Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες, και οι περισσότεροι ασθενείς έχουν εντοπισμένη νόσο κατά τη στιγμή της διάγνωσης . Ωστόσο, το 4% παρουσιάζουν ήδη με μεταστατική νόσο. Μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος είναι μια θεμελιώδης διαδικασία στην καρκινογένεση που έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Η κύρια εκδήλωση σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης είναι η καταστολή της E-cadherin από παράγοντες μεταγραφής, αλλά η διαδικασία ρυθμίζεται επίσης από microRNAs. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η ανάλυση των γονιδίων και έκφραση microRNA εμπλέκονται σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση σε εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη και κυτταρικές γραμμές μεταστατικού καρκίνου του προστάτη και συσχετίζονται με κλινικοπαθολογοανατομικές ευρήματα. Μελετήσαμε 51 δείγματα φρέσκου κατεψυγμένου ιστού από ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη (PCA) αντιμετωπίζονται από ριζική προστατεκτομή και τρία μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (LNCaP, DU145, PC3). Η έκφραση των γονιδίων 10 και 18 miRNAs αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε ομάδες ανάλογα με σκορ Gleason, παθολογικές στάδιο, προεγχειρητική PSA, βιοχημική υποτροπή, και ομάδα κινδύνου για την συσχέτιση με κλινικοπαθολογοανατομικές ευρήματα. Η πλειοψηφία των περιπτώσεων εντοπισμένη προστάτη έδειξε μια επιθηλιακά φαινότυπο, με υπερέκφραση της Ε-καδερίνης και υποέκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών. MiRNA-200 μέλη της οικογένειας και miRNAs 203, 205, 183, 373, και 21 υπερεκφράζεται, ενώ miRNAs 9, 495, 29b, και 1 ήταν υποεκφράζονται. χαμηλά επίπεδα έκφρασης των miRNAs 200b, 30α, και 1 ήταν σημαντικά σχετίζεται με παθολογικές στάδιο. Χαμηλότερη έκφραση του miR-200b συσχετίστηκε επίσης με σκορ Gleason ≥8 και μικρότερες βιοχημικής υποτροπής επιβίωση χωρίς. Επιπλέον, χαμηλά επίπεδα έκφρασης των επιπέδων miR-30a και υψηλής έκφρασης της βιμεντίνης και Twist1 παρατηρήθηκαν στην ομάδα υψηλού κινδύνου. Σε σύγκριση με τον πρωτογενή όγκο, οι μεταστατικές κυτταρικές γραμμές έδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-183 και Twist1. Εν ολίγοις, miRNAs 200b, 30α, 1, και 183 και τα γονίδια Twist1 και βιμεντίνης θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και μπορεί τελικά να γίνουν σημαντικές προγνωστικοί δείκτες

Παράθεση:. Katz Β, Reis ST, Viana NI, Morais DR, Moura CM, Dip Ν, et al. (2014) Ολοκληρωμένη Μελέτη των γονιδίων και έκφραση microRNA Σχετικά με τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (11): e113700. doi: 10.1371 /journal.pone.0113700

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Ιούλη, 2014? Αποδεκτές: 28 Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 19 Νοεμ, 2014

Copyright: © 2014 Katz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa κάνει Estado de Sao Paulo) με αριθμό πρωτοκόλλου 2012 /50.094 – 9. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι μία από τις πιο κοινές όγκους σε άνδρες, και αντιπροσωπεύει το 29% όλων των νεοδιαγνωσθέντων καρκίνων [1]. Μετά την έγκριση του προσυμπτωματικού ελέγχου PSA, οι περισσότεροι ασθενείς παρουσιάζουν τοπική προστάτη, αλλά 4% έχουν ήδη μεταστατική νόσο κατά τη στιγμή της διάγνωσης [1]. Προς το παρόν, κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, όπως η διοργάνωση, το σκορ Gleason (GS), και τα επίπεδα του PSA είναι καλοί προγνωστικοί δείκτες [2] και χρησιμοποιούνται για τη λήψη αποφάσεων θεραπεία? Ωστόσο, δεν είναι αρκετά ακριβείς για να κάνουν διακρίσεις μεταξύ των όγκων που θα παραμείνουν νωχελικός και εκείνων που αργότερα θα εξελιχθεί για να γίνει μεταστατική. Πράγματι, τα μοναδικά βιολογικά χαρακτηριστικά και ετερογενή γενετικό υπόβαθρο του προστάτη [3] μπορεί να περιορίσει την αποτελεσματικότητα των συμβατικών κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρους πρόβλεψης δείκτες. Για τους λόγους αυτούς, το μοριακό βιοδείκτες έχουν όλο και περισσότερο ερευνηθεί για να βοηθήσουν την κατανόηση και πρόβλεψη της συμπεριφοράς του καρκίνου.

Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι μια αντίστροφη βιολογική διαδικασία η οποία παίζει ρόλο στην εισβολή και τη μετάσταση κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης. Επιθηλιακά προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου είναι μειωμένη, και τα κύτταρα αποκτούν έναν άξονα σχήματος, ιδιαίτερα κινητικό φαινότυπο ινοβλαστών και μεγαλύτερη ικανότητα για τη μετανάστευση και την εισβολή [4]. Το κύριο χαρακτηριστικό της EMT είναι μεταγραφική αποσιώπηση της E-cadherin [5], [6], η οποία ελέγχεται από τους μεταγραφικούς ρυθμιστές

ZEB1

,

ZEB2

,

SNAI1

(σαλιγκάρι),

SNAI2

(Slug), και

TWIST1

[5], [7], [8]. Επιπλέον, υπάρχει επίσης προς τα πάνω ρύθμιση των δεικτών μεσεγχυματικών, όπως βιμεντίνης και Ν-cadherin, μια διαδικασία που είναι γνωστή ως καντερίνη μεταγωγής [9].

Οι ρόλοι των γονιδίων που σχετίζονται με την EMT σε προστάτη δεν είναι πλήρως κατανοητοί, και προηγούμενες μελέτες περιγράφουν την απώλεια της Ε-καδερίνης [10] που ακολουθείται από αυξημένη έκφραση του Ν-καντερίνης, η καντερίνη-11 και βιμεντίνης [9] στην ανάλυση ανοσοϊστοχημείας. Τα επίπεδα έκφρασης του

ZEB1

, ένα κρίσιμο ρυθμιστή του EMT στον προστάτη, έχουν σχέση με την GS [11], και Behnsawy et al πρότεινε τη χρήση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης EMT ως δείκτες της βιοχημικής υποτροπής μετά από ριζική προστατεκτομή [ ,,,0],12].

τα microRNAs (miRNAs), μια νέα κατηγορία μη-κωδικοποίησης, ρυθμιστικές RNAs, έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε πολλές διαδικασίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της ΕΜΤ [13]. Ένα από τα κύρια miRNAs που εμπλέκονται στην ΕΜΤ είναι η οικογένεια miR-200, το οποίο είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της επιθηλιακής διαφοροποίησης. Αυτή η ομάδα αποτελείται από miR-200a, miR-200b, miR-429, miR-200c, και miR-141, τα οποία παράγονται από δύο μεταγραφές. Οι πρώτες τρεις προέρχονται από το χρωμόσωμα 1, ενώ οι δύο τελευταίοι προέρχονται από το χρωμόσωμα 12. Τα μέλη αυτής της ομάδας είναι πολύ σχετικές με τη σειρά, υποδεικνύοντας ότι ενδέχεται στοχεύουν σε ένα παρόμοιο συμπλήρωμα αγγελιοφόρων RNA [14].

Μεταξύ των στόχων της οικογένειας miR-200 είναι ZEB1 και ZEB2 [15] – [17]. miR-200 μέλη αναστέλλουν την έκφραση του Zeb στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο με σύνδεση προς υψηλά συντηρημένες θέσεις στόχους σε 3’UTRs τους [18], [19]. Είναι ενδιαφέρον, miR-200 μέλη είναι μεταγραφική στόχοι του

ZEB1

και

ZEB2

. Η στενή λειτουργική σχέση μεταξύ των παραγόντων Zeb και την οικογένεια miR-200 σε ένα διπλό βρόχο αρνητικής ανάδρασης που είναι γνωστό ως το βρόχο Zeb /miR-200 ανάδραση [18], στην οποία η ενεργοποίηση μιας ομάδας επηρεάζει αρνητικά την έκφραση του άλλου ομάδα. Ανάλογα με τα εξωκυτταρικά σήματα, αυτός ο βρόχος μπορεί να αλλάξει από τη μία πλευρά προς την άλλη πλευρά και να σταθεροποιήσει είτε το επιθηλιακών ή μεσεγχυματικά φαινότυπο. Άλλα miRNAs έχουν επίσης αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε EMT, με στόχο

SNAI1

(miR-29b, miR-30a, miR-34a) [20], [21], και

SNAI2

(miR -34a, miR-1, miR-200b) [22], [23]. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν αξιολογήσει miRNAs που εμπλέκονται στην EMT στην ΣΕΣΣ.

Στόχος μας είναι να αποκρυπτογραφήσει το ρόλο των γονιδίων και των miRNAs που σχετίζονται με την EMT στο PCA, ώστε να εντοπίσει ένα προφίλ που καθορίζει τη συμπεριφορά του προστάτη.

υλικά και Μέθοδοι

ασθενής

επιλογή

επιλέχθηκαν Πενήντα ένας ασθενείς που είχαν κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη και υποβλήθηκε σε ριζική προστατεκτομή μεταξύ των ετών 2000 και 2002. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον ίδιο χειρουργό (MS), και όλες οι παθολογικές δείγματα αναλύθηκαν με τον ίδιο uropathologist (KRML). Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν για ένα μέσο χρονικό διάστημα των 63,06 μήνες

Η ομάδα ελέγχου αποτελείτο από δέκα δείγματα από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για την καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, και είχε όγκο του προστάτη & lt? 50 εκ.

3 για υπερήχων, τα επίπεδα PSA & lt?. 2,5 ng /ml, και όχι κακοήθεια στην παθολογική δείγμα

δείγματα ιστού του προστάτη

Όλα τα δείγματα φρέσκο ​​κατεψυγμένο προστάτη ελήφθησαν από βιοτράπεζας προστάτη μας, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το θεσμικό συμβούλιο δεοντολογίας (CAPPesq – Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa) υπό τον αριθμό 5907. Τα νωπά-κατεψυγμένα όγκους προήλθε από ριζική προστατεκτομή δείγματα, και ένα 1 εκατοστό

3 θραύσμα απομονώθηκε από την ύποπτη περιοχή και αμέσως snap-καταψύχθηκε στους -80 ° C. Το υπόλοιπο του ιστού μονιμοποιήθηκε σε 10% φορμαλίνη, συνήθως υποβάλλονται σε επεξεργασία, και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για ιστολογική εξέταση. Τα δείγματα στη συνέχεια αναθεωρούνται και βαθμολογούνται χρησιμοποιώντας το τροποποιημένο σύστημα ταξινόμησης Gleason [24], και το στάδιο προσδιορίστηκε μετά TNM 2010.

Οι κυτταρικές σειρές

Ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές σειρές LNCaP, DU145, και PC3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). LNCaP, DU145, PC3 και διατηρήθηκαν σε RPMI, DMEM, και ΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), αντίστοιχα. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιακό διάλυμα (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), και οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 .

RNA και την απομόνωση miRNA και ενίσχυση

Τόσο RNA και miRNA απομονώθηκαν από ιστούς του προστάτη και κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας το κιτ Ambion mirVana (Austin, TX, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. cDNA παράχθηκε από RNA και miRNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ TaqMan του RNA αντίστροφη μεταγραφή και TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit, αντίστοιχα. Για γονιδίου και ενίσχυση miRNA, ένα σετ αντιδραστηρίων TaqMan χρησιμοποιήθηκε με το 7500 Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις διπλούν, και

Β2Μ

(β-2-μικροσφαιρίνη) και RNU-48 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για ενδογενή γονίδια και miRNAs, αντίστοιχα.

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και miRNA ήταν λαμβάνονται με σχετική ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔct μέθοδο. Ο τύπος που χρησιμοποιείται είναι ΔΔCT = DCT

1- DCT

2, όπου DCT

1 = CT του στόχου (δείγμα όγκου) – CT του μέσου όρου της ενδογενούς ελέγχου (δείγμα όγκου), και DCT

2 = CT του μέσου όρου των κανονικών ελέγχων (ιστός καλοήθη προστάτη) – CT του μέσου του ενδογενούς ελέγχου (καλοήθη ιστό του προστάτη). Για την αξιολόγηση των μεταστατικών κυτταρικών σειρών, ο «έλεγχος» (DCT

2) θεωρήθηκε ότι είναι οι όγκοι pT2. Το τελικό αποτέλεσμα προκύπτει από την εφαρμογή του 2

-ΔΔct μέθοδο. Εκτίμηση μεγαλύτερο ή μικρότερο από το 1 θεωρήθηκαν για να υποδείξει υπερέκφραση ή υποέκφραση, αντίστοιχα. Όλες οι τιμές ήταν τυποποιημένη σε σχέση με τις κανονικές τιμές ελέγχου, οι οποίες εκπροσωπήθηκαν ως τιμή 1.

Gene και miRNA επιλογή

Η επιλογή των miRNAs και γονιδίων αξιολογούνται στην παρούσα μελέτη βασίστηκε σε τους ρόλο στη διαδικασία ΕΜΤ σε διάφορους τύπους καρκίνου. Πραγματοποιήσαμε μια αναζήτηση βιβλιογραφίας μέσω του PubMed και Web of Science χρησιμοποιώντας τους όρους «επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης», «καρκίνο», και «miRNA». Με βάση τα στοιχεία που δημοσιεύονται στη βιβλιογραφία, επιλέξαμε 18 miRNAs που στοχεύουν τα πιο σημαντικά γονίδια που εμπλέκονται στην EMT. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Για να συγκρίνετε τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά μεταξύ των ασθενών με εντοπισμένο προστάτη, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε ομάδες με βάση την GS τους (GS ≤6 vs GS ≥8), παθολογική στάδιο (pT2 vs ρΤ3), προεγχειρητική PSA (& lt? 10 vs ≥10 ng /mL), και απουσία ή παρουσία της βιοχημικής υποτροπής, που ορίζεται ως η PSA ≥0,02 ng /mL. Οι ασθενείς επίσης κατατάσσονται σε ομάδες χαμηλού κινδύνου και νόσου υψηλού κινδύνου ανάλογα με την παρουσία του κάθε δυσμενή χαρακτηριστικό. Σε αυτό το σενάριο, οι τιμές έκφραση στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με εκείνες στην καλοήθη ιστό προστάτη.

Για την αξιολόγηση των μεταστατικών όγκων, τρία μεταστατικές κυτταρικές γραμμές προστάτη αναλύθηκαν μαζί και ορίζεται ως το μεταστατικό ομάδα. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων και miRNAs μεταξύ της ομάδας των κυττάρων και οι όγκοι ρΤ3 συγκρίθηκαν σε σχέση με ρΤ2 όγκους, που θεωρήθηκαν η ομάδα «ελέγχου». Το σκεπτικό ήταν ότι η παθολογική στάδιο θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει μια πρακτική απόδειξη της ΕΜΤ, και με τη χρήση αυτής της μεθόδου, θα μπορούσαμε να αξιολογήσει ποια δείκτες EMT εμπλέκονται στην εξέλιξη μιας εντοπισμένης όγκου σε μετάσταση.

Το Mann-Whitney U και των δοκιμών Τ χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τις GS, παθολογικές στάδιο, προεγχειρητική επίπεδα PSA, βιοχημική υποτροπή, και των ομάδων κινδύνου. Η κατανομή των γονιδίων και τα επίπεδα έκφρασης miRNA ήταν ασύμμετρη, και τα δεδομένα log-μετασχηματιστεί για ανάλυση. Καμπύλες κατά Kaplan-Meier κατασκευάστηκαν για να αναλύσει βιοχημικής υποτροπής επιβίωση χωρίς. Η στατιστική σημαντικότητα για όλες τις δοκιμές, όπως εκτιμάται από τον υπολογισμό των δύο όψεων

P

-τιμές, ορίστηκε σε & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Τα δεδομένα του ασθενούς

Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 65 έτη. Η μέση και διάμεση GS ήταν 7,3 και 7, αντίστοιχα. Είκοσι δύο ασθενείς (43%) ήταν σταδίου ρΤ2, και 29 (57%) ασθενείς ήταν σταδίου ρΤ3. Δεκαεπτά (33%) ασθενείς είχαν βιοχημική υποτροπή σε μια μέση περίοδο παρακολούθησης των 63,06 μήνες. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Η

miRNA και γονιδιακής έκφρασης σε εντοπισμένες προστάτη

miRNAs 200α, 200b, 200c, 429, 141, 205, 203, 21, 183, και 373 είχαν υπερεκφράζεται σε 35 (69%), 47 (92%), 38 (74%), 39 (77%), 42 (82%), 44 (86%), 38 (74%), 51 (100 %), 38 (74%), και 33 (64%) δείγματα, αντίστοιχα. miRNAs 1, 29b, 9, και 495 είχαν υποεκφράζεται σε 41 (80%), 41 (80%), 36 (71%), και 42 (82%) δείγματα, αντίστοιχα. miRNAs 34α, 155, 30α, και 10β έδειξε μια μεταβλητή πρότυπο έκφρασης: miR-34a και miR-155 ήταν υποεκφράζεται σε 55% και 57% των δειγμάτων, αντίστοιχα, και miR-30a και miR-10b υπερεκφράστηκαν σε 51% των δειγμάτων (Πίνακας S1 σε File S1).

Ε-καδερίνης υπερεκφράστηκε σε 50 περιπτώσεις (98%). Τα γονίδια Ν-cadherin,

TGFB1

, και

ZEB1

ήταν υποεκφράζονται σε 36 (71%) ασθενείς, ενώ η

SNAI2

και βιμεντίνης ήταν υποεκφράζονται σε 42 (82%) και 41 (80%) ασθενείς, αντίστοιχα.

ZEB2

,

SNAI1

, και

PDGFD

έδειξαν μεταβλητή μοτίβα έκφρασης. Από την άλλη πλευρά,

TWIST1

ήταν η μόνη ΕΜΤ-επαγόμενη γονίδιο που έδειξε υπερέκφραση στην πλειονότητα των περιπτώσεων (73%) (Πίνακας S1 σε S1 File).

miRNAs και γονιδίων που σχετίζονται με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά

οι πίνακες 3 και 4 απεικονίζουν τα δεδομένα που αφορούν miRNA και γονιδιακή έκφραση σε σχέση με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, αντίστοιχα. Χαμηλά επίπεδα miR-200b, miR-30a, και miR-1 που σχετίζεται με τη νόσο ρΤ3. Από τις 18 miRNAs που μελετήθηκαν, τρία σημαντικά υποεκφράζονται στη νόσο ρΤ3 (miR-200b – 7,73 vs 23.86,

P

= 0,02? MiR-30a – 1.73 vs 3.79,

P

= 0,048? και miR-1 με 0,72 vs 1,97,

P

= 0.04). Ωστόσο, όσον αφορά τα γονίδια, δεν μπορέσαμε να βρούμε καμία σχέση μεταξύ τους έκφραση και παθολογικών στάδιο.

Η

Είμαστε αξιολόγησε τη συσχέτιση της GS με τα miRNAs με εξαίρεση GS 7, λόγω της αβέβαιης συμπεριφοράς τους. Δεκαπέντε ασθενείς (29%) είχαν ένα GS ≤6 και 23 (45%) είχαν GS ≥8. Βρήκαμε ότι το miR-200b έκφραση ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ασθενείς με GS ≥8 σε σύγκριση με τους ασθενείς με ένα GS ≤6 (6,94 vs 18.67,

P

= 0,035). Δεν βρέθηκε κάποια σχέση μεταξύ της GS και των άλλων miRNAs και τα γονίδια.

Όταν οι ασθενείς ομαδοποιήθηκαν σύμφωνα με χαμηλού κινδύνου και νόσου υψηλού κινδύνου, η νόσος υψηλού κινδύνου είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα του miR-30a (1,70 vs 6.37,

P

= 0,039). Επίσης, τα υψηλά επίπεδα της βιμεντίνης και

TWIST1

συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με τη νόσο υψηλού κινδύνου (0.27 vs 0.90,

P

= 0,017? 1,81 vs 8,89,

P

= 0,018) .

Λόγω της σημαντική συσχέτιση μεταξύ miRNAs 200b, 30α, και 1 με παθολογικό στάδιο και το δυναμικό τους ως προγνωστικοί δείκτες, έγινε μια ανάλυση επιβίωσης. Η ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με χαμηλότερα επίπεδα miR-200b είχαν σημαντικά μικρότερη βιοχημικής υποτροπής επιβίωση χωρίς (

P

= 0,049) (Εικόνα 1).

Οι ασθενείς με miR-200b έκφρασης επίπεδα ≤14.690 έδειξαν σημαντικά μικρότερη βιοχημικής υποτροπής επιβίωση χωρίς.

Η

Επιπλέον, miR-183 και

TWIST1

επίπεδα έκφρασης ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μεταστατικές κυτταρικές σειρές προστάτη σε σύγκριση με τα επίπεδα σε ασθενείς με νόσο ρΤ3 και όγκους υψηλού βαθμού (Πίνακας S2 στο αρχείο S1). Σε κυτταρικές σειρές, τα επίπεδα του miR-183 και Twist1 ήταν 2,64 και 3,54, αντίστοιχα, ενώ σε όγκους ρΤ3, τα επίπεδά τους ήταν 40.41 και 14.45, αντίστοιχα (

P

= 0.009 και

P

= 0,049, αντίστοιχα).

Συζήτηση

Η σημασία της EMT στην καρκινογένεση έχει μελετηθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια, και σήμερα θεωρείται ένας από τους κύριους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την εξέλιξη του όγκου και μεταστατική διάδοση. Η μελέτη μας στοχεύει να αξιολογηθεί η σημασία των προτύπων έκφρασης των πολλαπλών miRNAs και γονίδια που εμπλέκονται στην EMT σε κλινικά δείγματα από εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη και σε μεταστατικές κυτταρικές γραμμές. Τα ευρήματά μας συνοψίζονται στο Σχήμα 2, το οποίο δείχνει τις κύριες miRNAs και τα γονίδια που εμπλέκονται στην EMT στην εξέλιξη του προστάτη και πιθανός μηχανισμός δράσης τους.

Τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs 200b, 30α και 1 μείωση, όταν τα αποκτά όγκου χαρακτηριστικά υψηλής ποιότητας, ενώ τα επίπεδα έκφρασης των TWIST1 και βιμεντίνης αύξηση. Όταν ο όγκος καθίσταται μεταστατικό, παρατηρείται μια αύξηση στα επίπεδα έκφρασης του miR-183 και TWIST1. Οι διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν τα γονίδια όταν τα miRNAs ή γονίδια θα μπορούσαν να δράσουν, με βάση τα προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα.

BR

= βιοχημικής υποτροπής.

Η

Έχουμε δείξει ότι το miR-200b, miR-30a, και miR-1 ήταν σημαντικά υποεκφράζονται σε όγκους μη-όργανο-περιορισμένο και θα μπορούσε να αποτελέσει ενδιαφέρουσα προγνωστικούς παράγοντες. Μια πρόσφατη μελέτη υποστηρίζει τα ευρήματά μας, αποδεικνύοντας ότι το miR-200b και miR-1 επάγει μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) σε κύτταρα ποντικού και ανθρώπου προστάτη και είναι σημαντικό οι ρυθμιστικές αρχές σε προστάτη ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου [23].

miR-200b ήταν υπερεκφράζεται σε δείγματα προστάτη, και το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες σχετικά προστάτη [25], [26]. Τα μέλη της οικογένειας miR-200 είναι τα πιο σημαντικά miRNAs που εμπλέκονται στην ΕΜΤ [27], και μελέτες σε κύτταρα προστάτη έδειξαν ότι miR-200b αναστέλλει EMT, ανάπτυξη, μετάσταση και [23], [28]. Υποθέτουμε ότι το miR-200b έχει τη μεγαλύτερη δυνατότητα να γίνει ένα προγνωστικό δείκτη, διότι χαμηλότερη έκφραση του miR-200b ήταν σημαντικά σχετίζεται με υψηλό GS, ασθένεια ρΤ3, και μικρότερες βιοχημικής υποτροπής επιβίωση χωρίς. Ο ρόλος του miR-200b έχει περιγραφεί σε άλλους όγκους, και προς τα κάτω ρύθμιση της σχετίζεται με προχωρημένο στάδιο της νόσου [29] και βραχύτερη γενική επιβίωση [30] – [32]. Παρόμοια με τα ευρήματά μας, Barron et al βρήκαν ότι τα επίπεδα miR-200a ήταν μειωμένη σε ασθενείς που υποτροπίασαν μελετώντας την έκφραση του miR-200a σε φορμόλη-σταθερής παραφίνη-ενσωματωμένες ιστών από ασθενείς με νόσο ρΤ3 [33], υποστηρίζοντας το δυναμικό του miR-200 οικογένεια ως ένας δείκτης της βιοχημικής υποτροπής.

Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση του miR-200 μπορεί να συμβάλει στην πρόοδο της προστάτη [15] [34]. Xu et al παρατήρησαν μια μείωση κατά 80% των επιπέδων του miR-200b σε χημικά ευνουχισμένα LNCaP κύτταρα μέσω αλληλουχίας RNA [35]. Οι αναδυόμενες ενδείξεις υποστηρίζουν την εμπλοκή των διαδικασιών EMT στην απελευθέρωση της ανδρογόνων σηματοδότησης άξονα, αλλά τα δεδομένα εξακολουθούν να είναι αμφιλεγόμενα. Zhu και Κυπριανού παρατήρησε ότι τα ανδρογόνα προκαλέσουν ανεξάρτητα EMT σχηματομόρφωσης εντός καρκινικών κυττάρων του προστάτη, με αποτέλεσμα ουσιαστικές αλλαγές στην κυτταρική εισβολή και την κινητικότητα [36]. Το ενεργοποιημένο υποδοχέα ανδρογόνων (AR) έχει πρόσφατα δειχθεί ότι προάγει την ενεργοποίηση ΕΜΤ μέσω καταστολής της έκφρασης Ε-καδερίνης εντός κυττάρων καρκίνου του μαστού [37]. Από την άλλη πλευρά, η Sun et al βρήκαν ότι ανδρογόνων στέρηση προκαλεί EMT in vivo και την απόκτηση των χαρακτηριστικών μεσεγχυματικών [38].

Αυτή είναι η δεύτερη μελέτη σχετικά με miR-1 και πρόγνωση σε ΣΕΣΣ. Hudson et al προηγουμένως διαπίστωσε ότι τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-1 συνδέθηκαν με προηγούμενες βιοχημικές υποτροπή σε προστάτη [39]. Τώρα δείξαμε ότι miR-1 ρυθμίζεται προς τα κάτω στον πρωτογενή όγκο σε σύγκριση με καλοήθη ιστό του προστάτη, και ήταν σημαντικά μειωμένη σε ασθένεια μη όργανο περιορίζεται. Πιστεύεται ότι miR-1 ρυθμίζει Slug [23], μέσω της ιστόνης μεθυλίωση και ακετυλίωση [39] και έχοντας επίσης ως γονίδια-στόχους που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή [40] διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην EMT σε PCa.

δεδομένα σχετικά με το ρόλο του miR-30a σε προστάτη είναι ελλιπής και αντιφατική. Στη μελέτη μας, miR-30a έδειξε μια μεταβλητή πρότυπο έκφρασης. miR-30a έχει περιγραφεί ως μειωτικά στη μελέτη που διεξήχθη από Porkka et al [41], ενώ Carlsson et al ανέφεραν τη ρύθμιση προς τα άνω του miRNA [42]. Πρόσφατα, Kao et al έδειξε ότι το γονίδιο ETS σχετίζεται (

ERG

), η οποία είναι η πιο συχνά υπερεκφράζεται ογκογονιδίου σε PCA, ένας άμεσος στόχος του miR-30 και ότι η υπερέκφραση του miR-30 σε κύτταρα προστάτη καταστέλλει φαινότυποι ΕΜΤ και αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [43]. miR-30 οικογένεια αναστέλλει επίσης την κυτταρική μετανάστευση, διεισδυτικότητα, και μετάσταση

in vitro

σε άλλους όγκους, όπως του πνεύμονα, του μαστού και του καρκίνου του ηπατοκυτταρικού [21], [44] – [46], μέσω της στόχευσης

SNAI1

[21], [44] και βιμεντίνης [45], [46]. Σε αυτή τη μελέτη, η σχέση παρατηρείται μεταξύ μειωμένη έκφραση του miR-30, προχωρημένο παθολογικό στάδιο, και η νόσος του υψηλού κινδύνου επιβεβαιώνει miR-30 ως καταστολέας των όγκων miRNA στη ΣΕΣΣ. Cheng et al παρατήρησαν ότι τα χαμηλά επίπεδα του miR-30a ήταν προγνωστικοί παράγοντες της προχωρημένο στάδιο και λεμφαδένα μετάσταση σε διηθητικό καρκίνο του μαστού [45]. Wang et al έδειξε ότι τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης του miR-30a συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης της πύλης θρόμβου φλέβα όγκου σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [46].

Όσον αφορά τα γονίδια, παρατηρήσαμε υπερέκφραση της Ε-καδερίνης σε σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις, και η πλειοψηφία των δεικτών μεσεγχυματικών, συμπεριλαμβανομένου του N-cadherin,

TGFB1

,

ZEB1

, βιμεντίνη, και

SNAI2

, ρυθμίστηκαν προς τα κάτω. Αυτό το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης υποδηλώνει σαφώς ότι εντοπισμένη προστάτη διατηρεί το επιθηλιακό φαινότυπο, παρά τη διαφοροποίηση των όγκων και την αύξηση της στάδιο. Ωστόσο,

TWIST1

ήταν υπερεκφράζεται στο 73% των περιπτώσεων.

TWIST1

είναι ένας παράγοντας μεταγραφής έλικας-βρόχου-έλικας που ενεργοποιεί ΕΜΤ μέσω έμμεσων αναστολής της Ε-καδερίνης [47].

TWIST1

έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε PCa στις δοκιμασίες ανοσοϊστοχημείας και να συσχετίζονται θετικά με την GS [48], [49]. Είναι ενδιαφέρον ότι ένα γονίδιο με τέτοια σημασία σε EMT και με την προγνωστική αξία στο PCA είναι υπερεκφράζεται σε εντοπισμένους όγκους. Η πρώιμη υπερέκφραση του

TWIST1

μπορεί να αποδοθεί στην ρύθμιση της από το

NKX3-1

γονίδιο [50], ένα ογκοκατασταλτικό που βρέθηκε να υποεκφράζεται στα πρώιμα στάδια του προστάτη [51 ], [52]. Ωστόσο, η πρώιμη ρύθμιση προς τα άνω του

TWIST1

δεν φαίνεται να είναι επαρκής για να κινήσει τη διαδικασία της EMT. Σύμφωνα με Casas et al,

TWIST1

επάγει

SNAI2

για την προώθηση της EMT [53], αλλά και η εξάντληση των

SNAI2

εντελώς εμποδίζει την ικανότητα του

TWIST1

να καταστείλει E-cadherin και προκαλούν EMT.

Έχουμε δείξει ότι τα υψηλά επίπεδα του

TWIST1

, καθώς και βιμεντίνης, συνδέονται σημαντικά με τους ασθενείς της ομάδας υψηλού κινδύνου και

TWIST1

ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερα στις μεταστατικές κυτταρικές σειρές. Σε μια πρόσφατη μελέτη, Behnsawy et al [12] έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του

TWIST1

και βιμεντίνης αξιολογείται με ανοσοϊστοχημεία είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας που σχετίζεται με μικρότερη βιοχημικής υποτροπής επιβίωση χωρίς, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια μπορεί να είναι εν δυνάμει δείκτες της βιοχημικής υποτροπής μετά από ριζική προστατεκτομή.

TWIST1

φαίνεται να παίζει κάποιο ρόλο σε διάφορα στάδια της EMT, και ο ρόλος της στην εξέλιξη του προστάτη [49]. Στη μελέτη των Kwok et al,

TWIST1

έκφραση ήταν υψηλότερη σε ιστούς που προέρχονται από μεταστατικές βλάβες από τα οστά και τους λεμφαδένες [48]. Ο ρόλος του

TWIST1

σε αυτό το επόμενο βήμα της ΕΜΤ θα μπορούσε να εξηγηθεί από την ενεργοποίηση του στόχου της, miR-10b. miR-10b όχι μόνο καταστέλλει E-cadherin [54], αλλά επίσης αναστέλλει τη μετάφραση της πρωτεΐνης HOXD10, επιτρέποντας την έκφραση της προ-μεταστατικό γονιδιακού προϊόντος,

RHOC

[55].

Έχουμε παρατηρήσει επίσης ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-183 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα μεταστατικό. Ueno et al παρατηρηθεί ότι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-183 ήταν σημαντικά σχετίζεται με υψηλότερο PSA, ανώτερο στάδιο και μικρότερη συνολική επιβίωση μετά από ριζική προστατεκτομή, αλλά η συμπεριφορά του στο PCA είναι απολύτως αμφιλεγόμενη μερικές δείχνουν ότι το miR-183 προάγει τη μετανάστευση και την εισβολή [56] – [58], ενώ άλλοι αναφέρουν ότι αναστέλλει τη μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση [59] – [61]. Ορισμένα στόχους του miR-183 έχουν προταθεί,

DKK3

,

Smad4

[56],

EGR1

και

PTEN

[57], η οποία μετατρέπει miR-183 ένα πλαίσιο εξαρτάται από miRNA. Με βάση τα αποτελέσματα μας και σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες στη βιβλιογραφία, πιστεύουμε ότι miR-183 δρα ως oncomiR σε PCa, και ο μηχανισμός μπορεί να περιλαμβάνει

ΡΤΕΝ

η οποία σχετίζεται προς PCA πρόοδο και την ανάπτυξη της μετάστασης [62 ]. Ding et al έδειξε επίσης ότι η ταυτόχρονη

PTEN

και

Smad4

αδρανοποίησης του προστάτη επιθήλιο είναι σε θέση να παράγουν ένα πλήρως διεισδυτικό επεμβατική και μεταστατικό φαινότυπο προστάτη σε ποντίκια [63].

Εν κατακλείδι, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε ότι η εξέλιξη επιρροές EMT όγκου σε διάφορα στάδια μέσω διαφόρων δεικτών. Εδώ, θα περιγραφεί μια ολοκληρωμένη μελέτη των miRNAs και γονίδια που σχετίζονται με EMT στην ΣΕΣΣ και διαπίστωσε ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-200b, miR-30a, miR-1,

TWIST1

και βιμεντίνης θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη λήψη διαδικασίες λήψης αποφάσεων που σχετίζονται με την κύρια ή επικουρική θεραπείες στο μέλλον.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

συνδυασμό αρχείων υποστήριξης πινάκων. Πίνακας S1: επίπεδα έκφρασης των miRNAs και γονίδια από κάθε περίπτωση σε σχέση με δείγματα BPH. Πίνακας S2: τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs και γονιδίων σε όγκους ρΤ3 και σε κυτταρικές σειρές (σε σχέση με τους όγκους pT2)

doi: 10.1371 /journal.pone.0113700.s001

(DOCX)