπόρου 7-μερές της υποθετικής θέσης δέσμευσης του miR-886-3p, δημιουργώντας δύο μεταλλάξεις ονομαστεί ως pEZX-Mut-UTR-01 και pEZX-Mut-UTR-02, αντίστοιχα. Όλα τα κατασκευάσματα αλληλουχία-επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Για τον προσδιορισμό διπλής λουσιφεράσης, TPC-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 12 φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν με 0.25 μ§ του κατασκευάσματος ανταποκριτή και 15 pmol του προ-miR-886-3p ή προ-miR-NC χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Στις 24 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για τόσο πυγολαμπίδας και λουσιφεράσης Renilla χρησιμοποιούν Luc-Pair ™ miR Λουσιφεράσης Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) σε αναγνώστη μικροπλακός SpectraMax M5e (Molecular Device, Sunnyvale, CA) σύμφωνα με τους κατασκευαστές «οδηγίες.

Ανάλυση δεδομένων

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Για να προσδιοριστεί η στατιστική σημασία, το Mann-Whitney U test, t test και ανάλυση διασποράς χρησιμοποιήθηκαν, ανάλογα με την περίπτωση. Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Αποτελέσματα

Mirna προφίλ της σποραδικής και οικογενούς θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς

σύγκριση του προφίλ έκφρασης των miRNAs της οικογενειακής και σποραδικές θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς δείγματα όγκων με τη χρήση ολόκληρου του γονιδιώματος ανάλυση miRNA μικροσυστοιχιών. Τα δείγματα ταιριάζουν με βάση την ηλικία και το φύλο των ασθενών, και το στάδιο της ΤΝΜ όγκου. έκφραση miRNA σε δείγματα όγκων συγκριτικά με δείγματα φυσιολογικού ιστού του θυρεοειδούς. Υπήρχαν 232 miRNAs σε σποραδικές και 135 miRNAs στην οικογενή θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς που απορρυθμισμένης σε σύγκριση με δείγματα φυσιολογικού ιστού του θυρεοειδούς (Σχήμα 1Α) (ρ & lt? 0,05). Εκατόν εννέα από τις απορρύθμισης του miRNAs ήταν μοναδικά σε σποραδικές, 13 ήταν μοναδικό στην οικογενή, και τέσσερις miRNAs ήταν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ σποραδικής και οικογενούς καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδες (Εικόνα 1Α και 1Β). Δύο από τις τέσσερις miRNAs επικυρώθηκαν να είναι σημαντικά εκφράζονται διαφορικά μεταξύ οικογενή και σποραδική θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 2). Τόσο miR-20a και miR-886-3p ήταν επίσης σημαντικά προς τα κάτω σε σποραδικό καρκίνο του θηλώδους θυρεοειδούς σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του θυρεοειδούς (ρ = 0,032 και ρ = 0.0032, αντίστοιχα) (Εικόνα 1Β).

Α) Σύγκριση εκφράζονται διαφορικά miRNAs σε σποραδική και την οικογενή θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του θυρεοειδούς. Η σποραδική κύκλος δείχνει τη σύγκριση αυτής της ομάδας στην κανονική θυρεοειδικού ιστού, το οικογενειακό κύκλο δείχνει τη σύγκριση αυτής της ομάδας στην κανονική θυρεοειδικού ιστού, και η οικογενής-σποραδικές κύκλος δείχνει σύγκριση μεταξύ οικογενή και σποραδικά καρκινώματα. Β) Σχετική τοις εκατό miRNA διαφορά έκφρασης μεταξύ οικογενή και σποραδικά καρκινώματα κανονικοποιούνται σε φυσιολογικά δείγματα ιστού. * Τιμή p & lt?. 0.05

Η

MiR-20α ήταν 4 φορές και miR-886-3p ήταν 3 φορές υψηλότερη σε οικογενειακό θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς σε σύγκριση με σποραδικές (p = 0,025 για το miR-20a , p = 0,028 για το miR-886-3p, p = 0,37 για το miR-195, p = 0,46 για το miR-29γ). Οι τιμές είναι συν μέσο έκφρασης και μείον το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει την αναλογία των miRNA και U6 RNA χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCt μέθοδο, και τη χαμηλότερη τιμή του δείγματος ορίστηκε σε 1,0.

Η

γονίδια-στόχοι και πορείες of Mir-886- 3ρ σε θυρεοειδή κύτταρα καρκίνου

Λαμβανομένης υπόψη της λειτουργίας του miR-886-3p σε κύτταρο όγκου βιολογία είναι άγνωστη, ήμασταν πρώτα ενδιαφέρονται για τον προσδιορισμό του γονιδίου-στόχου (ων) και της οδού (ες) που μπορεί να ρυθμίζεται από miR -886-3p. Χρησιμοποιήσαμε δύο προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό miR-886-3p στόχους: πρόβλεψη στόχου miRNA και ανάλυση έκφρασης mRNA του γονιδιώματος σε επίπεδο σε κύτταρα που υπερεκφράζουν miR-886-3p (Σχήμα 3). Βρήκαμε 730 προβλέψει γονιδίων στόχων για miR-866-3p χρησιμοποιώντας βάσεις δεδομένων πρόβλεψη-στόχο (Μιράντα, miRBase, στόχος σαρώσεις). Με την εκτέλεση ανάλυσης μονοπατιού KEGG στις mRNAs απορρυθμισμένη σε miR-886-3p λιγότερο υπό εκφράζεται κύτταρα, βρήκαμε γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και τις οδούς εστιακής προσκόλλησης είχαν misexpressed κατόπιν miR-886-3p υπερέκφραση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του θυρεοειδούς. Ενσωμάτωση αυτών των βιοπληροφορικής προσεγγίσεις εντόπισε έξι γονίδια κοινά μεταξύ των αναλύσεων. Ως εκ τούτου, αυτά τα γονίδια προβλέπεται να είναι miR-886-3p στόχους.

Η

Για να αντιμετωπιστεί περαιτέρω την υπόθεση αυτή, επιλέξαμε τέσσερα από αυτά τα γονίδια για την επικύρωση κατά miR-886-3p υπερέκφραση. Βρήκαμε σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω όλων των τεσσάρων γονιδίων κατά miR-886-3p υπερέκφραση με ποσοτική RT-PCR (Σχήμα 4). Από αυτά τα γονίδια, ήμασταν ενδιαφέρεται ιδιαίτερα

CDC6

δεδομένου ότι αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί ένα ισχυρός ρυθμιστής της αντιγραφής του DNA και ογκογένεση [27]. Είναι ενδιαφέρον, ανάλυση στυπώματος western έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση του

CDC6

έκφραση πρωτεΐνης εντός 72 ωρών από miR-886-3p υπερέκφραση (Σχήμα 5). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω εάν

CDC6

είναι ένας άμεσος στόχος του miR-886-3p ρύθμιση, επιμόλυνση του 3’UTR

CDC6

άγρια ​​φορέα τύπου στον καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων με miR-886-3p υπερέκφραση έδειξαν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης υποδηλώνοντας ότι

CDC6

ήταν άμεσο στόχο του miR-886-3p (Σχήμα 6). Μεταλλάξεις στην προβλεπόμενη περιοχή σπόρων για miR-886-3p στην 3’UTR του

CDC6

καταργηθεί αυτό το αποτέλεσμα, γεγονός που υποδηλώνει περαιτέρω ότι το miR-886-3p ρυθμίζει άμεσα

έκφραση CDC6

(Σχήμα 6 ).

Η επιμόλυνση των προ-miR-886-3p μείωσε σημαντικά τα επίπεδα mRNA των τεσσάρων γονιδίων στόχων (

CDC6

,

PIP5K1C

,

ΡΧΝ

,

ΖΥΧ

) σε Α) TPC-1 κυτταρική γραμμή και Β) κυτταρική σειρά FTC-133 (* p & lt? 0,05? ** p & lt? 0,01). Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει την αναλογία του συγκεκριμένου γονιδίου στόχου και GAPDH χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCt μέθοδο, και την τιμή της ομάδας miR-NC ορίστηκε σε 1,0 για να γίνεται σύγκριση της πτυχής διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών γραμμών και γονιδίων.

Α) Εκπρόσωπος δυτική εικόνα κηλίδα του

CDC6

πρωτεΐνη έκφρασης στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με προ-miR-886-3p σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα (miR-NC). Β) Band πυκνότητας ποσοτικοποίηση των

CDC6

έκφραση της πρωτεΐνης. Το ImageJ λογισμικό (Maryland, USA) χρησιμοποιήθηκε για πυκνομετρική ανάλυση των Western blots.

Η

Α) φορέα pEZX-WT-UTR με τόσο Renilla λουσιφεράσης (hRLuc) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος και λουσιφεράση πυγολαμπίδας (hLuc) ήταν ανοδικά του κατασκευάσματος 3′-UTR. Β) θέση πρόσδεσης Υποθετικές του miR-886-3p στο

CDC6

3 ‘UTR μαζί με τις μεταλλάξεις στην προβλεπόμενη περιοχή σπόρου. C) Αριστερό σχήμα δείχνει δραστικότητα λουσιφεράσης του pEZX-WT-UTR στα κύτταρα TPC-1 όταν συν-επιμολυσμένα με προ-miR-886-3p ή προ-miR-NC, ρ & lt? 0.05. Μεσαία και δεξιά στοιχεία showluciferase δραστηριότητα pEZX-Mut-UTR-01 και pEZX-Mut-UTR-02 στο TPC-1 κύτταρα όταν συν-επιμολυσμένα με προ-miR-886-3p ή προ-miR-NC, αντίστοιχα. Όλες οι μετρήσεις λουσιφεράσης έγιναν εις τριπλούν και αναγνώσεις έγιναν στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Η

MiR-886-3p ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και τον πολλαπλασιασμό, και το σχηματισμό σφαιροειδές και τη μετανάστευση

Επειδή βρήκαμε miR-886-3p ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και τις οδούς εστιακής προσκόλλησης, ενδιαφερθήκαμε για τον προσδιορισμό του ρόλου του miR-886-3p επί του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό πολλαπλασιασμό, καθώς και ο σχηματισμός σφαιροειδές και τη μετανάστευση. Έχουμε καθορίζεται για πρώτη φορά την βασική έκφραση της miR-886-3p σε τέσσερα καλά χαρακτηρισμένο και επικυρώνονται καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές και διαπίστωσε ότι FTC-133 και TPC-1 είχαν υψηλότερο και χαμηλότερο επίπεδο του miR-886-3p έκφρασης, αντίστοιχα (Σχήμα 7Α ). Χρησιμοποιήσαμε αυτές τις γραμμές κυττάρων για να αναλύσει την επίδραση του miR-886-3p επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η υπερέκφραση του miR-886-3p πολλαπλασιασμός ανέστειλε σημαντικά κυττάρων κατά 79% σε κύτταρα FTC-133 σε 144 ώρες (ρ & lt? 0.001) και 77% σε κύτταρα TPC-1 στις 120 ώρες (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με προ-ΜΙΚ NC (Σχήμα 7Β).

Α) Βασική έκφραση του miR-886-3p σε τέσσερις γραμμές του καρκίνου του θυρεοειδούς. Β) Επίδραση του miR-886-3p υπερέκφραση στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς. Προ-miR-886-3p ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. * P≤0.001.

Η

Με δεδομένη την βαθιά επίδραση του miR-886-3p υπερέκφραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, θελήσαμε να εξερευνήσετε την επόμενη το μηχανισμό του miR-886-3p μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης. Εμείς, ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες κυτταρομετρίας ροής και αννεξίνης V για να προσδιοριστεί η επίδραση του miR-886-3p στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, αντίστοιχα. Η υπερέκφραση του miR-886-3p αύξησε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων στη φάση S (12-16%), ενώ μείωση του αριθμού των κυττάρων σε G

0 /G

1 (11-22%) (ρ & lt? 0.001 ). Εμείς, ωστόσο, δεν διαπίστωσαν σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων στην απόπτωση με και χωρίς miR-886-3p υπερέκφραση. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το miR-886-3p ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και τον πολλαπλασιασμό συνεπής με miR-886-3p οδό και στόχο την πρόβλεψη μας αναλύσεις.

Επειδή miR-886-3p οδό και στόχο αναλύσεις έδειξαν γονίδια που ρυθμίζουν εστιακής προσκόλλησης ήταν misexpressed, προσδιορίσαμε επίσης το αποτέλεσμα του miR-886-3p υπερέκφραση στο σχηματισμό σφαιροειδές καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρική σειρά και κυτταρική μετανάστευση. Η κυτταρική σειρά FTC-133 σχηματίζει σφαιροειδή, όταν καλλιεργηθούν σε ultralow φιάλες προσκολλημένη πολιτισμό μέσα σε 72 ώρες. Συνεπής με την επίδραση του miR-886-3p υπερέκφραση σε κύτταρα μονοστοιβάδας, παρατηρήσαμε μια μείωση στον αριθμό και το μέγεθος των σφαιροειδών στον καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρική γραμμή FTC-133 η οποία διατηρήθηκε για μέχρι 2 εβδομάδες σε καλλιέργεια (Σχήμα 8). Επιπλέον, miR-886-3p υπερέκφραση μείωσε τις πολλαπλές κυτταρικές υποκατάστημα-όπως δομές που παρατηρείται στα κύτταρα αρνητικού ελέγχου. Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η επίδραση του miR-886-3p υπερέκφραση στην κυτταρική μετανάστευση, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μηδέν πληγή. Η υπερέκφραση του miR-886-3p ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση του TPC-1 κυτταρική γραμμή (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 9)

Pre-miR-886-3p μείωσε το μέγεθος και τον αριθμό των σφαιροειδή στην FTC. -133 κυτταρική σειρά. Α) αντιπροσωπευτική εικόνα των σφαιριδίων σε καλλιέργεια με miR-886-3p υπερέκφραση. Β) Ποσοτικοποίηση των σφαιροειδές διαφορά με miR-886-3p υπερέκφραση. Η συνολική έκταση που καταλαμβάνεται από σφαιροειδή μέσα σε μια εικόνα μετρήθηκε με περικυκλώνει την περίμετρο κάθε σφαιροειδές, σημειώνοντας ολόκληρη την περιοχή, καθώς και τον υπολογισμό των αριθμών pixel χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (Maryland, USA). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα. (*** Υποδεικνύει ρ & lt? 0.001).

Η

Pre-miR-886-3p μειώθηκε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων σε 22 ώρες (p & lt? 0.001). Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα της δοκιμασίας πληγής σε χρόνο 0 και 22 ώρες μετά το μηδέν. Β) Ποσοτικοποίηση των τραυμάτων κλείσιμο πλάτος με miR-886-3p υπερέκφραση. Έξι διαφορετικές τοποθεσίες οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης ανεστραμμένης (μεγέθυνση 10x) σε κάθε πλάκα σε διαφορετικά χρονικά σημεία, και τρεις πλάκες χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ομάδα. Το πλάτος του τραύματος στις εικόνες 10 × μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πάχος. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα. (*** Υποδεικνύει ρ & lt? 0.001).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε miRNA προφίλ των οικογενειακών και σποραδικές δείγματα όγκων του καρκίνου του θηλώδους του θυρεοειδούς. Βρήκαμε τέσσερα miRNAs εκφράζονται διαφορικά μεταξύ αυτών των ομάδων, δύο από τα οποία, miR-886-3p και miR-20a, επικυρώθηκαν να εκφράζονται διαφορικά με 3- και 4-φορές, αντίστοιχα. Και οι δύο αυτές miRNAs ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό θυρεοειδούς με 3.5-4 φορές. Γονιδίωμα-ευρύ μονοπάτι γονιδιακής έκφρασης και την πρόβλεψη-στόχο αναλύσεις απέδειξαν γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και τις οδούς εστιακής προσκόλλησης ήταν ο αποδέκτης της miR-886-3p. Η υπερέκφραση του miR-886-3p σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς ανέστειλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ο αριθμός και το μέγεθος των σφαιροειδών, και κυτταρικής μετανάστευσης. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-886-3p αύξησε τον αριθμό των κυττάρων στη φάση S και μείωσε τον αριθμό των κυττάρων σε G

0G

1 φάση με καμία επίδραση στην απόπτωση.

Δεν είμαστε ενήμεροι τυχόν άλλες μελέτες που έχουν σχέση με το προφίλ miRNA των όγκων που σχετίζονται με οικογενή σύνδρομα καρκίνου με σποραδικά εμφανιζόμενος ομολόγους τους. Μια τέτοια ανάλυση παρέχει σημαντικές γνώσεις σχετικά με τις γενετικές οδούς που μπορεί να είναι διαφορετική σε ιστολογικά παρόμοια όγκους, οι σημαντικοί στόχοι της προδιαθέσεως γενετικές αλλαγές, και, στην περίπτωση της FNMTC, η μοριακή βάση. Αν και οι περισσότεροι ερευνητές έχουν προτείνει ότι FNMTC είναι μια ξεχωριστή κληρονομικό σύνδρομο, τα επιχειρήματα ενάντια σε αυτό περιλαμβάνουν ότι, 1) το ίδιο γονίδιο ευαισθησίας (ες) τόποι δεν έχουν παρατηρηθεί σε διάφορες μελέτες σύνδεσης ή, 2) μη κακοήθη όγκων του θυρεοειδούς είναι συχνές και επομένως θυρεοειδούς διάγνωση του καρκίνου μπορεί να είναι μια δράση ιδρυτή ή συμπτωματικά ανακάλυψα, και 3) η εκφραστικότητα είναι μεταβλητή [2]. Από την άλλη πλευρά, αρκετές μελέτες υποστηρίζουν FNMTC ως μια ξεχωριστή κληρονομικό σύνδρομο, διότι, 1) έχουν πολλαπλούς συγγενικούς κύκλους έχουν αναφερθεί να έχουν γενεών εμφάνιση FNMTC, 2) υπάρχει ένα υψηλότερο ποσοστό του καρκίνου του θυρεοειδούς σε άνδρες και τα παιδιά μέσα FNMTC γενεαλογία, 3 ) υπάρχει μια μικρότερη ηλικία της παρουσίασης, και 4) υπάρχει αρσενικό-να-αρσενικό μετάδοσης. Τέλος, επιδημιολογικές μελέτες αποδεικνύουν ότι ο κίνδυνος του καρκίνου του θυρεοειδούς σε ένα συγγενή πρώτου βαθμού ενός ασθενή με διάγνωση καρκίνου του θυρεοειδούς είναι 5-φορές υψηλότερα [28]. Δεδομένης αυτής της διαμάχης, που έθεσε ως στόχο να προσδιορίσει εάν τα προφίλ έκφρασης των οικογενειακών και σποραδικές θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς ήταν διαφορετικά. Ένας μεγάλος αριθμός των miRNAs ήταν απορρυθμισμένης τόσο οικογενή και σποραδική θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του θυρεοειδούς. Πραγματοποιήσαμε το προφίλ miRNA σε δείγματα όγκων από ασθενείς που ταιριάζουν ως προς την ηλικία, το φύλο και το στάδιο του καρκίνου ΤΝΜ. Η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιείται για την ελαχιστοποίηση παράγοντες σύγχυσης που θα μπορούσε να οδηγήσει σε διαφορετικό προφίλ έκφρασης miRNA λόγω των διαφορετικών έκταση της νόσου, ιστολογικούς υποτύπους του όγκου, και το καθεστώς της διαφοροποίησης του όγκου [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε προσεκτικό σχεδιασμό της μελέτης και την ανάλυσή μας παρέχουν τα ευρήματα τα οποία, για πρώτη φορά, να υποστηρίξει ένα μοριακό διαφορά στην οικογενή και σποραδική θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς.

Μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ οικογενή και σποραδική θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, δύο miRNAs επικυρώθηκαν να εκφράζονται διαφορικά από ποσοτική RT-PCR. Τόσο miR-20a (13q31.3) και miR-886-3p (5q31.2) δεν βρίσκονται σε χρωμοσωμικές θέσεις έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως ως ευαισθησίας τόπους από μελέτες σύνδεσης σε συγγενικούς κύκλους με FNMTC. Λόγω των μικρών μηκών νουκλεοτιδίου miRNAs, δεν προκαλεί έκπληξη το ότι οι γενετικές μεταβολές στο χρωμοσωμικό τόπους που κωδικοποιεί miR-20a και miR-886-3p μπορεί να έχουν χαθεί σε αυτές τις μελέτες, ακόμη και με τη χρήση των συστοιχιών SNP υψηλής ανάλυσης [13]. Στο μέλλον, η ανάλυση αλληλουχίας βλαστικής γραμμής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί εάν αυτές miRNAs είναι γονίδια ευαισθησίας υποψήφιος για FNMTC. Επιπλέον, θα είναι σημαντικό να καθοριστεί σε μελλοντικές μελέτες ο μηχανισμός της γενικής MiR-886-3p ρύθμιση προς τα κάτω στον καρκίνο του θυρεοειδούς οφείλεται σε αντιγραφή παραλλαγή αριθμό, αδρανοποίηση μεταλλάξεις ή διαγραφή.

Δεν ήταν ενδιαφέρονται για τη μελέτη του ρόλου του miR-886-3p στο θυρεοειδή καρκινογένεση για διάφορους λόγους. Κυρίως, η λειτουργία των miR-886-3p είναι άγνωστη, χρωμοσωμική θέση του γονιδίου miR-886 στο 5q31 μοιράζεται με τη μετατροπή β1 παράγοντα ανάπτυξης, ένα σημαντικό ρυθμιστή σε επιθηλιακά καρκινογένεση, και το επίπεδο των miR-886-3p διαφορά έκφρασης μεταξύ οικογενή και σποραδικές θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς ήταν μεγάλο (3 φορές). Συνεπής με τα ευρήματά μας, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε miR-886-3p ήταν προς τα κάτω σε καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα σε σύγκριση με το φυσιολογικό πνευμονικό ιστό, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή ρόλο ογκοκατασταλτικών για αυτό το miRNA [5]. Χρησιμοποιώντας δύο καλά χαρακτηρισμένα κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς με διαφορετικά επίπεδα της βασικής miR-866-3p έκφραση, αποδείξαμε ότι miR-886-3p διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, και ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και εστιακής προσκόλλησης μονοπάτια. Έχουμε επιλέξει

CDC6

, ένα ισχυρό ρυθμιστή της αντιγραφής του DNA και ογκογένεση [27], για περαιτέρω ανάλυση και διαπίστωσε ότι

CDC6

ήταν άμεσο στόχο του miR-886-3p. Αν και λειτουργικές μελέτες μας έγιναν σε γραμμές του καρκίνου του θυρεοειδούς, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το miR-886-3p είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής βιολογίας του όγκου στον καρκίνο του θυρεοειδούς [26].

Η υπερέκφραση του miR-886-3p προκάλεσε δραματική αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν την αντιγραφή του DNA και εστιακή προσκόλληση. Τέσσερα γονίδια (

CDC6

,

PIP5K1C

,

ΡΧΝ

,

ΖΥΧ

) είχε & gt? 4 φορές νοκ ντάουν με αυξημένη miR-886-3p έκφρασης .