Αφηρημένο

Η ανάπτυξη των γενετικά σημειώνονται ξενομοσχευμάτων όγκου των ζώων είναι μια περιοχή της συνεχιζόμενης έρευνας για να επιτρέψει ευκολότερη και πιο αξιόπιστη δοκιμή των αντικαρκινικών θεραπειών. Γενετικά αξιοσημείωτη μοντέλα όγκων έχουν ένα αριθμό πλεονεκτημάτων έναντι των συμβατικών μοντέλα όγκων, συμπεριλαμβανομένου του εύκολη διαμήκη παρακολούθηση των θεραπειών και του μειωμένου αριθμού των ζώων που χρειάζονται για τις δοκιμές. Αρκετές διαφορετικές μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες μελέτες για να σηματοδοτήσει όγκους γενετικά, όμως όλα έχουν περιορισμούς, όπως γονοτοξικότητας και άλλα αντικείμενα που σχετίζονται με τη χρήση της ενσωμάτωσης των ιικών φορέων. Πρόσφατα, έχουμε δημιουργείται ένα επισωματικά διατηρείται σύστημα DNA (pDNA) έκφραση πλασμιδίου βασίζεται σε Region Ικρίωμα /Matrix Συνημμένο (S /MAR), η οποία επιτρέπει τη μακροπρόθεσμη έκφραση διαγονιδίου λουσιφεράσης στο ήπαρ ποντικού. Εδώ περιγράφουμε μια περαιτέρω χρήση αυτού του φορέα ρϋΝΑ με το ανθρώπινο υποκινητή της ουβικιτίνης C για να δημιουργήσουν σταθερώς επιμολυσμένα ανθρώπινου ηπατώματος (Huh7) και ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνωμα (MIA-PaCa2) κυτταρικές γραμμές, οι οποίες παραδόθηκαν σε «ανοσολογική ανεπάρκεια» ποντικούς και παρακολουθήθηκε κατά μήκος πάνω φορά χρησιμοποιώντας ένα bioluminometer. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αποκάλυψε παρατεταμένης επισωματικό μακροπρόθεσμη έκφραση λουσιφεράσης και σχηματισμό ενός όγκου δείχνει τα παθολογικά χαρακτηριστικά του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) και παγκρεατικό καρκίνωμα (PaCa), αντίστοιχα. Αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι ένας φορέας ρϋΝΑ προσδίδουν παρατεταμένη έκφραση διαγονιδίου λουσιφεράσης επισωμική σε διάφορα μοντέλα όγκου ποντικού και έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί εύκολα για να ακολουθήσει το σχηματισμό όγκων χωρίς να παρεμβαίνει στο κυτταρικό γονιδίωμα

Παράθεση:. Αργυρός O, Wong SP, Gowers Κ, Harbottle RP (2012) η γενετική τροποποίηση των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση μη-Viral, Επισωμικοί S /MAR Φορείς για

In Vivo

όγκου Μοντελοποίηση. PLoS ONE 7 (10): e47920. doi: 10.1371 /journal.pone.0047920

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιούν του 2011? Αποδεκτές: 20η Σεπτεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Οκτωβρίου 2012

Copyright: © 2012 Αργυρός et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Myrovlytis Trust. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος αποτελεί έναν από τους μεγαλύτερους κινδύνους για την υγεία σε όλο τον κόσμο. Συνεπώς, υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών και νέες εξελίξεις στη μοντελοποίηση των όγκων σε ζώα. Ωστόσο, παρά τη σημαντική πρόοδο σε αυτόν τον τομέα, η ανάπτυξη των κλινικά σχετικές ζωικά μοντέλα που επιτρέπουν την ταχεία και ευαίσθητη παρακολούθηση της πρώιμης ανάπτυξης του όγκου και η επακόλουθη μετάσταση παραμένει μια συνεχής πρόκληση [1].

Πολλά τα συμβατικά μοντέλα όγκων σε ζώα που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη αντικαρκινικών θεραπειών περιλαμβάνουν ένεση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [2], [3] που ακολουθείται από πρότυπες μετρήσεις δαγκάνα να εκτιμήσει το μέγεθος του όγκου, συνήθως ως μια μέτρηση τελικού σημείου, μετά έχει θυσιαστεί το ζώο. Αυτά τα μοντέλα είναι αρκετά περιορισμένη και η έρευνα ήταν σε εξέλιξη για την ανάπτυξη ενός γενετικά σημαντική όγκου που θα επιτρέπουν μη επεμβατική παρακολούθηση των παραμέτρων του όγκου με

in vivo

απεικόνισης βασίζεται σε εκπομπή φωτός από κύτταρα λουσιφεράσης που εκφράζουν ή φθορισμού από κύτταρα που εκφράζουν GFP. [1] Η χρήση γενετικά σημειώνονται κυττάρων όγκου σε ένα μοντέλο καρκίνου ζώο έχει μια σειρά από πλεονεκτήματα. Κατά κύριο λόγο, αυτό επιτρέπει σε κάποιον να παρακολουθήσει την αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών παρεμβάσεων όπως φάρμακο, γονίδιο ή θεραπείες κύτταρο πιο εύκολα από ό, τι με τα συμβατικά μοντέλα. Διευκολύνει την παρακολούθηση των παραμέτρων του όγκου, όπως το μέγεθος και την ανάπτυξη, καθώς δίνει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευαίσθητη απεικόνιση της πρώιμης μετάστασης και την αξιολόγηση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου μετά τη θεραπεία [4]. Επιτρέπει επίσης τη χρήση των διαδοχικών μετρήσεων να ακολουθήσουν το μέγεθος του όγκου κατά τη διάρκεια της θεραπείας, ώστε να διαχρονικές μελέτες μπορεί να γίνει για να αναλύσει τις επιπτώσεις των θεραπειών πάροδο του χρόνου δίνοντας περισσότερες αξιόπιστες πληροφορίες και τη μείωση του αριθμού των πειραματόζωων [5].

σε παλαιότερες μελέτες, μια ποικιλία διαφορετικών μεθόδων έχουν χρησιμοποιηθεί για να προσδώσουν τα καρκινικά κύτταρα με ανιχνεύσιμους δείκτες [1], [4], [6], [7], [8], [9]. Η πιο αποτελεσματική μέθοδος για την παράδοση γονιδίων σε κύτταρα είναι η χρήση του φορείς που προέρχονται από τροποποιημένους ιούς [10]. Ωστόσο, παρά τα πλεονεκτήματα αυτού του συστήματος απελευθέρωσης γονιδίου υπάρχουν επίσης σημαντικοί περιορισμοί, που σχετίζονται κυρίως με την ενσωμάτωση του φορέα στο γονιδίωμα του κυττάρου, η δυνητική ανοσογονικότητα των γονιδίων που κωδικοποιούν ιικές καθώς και την απώλεια της μακροπρόθεσμης έκφρασης του γονιδίου αναφοράς. Θα ήταν μεγάλο ενδιαφέρον, ως εκ τούτου, να αναπτύξει ένα σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου μη ιικά οποία μπορεί να μεσολαβήσει παρατεταμένη έκφραση γονιδίου ανταποκριτή σε ένα μοντέλο όγκου ζώου. Ένας αποτελεσματικός τρόπος για την επίτευξη αυτού του στόχου είναι η χρήση ενός συστήματος έκφρασης πλασμιδίου DNA (pDNA), το οποίο μπορεί να διατηρηθεί ως ένα λειτουργικό, επισωμικό οντότητα αφού έχει παραδοθεί σε κύτταρα του μοντέλου του όγκου και να τους παρέχουν καλή ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης γονιδίου δείκτη καθ ‘όλη τη διάρκεια της ζωής τους [11].

Προηγούμενο

in vivo

μελέτες στις οποίες συμμετείχαν φορείς ρΡΝΑ έχουν δείξει ότι οι υποκινητές ιών, όπως ο κυτταρομεγαλοϊός (CMV) είναι σε θέση να παρέχει τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου αρχικά [12], [13], αλλά ακολουθείται με επακόλουθη μείωση της έκφρασης μέσα σε δύο μήνες [14]. Αυτή η μείωση στην έκφραση είναι εξαρτώμενη από προαγωγό και πιθανόν να είναι το αποτέλεσμα της μεταγραφικής σίγησης του προαγωγού [15]. Πράγματι, CpG μεθυλίωση του υποκινητή CMV σε διάφορους πλασμιδιακούς φορείς έχει βρεθεί να έχουν αρνητική επίδραση στην έκφραση διαγονιδίου τόσο

in vitro

και

in vivo

[11], [16], [ ,,,0],17].

Πρόσφατα, εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι ένας φορέας ρϋΝΑ που περιλαμβάνει ένα συνδυασμό ενός, ιστού-ειδικό προαγωγό θηλαστικού με μία περιοχή προσάρτησης πυρηνικό ικρίωμα /μήτρας (S /MAR) στοιχείο μπορεί να προωθήσει τη μακροπρόθεσμη έκφραση επισωμική

in vitro

και

in vivo

[11], [18], [19], [20], [21]. Το στοιχείο S /MAR παρέχει μια ειδική σύνδεση του φορέα με το πυρηνικό πλέγμα μέσω σύνδεσης ικριώματος παράγοντα-Α (SAF-Α), πρόσδεση του φορέα στο ικρίωμα χρωμόσωμα κατά την διάρκεια της μίτωσης και φέρνοντας το πλασμίδιο σε στενή επαφή με τα μηχανήματα αντιγραφής του κυττάρου, ως εκ τούτου, η δημιουργία μιτωτική σταθερότητα και τη διατήρηση του πλασμιδίου ως επιγενετική οντότητα μέσω των εκατοντάδων των κυτταρικών διαιρέσεων [22], [23], [24], [25], [26]. Το στοιχείο S /MAR έχει δειχθεί ότι έχει μια προστατευτική επίδραση επί ευαίσθητων σε μεθυλίωση θέσεις στο α1-αντιθρυψίνης (ΑΑΤ) ήπατος-ειδικού προαγωγού [11], αλλά δεν έχει τέτοια επίδραση στον υποκινητή CMV, υπογραμμίζοντας ότι ένα θηλαστικό, αντί μια ιογενής υποκινητής είναι πιο κατάλληλο για τη μακροπρόθεσμη έκφραση διαγονιδίου με αυτόν τον φορέα.

ένα S /MAR που περιέχει το πλασμίδιο έχει αναπτυχθεί για εφαρμογή στο ήπαρ με τη χρησιμοποίηση ενός ήπατος-ειδικού προαγωγού, ΑΑΤ, και έχει δειχθεί να διατηρείται και να εκφράζουν το διαγονίδιο λουσιφεράση επισωματικά πάνω από 6 μήνες σε ηπατοκύτταρα [11]. Δεδομένης της μακροπρόθεσμης έκφρασης αυτών των επισωματικά πλασμίδια διατηρούνται, ένα S /MAR βασίζεται φορέα σε συνδυασμό με έναν προαγωγό θηλαστικού φαίνεται να είναι ιδανικό για χρήση ως γενετικός δείκτης των καρκινικών κυττάρων.

Τα πλασμίδια που περιέχουν ένα S /MAR αλληλουχία και έναν υποκινητή CMV έχουν προηγουμένως επιτυχώς επιμολύνθηκε σε CHO [18], [23], [25], HaCat [23], HeLa [27], Κ562 κύτταρα λευχαιμίας, U251 γλοιώματος [20] και του πρωτογενούς ινοβλάστης [28] και έχουν δειχθεί να αναπαράγουν και να διατηρηθούν ως εξωχρωμοσωμικά επισώματα.

η εργασία που περιγράφεται εδώ δείχνει, για πρώτη φορά, η χρήση ενός επισωματικά διατηρηθούν, pUbC-S /MAR πλασμίδιο, μεσολαβώντας επίμονη λουσιφεράσης έκφραση του διαγονιδίου να παράγουν γενετικά επισημασμένο καρκινικών κυτταρικών σειρών που οδηγούν σε διαφορετικούς καρκίνους όταν εφαρμόζεται

in vivo

. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται είναι ένα ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυτταρική γραμμή Huh7, η οποία προέρχεται από έναν ασθενή με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και ενός ανθρώπινου παγκρεατικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή, ΜΙΑ-PaCa2.

Αποτελέσματα

Generation σταθερά επιμολυσμένων όγκου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας pUbC-S /MAR πλασμίδιο

με βάση την προηγούμενη

in vitro

μελέτες με χρήση S /MAR φορείς, έχουμε ως στόχο να εφαρμόσετε αυτήν την εμπειρία για να δημιουργήσει μια σειρά από διαφορετικά σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές γραμμές όγκου για την παραγωγή διαφόρων μοντέλων όγκου, η οποία μπορεί να παρακολουθείται με

in vivo

τεχνικές απεικόνισης βιοφωταύγεια. Ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα S MAR στοιχείο /σε συνδυασμό με τον υποκινητή θηλαστικού UBC (pUbC-S /MAR), την οδήγηση ενός διαγονιδίου λουσιφεράσης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 1Α). Η πανταχού παρούσα προαγωγός UBC εφαρμόστηκε έτσι ώστε ο ίδιος φορέας θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο του διαγονιδίου λουσιφεράσης σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές.

Α) Το πλασμίδιο pUbC-S /MAR που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, στην οποία έκφραση λουσιφεράσης οδηγείται από τον ανθρώπινο προαγωγό UBC. Β) Huh7, και MIA-PaCa2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pUbC-S /MAR και αναπτύχθηκαν υπό επιλογή με G418 για περίπου δύο εβδομάδες. Τρεις απλές αποικίες απομονώθηκαν και επεκτάθηκαν από την επιλογή με την τακτική απεικόνισης χρησιμοποιώντας ένα bioimager Xenogen. Γ) κηλίδας Southern του ολικού DNA που απομονώθηκε από τρεις μεμονωμένες αποικίες για κάθε κυτταρική σειρά σε 45 ημέρες μετά την διαμόλυνση. Οι διαδρομές 1-3: Huh7 απομονωμένες αποικίες? Λωρίδες 4-6 ΜΙΑ-PaCa2 απομονωμένες αποικίες? (+): Θετικός μάρτυρας, 10 ng του βακτηριακού πλασμιδίου pUbC-S /MAR. Δ) δοκιμασία βιοφωταύγειας λουσιφεράσης (εις διπλούν) για αυξανόμενες ποσότητες κυττάρων Huh7 και MIA-PaCa2, δείχνοντας τα όρια του σήματος (λουσιφεράση) ανίχνευση,

in vitro

. Ε-Ρ) Πλασμίδιο πειράματα διάσωση τριών

E.Coli

αποικίες για Huh7 (λωρίδες 1-3) και τέσσερις αποικίες για κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ-PaCa2 (λωρίδες 4-7), δείχνοντας ταυτόσημες πρότυπο περιορισμού με καθαρό pUbC -S /MAR πλασμίδιο (+), μετά από περιοριστική πέψη με

Spe

Ι ένζυμο. (-) Αρνητικό μάρτυρα (όχι DNA)? M: 1-kbp σκάλα (Hyperladder Ι, Bioline)

Η

Τα κύτταρα MIA-PaCa2 και Huh7 επιμολύνθηκαν με τον φορέα pUbC-S /MAR και αναπτύχθηκαν για δύο εβδομάδες σε παρουσία G418 (. 1 mg /mL). Μετά το διάστημα αυτό τα κύτταρα που σχηματίζονται διακριτές αποικίες και έκφραση λουσιφεράσης επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας ένα bioluminescent απεικονιστή (σχήμα 1Β, άνω πλαίσιο). Τρεις επιμέρους διαγονίδιο που εξέφραζε αποικίες για κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές (Huh7 και MIA-PaCa2) απομονώθηκαν και στην συνέχεια καλλιεργούνται χωρίς επιλογή με αντιβιοτικό (Σχήμα 1Β, μεσαίο πλαίσιο). Η έκφραση του διαγονιδίου λουσιφεράσης καταδείχθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές που δεικνύουν επιτυχή σταθερή επιμόλυνση με το πλασμίδιο pUbC-S /MAR. Τα κύτταρα περαιτέρω καλλιεργήθηκαν απουσία της πίεσης επιλογής για άλλο ένα μήνα (κάτω πάνελ σχήμα 1Β). Σε 45 ημέρες μετά την επιμόλυνση γενωμικό DNA εκχυλίσθηκε από τρεις αποικίες από κάθε κυτταρική γραμμή για να επιβεβαιώσει επισωματική διατήρηση του ρϋΝΑ. Μια κηλίδα Southern Διεξήχθη (σχήμα 1Γ), η οποία σε κάθε περίπτωση έδειξαν μία μοναδική ζώνη του το ακριβές μέγεθος του pUbC-S /MAR (8198 bps) για κάθε μία από τις αποικίες και των δύο κυτταρικών σειρών. Τέλος πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιφεράσης βιοφωταύγεια σε αυξανόμενες ποσότητες κυττάρων, με σκοπό την παροχή άμεσης ποσοτικά αποτελέσματα της γονιδιακής έκφρασης για σύγκριση. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 1Δ, όπου το όριο ανίχνευσης του σήματος ήταν μεταξύ 500-5000 κύτταρα για τα κύτταρα Huh7 και μεταξύ 250-2500 κύτταρα για την MIA-PaCa2.

Περαιτέρω απόδειξη για επισωματική διατήρηση παρεσχέθη από το πλασμίδιο διάσωσης του pUbC-S /MAR από ανθεκτικό στην καναμυκίνη

Ε. coli

βακτήρια μετά από μετασχηματισμό με συνολικό DNA από κάθε μία από τις αποικίες των δύο κυτταρικών γραμμών. Σε αυτή την περίπτωση μόνο ανέπαφο ελεύθερο πλασμίδιο DNA θα παρήγαγε βακτηριακές αποικίες σε πλάκες που περιέχουν καναμυκίνη που είναι ο δείκτης αντίστασης που υπάρχει στο πλασμίδιο pUbC-S /MAR. Τα πρότυπα περιορισμού του ρϋΝΑ των επιλεγμένων αποικιών ήταν συνεπή με μη τροποποιημένο μη ενσωματωμένη κατασκευάσματα πλασμιδίου και για το τις κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ-PaCa2 (σχήμα 1 Ε και 1 F) Huh7 και.

σταθερά διαμολυσμένα Huh7 και ΜΙΑ PaCa2-Κυττάρων γραμμές αποτελούν όγκοι

in vivo

διατηρώντας παράλληλα υψηλά επίπεδα διαγονιδιακής έκφρασης 35 ημέρες μετά την ένεση

τα κύτταρα από κάθε μία από τις δύο που δημιουργούνται σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών (MIA-PaCa2 και Huh7) έχουν ξεχωριστά διαχειρίζεται ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε ομάδες ποντικών (η = 4). Οι ποντικοί απεικονίστηκαν 24 ώρες μετά την ένεση και η έκφραση λουσιφεράσης παρατηρήθηκε και στις δύο ομάδες με ένεση ποντικούς (Σχήμα 2Α). Παρατηρήσαμε ότι και οι τέσσερις ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα MIA-PaCa2 εκφράζεται λουσιφεράσης σε όλη τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης και σχημάτισαν όγκους, ενώ τρία από τα τέσσερα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα Huh7 εκφράζεται λουσιφεράση και ένας ποντικός δεν είχε καμία αρχική έκφραση λουσιφεράσης, πιθανώς λόγω της αδυναμίας του κύτταρα να εγκατασταθούν στο νέο περιβάλλον, αν και αυτό παραμένει ασαφές. Παρ ‘όλα αυτά, η έκφραση της λουσιφεράσης παρακολουθήθηκε και στις δύο ομάδες ποντικών για μια συνολική περίοδο 35 ημερών με εβδομαδιαίες bioimaging. Bioluminescent φωτογραφίες απεικόνιση ενός αντιπροσωπευτικού ποντικού συναρτήσει του χρόνου για κάθε κυτταρική γραμμή δείχνεται στο Σχήμα 2Α. Το επίπεδο έκφρασης αυξήθηκε απότομα 21 ημέρες μετά την παράδοση των κυττάρων (Σχήμα 2C). Δεν έκφραση λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε στον έλεγχο χωρίς θεραπεία ζώα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), όπου το επίπεδο υποβάθρου της εκπομπής φωτός ήταν 5 × 10

5 φωτόνια /sec /cm

2 /sr.

Α) μια ομάδα τεσσάρων ποντικών για κάθε κυτταρική σειρά εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά με 3 × 10

6 Huh7 ή MIA-PaCa2 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με pUbC-S /MAR και οπτικοποιήθηκε την πάροδο του χρόνου (από τη μια μέρα μετά την ένεση) για βιοφωταύγεια χρησιμοποιώντας ένα Xenogen bioimager, μετά από ενδοπεριτοναϊκή ενέσεις των 15 mg /ml D-λουσιφερίνης, με το χρόνο κτήσης ένα λεπτό. Ένας εκπρόσωπος ποντίκι για κάθε κυτταρική γραμμή δείχνεται στις ημέρες 7, 21 και 35. Β) Σε 35 ημέρες μετά την ένεση τα Huh7 και ΜΙΑ PaCa2-εγχυθεί ποντίκια θανατώθηκαν και τεμαχίστηκαν να ψάξουν για ενδείξεις ανάπτυξης όγκου. Καμία ανάπτυξη ήταν εμφανής από την εξωτερική εξέταση του ζώου, αλλά για το άνοιγμα επάνω μια μάζα παρατηρήθηκε στην περιτοναϊκή κοιλότητα (Huh7 αντιμετωπίζονται ποντίκι φαίνεται ως παράδειγμα). Το ζώο απεικονίζεται για βιοφωταύγεια πριν και μετά την αφαίρεση του όγκου. Η ένταση της έκφρασης λουσιφεράσης δείχνεται στο ποντίκι: το κόκκινο αντιπροσωπεύει υψηλή έκφραση, βιολετί αντιπροσωπεύει χαμηλή έκφραση. Το μπαρ το χρώμα παρουσιάζει σχετική ένταση του σήματος. (Γ) Γραφική απεικόνιση της έκφρασης μακροπρόθεσμης λουσιφεράσης από NOD-SCID εγχύθηκαν με είτε Huh7 ή MIA-PaCa2 σταθερές κυτταρικές σειρές (η = 3 για Huh7 και n = 4 για MIA-PaCa2). Λουσιφεράσης ποσοτικοποίηση εκφράζεται, όπως τα φωτόνια /sec /cm

2 /sr και χαράσσεται (+/- SD). επίπεδο υποβάθρου της εκπομπής φωτός σε μη επεξεργασμένα ζώα είναι 5 × 10

5 φωτόνια /sec /cm

2 /SR.

Η

Με δεδομένη την αύξηση της λουσιφεράσης έκφραση του διαγονιδίου σε 35 ημέρες μετά -administration των κυττάρων, ήμασταν σίγουροι ότι ένας όγκος που προέρχεται από τα κύτταρα εγχέονται είχε σχηματιστεί. Ως εκ τούτου, οι ποντικοί θανατώθηκαν σε 35 ημέρες και τεμαχίζεται για να ψάξουν για αποδείξεις σχηματισμού όγκων. Ενώ εξωτερικά δεν υπήρξε αξιοσημείωτη ανάπτυξη, παρατηρήθηκε μία μεγάλη μάζα στην περιτοναϊκή κοιλότητα μόλις το ζώο αποκόπηκε. Μια αντιπροσωπευτική φωτογραφία της μάζας του όγκου από ένα ζώο υποβάλλεται σε επεξεργασία με κύτταρα Huh7 φαίνεται στο Σχήμα 2Β. Απεικόνιση των ποντικών πριν και μετά την αφαίρεση του όγκου επιβεβαίωσε ότι λουσιφεράσης διαγονιδιακή έκφραση εντοπίστηκε στη μάζα του όγκου (Σχήμα 2Β).

Ιστολογική Ανάλυση του σχηματιζόμενου Όγκοι

αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματίζονται τομές ιστών διεξήχθησαν για τον προσδιορισμό της ιστολογίας του όγκου που προέρχεται από κάθε κυτταρική γραμμή. Το Σχήμα 3 δείχνει τα τμήματα ιστολογία όγκων που σχηματίζονται από κύτταρα Huh7. Ιστολογία επιβεβαιώνει ότι ο όγκος είναι ένας ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) με διάφορους βαθμούς διαφοροποίησης (Σχήμα 3Α-D). Ο όγκος αποτελείται από πολυγωνικά κύτταρα κατανέμονται σε χαλαρά φύλλα και pseudoglandular μοτίβα. Οι πυρήνες ήταν μέτρια πλειομορφικές, φυσαλιδώδη και περιέχουν nucleolus. Επίσης σημειώνεται λίγες απομονωμένες μιτωτικά σχήματα. Το κυτταρόπλασμα ήταν ηωσινοφιλική και οι κελιών ήταν σαφώς καθορισμένα, ενώ το στρώμα ήταν λιγοστά. Η ενδοκυτταρική και εξωκυτταρική σταγονίδια χολή δεν παρατηρήθηκαν στον όγκο ούτε και η νέκρωση του όγκου. Τα χαρακτηριστικά του όγκου επιβεβαιώθηκαν από ανεξάρτητη παθολογοανατόμο που να είναι συνεπής με HCC Grade II (τροποποιημένο Edmonson και Στάινερ σύστημα βαθμολόγησης).

Τμήματα από διάφορα μέρη των δύο όγκων κόπηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για ιστολογική ανάλυση των όγκων. Α-Δ) Τμήματα από Huh7 ένεση ποντίκια. Τμήματα έχουν μια άμορφη δομή και ταυτοποιήθηκαν ως ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) του ποικίλους βαθμούς διαφοροποίησης: (Α) Μέτρια διαφοροποιούνται HCC, μεγέθυνση × 10 (Β-Ο) Τα τμήματα αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για να δείξει τη διανομή της έκφρασης λουσιφεράσης. Brown χρώση υποδεικνύει λουσιφεράσης θετικά κύτταρα. (Β) θετικώς χρωματισμένο, μεγέθυνση χ 40 (C) Θετικά χρωματισμένο, μεγέθυνση χ 10 (D) Αρνητικός έλεγχος: χωρίς πρωτογενές αντίσωμα προστίθεται, μεγέθυνση χ 10 E-Η) Τμήματα από MIA-PaCa2 εγχυθεί ποντικούς. Τμήματα έχουν μια άμορφη δομή και ταυτοποιήθηκαν ως παγκρεατικό καρκίνωμα (PaCa) διαφόρων βαθμών διαφοροποίησης. (Ε) Μέτρια διαφοροποιούνται PaCa, μεγέθυνση × 10 (F-G) Τα τμήματα αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για να δείξει τη διανομή της έκφρασης λουσιφεράσης. Brown χρώση υποδεικνύει λουσιφεράσης θετικά κύτταρα. (F) θετικώς χρωματισμένο, μεγέθυνση χ 40 (G) θετικώς χρωματισμένο, μεγέθυνση χ 10 (Η) Αρνητικός μάρτυρας:. Προστέθηκε καθόλου πρωτογενές αντίσωμα, μεγέθυνση χ 10

Η

Επιπλέον λουσιφεράσης ανοσοϊστοχημική ανάλυση των τμημάτων του όγκου (Σχήμα 3Β και 3C) έδειξαν όλα ηπατικού τύπου κύτταρα που προέρχονται από τα εγχυθέντα κύτταρα να εκφράζουν λουσιφεράση. Οι Μη προετοιμασμένο περιοχές πιστεύεται ότι είναι είτε νεκρωτικό ιστό ή κύτταρα προσλαμβάνονται στον όγκο, η οποία δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί πειραματικά και βρίσκεται υπό έρευνα.

Ομοίως, Αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές ιστού χρωματίζονται ελήφθησαν για τους όγκους που σχηματίζεται στο ποντίκια μετά από ένεση κυττάρων ΜΙΑ-PaCa2 (Σχήμα 3Ε-Η). Στην περίπτωση αυτή, οι ιστολογικές τομές αποκάλυψε ότι τα κύτταρα του όγκου που σχηματίζονται είχε διεισδύσει μεταξύ της κανονικής παγκρεατική acini στην περιφέρεια του όγκου. Τα κύτταρα όγκου που περιγράφονται πρόκειται να διανεμηθούν σε στερεά φύλλα χωρίς ένδειξη αδενικής διαφοροποίησης και έχουν μια μέτρια ποσότητα κυτταροπλάσματος με σαφώς καθορισμένες κύτταρο σύνορα. Οι πυρήνες ήταν άτυπα και υπερχρωματικό ενώ πυρηνίσκοι ήταν άσημος. Μιτωτική ποσοστά ήταν σπάνιες. Η πλειοψηφία των κυττάρων του όγκου περιείχε ένα χλωμό ενδοκυτταροπλασματική κυστιδίων πιέζει τον πυρήνα προς την περιφέρεια προσδίδει μια εμφάνιση σφραγιστικό δαχτυλίδι. Εξωκυττάρια βλέννα και στρωματικά ίνωση δεν παρατηρήθηκαν. Μια ανεξάρτητη ιστοπαθολόγου επιβεβαίωσε όλα τα χαρακτηριστικά του όγκου ήταν σύμφωνες με καρκίνωμα δαχτυλίδι σφραγίδα του παγκρέατος.

Τα pUbC-S /MAR πλασμίδιο είναι επισωματικά διατηρηθεί και Εκφράζεται στο προκύπτον όγκου ιστοί

Για να παρέχουν φυσική απόδειξη της μοριακής φύσεως των pUbC-S /MAR πλασμιδίου στο HCC και του παγκρέατος, πραγματοποιήσαμε ανάλυση στυπώματος Southern επί του συνολικού DNA που απομονώθηκε από δύο διαφορετικές θέσεις του ίδιου όγκου σε 35 ημέρες μετά την παράδοση είτε του Huh7 ή ο ΜΙΑ-PaCa2 κυτταρική γραμμή.

Ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα φαίνεται στο Σχήμα 4Α, όπου ένα άτομο ζώνη του αναμενόμενου μεγέθους ανιχνεύεται σε όλες τις διαδρομές. Αυτό δείχνει ότι οι pUbC-S /MAR ρϋΝΑ παραμείνει επισωματικό σε 35 ημέρες μετά την παράδοση. Περαιτέρω απόδειξη για επισωματική διατήρηση Επίσης παρέχεται από το πλασμίδιο διάσωσης του pUbC-S /MAR πλασμιδίου απομονώθηκε από ανθεκτικά σε καναμυκίνη

E. coli

μετά από μετασχηματισμό με συνολικό DNA από τον όγκο που προέρχεται από Huh7 ή MIA-PaCa2 ποντίκια με αγωγή. Στην περίπτωση αυτή, μόνο άθικτο δωρεάν ρϋΝΑ από το απομονωμένο δείγμα όγκου θα παράγει βακτηριακές αποικίες σε πλάκες που περιέχουν καναμυκίνη, τον δείκτη αντίστασης που υπάρχει στο πλασμίδιο. Τα πρότυπα περιορισμού του πλασμιδίου pUbC-S /MAR ήταν συμβατά με μη τροποποιημένο μη ολοκληρωμένες κατασκευάσματα πλασμιδίου (που φαίνεται στο Σχήμα 4Ε).

(Α) ανάλυση κηλίδας Southern του ρϋΝΑ απομονώθηκε από δύο διαφορετικές περιοχές του ιστού του όγκου από NOD /SCID ποντίκια, 35 ημέρες μετά την παράδοση των σταθερών κυτταρικών γραμμών Huh7 και MIA-PaCa2, πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Ένα αντιπροσωπευτικό πρότυπο υβριδισμού του ρϋΝΑ που απομονώνονται από ένα ζώο από κάθε όγκου παρουσιάζεται. Ανίχνευση του πλασμιδίου δείκτη από M: 1-kbp σκάλα (Hyperladder Ι, Bioline)? Λωρίδα 1: pUbC-S /MAR απομονωθεί από καρκινικό ιστό που σχηματίζεται μετά την έγχυση Huh7 του NOD /SCID ποντικούς σε 35 ημέρες μετά την ένεση? λωρίδα 2: pUbC-S /MAR που απομονώνονται από μία διαφορετική περιοχή του ιστού του όγκου που σχηματίζεται μετά από την παράδοση Huh7 σε NOD /SCID ποντικούς σε 35 ημέρες μετά την ένεση? λωρίδα 3 pUbC-S /MAR απομονωθεί από καρκινικό ιστό που σχηματίζεται μετά την ένεση MIA-PaCa2 του NOD /SCID ποντικούς σε 35 ημέρες μετά την ένεση? λωρίδα 4: pUbC-S /MAR που απομονώνονται από μία διαφορετική περιοχή του ιστού του όγκου που σχηματίζεται μετά από την παράδοση MIA-PaCa2 σε NOD /SCID ποντικούς σε 35 ημέρες μετά την ένεση? (+) Θετικός έλεγχος: 25 ng του γραμμικού πλασμιδίου pUbC-S /MAR. (Β) Replication εξαρτώμενη δοκιμασία pUbC-S /MAR πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε από τους όγκους των ποντικών σε 35 ημέρες μετά τη χορήγηση. διαδρομές 1-3: κηλίδας Southern του ολικού DNA όγκου που απομονώθηκε από NOD /SCID ποντικούς σε 35 ημέρες μετά την παράδοση με Huh7 σταθερή κυτταρική γραμμή και διπλή πέψη με

Spe

I-

Mbo

Ι ( λωρίδα 1),

Spe

Ι

ϋρη

Ι (λωρίδα 2) ή

Spe

Ι

Bfu

CI (λωρίδα 3) ένζυμα? διαδρομές 7-9: Southern του ολικού DNA όγκου που απομονώθηκε από NOD /SCID ποντικούς σε 35 ημέρες μετά την παράδοση με ΜΙΑ-PaCa2 σταθερή κυτταρική γραμμή και διπλή πέψη με

Spe

I-

Mbo

Ι (λωρίδα 4),

Spe

Ι

ϋρη

Ι (λωρίδα 5) ή

Spe

Ι

Bfu

CI (λωρίδα 6) Τα ένζυμα? Μ: 1-kbp σκάλα (Hyperladder Ι, Bioline UK Ltd., Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο). (Γ) ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε DNA του όγκου που λαμβάνεται κατά την ημέρα 35 μετά την ένεση των κυτταρικών σειρών Huh7 και MIA-PaCa2. DNA εκχυλίστηκε από δύο διαφορετικές θέσεις του κάθε όγκου στο τέλος του πειράματος και του αριθμού των pUbC-S /MAR γονιδιώματα φορέα ανά γονιδίωμα διπλοειδή παρουσιάζεται, μετά από κανονικοποίηση με γονίδιο GAPDH, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. (Δ) Ανάλυση PCR του DNA που απομονώθηκε

in vitro

από την Huh7 (λωρίδα 1) και τα κύτταρα πριν από την ένεση σε ποντίκια NOD /SCID ΜΙΑ-PaCa2 (λωρίδα 4), και

in vivo

από δύο διαφορετικές περιοχές του όγκου για κάθε κυτταρική σειρά (διαδρομές 2,3 για Huh7 και οι διαδρομές 5,6 για τις κυτταρικές γραμμές MIA-PaCa2). Αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος PCR: 1091 bp. 100 bp DNA σκάλα (διαδρομή Μ), (+) θετικός έλεγχος: pUbC-S /MAR? (-) Αρνητικό έλεγχο: μείγμα PCR χωρίς DNA. πειράματα διάσωσης (Ε) πλασμίδιο τεσσάρων

E.Coli

αποικίες για Huh7 (λωρίδες 1-4) και τρεις αποικίες για κυτταρικές σειρές ΜΙΑ-PaCa2 (λωρίδες 5-7), δείχνοντας πανομοιότυπο πρότυπο περιορισμού με καθαρό pUbC- S /MAR πλασμίδιο (+), μετά από περιοριστική πέψη με

Spe

Ι ένζυμο. Μ:. 1-kbp σκάλα (Hyperladder Ι, Bioline)

Η

Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε μια αντιγραφή του δοκιμασίας εξαρτάται από τον περιορισμό για να δείξει την αντιγραφή pDNA. Ολικό DNA του όγκου από δύο διαφορετικές περιοχές είτε του HCC ή του όγκου PaCa, απομονώθηκαν από τις ομάδες των ζώων που έλαβαν θεραπεία με pUbC-S /MAR πλασμιδίου στο τέλος του πειράματος 35 ημέρες και υποβλήθηκε σε πέψη με

Spe

I, ένα ενιαίο κόφτη, για να διανοιχτεί το πλασμίδιο, πριν από την περαιτέρω πέψη όλη τη νύχτα με τα ευαίσθητα σε μεθυλίωση ένζυμα

ϋρη

Ι,

Mbo

Ι ή

Bfu

CI. Όλα τα τρία ένζυμα αναγνωρίζουν την ίδια ακολουθία (GATC).

ϋρη

Ι απαιτεί μεθυλίωση του DNA στόχου από βακτηριακά κύτταρα για την πέψη, ενώ η

Mbo

περιορισμός που εξαρτάται από μεθυλίωση του DNA των θηλαστικών και

Bfu

περικοπές Cl ανεξάρτητα από την κατάσταση μεθυλίωσης και δεν διακρίνει την πηγή της μεθυλίωσης.

Ο περιορισμός θραύσματα πέψης διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 0,8%, στη συνέχεια στυπώθηκαν και ανιχνεύθηκαν με ένα 408-bp από το γονίδιο αντοχής στην καναμυκίνη. Η ανάλυση κηλίδος Southern (Σχήμα 4Β) χρησιμεύει για να συγκρίνει το μοτίβο πέψης του pUbC-S /MAR στο DNA του όγκου που απομονώνονται από το Huh7 αγωγή ομάδα ζώων (Σχήμα 4Β διαδρομές 1-3) με εκείνη από την ομάδα ΜΙΑ-PaCa2 (λωρίδες Σχήμα 4Β 4-6).

η απώλεια των βακτηριακών μεθυλίωσης του πλασμιδίου pUbC-S /MAR βρίσκεται στο DNA που απομονώθηκε από τους δύο όγκους όταν αυτά χωνεύονται με

Spe

I /

Mbo

Ι ή

Spe

I /

ϋρη

Ι, αντίστοιχα (λωρίδες 1,2,4,5). Η επιτυχής χώνευση με

Mbo

Ι υποδεικνύεται από μετατροπή της γραμμικής

Spe Ι

ζώνη για να θραύσματα πέψης (λωρίδα 1 για Huh7 και διαδρομή 4 για MIA-PaCa2), και η έλλειψη της πέψης με

ϋρη

μου αφήνει το ενιαίο

Spe

Ι γραμμικοποιημένου ζώνη ανέπαφη (λωρίδα 2 για Huh7 και λωρίδα 5 για ΜΙΑ-PaCa2). Όπως

Mbo

Ι κόβει μόνο DNA που προέρχεται από θηλαστικά, ενώ

Dpn

Ι απαιτεί βακτηριακών μεθυλίωσης για την πέψη, αυτό υποδηλώνει ότι pUbC-S /MAR πλασμίδιο έχει αντιγραφεί σε κύτταρα όγκου τόσο του HCC και PaCa. Τέλος, η πέψη με το

Spe

I-

Bfu

CI δεν μπλοκάρεται από οποιοδήποτε είδος μεθυλίωσης και χρησιμεύει ως ένας θετικός έλεγχος για το πλασμίδιο χώνευση (λωρίδες 3 και 6). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το S /MAR-φιλοξενούν πλασμίδιο pUbC-S /MAR είναι ικανός να αντιγράφει

in vivo

μετά την παράδοση του σταθερώς επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών, που είναι παρόμοια με τις μελέτες

in vitro

στην οποία S /MAR-προικισμένο ρΡΝΑ είναι σε θέση να επιτύχει μιτωτική σταθερότητα και την αναπαραγωγή [26]. Το σωστό μέγεθος των ζωνών πέψη περιορισμού υποδεικνύει μιτωτική σταθερότητα χωρίς ακαθάριστο αναδιατάξεις του αντιγραφικό πλασμίδιο.

Ποσοτική PCR διεξήχθη κατά τον τερματισμό του πειράματος (στο 35 ημέρες μετά την παράδοση) να συγκρίνει το σχετικό αριθμό αντιγράφων του πλασμιδίου μόρια στο Huh7 και ΜΙΑ PaCa2-αγωγή ομάδες. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 4C, όπου και στις δύο περιπτώσεις, ο αριθμός αντιγράφων πλασμιδίου υπολογίζεται να είναι περίπου μία έως τρεις διάνυσμα αντίγραφα /κύτταρο, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ένα σχετικά χαμηλό αριθμό αντιγράφων του S /MAR φορέα μικρότερη από 10 αντίγραφα /κυττάρου [18], [25], [29].

Επιπλέον, η συντήρηση του γονιδίου διαγονιδιακών δείκτη δείχθηκε επίσης με ανάλυση PCR σε DNA που απομονώθηκε από «καλλιεργούνται» κύτταρα ΜΙΑ-PaCa2 και Huh7 (Σχήμα 4D , λωρίδες 1 και 4) και από δύο διαφορετικές θέσεις του ιστού του όγκου σε 35 ημέρες μετά τον τοκετό (Σχήμα 4D, λωρίδες 2,3 για Huh7 και οι διαδρομές 5,6 για MIA-PaCa2). Ένα προϊόν PCR του αναμενόμενου μεγέθους, 1091 bps, δημιουργήθηκε από το DNA όλων των πηγών που υποδεικνύει ότι το πλασμίδιο pUbC-S /MAR διατηρήθηκε σε αμφότερα τα κύτταρα Huh7 και ΜΙΑ-PaCa2 και σε όλο τον όγκο που προέρχεται από αυτά τα κύτταρα μετά από έγχυση σε NOD -SCID ποντίκια. Αυτό επιβεβαιώνει την παρουσία του pUbC-S /MAR πλασμίδιο τόσο

in vitro

και

in vivo.

Η

Συζήτηση

Το έργο αυτό αντιπροσωπεύει την ανάπτυξη μοντέλα όγκων ποντικών που προέρχονται από δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Σημαντικά, αυτή η μελέτη δείχνει για πρώτη φορά τη δημιουργία γενετικά σημειώνονται μοντέλα ποντικών του παγκρέατος και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος χρησιμοποιώντας μια μη-ιική επισωματικό φορέα πλασμιδίου. Τόσο HCC και PaCa έχουν υψηλή συχνότητα εμφάνισης? HCC είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο και ευθύνεται για το 80-90% των πρωτοπαθούς καρκίνου του ήπατος [30], ενώ υπάρχουν περίπου 42.470 άτομα που έχουν διαγνωσθεί με καρκίνο του παγκρέατος κάθε χρόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες με λιγότερο από το ένα 20% δωδεκάμηνος ρυθμός επιβίωσης [31].

με δεδομένη την επικράτηση αυτών των ασθενειών, είναι ζωτικής σημασίας να αναπτυχθεί μια αποτελεσματική μέθοδος για τη βελτίωση της ανίχνευσης και την πρόγνωση της νόσου. Η παραγωγή ενός αποτελεσματικού γενετικώς σημειώνονται μοντέλο ποντικού όγκου για HCC και PaCa είναι ένα σημαντικό βήμα στη διαδικασία αυτή, καθώς θα επιτρέψει τις επιπτώσεις των πιθανών θεραπευτικών να παρακολουθείται πιο εύκολα και με ακρίβεια και θα επιτρέψουν συνεπώς πιο αξιόπιστα δεδομένα κατά την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων.

προσπάθειες να παράγουν γενετικά σημειώνονται οι όγκοι προηγουμένως είχαν περιορισμούς, όπως ο κίνδυνος της ολοκλήρωσης με ιικών φορέων και των δυνητικών ενθετική μεταλλαξογένεση. Επιπλέον, η γονοτοξικότητας ιικών φορέων μπορεί να αλλάξει σημαντικά τα χαρακτηριστικά του αποδέκτη των κυττάρων του και μετέπειτα θυγατρικά κύτταρα. Κατά τη δημιουργία μοσχευμάτων όγκων, οι λιγότερες αλλαγές στο αρχικό καρκινικά κύτταρα τόσο καλύτερη είναι η αναπαράσταση του μοντέλου καρκίνου. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη μη-ιικών φορέων στην έρευνα για τον καρκίνο να ελαχιστοποιηθούν οι ανεπιθύμητες ενέργειες αυτές είναι ζωτικής σημασίας. προηγούμενη εργασία μας έχει δείξει ισχυρή έκφραση παρατεταμένης επισωμική λουσιφεράσης

in vivo

, από ένα σύστημα έκφρασης που περιλαμβάνει ένα ρϋΝΑ S /MAR στοιχείο και έναν υποκινητή θηλαστικού στο ήπαρ ποντικού [11], [20], [21]. Παρακολούθηση της λουσιφεράσης διαγονιδίου την πάροδο του χρόνου σε ένα μόνο ζώο χωρίς την ανάγκη για θυσιάζοντας τα ζώα δεικνύει την χρησιμότητα αυτού του φορέα σε γενετικώς αξιοσημείωτη καρκινικά κύτταρα για την παρακολούθηση της ανάπτυξης ενός μοντέλο όγκου απλά με

in vivo

απεικόνισης. Όπως φαίνεται εδώ, ο φορέας S /MAR επιτρέπει σταθερή επιμόλυνση των καρκινικών κυττάρων και την επακόλουθη ανάπτυξη του όγκου HCC ξενομοσχευμάτων και PaCa. Αυτό το έγγραφο περιγράφει την πρώτη επίδειξη της λειτουργικής χρήσης του φορέα S /MAR να επιμολύνει σταθερά τα καρκινικά κύτταρα με γενετικά σηματοδοτήσει όγκους

in vivo

.

Προηγούμενες μελέτες

in vitro

έχουν δείξει ότι η S /MAR φορείς μπορούν να αναπαραχθούν επισωματικά ανεξάρτητα από τον χρησιμοποιούμενο προωθητή. Έχουμε επιβεβαιώσει και επεκτείνει αυτήν την παρατήρηση χρησιμοποιώντας τον φορέα pUbC-S /MAR σε κυτταρικές σειρές Huh7 και MIA-PaCa2. Έχουμε λάβει παρόμοια αποτελέσματα με τη χρήση του φορέα pEPI-Luc – ενός πλασμιδίου S /MAR όπου η έκφραση λουσιφεράσης καθοδηγείται από τον υποκινητή του ανθρώπινου CMV (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, μια προηγούμενη μελέτη για να σηματοδοτήσει καρκινικά κύτταρα γενετικά με λουσιφεράση διαγονίδιο οδηγείται από τον προαγωγό CMV [4] έχει δείξει τα όρια αυτού του υποκινητή για τη μακροπρόθεσμη έκφραση διαγονιδίου αφού ο υποκινητής CMV εύκολα αδρανοποιείται με διάφορους μηχανισμούς ξενιστές όπως CpG μεθυλίωσης [11], [14], [15], [16], [17]. Αυτός ο περιορισμός έχει ξεπεραστεί με τη μελέτη μας, η οποία επιδεικνύει μία παρατεταμένη έκφραση από τον προαγωγό UBC θηλαστικού σε συνδυασμό με ένα S /MAR στοιχείο. Διαφορική δημιουργία κυττάρων μπορεί να ευθύνεται για τις διαφορές στο λουσιφεράσης έκφραση παρατηρείται μεταξύ των ζώων σε κάθε ομάδα μετά τη χορήγηση.

ανάλυση Ιστοπαθολογία των όγκων έδειξε την τυπική μορφολογία ιστού που αναμένεται από PaCa και HCC (Σχήμα 3) και την ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε όλα τα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από αυτές που εγχέεται στο ποντίκι για να είναι λουσιφεράση θετικό (Σχήμα 3). Με δεδομένο αυτό και η μακροπρόθεσμη έκφραση διαγονιδίου που επιτεύχθηκε για 35 ημέρες μετά την ένεση, όπου παρατηρείται μία απότομη αύξηση της έκφρασης μετά από 21 ημέρες (Σχήμα 2C), αυτό το S /MAR φορέα φαίνεται να ταιριάζει ιδανικά για χρήση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές για την παραγωγή ένα γενετικά σημειώνονται ποντικού μοντέλο αυτής της ασθένειας.