Abstract

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) συνδέεται με μια έντονη αντίδραση στρωματικά πλούσιου σε κολλαγόνο που έχει αποδειχθεί ότι συμβάλλουν στην χημειο-αντίσταση. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι PDAC κύτταρα είναι ανθεκτικά σε χημειοθεραπεία gemcitabine στο μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου λόγω της αυξημένης έκφρασης της ομάδας υψηλής κινητικότητας επαναμοντελοποίηση χρωματίνης πρωτεΐνης Α2 (HMGA2). Έχουμε τώρα βρει ότι τα ανθρώπινα PDAC όγκοι εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση σε ινωτικές περιοχές. Δείχνουμε ότι σε σχέση με κύτταρα που αναπτύσσονται επί πλαστικών ιστοκαλλιέργεια, PDAC κύτταρα που αναπτύσσονται σε γέλες τρισδιάστατο κολλαγόνου εμφανίζουν αυξημένη ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση, μαζί με την αυξημένη έκφραση του Ρ300, pCAF και ακετυλτρανσφεράσες GCN5 ιστόνης (καπέλα). Να χτυπήσει κάτω HMGA2 μετριάζει την επίδραση του κολλαγόνου για ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση και για το κολλαγόνο που προκαλείται p300, pCAF και έκφραση GCN5. Δείχνουμε επίσης ότι ανθρώπινους όγκους PDAC με HMGA2 εμφανίζουν αυξημένη ιστονών H3K9 και H3K27 ακετυλίωση. Επιπλέον, δείχνουμε ότι τα κύτταρα σε πηκτές τρισδιάστατο κολλαγόνου εμφανίζουν αυξημένη προστασία έναντι γεμσιταβίνης. Σημαντικά, κάτω ρύθμιση των HMGA2 ή p300, pCAF και καπέλα GCN5 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε γεμσιταβίνη σε τρισδιάστατο κολλαγόνου. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας να αυξήσουν την κατανόησή μας για το πώς το μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου συμβάλλει στην χημειο-αντίσταση in vitro και να προσδιορίσει HATs ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους κατά της θανατηφόρου καρκίνου

Παράθεση:. Dangi-Garimella S, Sahai V, Ebine K, Kumar Κ, Munshi HG (2013) Τρισδιάστατο κολλαγόνου Ι Προωθεί γεμσιταβίνη αντοχή in vitro σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος μέσω HMGA2-εξαρτημένων Έκφραση ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης. PLoS ONE 8 (5): e64566. doi: 10.1371 /journal.pone.0064566

Επιμέλεια: Edna Cukierman, Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21η Ιανουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 16η Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Μαΐου, 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου Grant # R01CA126888 Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων Merit Grant # I01BX001363. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τις τεράστιες προσπάθειες, η πρόοδος που σημειώθηκε στη θεραπεία της παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) ήταν απογοητευτικά πενιχρή [1], [2]. PDAC εξακολουθεί να παραμένει η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις ΗΠΑ, με θνητότητα ενός έτους περίπου 80% για τους περισσότερους ασθενείς [3]. Αυτή η έλλειψη προόδου οφείλεται εν μέρει στην έντονη πλούσιου σε κολλαγόνο ινωτική αντίδραση που σχετίζεται με PDAC όγκους [4], [5], η οποία στη συνέχεια περιορίζει την παράδοση και την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Πρόσφατα, δημοσιεύτηκαν ότι τα κύτταρα PDAC στην τρισδιάστατη μικροπεριβάλλον κολλαγόνου επάγει υψηλής κινητικότητας ομάδα Α2 (HMGA2), ένα αρχιτεκτονικό πρωτεΐνη που ρυθμίζει τη δομή της χρωματίνης και επίσης μεσολαβεί χημειο-αντίσταση στο κολλαγόνο πλούσια μικροπεριβάλλον [6], [10], [11]. Σημαντικά, HMGA2 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους PDAC όγκων, ιδιαίτερα σε υψηλής ποιότητας όγκους με μεταστάσεις στους λεμφαδένες [12], [13].

PDAC συνδέεται επίσης με επιγενετικές αλλαγές, οι οποίες έχουν συνδεθεί με πρόγνωση των ασθενών [ ,,,0],14], [15]. Μετα-μεταφραστική τροποποίηση μοτίβα ιστόνης ανιχνεύεται με ανοσοϊστοχημεία δείχθηκαν να είναι προβλεπτική της πρόγνωσης σε δύο μεγάλες ομάδες ασθενών PDAC έλαβαν χημειοθεραπεία [14], [15]. PDAC ασθενείς των οποίων οι όγκοι έδειξαν μια χαμηλή έκφραση του ιστόνης Η3 λυσίνης 27 τρι-μεθυλίωση (H3K27Me

3) ή ιστόνης Η3 λυσίνη 9 δι-μεθυλίωση (H3K9Me

2), τα οποία είναι τα σήματα των κλειστών χρωματίνης ( «ετεροχρωματίνη) και το γονίδιο καταστολής [16], [17], [18], είχαν σημαντικά μικρότερη συνολική επιβίωση από PDAC ασθενείς των οποίων ο καρκίνος εμφανίζεται υψηλή ιστονών H3K27Me

3 ή ιστόνης H3K9Me

2 έκφραση [14], [15]. Ωστόσο, PDAC ασθενείς με χαμηλή ιστόνης H3K4Me

2, το οποίο είναι ένα σημάδι μιας πιο ανοικτής χρωματίνης ( «ευχρωματίνη») κατάσταση, έδειξαν επίσης μικρότερη συνολική επιβίωση από PDAC ασθενείς των οποίων ο καρκίνος εμφανίζεται υψηλή έκφραση H3K4Me

2 [15] . Σε αντίθεση με ιστόνης μεθυλίωση, η οποία συνδέεται τόσο με την ενεργοποίηση γονιδίων και καταστολή, ακετυλίωση ιστονών έχει μόνο συνδέεται με την ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την κατάσταση ευχρωματίνη [16], [17], [18]. Παρά τη σαφή σύνδεση μεταξύ ακετυλίωση των ιστονών και την ανάπτυξη του καρκίνου [19], [20], η συμβολή των καπέλων μέχρι την πρόοδο PDAC δεν έχει καλά μελετηθεί.

Η έκφραση και η δραστικότητα των πρωτεϊνών ΗΑΤ μεταβάλλονται σε μια ποικιλία καρκίνους [21], [22]. Για παράδειγμα, το ΗΑΤ P300 εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του υποκινητή c-myc σε PDAC κύτταρα [23]. Το καπέλο P300 απαιτείται επίσης για τη μετάβαση του κύκλου G1 /S κύτταρο, όπως ρύθμιση προς τα κάτω του p300 ΗΑΤ προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του μελανώματος [24]. HATs ρυθμίζουν επίσης την χρωματίνη κατάσταση στα κύτταρα, με GCN5 και pCAF HATs που συνήθως απαιτούνται για την παγκόσμια ακετυλίωση των ιστονών H3K9 και το καπέλο P300 που συνήθως εμπλέκονται στην παγκόσμια ακετυλίωση των ιστονών H3K27 [22], [25]. Είναι ενδιαφέρον, το καπέλο GCN5 συμβάλλει στην εκτεταμένη συντήρηση των ενεργών χρωματίνης που προκαλείται από το myc ογκοπρωτεΐνη [26].

Στην έκθεση αυτή, θα εξετάσει το ρόλο και τη ρύθμιση των p300, pCAF και καπέλα GCN5 στα κύτταρα PDAC. Θα δείξουμε ότι το τρισδιάστατο μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου μέσω της έκφρασης HMGA2 προωθεί ιστονών H3K9 και H3K27 ακετυλίωση μαζί με p300, pCAF και έκφραση GCN5 HAT στα κύτταρα PDAC. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η ανθρώπινη PDAC όγκους με αυξημένη εμφάνιση ίνωσης υψηλότερο H3K9 της ιστόνης και H3K27 ακετυλίωση, και έχουν αυξημένη έκφραση HMGA2. Επιπλέον, τα κύτταρα PDAC σε πηκτές τρισδιάστατο κολλαγόνου εμφανίζουν αυξημένη προστασία έναντι γεμσιταβίνης. Αξίζει να σημειωθεί, προς τα κάτω ρύθμιση HMGA2 ή p300, pCAF και καπέλα GCN5 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε γεμσιταβίνη σε τρισδιάστατο κολλαγόνου. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας αυξήσει την κατανόησή μας για το πώς η τρισδιάστατη μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου συμβάλλει στην χημειο-αντίσταση in vitro, και να δημιουργήσουν HATs ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους κατά της θανατηφόρου καρκίνου.

Αποτελέσματα

Το κολλαγόνο αυξήσεις ιστονών H3K9 και H3K27 ακετυλίωση

Πρόσφατα δημοσιεύτηκε ότι τα κύτταρα PDAC αυξάνεται στο κολλαγόνο-πλούσιο μικροπεριβάλλον ήταν προστατευμένα από τις συνέπειες της χημειοθεραπείας [6]. Δείξαμε ότι η χημειο-προστασία οφειλόταν στην αυξημένη έκφραση του HMGA2 [6], ένα αρχιτεκτονικό πρωτεΐνη που εμπλέκεται στη ρύθμιση της κατάστασης χρωματίνη [10]. Δεδομένου ότι HATs έχουν συνδεθεί με αλλαγές στην κατάσταση της χρωματίνης και επίσης μεσολαβούν την απόκριση σε βλάβη του DNA [19], [20], [21], [22], [27], [28], εξετάσαμε αν ίνωση σε ανθρώπινο PDAC όγκων που σχετίζονται με τις αλλαγές στην ακετυλίωση των ιστονών. Επιπλέον, δεδομένου ότι οι ρ300 και GCN5 HATs εμπλέκονται στην χρωματίνη χαλάρωση με την προώθηση ακετυλίωση σε θέσεις βλάβης του DNA και τη διευκόλυνση της επισκευής [27], [28], εξετάσαμε μεταβολές στην ακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης των ιστονών Η3 διαμεσολαβείται από αυτούς τους δύο καπέλα. Όπως P300 HAT συνήθως εμπλέκονται στην παγκόσμια ιστονών H3K27 ακετυλίωση και GCN5 HAT λειτουργίες για τη ρύθμιση της παγκόσμιας ακετυλίωση των ιστονών H3K9 [22], [25], τα δείγματα όγκων του ανθρώπου PDAC βάφτηκαν για ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση με IHC και τρίχρωμη χρώση για την αξιολόγηση για την ίνωση . Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α και 1Β, υπάρχει αυξημένη ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση σε περιοχές της ίνωσης σε σύγκριση με τα μη-ινωτικών περιοχών. Ποσοτικοποίηση της σχετικής χρώση έδειξε ότι υπήρχε περίπου 2-φορές αύξηση στην πυρηνική χρώση των ιστονών H3K9 και H3K27 ακετυλίωση σε περιοχές της ίνωσης σε σύγκριση με μη ινωτικών περιοχών (Εικ. 1 C). Για να προσδιορίσετε αν το μικροπεριβάλλον κολλαγόνου αιτιακή σχέση με ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση, κύτταρα PDAC (PANC1 και CD18 κύτταρα) απλώθηκαν σε πλαστικό καλλιέργειας ιστών ή σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου και αξιολογούνται για ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση με κηλίδωση Western. κύτταρα PDAC καλλιεργούνται σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου έδειξε αυξημένη ιστονών H3K9 και H3K27 ακετυλίωση (Εικ. 1D).

Α, Β

. Ανθρώπινα μικροσυστοιχίες παγκρεατικού ιστού (TMAs) που περιέχει 24 δείγματα ανοσοχρώση με IgG αντίσωμα ελέγχου ή για ιστόνης H3K9 και ιστόνης H3K27 ακετυλίωση (Ac). Η TMAs επίσης τρίχρωμη χρώση για την αξιολόγηση για την ίνωση. Η

ένθετα

δείχνουν εικόνες υψηλότερης μεγέθυνσης των χρώση με IgG ελέγχου, καθώς και για ιστόνης H3K9Ac και ιστόνης H3K27Ac.

C

. Ποσοτικοποίηση των ιστονών H3K9Ac- και ιστόνης H3K27Ac-θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Adobe Photoshop CS3. *, P & lt? 0,01 σε σχέση με τμήματα με χαμηλή ίνωση.

D

. PANC1 και CD18 κύτταρα αναπτύχθηκαν πάνω σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού ή σε τρισδιάστατες γέλες κολλαγόνου για 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για ιστόνης H3K9Ac και H3K27Ac χρησιμοποιώντας α-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Επίσης εξετάσαμε την επίδραση του κολλαγόνου Ι-επικαλυμμένες επιφάνειες ( «δισδιάστατη κολλαγόνου») για ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση. Όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχ. S1, επικαλυμμένες με κολλαγόνο επιφάνειες είχαν μεταβλητά αποτελέσματα επί ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση. Ιστόνης H3K9 ακετυλίωση αυξήθηκε σε δισδιάστατο κολλαγόνου στα κύτταρα PANC1, αλλά όχι σε κύτταρα CD18. Σε αντίθεση, ιστόνη H3K27 ακετυλίωση αυξήθηκε σε δισδιάστατο κολλαγόνου στα κύτταρα CD18, αλλά όχι σε κύτταρα PANC1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι δύο διαστάσεων επιφάνειες κολλαγόνου μπορεί να προκαλέσει, σε κάποιο βαθμό, της ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση. Ωστόσο, δεδομένου ότι τα κύτταρα του όγκου in vivo που περιβάλλεται από το κολλαγόνο [4], [5], επίστρωση κυττάρων σε τρισδιάστατο κολλαγόνου είναι περισσότερο αντιπροσωπευτικό μοντέλο για να εξετάσει την επίδραση του κολλαγόνου επί του παγκρέατος συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων.

HMGA2 ρυθμίζει κολλαγόνου που προκαλείται από H3K9 και H3K27 ακετυλίωση

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι το μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου αυξημένη έκφραση HMGA2 στο PDAC κύτταρα [[6] και Σχ. 2a]. Για να προσδιορίσετε αν HMGA2 μεσολάβηση του κολλαγόνου που προκαλείται από H3K9 ιστόνης και H3K27 ακετυλίωση, έκφραση HMGA2 ήταν μειωτικά από 2 διαφορετικά siRNAs στα κύτταρα PANC1 και CD18 (Εικ. 2Β) και το αποτέλεσμα επί της ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση προσδιορίστηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C και 2D, HMGA2 siRNA μειωμένη προκαλούμενη από κολλαγόνο ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση στα δύο κύτταρα PANC1 και CD18. Από in vitro καλλιέργειες μας θεσπίσει ρύθμιση HMGA2 ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση, είμαστε δίπλα εξέτασε το βαθμό στον οποίο τα δείγματα όγκων του ανθρώπου PDAC που υπερεκφράζουν HMGA2 δείχνουν ενδείξεις αυξημένης H3K9 ιστόνης και H3K27 ακετυλίωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Ε, το ανθρώπινο PDAC όγκους με έκφραση HMGA2 έδειξαν επίσης αυξημένη H3K9 ιστόνης και H3K27 ακετυλίωση. Η συσχέτιση μεταξύ HMGA2 και H3K9 ακετυλίωση σε TMAs μας ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0.03), ενώ η συσχέτιση μεταξύ HMGA2 και H3K27 ακετυλίωση κινήθηκαν προς την σημαντικότητα (p = 0.10).

Μια

. PANC1 και CD18 κύτταρα αναπτύχθηκαν πάνω σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού ή σε τρισδιάστατες γέλες κολλαγόνου για 24 ώρες και ανοσοστυπώθηκαν για HMGA2. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Β

–

D

. PANC1 και CD18 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή με 2 διαφορετικά siRNAs HMGA2, αφήνονται να ανανήψουν επί μία νύκτα και έπειτα ενσωματώνονται σε τρισδιάστατο κολλαγόνου για 24 ώρες. Προϊόντα λύσης στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν για HMGA2 (

Β

), ιστόνης H3K9Ac (

C

) και ιστόνης H3K27Ac (

D

) χρησιμοποιώντας α-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

E

. Ανθρώπινων παγκρεατικών TMAs ανοσοχρωματίστηκαν για HMGA2 (

αριστερά

), ιστόνης H3K9Ac (

μεσαία

) και ιστόνης H3K27Ac (

δεξιά

).

F

. Η σχέση μεταξύ HMGA2 και ιστόνης H3K9Ac ή H3K27Ac εκτιμήθηκε με την ακριβή δοκιμασία του Fisher.

Η

HMGA2 ρυθμίζει προκαλούμενη από κολλαγόνο p300, pCAF και έκφραση GCN5 HAT

Εξετάσαμε την επόμενη το αποτέλεσμα των τριών διάστατο τζελ κολλαγόνου στο p300, pCAF και καπέλα GCN5 στα κύτταρα PANC1 και CD18. Όπως αναλύεται ανωτέρω, p300 HAT συνήθως εμπλέκονται στην παγκόσμια ακετυλίωση H3K27 και GCN5 και pCAF HATs λειτουργούν για τη ρύθμιση της παγκόσμιας H3K9 ακετυλίωση [22], [25]. κύτταρα PDAC σε πηκτές τρισδιάστατο κολλαγόνου εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του Ρ300, pCAF και καπέλα GCN5 (Εικ. 3Α). Για να καταδειχθεί ότι Αυτά τα καπέλα, στην πραγματικότητα διαμεσολαβούν που προκαλείται από κολλαγόνο H3K9 και H3K27 ακετυλίωση σε κύτταρα PDAC, p300, έκφραση pCAF και GCN5 ήταν μειωτικά χρησιμοποιώντας συνδυασμό τριών διαφορετικών siRNAs σε PANC1 και CD18 κύτταρα (Σχ. 3Β), και η επίδραση στο H3K9 και H3K27 ακετυλίωση προσδιορίστηκε. Ο συνδυασμός των siRNAs κατά p300, pCAF και GCN5 μειώθηκε κολλαγόνου που προκαλείται από ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση και στα δύο κύτταρα PANC1 και CD18 (Σχ. 3C και 3D).

Μια

. PANC1 και CD18 κύτταρα αναπτύχθηκαν πάνω σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού ή σε τρισδιάστατων γέλες κολλαγόνου για 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για p300, pCAF και acetyltrasferases GCN5 ιστόνης (καπέλα) χρησιμοποιώντας α-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

Β

–

D

. PANC1 και CD18 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή με συνδυασμό των siRNAs έναντι Ρ300, pCAF και GCN5 (ΗΑΤ siRNA)? αφέθηκαν να ανανήψουν επί μία νύκτα και έπειτα ενσωματώνονται σε πηκτές τρισδιάστατο κολλαγόνου για 24 ώρες. Τα λύματα ανοσοστυπώθηκαν για τις αντίστοιχες πρωτεΐνες HAT (

Β

), και ιστόνης H3K9Ac (

C

) και H3K27Ac (

D

). Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

E, F

. PANC1 και CD18 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή με μεμονωμένες siRNAs κατά p300, pCAF και GCN5? αφέθηκαν να ανανήψουν επί μία νύκτα και έπειτα ενσωματώνονται σε πηκτές τρισδιάστατο κολλαγόνου για 24 ώρες. Τα λύματα ανοσοστυπώθηκαν για ιστόνης H3K9Ac (

E

) και H3K27Ac (

F

). Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Εξετάσαμε επιπλέον τη σχετική συμβολή των p300, GCN5 και pCAF στην ακετυλίωση των ιστονών με τη χρήση μεμονωμένων siRNAs παρά συνδυάζοντας όλες τις τρεις siRNAs. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Ε, η επιμόλυνση των επιμέρους siRNAs κατά p300, pCAF ή GCN5 μειώθηκε ιστονών H3K9 ακετυλίωση στα κύτταρα PANC1. Ωστόσο, η επιμόλυνση των επιμέρους siRNAs HAT στα κύτταρα CD18 είχε ελάχιστη επίδραση ή παραδόξως αυξηθεί ακετυλίωση των ιστονών H3K9 στα κύτταρα CD18. Επιμόλυνση του GCN5 siRNA ή pCAF siRNA σε κύτταρα CD18 αυξήθηκε ιστονών H3K9 ακετυλίωση. Είναι ενδιαφέρον, δείχθηκε πρόσφατα ότι υπάρχει αυξημένη ιστονών H3K9 ακετυλίωση σε pCAF-άκυρη και GCN5-null εμβρυϊκά ινοβλάστες ποντικού [25]. Ομοίως, η επίδραση επί της ιστόνης H3K27 ακετυλίωση ήταν είτε ελάχιστα είτε αυξήθηκε μετά την επιμόλυνση είτε GCN5 siRNA ή pCAF siRNA (Σχ. 3F). Ωστόσο, η επιμόλυνση με p300 siRNA μείωσε ιστονών H3K27 ακετυλίωση τόσο CD18 και PANC1 κύτταρα.

Από τη στιγμή που αποδεικνύουν ότι HMGA2 ρυθμίζει προκαλούμενη από κολλαγόνο ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση (Εικ. 2), εξετάσαμε την έκταση στην οποία HMGA2 επίσης, με τη μεσολάβηση της επαγόμενης από κολλαγόνο p300, pCAF και έκφραση GCN5. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, HMGA2 siRNA μειώθηκε p300, pCAF και τα επίπεδα GCN5 και στα δύο κύτταρα PANC1 και CD18 που καλλιεργούνται σε 3D κολλαγόνο.

PANC1 και τα κύτταρα CD18 επιμολύνονται με siRNA ελέγχου ή με 2 διαφορετικά siRNAs HMGA2, επέτρεψε να ανακτήσει τη διάρκεια της νύχτας και, στη συνέχεια, επιστρώθηκαν σε τρισδιάστατο γέλες κολλαγόνου για επιπλέον 24 ώρες. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια αναλύθηκαν για p300 (

A

), pCAF (

B

) και GCN5 (

C

) HATs χρησιμοποιώντας α-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Τα PDAC κυττάρων σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου προστατεύονται από γεμσιταμπίνη

Είχαμε προηγουμένως δείξει ότι τα κύτταρα PDAC σε τρισδιάστατο κολλαγόνου πηκτές προστατεύονται από τις επιδράσεις της γεμσιταβίνης και συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται [6]. Έτσι, εξετάστηκε η επίδραση του κολλαγόνου σε κύτταρα CD18 εξής γεμσιταβίνης θεραπεία. CD18 κύτταρα σε πλαστικό ή σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου έλαβαν θεραπεία με gemcitabine για 24 ώρες και στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη ή να υποβληθεί σε κολλαγενάση εκχύλιση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επανατοποθετήθηκαν σε πλάκες επάνω σε πλαστικό ή σε πηκτές τρισδιάστατη κολλαγόνο, και η ικανότητα των κυττάρων να σχηματίσουν αποικίες εκτιμήθηκε σε 5 ημέρες. Περίπου 5% των κυττάρων CD18 επί πλαστικών σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη μορφή πολλαπλών κυτταρικών αποικιών σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 5Α). Σε αντίθεση, περισσότερο από το 50% των κυττάρων CD18 σε τρισδιάστατο γελών κολλαγόνου έλαβαν θεραπεία με αποικίες μορφή γεμκιταβίνη (Εικ. 5Α).

A

. CD18 κύτταρα αναπτύσσονται επί πλαστικών ή σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με γεμσιταβίνη για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη ή εξάγεται από το κολλαγόνο με κατεργασία κολλαγενάσης. Τα κύτταρα απλώνονται εκ νέου σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού ή σε τρισδιάστατες γέλες κολλαγόνου σε χαμηλή πυκνότητα (

αριστερά

). Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν 5 ημέρες αργότερα και μετρήθηκαν (

δεξιά

). **, P & lt? 0.001. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Β, Γ

. κύτταρα CD18 ήταν επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA, HMGA2 siRNA (

Β

) ή συνδυασμός των siRNAs κατά pCAF, GCN5 και p300 (

C

), επέτρεψε να ανακτήσει τη διάρκεια της νύχτας και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε τζελ κολλαγόνου για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με gemcitabine για 24 ώρες, εκχυλίζεται εκ του κολλαγόνου με κατεργασία κολλαγενάσης και στη συνέχεια απλώνονται εκ νέου σε τρισδιάστατο γελών κολλαγόνου σε χαμηλή πυκνότητα. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν 5 ημέρες αργότερα και μετρήθηκαν. *, P & lt? 0,05. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

HMGA2 και καπέλα διαμεσολαβούν προστασία έναντι γεμσιταβίνης σε τρισδιάστατο τζελ κολλαγόνου

Όπως είχαμε δείξει στο παρελθόν ότι HMGA2 siRNA μείωση του πολλαπλασιασμού των κύτταρα PDAC σε τρισδιάστατο γελών κολλαγόνου μετά από θεραπεία γεμσιταβίνη [6], εξετάσαμε την επίδραση της HMGA2 siRNA επί PDAC κυττάρων σε κολλαγόνο μετά από θεραπεία γεμσιταβίνης. κύτταρα CD18 επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή HMGA2 siRNA, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη για 24 ώρες, ενώ αυξάνεται σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκχυλίζεται από το κολλαγόνο και απλώνονται εκ νέου σε κολλαγόνο σε μια χαμηλής πυκνότητας για επιπλέον 5 ημέρες. κύτταρα CD18 επιμολυσμένα με HMGA2 siRNA δείχνουν μειωμένη αριθμός των αποικιών σε σύγκριση με κύτταρα CD18 επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχ. 5Β). Ομοίως, εξετάσαμε την επίδραση της siRNAs κατά p300, pCAF και καπέλα GCN5 για PDAC κυττάρων σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου μετά τη θεραπεία γεμσιταβίνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. κύτταρα 5C, CD18 επιμολυσμένων με p300, pCAF και GCN5 HAT siRNAs δείχνουν επίσης μείωση του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με κύτταρα CD18 επιμολυσμένα με τον έλεγχο του siRNA.

Συζήτηση

Το κολλαγόνο-πλούσιο μικροπεριβάλλον του όγκου διαδραματίζει ουσιώδη ρόλο στην εξέλιξη PDAC από τα δύο προωθώντας τόσο εισβολή και μετάσταση όγκου και την προστασία έναντι καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπεία [4], [29]. Περιορίζει όχι μόνο την παράδοση της χημειοθεραπείας στα καρκινικά κύτταρα [7], αλλά επίσης ενεργοποιεί οδούς που περιορίζουν την επίδραση της χημειοθεραπείας [6] σηματοδότησης, [7], [8], [9]. Προηγουμένως, είχαμε δημοσιεύθηκε ότι η επαγωγή της έκφρασης HMGA2 στον τρισδιάστατο κολλαγόνου αφήνεται κύτταρα PDAC να ξεπεραστεί η επίδραση της χημειοθεραπείας και συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται [6]. Είναι ενδιαφέρον, HMGA πρωτεΐνες δείχθηκε πρόσφατα να αυξηθεί η έκφραση της αταξίας-τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ), το κύριο κυτταρικό αισθητήρα γονιδιοτοξικών στρες, αυξάνοντας έτσι την αντίσταση σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA [30]. Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε ότι HMGA2 μπορεί επίσης να ρυθμίζουν την έκφραση του Ρ300, pCAF και καπέλα GCN5 σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου για να περιορίσει την επίδραση της γεμσιταβίνης.

Αν και δεν είχαμε εξετάσει αν HMGA2 συνδέεται άμεσα με HAT υποκινητές να ρυθμίζουν την έκφραση, HMGA2, δρώντας ως παγκόσμιος διακόπτης χρωματίνης, έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν & gt? 1.000 γονίδια [31]. Ορισμένα από αυτά τα γονίδια ρυθμίζονται από HMGA2 με απευθείας σύνδεση προς τις αλληλουχίες υποκινητή. Για παράδειγμα, HMGA2 ρυθμίζει την έκφραση hTERT με σύνδεση προς τον υποκινητή hTERT και προκαλώντας μειωμένη κατάληψη HDAC2 στον υποκινητή hTERT [32]. Αυτό οδηγεί σε μια εντοπισμένη αύξηση της ιστόνης H3K9 ακετυλίωση και διαμόρφωση μεταγραφή του hTERT [32]. Ωστόσο, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι HMGA2 μπορεί να επηρεάσει έμμεσα την γονιδιακή έκφραση μέσω ενεργοποίησης των σηματοδοτικών οδών, όπως η επαγωγή της ΡΙ3Κ /Akt /mTOR /p70S6K καταρράκτη σηματοδότησης εξής υπερέκφραση του HMGA2 σε στρωματικά κύτταρα [33]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι HMGA2 προωθεί ERK1 2 σηματοδότηση /σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε 3D κολλαγόνου [6]. Επιπλέον, έχουμε βρει ότι ERK1 /2 σηματοδότηση μπορεί επίσης να μεσολαβήσει που προκαλείται από κολλαγόνο έκφραση ΗΑΤ (Dangi-Garimella S. και Munshi H.G., αδημοσίευτη παρατήρηση). Έτσι, είναι πιθανό ότι η ρύθμιση HMGA2 καπέλα σε τρισδιάστατο κολλαγόνου επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση ERK1 2 σηματοδότησης /.

Θα δείξουμε ότι οι αυξημένες p300, GCN5 και pCAF έκφραση HAT σε 3D κολλαγόνο προωθεί ιστονών H3K9 και H3K27 ακετυλίωση . Είναι σημαντικό, ιστονών H3K9 και H3K27 ακετυλίωση βρίσκονται κυρίως στις θέσεις έναρξης της μεταγραφής και είναι εμπλουτισμένα σε υποστηρικτές του ενεργά μεταγράφονται τα γονίδια [16], [18], και έτσι οι αλλαγές στο ιστονών H3K9 και της ιστόνης H3K27 μπορεί να έχει ευρείες και βαθιές συνέπειες για την έκφραση των γονιδίων και κυτταρική συμπεριφορά. Είναι πιθανό ότι το μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου μπορεί επίσης να ρυθμίσει ακετυλίωση άλλων καταλοίπων λυσίνης. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι η GCN5 και pCAF είναι περιττά και απαιτούνται ειδικά για ιστόνης H3K9 ακετυλίωση σε ινοβλάστες [25]. PCAF-null ινοβλάστες έχουν τη διατήρηση των ιστονών H3K9 ακετυλίωση και καταδεικνύουν μείωση των ιστονών H3K9 ακετυλίωση μόνο όταν GCN5 έχει χτυπηθεί κάτω σε αυτές τις ινοβλάστες [25]. Είναι ενδιαφέρον, οι συγγραφείς δείχνουν πειστικά ότι GCN5 μπορεί ακετυλίωση ιστονών H3K14 σε μια in vitro δοκιμασία, αλλά καμία αλλαγή στην ιστονών H3K14 ακετυλίωση ανιχνεύθηκε όταν pCAF και GCN5 είχαν γκρέμισε in vivo [25]. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση p300 δεν επηρέασε ακετυλίωση ιστονών H3K14 in vivo, αλλά κυρίως μειώθηκε ιστόνης K3K27 ακετυλίωση [25]. Είναι επίσης πιθανό ότι οι αλλαγές στην ιστόνης H3K9 και H3K27 ακετυλίωση μπορεί να οφείλεται σε καταστολή του αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) σε τρισδιάστατο κολλαγόνου. HDAC1 και HDAC7 αυξάνονται σε ανθρώπινα παγκρεατικά νεοπλάσματα συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό [34], [35]. Επιπλέον, η έκφραση των μελών της κατηγορίας HDACs Ι σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές είναι αυξημένη σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα HPDE [36]. Σε μελλοντικές μελέτες, θα εξετάσουμε κατά πόσον το μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου ρυθμίζει την έκφραση των HDAC σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές.

Αξίζει να σημειωθεί, δείχνουμε ότι τα καπέλα συμβάλλουν στην χημειο-αντίστασης σε τρισδιάστατο κολλαγόνου. Το καπέλο P300 έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην απόκριση βλάβης DNA με διαμόρφωση μη ομόλογες άκρο σύνδεσης (NHEJ) επισκευάσει [27]. Η μείωση της δραστηριότητας ή την έκφραση του p300 HAT καταστέλλει ΝΗΕΙ, μειώνει διάλειμμα (ΟΕΔ) Επισκευή διπλό σκέλος και ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα στην ακτινοβολία και η χημειοθεραπεία [27]. Το καπέλο P300 απαιτείται για ακετυλίωση των ιστονών σε DSBs να διευκολυνθεί χρωματίνη χαλάρωση και την ενδεχόμενη επιδιόρθωση του DNA [27]. Επιπλέον, GCN5 διεγείρει την επισκευή των πυρηνικών εκτομή με την προώθηση H3K9 ακετυλίωση και χαλάρωση χρωματίνης σε θέσεις βλάβης [28]. Είναι σημαντικό, αυτό γίνεται όλο και περισσότερο αναγνωρίζεται ότι η κατάσταση της χρωματίνης μπορεί να επηρεάσει την κυτταρική ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία. Αν και η πιο συμπαγής ετεροχρωματίνης μπορεί να περιορίσει την έκταση της αρχικής βλάβης του DNA [37], μπορεί επίσης να περιορίσει την πρόσβαση σε πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DNA. επιδιόρθωσης του DNA μετά από έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες είναι λιγότερο αποτελεσματική στην ετεροχρωματινικών περιοχών σε σχέση με τις λιγότερο συμπαγή ευχρωματινικούς περιοχές [38]. Συνεπής με το υπόδειγμα του οποίου ετεροχρωματίνης περιορίζει την πρόσβαση σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, η θεραπεία με την τριχοστατίνη αναστολέα HDAC προωθείται ευχρωματίνη σχηματισμό και αυξημένη απόκριση βλάβης του DNA σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [39].

Αν και δεν έχουμε εξεταστεί η επίδραση της στόχευσης HATs in vivo, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι HATs στόχευσης θα μας επιτρέψει να αυξήσουμε την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του παγκρέατος και σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Αυτό υποστηρίζεται επίσης από τα ευρήματα ότι μια πιο ανοικτή χρωματίνης κατάσταση σε δείγματα όγκων PDAC μπορεί να σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση [14], [15]. Αν και έχουν διάφορους αναστολείς HDAC έχουν περιγραφεί και εκτεταμένα μελετηθεί στον καρκίνο εξέλιξης [40], [41], [42], μόνο ένας περιορισμένος αριθμός αναστολέων ΗΑΤ έχουν αναπτυχθεί [22]. Επίσης, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με PDAC τον αναστολέα HDAC CI-994 και gemcitabine δεν απέδειξε αυξημένα ποσοστά ανταπόκρισης σε σύγκριση με gemcitabine μόνη [43]. Οι αρχικές συνθετικές αναστολείς HAT αποδειχθεί αποτελεσματική στην αναστολή δραστηριότητας HAT in vitro? Ωστόσο, η χρήση τους ήταν περιορισμένη από τη χαμηλή μεταβολική σταθερότητα και την κακή κυτταρική διαπερατότητα. Η χρήση του φυσικός αναστολέας ΗΑΤ anacardic οξύ ήταν επίσης περιορισμένη από την κακή κυτταρική διαπερατότητα [44]. Αν και η φυσικώς ενυπάρχουσες ενώσεις κουρκουμίνη και γκαρσινόλης έχουν δειχθεί ότι είναι αποτελεσματικοί αναστολείς ΗΑΤ in vitro και in vivo [22], αποδεικνύουν επίσης σημαντική μη ειδική δραστικότητα. Πρόσφατα, η ένωση C646 σχεδιάστηκε με κοσκίνισμα εικονικό συνδέτη και αποδείχθηκε ότι είναι ένας ισχυρός και εξαιρετικά εκλεκτικό, κελί διαπερατό μικρό μόριο αναστολέα p300 ΗΑΤ [45]. Ο αναστολέας C646 παρεμποδίζει ενδοκυτταρική ακετυλίωση ιστόνης και επιβραδύνει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων in vitro [45], [46]? Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα του C646 σε μελέτες ζώων και των ανθρώπων δεν έχει αναφερθεί.

Σε γενικές γραμμές, αποδεικνύουμε ότι το μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου in vitro περιορίζει την αποτελεσματικότητα της gemcitabine μέσω HMGA2 εξαρτώμενη έκφραση ΗΑΤ (Εικ. 6). Δείχνουμε επίσης ότι η έκφραση HMGA2 σχετίζεται με ακετυλίωση ιστονών σε ανθρώπινους όγκους PDAC, ιδιαίτερα στις περιοχές της ίνωσης, υποδηλώνοντας ότι η έντονη ινωτική αντίδραση μπορεί να συνεισφέρει στην αντίσταση χημειοθεραπεία μέσω της αυξημένης σηματοδότησης HMGA2-ΗΑΤ. Δεδομένου ότι πολύ λίγη πρόοδος έχει σημειωθεί στην αντιμετώπιση του καρκίνου του παγκρέατος, που στοχεύουν HATs θα μπορούσε να είναι μια νέα προσέγγιση για την ευαισθητοποίηση του παγκρέατος σε χημειοθεραπεία.

Προηγουμένως, είχε δημοσιεύσει ότι το μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου που προκαλείται από την έκφραση HMGA2 [Dangi- Garimella S κ.ά., [6]]. Έχουμε τώρα αποδείξει ότι τα κύτταρα PDAC στο μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου επάγουν HMGA2 εξαρτώμενη έκφραση ΗΑΤ και ιστόνης Η3 ακετυλίωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι το μικροπεριβάλλον κολλαγόνο προάγει σχηματισμό ευχρωματίνη. Αυτό το σηματοδοτικό μονοπάτι επιτρέπει PDAC κύτταρα να αντισταθούν στις επιδράσεις της γεμσιταβίνης στο μικροπεριβάλλον του κολλαγόνου.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά /Αντιδραστήρια

GCN5 (SC-20698) , pCAF (SC-13124), και α-τουμπουλίνης (sc-8035) αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)? P300 (05-257), ιστόνη H3K9 ακετυλίωση (04-1003), και ιστόνης H3K27 ακετυλίωση (05-1334) αντισώματα ελήφθησαν από την Millipore (Billerica, ΜΑ)? και το αντίσωμα HMGA2 ήταν από Biocheck Inc. (Foster City, CA). Δευτερεύοντα αντισώματα αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Κολλαγόνο τύπου Ι λήφθηκε από την BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Η γεμσιταβίνη ελήφθη από την ΕΗ Lilly (Indianapolis, ΙΝ). Nucleofector kit ηλεκτροδιάτρηση αγοράστηκε από την Lonza (Walkersville, MD). HMGA2 # 1 (279254), HMGA2 # 2 (279.255), GCN5 (s5659), pCAF (s16894), και P300 (s4696) siRNAs αγοράστηκαν από την Life Technologies (Carlsbad, CA).

ανοσοϊστοχημεία (IHC )

Η παγκρεατική μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs) ελήφθησαν από την US Biomax (Rockville, MD) και αποτελείτο από 24 παγκρεατικά πυρήνων μέτρησης 1,5 mm σε διάμετρο και 5 μm σε πάχος. Οι πλάκες τριχρωματική χρώση ή χρώση για H3K9 ακετυλίωση, H3K27 ακετυλίωση, και HMGA2 σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες IHC [5], [6], [47]. Χρωματισμένο δείγματα βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα από 0-3 με το ακόλουθο σύστημα βαθμολόγησης: 0-0% των κυττάρων βάφονται? 1 & lt? 25%? 02.26.50%, ή 3 & gt?. 50%

Κυτταρική καλλιέργεια

PANC1 και CD18 /ΗΡΑΡ-ΙΙ ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιείχε 10% FBS και αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) [6]. Τα κύτταρα ελέγχθηκαν από STR προφίλ στο Μηχανισμό Johns Hopkins Γενετικών Πόρων Core και έδειξε ένα παρόμοιο προφίλ με εκείνη στην ιστοσελίδα της ATCC.

Ενσωμάτωση κυττάρων σε τρισδιάστατο κολλαγόνου τύπου Ι τζελ

Το κολλαγόνο μίγμα (2 mg /mL) έγινε με την προσθήκη των κατάλληλων όγκων αποστειρωμένου νερού, 10Χ ϋΜΕΜ και Ν & ΟΗ και διατηρήθηκαν σε πάγο μέχρι να χρειαστούν [6], [48], [49]. κύτταρα PDAC αιωρήθηκαν στο διάλυμα κολλαγόνου και αφέθηκε να πήξει για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τακτικές media προστέθηκε στη συνέχεια στην κορυφή της γέλης και επωάστηκαν για 24 ώρες.

Η επιμόλυνση

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA κατά HMGA2, GCN5, pCAF, p300 ή ελέγχουν siRNA (50 nmoles) χρησιμοποιώντας Nucleofector Kit R (Lonza), αφέθηκαν να ανανήψουν επί μία νύκτα και έπειτα τοποθετήθηκαν σε πηκτώματα τρισδιάστατο κολλαγόνο (2 mg /ml).

ανοσοαποτύπωσης

ανοσοκηλίδωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5], [50]. Για τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε κολλαγόνο, η μήτρα διαλύεται πρώτα σε κολλαγενάση (Worthington Biologicals, Lakewood, NJ) και στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [51].

σχηματισμού αποικίας

δοκιμασία

CD18 κυττάρων επί πλαστικών καλλιέργειας ιστού ή σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου έλαβαν θεραπεία με γεμσιταβίνη. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης ή εξάγεται από το κολλαγόνο, και στη συνέχεια ανακαλλιεργήθηκαν πάνω σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού ή σε τρισδιάστατα πηκτώματα κολλαγόνου σε χαμηλή πυκνότητα. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν 5 ημέρες αργότερα και μετρήθηκαν.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με GraphPad Instat (LaJolla, CA), χρησιμοποιώντας ανάλυση t-test ή ακριβούς δοκιμασίας του Fisher.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Επίδραση των 2D κολλαγόνου για ιστόνης H3K9 και της ιστόνης H3K27 ακετυλίωση.

Α, Β

. PANC1 και CD18 κύτταρα αναπτύχθηκαν πάνω σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού ή σε κολλαγόνο Ι-επικαλυμμένες πλάκες ιστοκαλλιέργειας (BD Biocoat κολλαγόνου Ι) για 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για ιστόνης H3K9Ac και H3K27Ac χρησιμοποιώντας α-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064566.s001

(ΔΕΘ)