Αφηρημένο

Pinus massoniana

προανθοκυανιδίνες του φλοιού (PMBPs), ένα δραστικό συστατικό που απομονώνεται από

Pinus massoniana

φλοιός, έχει αναφερθεί ότι διαθέτει ένα ευρύ φάσμα βιοχημικών ιδιοτήτων. Εδώ, ερευνήσαμε την επίδραση κατά των όγκων των PMBPs για τον καρκίνο των ωοθηκών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PMBPs μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών και προκαλούμενη από κύτταρα εξαρτώμενη από τη δόση απόπτωση. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί που εμπλέκονται διαλευκάνθηκαν να περιλαμβάνουν την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, προς τα κάτω ρύθμιση της αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και την ενεργοποίηση της κασπάσης 3/9, γεγονός που υποδηλώνει ότι PMBPs πυροδοτείται απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης των μιτοχονδρίων που σχετίζονται μονοπάτι αποπτωτικά. Επιπλέον, επούλωση τραυμάτων και Transwell δοκιμασίες θάλαμος αποκάλυψε ότι PMBPs θα μπορούσε να καταστείλει τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. PMBPs δραματικά ανέστειλε δραστικότητα ΜΜΡ-9 και έκφραση, μπλοκάρει τη δραστηριότητα των ΝΡκΒ και την ενεργοποίηση του ERK1 /2 και p38 ΜΑΡΚ. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι PMBPs έχει τη δυνατότητα να αναπτυχθεί ως ένα αντικαρκινικό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών ή /και τη διαχείριση της νόσου

Παράθεση:. Liu J, Bai J, Jiang G, Λι Χ, Wang J, Wu D, et al. (2015) Αντι-όγκου Επίδραση του

Pinus massoniana

Bark προανθοκυανιδίνες για τον καρκίνο των ωοθηκών, μέσω επαγωγής της κυτταρικής απόπτωσης και αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης. PLoS ONE 10 (11): e0142157. doi: 10.1371 /journal.pone.0142157

Επιμέλεια: Yi-Hsien Hsieh, Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, ΤΑΪΒΑΝ

Ελήφθη: 1 Μαΐου, 2015? Αποδεκτές: 19 Οκτωβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 5, Νοεμβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.81302282) (URL: https://www.nsfc.gov.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες και την κύρια αιτία θανάτου σε γυναικολογικών κακοηθειών [1] .Η θεραπεία πρώτης γραμμής του καρκίνου των ωοθηκών είναι συνήθως παραδοσιακή χειρουργική επέμβαση σε συνδυασμό με την πλατίνα πακλιταξέλη χημειοθεραπεία με βάση την [2]. Παρά την καλή αρχική ανταπόκριση στις περισσότερες ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι ακόμη χαμηλή λόγω relapses- μια κοινή εμφάνιση μετά τη θεραπεία πρώτης γραμμής [3]. Υπήρξαν λίγες εξελίξεις στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών από την τυποποίηση της σισπλατίνης και πακλιταξέλης ναρκωτικών τα τελευταία 20 χρόνια [4]. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Σήμερα, μερικά φυσικά βιοενεργά φυτοχημικά χρησιμοποιούνται για να εμποδίσουν τον πολλαπλασιασμό ή τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [5]. Τέτοιες φυτοχημικά είναι μη-τοξικά και στερείται παρενεργειών, έτσι είναι καλές εναλλακτικές λύσεις και /ή συμπληρωματικά με τα συμβατικά κυτταροτοξική χημειοθεραπεία [5]. Το εκχύλισμα φλοιού πεύκου αρχικά είχε θεωρηθεί μια ενοχλητική προϊόν αποβλήτων στη βιομηχανία ξυλείας, αλλά τώρα αναγνωρίζεται ως πλούσια σε φυσικό προανθοκυανιδίνες με τους πιθανούς φαρμακευτικές ιδιότητες [6]. Έχει αποδειχθεί ότι οι προανθοκυανιδίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόληψη των όγκων λόγω της ικανότητάς τους να ρυθμίζουν την δράση των πολλαπλών στόχων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση [7]. Ως εκ τούτου, η δράση κατά των όγκων του εκχυλίσματος φλοιού πεύκου έχει λάβει την μεγαλύτερη προσοχή πρόσφατα.

Pinus massoniana

Αρνί της οικογένειας Pinaceae είναι εγγενές στην νότια και νοτιοδυτικά της Κίνας. φλοιός του έχει χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική για τη θεραπεία της φλεγμονής, αρθραλγία, ρευματισμούς και καρκίνος [8]. Το κύριο συστατικό του

Pinus massoniana

φλοιός είναι επίσης προανθοκυανιδίνες. αντικαρκινική δραστικότητα της έχουν αποδειχθεί σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατώματος Hep G2, τον καρκίνο του τραχήλου κύτταρα HeLa και κύτταρα σαρκώματος ποντικού S180 [9,10,11]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα των

Pinus massoniana

προανθοκυανιδίνες του φλοιού (PMBPs) για τον καρκίνο των ωοθηκών και οι μηχανισμοί που διέπουν τη διαδικασία δεν έχουν ακόμη οριοθετηθεί.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε εάν προανθοκυανιδίνες από

Pinus massoniana

φλοιό θα μπορούσε να ασκήσει κατά του όγκου αποτελέσματα σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και διερευνήθηκε περαιτέρω τις λεπτομέρειες των μηχανισμών που διέπουν αυτή τη διαδικασία. Τα δεδομένα μας μπορεί να αποτελέσει τη βάση για τη μελλοντική ανάπτυξη της PMBPs ως ένα αποτελεσματικό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά, αντιδραστήρια και χημικά

Τα αντισώματα έναντι της κασπάσης -3, κασπάσης-9, Bcl-2 αγοράσθηκαν από την Cell Signaling Technology (Denver, ΜΑ). Αντισώματα έναντι ΜΜΡ-9, ΝΡκΒ, ΙκΒα και β-ακτίνης ελήφθησαν από Protein Tech Group, Inc. (Chicago, USA). Αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένων ΙκΒα, ERK1 /2, ρ38 και ΙΝΚ ελήφθησαν από Sangon Biotech, Κίνα. Το κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) αγοράστηκε από την Amersham Life Science, Inc. (Ηνωμένες Πολιτείες). Η αννεξίνη V-FITC συζευγμένο κιτ ανίχνευσης της απόπτωσης και της μιτοχονδριακής μεμβράνης κιτ δυναμικό ανίχνευση JC-1 αγοράστηκαν από Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Κίνα). Transwells αγοράστηκαν από BD Biosciences (San Jose, ΗΠΑ). ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλο-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο) και DAPI (2- (4-αμιδινοφαινυλ) -6-indolecarbamidine διυδροχλωρική) ελήφθησαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). PMBPs σκόνη αγοράστηκε από Shaanxi Sciphar Hi-tech Industry Co, Ltd (Shanxi, Κίνα). Περιείχε περίπου 95% προανθοκυανιδίνες και σταθερό για τουλάχιστον δύο χρόνια στους 4 ° C.

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Α2780 γραμμή ωοθήκης καρκινικό κύτταρο ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC ) και αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS (και τα δύο αγοράστηκαν από Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ, USA). Ον2008 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Καθ Shiying Cui (Dalian Medical University, Κίνα) και αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen, Burlington, ΟΝ, Canada) συμπληρωμένο με 10% FBS. Κανονική ωοθηκών επιθηλιακή κυτταρική γραμμή IOSE80 ελήφθη από την καναδική ωοθηκικό ιστό Τράπεζα και αναπτύχθηκαν σε μέσο 199 (Invitrogen) και MCDB 105 (Sigma) συμπληρωμένο με 10% FBS. Όταν τα κύτταρα ήταν 80% συρρέοντα, αυτά συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση 0,25%. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις PMBPs με κατάλληλο αντίστοιχο ελέγχους.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η επίδραση της PMBPs στην βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. Τα κύτταρα (1 χ 10

4 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων και επωάζονται για 24 ώρες. Στη συνέχεια, 200 μΙ μέσου που περιείχε 0, 10, 25, 50, 75, 100 και 120 PMBPs μg /ml προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Κάθε συγκέντρωση PMBPs ήταν υπερεξαπλασιάστηκαν. Μετά από 24 ώρες και 48 ώρες PMBPs θεραπεία, 20 μΐ ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες. Το διάλυμα ΜΤΤ αφαιρέθηκε και τα κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 150 μΙ DMSO. Η απορρόφηση του διαλύματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός Ascent Multiskan σε μήκος κύματος 540 nm.

χρώση ϋΑΡΙ δοκιμασία

Περίπου 4 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών απλώθηκαν σε 6-φρεατίων και στη συνέχεια κατεργάζεται με PMBE σε 0, 25, 50 και 100 μg /ml για 24 ώρες. Κύτταρα σε κάθε πηγάδια βάφτηκαν με DAPI πριν από τον καθορισμό με 3,7% φορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού.

κυτταρικής απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

Μετά την επεξεργασία με 0, 10, 25, 35 και 50 ml PMBPs μg /για 24 ώρες, ωοθηκών καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS τρεις φορές, στη συνέχεια επωάστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με μία ροή FACS /Calibur κυτταρόμετρο (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

Δοκιμασία για μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

Οι αλλαγές του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης JC-1. Μετά την επεξεργασία με 0, 25, 35, 50 μg /ml PMBPs για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με JC-1 βαφή για 15 λεπτά στους 37 ° C σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με μία ροή FACS /Calibur κυτταρόμετρο.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Α2780 και Ον2008 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αναπτύχθηκαν για τη δημιουργία ενός συρρέουσα μονοστιβάδα. Η κυτταρική μονοστιβάδα ήταν γδαρμένο σε μια ευθεία γραμμή με P200 μλ ρύγχος πιπέτας. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση αποσπασμένα κύτταρα και στη συνέχεια επωάζονται με πλήρες μέσο ανάπτυξης το οποίο περιέχει 0, 5, 10 και διάλυμα 25 μg /ml PMBPs για 24 ώρες. Η μετανάστευση των κυττάρων παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων σε 100 × μεγέθυνση στις 0 και 24 ώρες μετά την επαγωγή του τραυματισμού. Κύτταρα που μετανάστευσαν στην απογυμνωμένη περιοχή σε κάθε ένα από έξι τυχαία πεδία μετρήθηκαν και ποσοτικά με τη χρήση με τη βοήθεια υπολογιστή μικροσκοπίου.

Transwell δοκιμασία θαλάμου

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή ποσοτικοποιήθηκαν με τον προσδιορισμό θαλάμου transwell. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ml PMBPs 0, 5, 10 και 25 μg /για 24 ώρες και συλλέχθηκαν. 1 × 10

5 κύτταρα σε DMEM χωρίς ορό προστέθηκαν σε κάθε άνω θάλαμο και DMEM με 10% FBS προστέθηκε στο κατώτερο θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα που παραμένουν επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο στους 100 × μεγέθυνση. Έξι τυχαία πεδία κάθε μεμβράνης Transwell μετρήθηκαν και ο μέσος όρος.

Ζελατίνη zymography

Η δραστικότητα της ΜΜΡ-9 ανιχνεύθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 5, 10, 25 μg /ml PMBPs για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το κυτταρικό μέσο συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Ίσος όγκος διαυγασθέν μέσο ηλεκτροφορήθηκε μέσω 10% SDS-PAGE πηκτή που περιέχει 0.1% (β /ο) ζελατίνη σε 4 ° C. Η πηκτή πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 100 mM NaCl και 2,5% Triton Χ-100) και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ενεργοποίησης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl

2, 0,02% NaN

3 και 1 μΜ ΖηΟ

2) στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, η γέλη χρωματίστηκε με 0,25% (β /ο) Coomassie Brilliant Blue σε 45% (ν /ν) μεθανόλη και 1% (ν /ν) οξικό οξύ και αποχρωματίζονται με 10% ισοπροπανόλη /10% οξικό οξύ (ν /ν ) λύση. ΜΜΡ-9 ζώνες παρατηρήθηκαν στα 92 kDa.

Παρασκευή ολικού κυτταρικού λύματος και

πυρηνικό κλάσμα

Για συνολικό προϊόν κυτταρικής λύσης, τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Beyotime, Jiangsu, Κίνα). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 12,000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Πυρηνική κλάσμα εκχυλίζεται με μια τροποποιημένη μέθοδο (Yeh, 2012). Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM HEPES, 10 mM KC1, 0,1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 0,2% ΝΡ-40, 1 mM DTT, και 0.5 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο) και της πυρηνικής σφαιρίδια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση σε 3000 rpm για 30 s στους 4 ° C. Το πυρηνικό κλάσμα εκχυλίσθηκε έπειτα με ρυθμιστικό διάλυμα Β (20 mM HEPES, 25% γλυκερόλη, 1.5 mM MgCl

2, 0,1 mM EDTA, 420 mM NaCl, 1 mM DTT, και 0.5 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο).

κηλίδος Western δοκιμασία

Τα συνολικά προϊόντα κυτταρικής λύσης ή πυρηνικά εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με ημι-ξηρή συσκευή για 1 ώρα. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό γάλα για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με το ειδικό διάλυμα πρωτογενούς αντισώματος όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την επώαση με το κατάλληλο αντι-είδος δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα, οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με το κιτ ECL.

Στατιστική ανάλυση

Δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD για τρία ανεξάρτητα πειράματα. SPSS 15.0 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για τις αναλύσεις. Η τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα της PMBPs για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Τα αποτελέσματα της PMBPs για τη βιωσιμότητα των ωοθηκών. τα καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα ωοθηκών πρώτον ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. Ωοθηκών καρκινικά κύτταρα Α2780 και Ον2008, καθώς και κανονική κύτταρα των ωοθηκών IOSE80 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 μg /ml) για 24 ώρες ή 48 ώρες. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα μετά από θεραπεία PMBPs έδειξαν μια δραματική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων από 25 μg /ml σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0,01), ενώ ίδιες συγκεντρώσεις δεν επηρέασε σημαντικά τη βιωσιμότητα των φυσιολογικών κύτταρα των ωοθηκών IOSE80 (Σχήμα 1Α). Η τιμή IC50 του PMBPs ήταν 48 ± 2,4 μg /ml για Α2780 και 67 ± 2,7 μg /ml για Ον2008 στις 48 h (Σχήμα 1Α).

(Α) ωοθηκών καρκινικά κύτταρα Α2780 και Ον2008, και φυσιολογική ωοθηκική κύτταρα IOSE80 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 μg /ml) για 24 ώρες ή 48 ώρες. βιωσιμότητα των κυττάρων στις διάφορες συγκεντρώσεις του PMBPs ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ και εκφράζεται σε σχέση με εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. (Β) Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα Α2780 και Ον2008, και φυσιολογικά κύτταρα των ωοθηκών IOSE80 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 25, 75, 100 μg /ml) για 24 ώρες, και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με ανεστραμμένη μικροσκοπία αντίθεσης (μεγέθυνση, 40 φορές).

η

Επιπλέον, οι μορφολογικές μεταβολές των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Α2780 και OV2008 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν χωρίς PMBPs εμφανίζεται χαρακτηριστικό κανονικό σχήμα με 70% συρροή μετά από 24 ώρες. Ωστόσο, συρροή των κυττάρων μειώθηκε δραματικά με προφανείς μορφολογικές μεταβολές κατά την κατεργασία PMBPs. Τα κύτταρα άρχισαν να συρρικνώνεται, έχασαν κανονικό σχήμα τους, έγινε γύρο και τελικά αποσπώνται από τον δίσκο καλλιέργειας (Σχήμα 1Β). Σε αντίθεση, δεν παρατηρήσαμε τέτοιες μορφολογικές μεταβολές σε φυσιολογικά κύτταρα των ωοθηκών, IOSE80, μετά από αγωγή PMBPs (Σχήμα 1Β). Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι PMBPs αναστέλλουν επιλεκτικά τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με μικρότερη επίδραση στην καλοήθη κύτταρα.

PMBPs να προκαλέσει ωοθηκών καρκινικά κύτταρα «απόπτωση

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον τα αποτελέσματα αντι-όγκου του PMBPs επί Α2780 και Ον2008 κύτταρα που σχετίζονται με την απόπτωση, τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Σχήμα 2Α). Μετά τη θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις PMBPs για 24 ώρες, οι πυρηνικές συμπύκνωση χρωματίνης και κατακερματισμένη στικτή μπλε πυρηνικό φθορισμό παρατηρήθηκαν στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, παρόμοια με τις μορφολογικές αλλαγές στα αποπτωτικά κύτταρα, αλλά τα κύτταρα ελέγχου που εμφανίζονται φυσιολογικά και άθικτα πυρήνες. Προτείνει ότι PMBPs μπορεί να επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

(Α) Α2780 και Ον2008 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 25, 50, 100 μg /ml) για 24 ώρες. Οι μορφολογικές αλλαγές των πυρήνων εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας χρώση ϋΑΡΙ. Τα βέλη δείχνουν την πυρηνική συμπύκνωση και αποπτωτικών σωμάτων (μεγέθυνση, 100 ×). (Β) Α2780 και Ον2008 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 10, 25, 35, 50 μg /ml) για 24 ώρες. Η κυτταρομετρία ροής εφαρμόστηκε για την ανάλυση διπλό χρωματισμένα κύτταρα Α2780 Αννεξίνη V-FITC /ΡΙ. Το χαμηλό δεξιά (LR) τεταρτημόριο των ιστογραμμάτων δείχνει τα πρώιμα αποπτωτικών κυττάρων και η άνω δεξιά (UR) τεταρτημόριο δείχνει τα τέλη αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων. (Γ) Η επεξεργασία του Α2780 και Ον2008 κυττάρων με PMBPs οδήγησε σε δραματική αύξηση στο ποσοστό των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων (συμπεριλαμβανομένης της πρόωρης απόπτωσης, αργά απόπτωση και νέκρωση). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

** P & lt?.. 0

01

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

Για την περαιτέρω ποσοτικοποίηση της απόπτωσης που προκαλείται από PMBPs, Α2780 και OV2008 κύτταρα σημάνθηκαν με Annexin V-FITC /ΡΙ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το κάτω δεξιά τεταρτημόριο (LR) δείχνει το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V

+ και PI

-) και την άνω δεξιά τεταρτημόριο (UR), το ποσοστό των καθυστερημένων αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων (αννεξίνη V

+ και PI

+). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PMBPs προκάλεσε απόπτωση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, ξεκινώντας στα 25 μg /ml, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Το ποσοστό της συνολικής αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων των κυττάρων Α2780 ήταν 1,17% σε κύτταρα ελέγχου (LR: 0,2% και UR: ​​0,97%), 2,46% σε κύτταρα κατεργασμένα με PMBPs 10 μg /ml (LR: 2,42% και UR: ​​0,04% ), 17,63% σε κύτταρα κατεργασμένα με PMBPs 25 μg /ml (LR: 16,12% και UR: ​​1,51%), 49,24% σε κύτταρα κατεργασμένα με PMBPs 35 μg /ml (LR: 41,87% και UR: ​​7,37%) και 77,23% σε κύτταρα κατεργασμένα με 50 μg PMBPs /ml (LR: 71,44% και UR: ​​5,79%) (Εικόνα 2Β). Ομοίως, εκείνα τα κύτταρα Ον2008 ήταν 5,78% σε κύτταρα ελέγχου (LR: 0,83% και UR: ​​4,95%), 6,46% σε κύτταρα κατεργασμένα με PMBPs 10 μg /ml (LR: 1,38% και UR: ​​5,08%), 21,45% σε κύτταρα κατεργασμένα με PMBPs 25 μg /ml (LR: 13,88% και UR: ​​7,57%), 59,94% σε κύτταρα κατεργασμένα με PMBPs 35 μg /ml (LR: 24,79% και UR: ​​35,15%) και 55.31% σε κύτταρα κατεργασμένα με 50 μg /ml PMBPs (LR: 10,21% και UR: ​​45,1%) (Εικόνα 2Β). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι PMBPs θα μπορούσε να προκαλέσει σημαντικά τόσο την πρώιμη και όψιμη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (

σ

& lt? 0,01). (Σχήμα 2C)

PMBPs προκαλέσουν μιτοχονδριακή μεμβράνη πιθανή απώλεια

είναι γνωστό ότι η βλάβη των μιτοχονδρίων κατά την απόπτωση αλλάζει το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης [12]. Για να διερευνήσουν τις επιπτώσεις των PMBPs στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, τα κύτταρα σε επεξεργασία με PMBPs ανιχνεύθηκαν με JC-1 βαφή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, το μέσο ποσοστό των πράσινου φθορισμού-θετικών κυττάρων Α2780 ήταν 2,41% χωρίς θεραπεία, 20,63% στα 25 μg /ml, 43,77% στα 35 μg /ml και 66,6% στα 50 μg θεραπεία /ml PMBPs. Ομοίως, εκείνα τα κύτταρα Ον2008 ήταν 0%, χωρίς θεραπεία, 36,28% στα 25 μg /ml, 43,81% στα 35 μg /ml και 78.79% σε 50 μg /ml (σχήμα 3Α). Υπήρξε σημαντική δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο πράσινο φθορισμό-θετικά κύτταρα (Σχήμα 3Β) (

ρ & lt?. 0

01

), γεγονός που υποδηλώνει την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης συσχετίζεται με την αύξηση της δόσης του PMBPs θεραπεία. Συνεπώς, η απόπτωση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με PMBPs συνδέεται με την βλάβη της μιτοχονδριακής μεμβράνης.

(Α) Το Α2780 και Ον2008 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 25, 35, 50 μg /ml) για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν, χρωματίστηκαν με JC-1 βαφή, και τελικά αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. θεραπεία (Β) PMBPs οδήγησε σε σημαντική αύξηση των θετικών κυττάρων πράσινου φθορισμού (GFP), η οποία έδειξε την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

** P & lt?.. 0

01

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

PMBPs upregulate πρωτεΐνες σχετίζονται με την απόπτωση και την καταστολή της Bcl-2

από PMBPs μπορούσε να διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, εξετάσαμε περαιτέρω κάποιες σχετίζονται με την απόπτωση πρωτεϊνών με στύπωμα Western. Το επίπεδο της β-ακτίνης χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος. Βρήκαμε ότι η έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με PMBPs μειώθηκε σημαντικά με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

ρ & lt?. 0

01

) (Σχ 4Α , 4Β και 4C). Τα μέλη της κασπάσης είναι ζωτικής σημασίας μεσολαβητές απόπτωσης [13]. Εκτιμήθηκαν οι εκφράσεις της κασπάσης-3 και κασπάσης-9. Διασπασμένη κασπάση-3-και διασπάται-κασπάση-9 επίπεδα έκφρασης δραματικά προς τα πάνω ρυθμισμένη μετά από θεραπεία PMBPs σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (

ρ & lt?. 0

01

) (Σχ 4Α, 4Β, 4D και 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι PMBPs ενεργοποιούν το κασπάσης-εξαρτώμενο μονοπάτι απόπτωσης.

(Α, Β) Τα κύτταρα Α2780 και Ον2008 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 15, 25, 35, 50 μg /ml) για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-2, που διασπάται-κασπάσης-3 και διασπάστηκε-κασπάση-9 μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. (C, D, E) ιστογράμματα δείχνουν τα μέσα επίπεδα έκφρασης του Bcl-2, που διασπάται-κασπάσης-3 και κασπάσης-διασπάστηκε-9 (± SD), αντίστοιχα, από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Bcl-2, που διασπάται-κασπάσης-3 και διασπάστηκε-κασπάση-9 επίπεδα εκφράστηκαν σε σχέση με τον έλεγχο φόρτωσης, β-ακτίνη. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές

** Ρ & lt?.. 0

01

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

PMBPs αναστέλλουν τη μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου των ωοθηκών. κύτταρα

Η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή είναι το σήμα κατατεθέν των καρκινικών κυττάρων. Για να διερευνηθεί αν PMBPs εξασθενημένη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό της επούλωσης τραύματος με διαφορετικές, δεν αποπτωτικά (5 μg /ml και 10 μg /ml), οι συγκεντρώσεις του PMBPs για 24 ώρες. Βρήκαμε ότι PMBPs μειώθηκε δοσοεξαρτώμενο την κίνηση του Α2780 και Ον2008 κυττάρων (Σχήμα 5). Τα ποσοστά κλείσιμο τραύματος της PMBPs κατεργασμένων κυττάρων ήταν χαμηλότερες από εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων (

P & lt?. 0

01

) (Σχήμα 5Β και 5Γ). Επιπλέον, εξετάσαμε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων αυτών χρησιμοποιώντας ένα 24 φρεατίων Transwell θάλαμος με την παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων PMBPs για 24 ώρες. PMBPs ανέστειλε σημαντικά το δυναμικό μετανάστευση και εισβολή των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

P & lt?. 0

01

) (Σχήμα 6). Η αγωγή με 5-25 μg PMBPs /ml παρεμπόδισε τη μετανάστευση και την εισβολή από 27% -66%, αντίστοιχα, σε κύτταρα Α2780, και το 11% -40% σε κύτταρα Ον2008, σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 6Β και 6C). Τόσο επούλωσης πληγών δοκιμασίας και transwell δοκιμασία θαλάμου υποδηλώνουν ότι PMBPs θα μπορούσε να καταστείλει τη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Μονοστιβάδες Α2780 και Ον2008 κύτταρα χαραχθεί με ένα ρύγχος πιπέτας και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PMBPs (0, 5, 10 , 25 μg /ml) για 24 ώρες. (Α) Εκπρόσωπος φωτογραφίες του μεταναστευτικά κύτταρα κάτω από το μικροσκόπιο στο πεδίο 100 × μεγέθυνση, πριν και μετά τον τραυματισμό. (B, C) Η μετανάστευση των Α2780 και Ον2008 κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της πληγής περιοχές κλείσιμο πριν και μετά την κάκωση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. **

P & lt? 0

01

και ***

P & lt?… 0

001

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Α2780 και Ον2008 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 5, 10, 25 μg /ml) για 24 ώρες. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων που μετανάστευσαν και εισέβαλαν πάνω στην κάτω πλευρά του transwell μεμβράνη σε 100 × μεγέθυνση κάτω από μικροσκόπιο. (B, C) Αριθμός κυττάρων του κάθε πεδίου μετρήθηκε και ο μέσος όρος. Εισβολή κύτταρα εκφράζονται σε σχέση με εκείνη της ομάδας ελέγχου. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. **

P & lt? 0

01

και ***

P & lt?… 0

001

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

η αναστολή της δραστικότητας ΜΜΡ-9 και έκφραση με PMBPs

δεδομένες τις επιπτώσεις της PMBPs σχετικά με τη μετανάστευση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και εισβολή, ερευνήσαμε περαιτέρω τους μηχανισμούς αυτής της διαδικασίας. Δεδομένου ότι η ΜΜΡ-9 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εισβολή του καρκίνου, εμείς επόμενη ανιχνεύεται δραστικότητα του ενζύμου ΜΜΡ-9 και έκφραση μετά την αγωγή PMBPs. δραστικότητα ΜΜΡ-9 σε ρυθμισμένο μέσο εξετάστηκε με ζυμογραφία ζελατίνης, και ΜΜΡ-9 έκφραση εξετάστηκε με στύπωση Western. PMBPs δοσοεξαρτώμενο καταστέλλεται δραστικότητα ΜΜΡ-9 (Σχ 7Α) και μειωμένο επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης ΜΜΡ-9 (

P & lt?. 0

05

) (Εικ 7Β). Έτσι, η ανασταλτική δράση της PMBPs για την διεισδυτικότητα του καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να είναι, τουλάχιστον εν μέρει, λόγω της καταστολής της δραστηριότητας ΜΜΡ-9.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 5, 10, 25 μg /ml) για 24 ώρες. (Α) Δράση της ΜΜΡ-9 στο υπερκείμενο των κυττάρων σε διάφορες συγκεντρώσεις του PMBPs εξετάσθηκε με ανίχνευση ζελατίνης ζυμογραφία. Οι λευκές λωρίδες αντιπροσωπεύουν ΜΜΡ-9 με τη μεσολάβηση πέψη ζελατίνη. (Β) Η πρωτεΐνη έκφραση της ΜΜΡ-9 σε Α2780 κύτταρα σε διάφορες συγκεντρώσεις PMBPs αξιολογήθηκε με στύπωμα Western. Ιστόγραμμα δείχνει μέσο επίπεδο της ΜΜΡ-9 (± SD) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. ΜΜΡ-9 επίπεδο πρωτεΐνη εκφράστηκε σε σχέση με τον έλεγχο φόρτωσης, β-ακτίνης, και τυποποιείται στο μη επεξεργασμένο ομάδα ελέγχου. *

P & lt?. 0

05

και **

P & lt?.. 0

01

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

PMBPs βλάψουν ΝΡκΒ πυρηνική μετατόπιση και ΜΑΡΚ ενεργοποίηση μονοπατιού

Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι αναστολή της δραστικότητας του ΝΡκΒ θα μπορούσε να καταστείλει καρκινικών κυττάρων εισβολή [14,15,16]. Εμείς, ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επίδραση του στην δραστικότητα PMBPs ΝΡκΒ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Θεραπεία των Α2780 κυττάρων με PMBPs μείωσε σημαντικά την πυρηνική μετατόπιση του ΝΡκΒ και φωσφορυλίωση ΙκΒα (

P & lt?. 0

05

) (Σχήμα 8Α και 8C). Αυτές οδήγησαν ότι PMBPs μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να καταστείλει την εισβολή καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με την αναστολή της δραστικότητας του ΝΡκΒ. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση των mitgen-activatied πρωτεϊνικών κινασών (MAPKs), συμπεριλαμβανομένων ERK1 /2, p38MAPK, JNK εμπλέκονται στη μετανάστευση του όγκου και την εισβολή, και ότι αυτές οι MAPKs δρουν ανοδικά του ΝΡκΒ [17,18,19]. Ως εκ τούτου, η κατάσταση ενεργοποίησης των ERK1 /2, p38MAPK και JNK εξετάστηκε σε Α2780 κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις PMBPs. PMBPs ανέστειλε σημαντικά την ERK1 /2 και ενεργοποίηση p38MAPK? Αλλά δεν JNK (

P & lt 0

05

.) (

P & gt?. 0

05

) (Σχήμα 8Β και 8Δ). Έτσι, η καταστολή της ERK1 /2 και ενεργοποίηση p38MAPK με PMBPs μπορεί να συνεισφέρει στην εξασθενημένη δυναμικό εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

(Α, Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMBPs (0, 5, 10, 25 μg /ml) για 24 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Μετρήθηκαν Το επίπεδο της πρωτεΐνης πυρηνικής p65, ρ-ΙκΒα, ΙκΒα, ρ-ΕΚΚ, ρ-p38 και ρ-JNK. (C, D) ιστογράμματα δείχνουν μέση τιμή (± SD) επίπεδο πυρηνικής p65, ρ-ΙκΒα, ΙκΒα, ρ-ΕΚΚ, ρ-p38 και ρ-ΙΝΚ από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η πυρηνική ρ65, ρ-ΙκΒα, ΙκΒα, ρ-ERK, ρ-p38 και τα επίπεδα έκφρασης ρ-ΙΝΚ εκφράστηκαν σε σχέση με τη φόρτωση β-ακτίνης ελέγχου και τυποποιηθεί με την ομάδα χωρίς θεραπεία ελέγχου. *

P & lt?. 0

05

και **

P & lt?.. 0

01

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

Συζήτηση

ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει η κύρια αιτία θανάτου σε γυναικολογικούς καρκίνους σε μεγάλο βαθμό λόγω της διάγνωσης προχωρημένο στάδιο και η περιορισμένη αποτελεσματικές θεραπείες, ειδικά στην υποτροπή της νόσου [20]. Φυσικά προϊόντα που προέρχονται από φυτά είναι υποσχόμενες θεραπευτικές ουσίες για θεραπείες του καρκίνου [21]. Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε την πιθανή χρησιμότητα των προανθοκυανιδινών από

Pinus massoniana

φλοιού σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών στην αναζήτηση της εξεύρεσης νέων αποτελεσματικών φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι εδώ PMBPs ελαττωμένη τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση που επάγεται και κατέστειλε την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Pinus massoniana

εκχύλισμα φλοιού έχει αναφερθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη των διαφόρων ειδών καρκίνου. Συγκεκριμένα, εμπόδισε επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων ηπατώματος BEL-7402 και HepG2 κύτταρα, αλλά ελαφρώς προώθησε την ανάπτυξη των ανθρώπινων φυσιολογικών κυττάρων ήπατος L-02 in vitro [8,9,22]. Είναι επίσης κατέστειλε την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας Hela και απόπτωση. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι οι προανθοκυανιδίνες που προέρχονται από το

Pinus massoniana Αρνί

φλοιό ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αλλά δεν επηρεάζει την κανονική κύτταρα των ωοθηκών. Παρατηρήσαμε επίσης ότι τα καρκινικά κύτταρα συρρικνώθηκαν και αποκολλήθηκαν από τα πιάτα καλλιέργειας μετά τη θεραπεία PMBPs, γεγονός που υποδηλώνει ότι PMBPs εμποδίζουν επιλεκτικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και προκαλούν κυτταρικό θάνατο.

Ερευνήσαμε περαιτέρω οι μηχανισμοί κατά του όγκου που απασχολείται από PMBPs σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Η απόπτωση παίζει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην εξάλειψη μεταλλαγμένα ή κύτταρα υπερ-αναπτυσσόμενο όγκο [23]. Υπάρχουν διάφορα είδη φυσικών προϊόντων που έχουν αναφερθεί για την πρόληψη της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων μέσω επαγωγής απόπτωσης [24]. Μερικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι

Pinus massoniana

εκχύλισμα φλοιού διεγείρουν απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου HeLa, κύτταρα HepG2 ανθρώπινου ηπατώματος και σαρκώματος ποντικού κύτταρα S180 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [9,10,11]. Στην παρούσα μελέτη, ϋΑΡΙ δεδομένα χρώση αποκάλυψε ότι τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με PMBPs εμφανίζονται συγκεκριμένες αποπτωτικές μορφολογικές μεταβολές. Η κυτταρομετρία ροής δεδομένα έδειξαν επίσης ότι η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία PMBPs. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι PMBPs διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Η επαγωγή της απόπτωσης σχετίζεται με την καταστολή των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών [25]. Έχει αναφερθεί ότι η πρωτεΐνη Bcl-2 είναι υψίστης σημασίας για τη ρύθμιση της μιτοχόνδρια που σχετίζεται αποπτωτική οδό [26]. Κάτω ρύθμιση της Bcl-2 έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

από μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο για την ενεργοποίηση της κασπάσης-9 [27]. Η σχάση-κασπάση-9 ενεργοποιεί περαιτέρω κασπάσης-3, ένα από τα βασικά ένζυμα της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι, να επάγει μετέπειτα αποπτωτικά γεγονότα [28]. Στο παρόν, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι PMBPs προκάλεσε μια σημαντική απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε τη μείωση της έκφρασης Bcl-2 που συνοδεύεται με αυξημένα επίπεδα διασπαστεί-κασπάσης-9 και διασπάστηκε-κασπάσης-3 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με PMBPs. Θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι PMBPs μπορεί να προκαλέσουν απόπτωση μέσω των μιτοχονδρίων σχετίζεται με μονοπάτι αποπτωτικών.

Βρήκαμε ότι PMBPs κατέστειλε αποτελεσματικά τη μετανάστευση καρκίνου των ωοθηκών και της εισβολής. Ένας σημαντικός παράγοντας που διευκολύνει την μεταστατική εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων είναι πρωτεολυτικά ένζυμα που αποδομούν την περιβάλλουσα εξωκυτταρική μήτρα, και έτσι να διευκολύνει την κυτταρική μετανάστευση διαμέσου της βασικής μεμβράνης. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) που συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση πίνακα [29]. Όσον αφορά τον καρκίνο των ωοθηκών, η έκφραση του ΜΜΡ-9 έχει συνδεθεί με την επεμβατική υποτύπους [30]. Η εργασία μας δείχνει ότι PMBPs θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω MMP-9 έκφρασης και δραστηριότητας. Ως εκ τούτου, PMBPs μπορεί να καταστέλλουν τη δράση της ΜΜΡ-9 για να εμποδίζουν τις μετανάστευση και την εισβολή των δυνατοτήτων των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Η ενεργοποίηση του ΝΡκΒ είναι ζωτικής σημασίας για τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [31,32,33]. Προτείναμε ότι PMBPs μπορεί να καταστείλει ΝΡκΒ δραστικότητας και αναστέλλουν ωοθηκών εισβολή του καρκίνου. Η φωσφορυλίωση του ΙκΒα μπορεί να απελευθερώσει υπομονάδες ΝΡκΒ που μεταφέρονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα των κυττάρων για τη ρύθμιση γονιδίων-στόχων [34]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η φωσφορυλίωση ΙκΒα και ΝΡκΒ μετατόπιση από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα αναστέλλονται από κατεργασία PMBPs (Σχήμα 8Α και 8C). NFκB χρησιμεύει ως μεταγραφικός παράγοντας για τη ρύθμιση ΜΜΡ-9 [35,36]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι PMBPs καταστέλλουν δραστικότητα του ΝΡκΒ και αυτό θετικά συσχετίζεται με την προς τα κάτω ρύθμιση της ΜΜΡ-9 έκφραση.

Ο καταρράκτης ΜΑΡΚ σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ERK1 /2, p38 ΜΑΡΚ και JNK, έχει εμπλακεί στη μετανάστευση και εισβολή των πολυάριθμων τύπων καρκινικών κυττάρων [37,38,39]. Σε αυτή τη μελέτη, εικάζουν ότι PMBPs μπορούσε να ανταγωνίζεται τη ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης για την καταστολή της μετανάστευσης και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι θεραπεία PMBPs ανέστειλε την ενεργοποίηση του ERK1 /2 και p38 ΜΑΡΚ με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά είχε μικρή επίδραση στην JNK οδός (Σχ 8Β και 8Δ).