Αφηρημένο

Η υποξία και η εξάντληση του ορού είναι κοινά χαρακτηριστικά των συμπαγών όγκων που συμβαίνουν κατά την αντιαγγειογένεση , ακτινοβολία και χημειοθεραπεία σε μια ευρεία ποικιλία κακοηθειών. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν CD133, ένας δείκτης για καρκίνο του παχέος εντέρου έναρξη ή βλαστικά κύτταρα, εμπλουτίζονται και να επιβιώσει κάτω από υποξία και η εξάντληση ορού συνθήκες, ενώ CD133- κύτταρα υφίστανται απόπτωση. καρκινικά κύτταρα CD133 + αυξήσει καρκινικά βλαστικά κύτταρα και τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά ιδιότητες μετάβασης. Επιπλέον, μέσω της διαλογής μια ομάδα τυροσίνης και σερίνης /θρεονίνης μονοπάτια κινάσης, εντοπίσαμε Hsp27 είναι μόνιμα ενεργοποιημένη στο CD133 + κύτταρα και όχι CD133- κυττάρων κάτω από υποξία και η εξάντληση ορού συνθήκες. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία διαφορά στην ενεργοποίηση Hsp27 μεταξύ των κυττάρων CD133 + και CD133- υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης. ενεργοποίηση Hsp27, η οποία διαμεσολαβείται από την οδό p38MAPK-ΜΑΡΚΑΡΚ2-Hsp27, απαιτείται για τα κύτταρα CD133 + για την αναστολή της κασπάσης 9 και 3 διάσπασης. Επιπλέον, η αναστολή της Hsp27 σηματοδότησης ευαισθητοποιεί CD133 + κυττάρων σε υποξία και εξάντληση ορού επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, η αντιαποπτωτικών οδός ενεργοποιείται επίσης σε σφαιροειδή καλλιέργεια εμπλουτισμένο CD133 + καρκινικά βλαστικά κύτταρα από μία ποικιλία κυττάρων συμπαγούς όγκου συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του εγκεφάλου και καρκίνο του στόματος, που υποδεικνύει ότι είναι μια κοινή οδός ενεργοποιείται σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα από πολλαπλούς τύπους όγκων. Έτσι, η ενεργοποίηση της ΡΡ2Α ή απενεργοποίηση της οδού p38MAPK-ΜΑΡΚΑΡΚ2-Hsp27 μπορεί να αναπτύξουν νέες στρατηγικές για την θεραπεία του καρκίνου με την καταστολή του πληθυσμού τους TIC

Παράθεση:. Lin SP, Lee ΥΤ, Wang JY, Miller Α.Ε., Χίου SH, Hung MC, et al. (2012) Επιβίωση του καρκίνου Stem Cells κάτω από υποξία και ορού εξάντληση μέσω Μείωση ΡΡ2Α δραστηριότητα και ενεργοποίηση της p38-ΜΑΡΚΑΡΚ2-Hsp27. PLoS ONE 7 (11): e49605. doi: 10.1371 /journal.pone.0049605

Επιμέλεια: Marianne Koritzinsky, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας, Καναδάς

Ελήφθη: 29η Απριλίου 2012? Αποδεκτές: 11 του Οκτωβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Νοέμβρη του 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (97-3111-B-010-001, και 99-3111-B-010-005-), Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων (V98E1-002), το MD Anderson Cancer Center /Κίνα Ιατρικό Πανεπιστήμιο και το Νοσοκομείο Αδελφή Ταμείο Ίδρυμα και το Εθνικό Πανεπιστήμιο Yang-Ming, Υπουργείο Παιδείας. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι ετερογενείς φαινοτυπικά και μοριακών χαρακτηριστικών των ανθρώπινων καρκίνων είναι συνάρτηση της έναρξης του όγκου τους ή καρκίνο πηγάζει περιεχόμενο κύτταρα (ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο) [1]. Ο πληθυσμός CD133 + κυττάρων αντιπροσωπεύουν περίπου 2,5% των όγκων καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων [2], και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι αυτός ο πληθυσμός των κυττάρων που περιέχει μια σειρά μη διαφοροποιημένων ογκογόνων TICs [2], [3]. Έδειξαν ότι η υποδόρια ένεση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου CD133 +, αλλά όχι CD133- κύτταρα, ήταν σε θέση να αναπαράγουν εύκολα τον αρχικό όγκο σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς. Απορρύθμιση της TIC αυτο-ανανέωση είναι μια πιθανή απαίτηση για την ανάπτυξη του καρκίνου [4], [5], [6], και την επιβίωση των τικ μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αντοχή σε θεραπείες καρκίνου και επανάληψης των όγκων [7]. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί επιβίωσης TICs από αντικαρκινική θεραπεία είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Ωστόσο, η αύξηση του ABC μεταφορείς [8], ενεργός χωρητικότητα επιδιόρθωσης DNA [7], και αντοχή σε απόπτωση με την παραγωγή κυτοκινών ή η ενεργοποίηση των συγκεκριμένων οδών έχουν αναφερθεί. Έτσι, ο προσδιορισμός των σηματοδοτικών μονοπατιών των ιδιοτήτων επιβίωσης και αυτο-ανανέωση των τικ έχει προσελκύσει πρόσφατα μεγάλη προσοχή, λόγω της υπόσχεση ενός νέου κυτταρικό στόχο για τη θεραπεία καρκίνων.

Οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ ( hsps) διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο ως μοριακοί συνοδοί, βοηθώντας την σωστή αναδίπλωση του στρες-συσσωρευμένων πρωτεϊνών κακώς-αναδιπλωμένη, και σχετίζεται άμεσα με διάφορα συστατικά του, ρυθμίζεται άμεσα προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο μηχανήματα. Μεταξύ αυτών, το βασικό επίπεδο Hsp27 είναι συνήθως υψηλή σε κύτταρα ή ιστούς από ένα ευρύ φάσμα των όγκων [9]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την αντίσταση Hsp27 στη χημειοθεραπεία με σισπλατίνη και δοξορουβικίνη, και αυξάνει το δυναμικό tumoriogenic του καρκίνου του παχέος εντέρου αρουραίου κύτταρα [10].

υποξία και εξάντληση ορού είναι κοινά χαρακτηριστικά των στερεών όγκων που συμβαίνουν κατά την αντιαγγειογονικοί, ακτινοβολία και χημειοθεραπεία σε μια ευρεία ποικιλία κακοηθειών [11], [12]. Υποξία και αναιμία (η οποία συμβάλλει σε υποξία όγκου) μπορεί να οδηγήσει σε ιοντίζουσα ακτινοβολία και η χημειοθεραπεία αντίσταση στερώντας καρκινικά κύτταρα του αιθέριου οξυγόνου για τις κυτταροτοξικές δραστηριότητες των παραγόντων αυτών [13], [14]. Η υποξία μπορεί επίσης να μειώσει την ευαισθησία του όγκου σε ραδιοθεραπεία και χημειοθεραπεία μέσω ενός ή περισσοτέρων έμμεσους μηχανισμούς που περιλαμβάνουν πρωτεομικής και γονιδιωματικών αλλαγές. Οι επιδράσεις αυτές, με τη σειρά, μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη ικανότητα διήθησης και μετάστασης, της απώλειας της απόπτωσης, και χαοτική αγγειογένεση, έτσι περαιτέρω αύξηση της αντίστασης θεραπεία. Ωστόσο, η απόκριση των κυττάρων του όγκου στην υποξία και η εξάντληση του ορού και του υποκείμενου μηχανισμού διαμεσολαβεί παραμένουν να διευκρινισθούν αυτή η απάντηση. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι τα περισσότερα από τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου υφίστανται απόπτωση κατά την έκθεση σε εξάντληση του ορού και υποξία, και η CD133 + πληθυσμός του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων είναι πιο ανθεκτικά σε απόπτωση μέσω της συστατική ενεργοποίηση ενός αντι-αποπτωτικό μονοπάτι σηματοδότησης που περιλαμβάνουν Hsp27. Επιπλέον, δείχνουμε ότι TICs μπορούν να ευαισθητοποιηθούν για να υποβληθούν σε απόπτωση και τον κυτταρικό θάνατο μέσω της αδρανοποίησης της οδού Hsp27.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και συνθήκες υποξίας

Η ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική σειρά ΗΤ-29 ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC). Οι CCS και κύτταρα πρωτογενούς καλλιέργειας HCW ήταν προικισμένος από τον Dr. Wen Κ Γιανγκ (Εργαστήριο Κυτταρικής /Gene Therapy, Κίνα Medical University Hospital, Taichung, Ταϊβάν). Τα κύτταρα CCS απομονώθηκαν από πρωτογενή όγκο ενός θηλυκού με Duke C

3 αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. Τα κύτταρα HCW απομονώθηκαν από το δείγμα μετάσταση στο ήπαρ ενός αρσενικού με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, Grand Island, ΝΥ,) που περιέχει 10 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 10 μg /mL στρεπτομυκίνη, 2 mmol /L γλουταμίνη, και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Gibco), σε 37 ° C υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Για υποξικές συνθήκες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα μίγμα αερίων αποτελούμενο από 94% Ν

2, 5% CO

2, και 1% O

2, η οποία διατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα επωαστήρα με δύο αισθητήρες αέρα, ένας για το CO

2 και το άλλο για O

2? η O

συγκέντρωση 2 επιτεύχθηκε και διατηρήθηκε χρησιμοποιώντας την παράδοση του αερίου αζώτου (N

2). Εάν O

2 ποσοστιαίες αυξήσεις πάνω από το επιθυμητό επίπεδο, το φυσικό αέριο Ν

2 αυτόματα εγχέεται στο σύστημα για να εκτοπίσει την περίσσεια O

2. Για σφαιροειδές καλλιέργεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε DMEM ελεύθερο ορού μέσο /F12 συμπληρωμένου με συμπλήρωμα Ν2, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη EGF (20 ng /mL? PeproTech), και FGF (10 ng /mL? PeproTech), και απλώθηκε σε πυκνότητα 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε ένα 6-φρεατίων Ultra-Low Συνημμένο Microplate (Corning, Lowell, ΜΑ).

Δοκιμασίες για απόπτωση

η απόπτωση προσδιορίστηκε με ένα κυψελοειδές χρωστική ουσία που ανιχνεύει μεμβράνη μεταβολές (φωσφατιδυλοσερίνη κτύπημα) και λεκέδες αποπτωτικά κύτταρα (APOPercentage? Accurate Chemical & amp? Scientific Corporation, New York, ΝΥ). Χρωματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας Spectramax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Εναλλακτικά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη, χρωματίστηκαν με TUNEL δοκιμασία (in situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, Roche), και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού. Για την ανίχνευση των διασπασμένων μορφών της κασπάσης 3 και 9, προϊόντα λύσης πρωτεϊνών παρασκευάσθηκαν και μια κηλίδα western πραγματοποιήθηκε με τα πρωτογενή αντισώματα αγοράζονται από τη Cell Signaling Technologies (Beverly, ΜΑ).

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασία

Για δοκιμασία μετανάστευσης, 4 × 10

4 κύτταρα, εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 0,5% FBS, σπάρθηκαν στο άνω φρεάτιο 24 φρεατίων transwell που περιείχε ένα φίλτρο με 8 μm πόρους ( Corning, συμπρωταγωνιστής, USA). Στο χαμηλότερο φρεάτιο, προστέθηκαν 600 μΐ DMEM συμπληρωμένο με 15% FBS. Κυττάρων επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα κύτταρα εκείνα που διατηρούνται στην άνω και απομακρύνθηκαν με μάκτρο και εκείνοι μετανάστευσαν προς την αντίθετη πλευρά του φίλτρου χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού στα 200 × μεγέθυνση. Η επεμβατική ικανότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με Matrigel (Becton Dickinson) -επικαλυμμένα φίλτρα πολυανθρακικού με 8 μm πόρους 24 φρεατίων transwell. Κυτταρική πυκνότητα σποράς, μέσο καλλιέργειας, περίοδο καλλιέργειας, και η μέθοδος αξιολόγησης ήταν η ίδια με τη δοκιμασία μετανάστευσης.

Real-time RT-PCR

Η μέθοδος του πραγματικού χρόνου RT-PCR όπως περιγράφεται [15]. Εν συντομία, ολικό RNA (1 μ§) του κάθε δείγματος αντίστροφα μεταγράφηκε σε 20 μι χρησιμοποιώντας 0.5 μα ολίγο dT και 200 ​​U Superscript RT III (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η ενίσχυση διεξήχθη σε έναν συνολικό όγκο 20 μL που περιέχει 0,5 μΜ από κάθε εκκινητή, 4 mM MgCl

2, 2 μί LightCycler ™ -FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche Molecular Systems, Alameda, CA) και 2 μί 110 αραιωμένο cDNA. Οι αντιδράσεις PCR παρασκευάστηκαν εις διπλούν και θερμαίνεται στους 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθήθηκε από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 60 ° C για 1 λεπτό, και επέκταση στους 72 ° C για 20 sec. Πρότυπες καμπύλες (τιμές κατωφλίου κύκλου έναντι της συγκέντρωσης εκμαγείου) παρασκευάστηκαν για κάθε γονίδιο στόχο και για την ενδογενή αναφοράς (GAPDH) σε κάθε δείγμα. Η ποσοτικοποίηση των άγνωστων δειγμάτων πραγματοποιήθηκε από τον LightCycler Σχετική έκδοση Ποσοτικοποίηση λογισμικού 3.3 (Roche).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, Διαλογή και MACS-διαχωρισμού

Οι αναρτήσεις των καρκινικών κυττάρων αρθεί με EDTA πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με FITC- ή ΡΕ-συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα προς δείκτες ανθρώπινης CD σε 50 μί ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (PBS, 2% FBS). Μετά την επώαση, τα κύτταρα με τα δεσμευμένα αντισώματα εκπλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη (σε PBS). αντισώματα ισοτύπου Mouse χρησίμευσαν ως αντίστοιχες μάρτυρες. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACScan κυτταρόμετρο ροής λογισμικό λειτουργίας CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για τη διαλογή παρασκευάστηκε ως μέθοδο κυτταρομετρίας ροής με όλες τις ασηπτικές αντιδραστήρια και χωρίς στερέωση. Μαγνητική κύτταρο διαχωρισμού (MACS) του CD133 + κυττάρων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (https://www.miltenyibiotec.com/en/NN_21_MACS_Cell_Separation.aspx). Μετά την επώαση με ανοσομαγνητικά CD133-μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Γερμανία) για 30 λεπτά στους 4 ° C, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS συν 0,5% BSA συν 2 mM EDTA, διηθείται μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 40 μm, και τρέξιμο πάνω από μια συσκευή μαγνητικού κυτταρικού διαχωρισμού (Auto-Macs? Miltenyi Biotec). για τη θετική επιλογή των κυττάρων CD133 +

Ανάλυση Western Blot

κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται με M-PER (Pierce, Rockford, IL ) συν πρωτεάσης κοκτέιλ αναστολέα (Halt ™? Pierce) και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA (Pierce). Δείγματα των προϊόντων λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου SDS-10% και μεταφέρθηκαν σε φίλτρα μεμβράνης PVDF, οι οποίες δεσμεύτηκαν με 5% βαθμού κηλίδωσης γάλα (Bio-Rad, Hercules, CA) σε TBST (20 mM Tris-HCI [ρΗ 7.6] , 137 mM NaCl, 1% Tween 20). Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα, αντέδρασαν με αντίστοιχες δευτερογενή αντισώματα, και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό χημειοφωταύγειας (Millipore, Billerica, ΜΑ). Οι μεμβράνες εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για την οπτικοποίηση των ζωνών (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Αντισώματα έναντι pPP2A (# 12615? Santa Cruz), ρρ38 (# 9216? Cell Signaling), pMAPKAPK2 (# 3007? Cell Signaling), pHsp27 (AF2314, R & amp? Α), β-τουμπουλίνης (# 05-661? Millipore), E-cadherin (# 4065? Cell Signaling), Ν-cadherin (# 4061? Cell Signaling), βιμεντίνη (MAB3400? Millipore), ινονεκτίνη (SC-8422? Santa Cruz), pJak2 (# 3771? Cell Signaling) και PC- src σε Tyr416 (# 2101? Cell Signaling) χρησιμοποιήθηκαν. ΡΡ2 και ΡΡ3 αγοράστηκαν από την Calbiochem.

Ανοσοφθορισμός και ανοσοϊστοχημική χρώση

Για ανοσοφθορισμό, σφαίρες υπέστησαν επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, επωάστηκαν με αντισώματα ποντικού ή κουνελιού κατά της ανθρώπινης CD133 (AC133 ποντικού IgG, Miltenyi) , CK 20 (Ks20.8 ποντικιού IgG2a, GeneTex, San Antonio, TX), CDX2 (Chemicon, Temecula, CA), και β-κατενίνης (H-102, Santa Cruz Biotechnology? Santa Cruz, CA), σε κατάλληλες αραιώσεις τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C, πλύθηκαν εκτεταμένα με PBS, και αντέδρασαν με αντίστοιχες ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης δευτερεύοντα αντισώματα. Ανοσοφθορισμός παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού. Για την ανοσοϊστοχημική χρώση, τα τμήματα του όγκου εγκλεισμένες σε παραφίνη αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και αντιγόνο ανακτώνται με τοποθέτηση σε τμήματα Declere διάλυμα εργασίας (Cell Marque, Austin, ΤΧ) σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 20 λεπτά. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. Υπολειμματική ενζυμική δραστικότητα απομακρύνθηκε με πλύσεις σε PBS, και η μη ειδική χρώση αποκλείστηκε με Ultra V Block για 5 λεπτά (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA). Στη συνέχεια, οι τομές αντέδρασαν με πρώτα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C, πλύθηκαν εκτεταμένα με PBS, και αντέδρασαν με αντίστοιχες βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα (Vector Laboratories, Burlingame, CA) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση (LSAB Kit? Dako, Carpinteria, CA), που ακολουθείται από διαμινοβενζιδίνη χρώση. Αντιχρωματισμός έγινε με αιματοξυλίνη Mayer για

Screening Ανίχνευση της φωσφορυλίωσης των RTK και Οικογένειας της ΜΑΡΚ

Μεμβράνες από το ανθρώπινο φωσφο-υποδοχέων τυροσινικής κινάσης Kit Array (Κατάλογος Αριθμός ARY001?. Ε & amp? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) και η Ανθρώπινη Phospho-ΜΑΡΚ Kit Array (Κατάλογος Αριθμός ARY002? Κ &? D Systems) αποκλείστηκαν με Array Buffer Ι για 1 ώρα. Μειωμένα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης σε Array Buffer Ι επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 2-8 ° C (ή 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου). Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης σε θερμοκρασία δωματίου, και επωάστηκαν με φρέσκο ​​αραιωμένο Ανίχνευση Αντισωμάτων για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό χημειοφωταύγειας. Μεμβράνες εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για να απεικονίσει τις τελείες

φορέα λεντοϊού Παραγωγής και κυττάρων Λοίμωξη

Τα πλασμίδια έκφρασης και οι κλώνοι βακτήρια για Hsp27 shRNA. (ShRNA1: TRCN0000008753, shRNA1: TRCN0000011466) δόθηκαν από τον πυρήνα RNAi του Εθνικού Συμβουλίου Επιστήμης στην Ταϊβάν. Οι φορείς λεντοϊών shRNA παρήχθησαν με διαμόλυνση 293FT κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (LF2000? Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και, στη συνέχεια, διηθούνται. Υποσυρρέοντα κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό παρουσία 8 μg /mL πολυβρένιο (Sigma-Aldrich). Σε 24 ώρες μετά την μόλυνση, απομακρύναμε μέσον και αντικαθίσταται με φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης που περιέχει πουρομυκίνη (4 μg /ml) και επιλέχθηκαν για μολυσμένα κύτταρα για 48 ώρες.

ΡΡ2Α φωσφατάσης Δοκιμασία Δραστηριότητα

ΡΡ2Α δραστικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ φωσφατάση V2460 (Promega, Madison, WI). Εν συντομία, τα κύτταρα διαχωρίζονται με MACS ή εμπλουτισμένα για TICs λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης φωσφατάσης, ακολουθούμενη από την απομάκρυνση της ενδογενούς φωσφορικού χρησιμοποιώντας στήλες περιστροφής που παρέχονται από το σύστημα προσδιορισμού φωσφατάσης σερίνης /θρεονίνης. 1 μg δείγματα πρωτεΐνης εις τριπλούν επωάζονται με φωσφοπεπτιδίου σε ρυθμιστικό αντίδρασης ΡΡ2Α για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, τα δείγματα χρωματίζονται με μίγμα χρωστικής για 15 λεπτά ακολουθούμενη από διακοπή της αντίδρασης, και μετρήθηκαν οι τιμές OD στα 600 nm. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με κύτταρα ελέγχου ως 100%.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν με Student t-test. Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η υποξία και ορού εξάντληση αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων CD133 +

Η έκθεση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου τόσο υποξία και ορό. μέσο ελεύθερο οδήγησε σε ένα μεγάλο αριθμό των νεκρών κυττάρων, υποδεικνύοντας τα περισσότερα από τα κύτταρα του όγκου δεν επιβιώνουν υπό αυτές τις συνθήκες. Ωστόσο, βρήκαμε ότι το ποσοστό των CD133 + κυττάρων ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου αυξημένη μερικές φορές κάτω από συνθήκες υποξίας και επίσης με μέσο χωρίς ορό, σε σύγκριση με νορμοξικές συνθήκες. Ωστόσο, σύμφωνα με τις δύο υποξίας και ελεύθερο ορού συνθήκες μέσου, ο πληθυσμός CD133 + αυξήθηκε μέχρι σχεδόν 30-φορές (Σχήμα 1Α). Η αύξηση του ποσοστού των κυττάρων CD133 + παρατηρήθηκε μετά από 2 ημέρες και ακόμη πιο δραματικά την ημέρα 4 ή 6. Αυτή η αύξηση σε κύτταρα CD133 + παρατηρήθηκε επίσης στα CCS και HCW πρωτογενή καλλιέργεια κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (Εικ. 1Β). Η αύξηση του επί τοις εκατό των κυττάρων CD133 +, ωστόσο, δεν οφειλόταν σε αύξηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων CD133 +, καθώς ο πραγματικός αριθμός των κυττάρων CD133 + μειώθηκε ελαφρά μαζί με την αύξηση του πολιτισμού υπό υποξίας και ελεύθερο ορού συνθήκες μέσο (Σχήμα 1 C) ή σε σύγκριση με τον αριθμό των κυττάρων CD133 + κάτω από ορό μέσο περιείχε ή /και συνθήκες νορμοξία (Εικόνα 1D). Δεδομένου ότι τα κύτταρα CD44 + και CD166 + θεωρούνται επίσης ως TICs σε καρκίνο του παχέος εντέρου [16], ζητήσαμε επίσης αν αυτοί οι δείκτες συνδέθηκαν με CD133 και επηρεάζεται από την υποξία και την εξάντληση του ορού. Η πλειονότητα των κυττάρων CD133 + βρέθηκαν να είναι αρνητικοί για τόσο CD44 και CD166, ωστόσο, με υποξία και ορό εξάντληση παρατηρήσαμε μια αύξηση σε κύτταρα CD166 +, αλλά όχι CD44 + και ο πληθυσμός του CD166 + ήταν πολύ μικρότερη από εκείνη του CD133 + (Σχήμα 1 Ε) , γεγονός που υποδηλώνει ότι η πλειονότητα του πληθυσμού CD133 + είναι διαφορετική από τις + /CD44 + κυττάρων CD166. Όπως ήταν αναμενόμενο, CD133 + κυττάρων βάφτηκαν αρνητικά για CD29, CD90 και CD105, δείκτες για τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα και CD45, σήμανσης των αιμοποιητικών κυττάρων (Σχήμα 1 F). Δεν κύτταρα χρωματίστηκαν θετικά για CD105 και CD45, και κανένας από αυτούς τους δείκτες αυξήθηκαν υπό εξάντληση ορού και συνθήκες υποξίας (Σχήμα 1 F).

(Α) ΗΤ-29, (Β) και CCS HCW κύτταρα σπάρθηκαν με κανονικό μέσο ανάπτυξης (FBS) κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση (NOR). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε εξάντληση ορού (SF), υποξία (Ηγρ), η υποξία και ορό εξάντληση, ή, ως έλεγχο, υπό τις ίδιες συνθήκες, και 2, 4 ή 6 ημέρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για δοκιμασία CD133 ποσοστό με ροή κυτταρομετρία. (C αριστερό πάνελ) Σύνολο κυττάρων για κάθε κατάσταση και (C δεξί πάνελ) τον αριθμό των κυττάρων του CD133- και CD133 + ΗΤ-29 κύτταρα σε ενδεικνυόμενη περίοδο υπό υποξία και εξάντληση ορού μετρήθηκαν. (Δ αριστερό πάνελ) Συνολικός αριθμός των κυττάρων και (D δεξί πάνελ) οι αριθμοί των CD133 + και τα κύτταρα CD133- της CCS και κυττάρων HCW σε 4 ημέρες υπό κάθε συνθήκη. (Ε και F) κυτταρομετρία ροής για τα προφίλ πρωτεΐνης επιφάνεια των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν υπό έλεγχο, ή υπό την υποξία και ορό εξάντληση για 4 ημέρες.

Η

CD133 + κύτταρα έχουν ιδιότητες του παχέος TICs

Για να περαιτέρω αντιμετώπιση εάν η CD133 + πληθυσμού είναι καλόπιστος παχέος TICs χρησιμοποιήσαμε τις ακόλουθες ιδιότητες που σχετίζονται με ορθοκολικό TICs στη βιβλιογραφία για να χαρακτηρίσει το CD133 + πληθυσμό. Δεδομένου ότι ένα ουσιώδες χαρακτηριστικό ικανότητα των τικ είναι να σχηματίσει αδιαφοροποίητο σφαίρες (σφαιροειδή) [2], αναρωτηθήκαμε εάν τα CD133 + κύτταρα που απομονώθηκαν από υποξία και εξάντληση ορού διαθέτουν την ικανότητα. Βρήκαμε ότι CD133 + κύτταρα ήταν σε θέση να σχηματίσουν σφαίρες πιο εύκολα από ό CD133- κύτταρα όταν καλλιεργούνται σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένου με EGF και FGF2 (Σχήμα 2Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα στις σφαίρες ήταν θετικά για CD133, αλλά αρνητική για διαφοροποιημένη δείκτες των όγκων παχέος εντέρου, δηλαδή της πυρηνικής β-κατενίνης (ενεργοποιημένο β-κατενίνης), κυτοκερατίνη 20 (ΟΚ20) και το ουραίο παράγοντα μεταγραφής τύπου ομοιοακολουθίας 2 (CDX2) (Σχήμα 2Β και 2C), υποδεικνύοντας αυτές οι σφαίρες ήταν αδιαφοροποίητο σφαίρες. Για να διερευνηθεί εάν η εμπλουτισμένη CD133 + πληθυσμό στις σφαίρες διαθέτει την ικανότητα να σχηματίζουν διαφοροποιημένων δείκτες των όγκων παχέος εντέρου, CD133 + σφαίρες σπάρθηκαν σε matrigel και εκτέθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό. Μετά από καλλιέργεια υπό αυτές τις συνθήκες για 2 εβδομάδες, άρχισαν να σχηματίσει διαφοροποιημένα σφαίρες που μειώθηκαν σε χρώση CD133, θετικά για την πυρηνική β-κατενίνης, ΟΚ20 και CDX2 (Σχήμα 2Β και 2C). Είναι σημαντικό ότι, για CD133 + κυττάρων, έγχυση μικρότερο από 1.000 κύτταρα ήταν αρκετή για να σχηματίζουν όγκους όταν μεταμοσχεύονται σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια, αλλά ακόμη και με 100.000 κύτταρα, CD133- δεν ήταν σε θέση να σχηματίσουν όγκους (Σχήμα S1A). Θα πρέπει να αναμένεται, οι όγκοι που σχηματίζονται από CD133 + κυττάρων, παρόμοια με τους όγκους που σχηματίζεται από χύδην κύτταρα, θετική χρώση για τον ορθοκολικό καρκίνο δείκτες (Σχήμα S1B). Επιπλέον, ξενομοσχεύματος όγκοι που σχηματίζονται από CD133 + περιείχαν επίσης CD133 + και κυττάρων CD133- (Σχήμα S1B), και το CD133 + πληθυσμού που απομονώθηκε από όγκους ξενομοσχεύματος που σχηματίζονται ενός πληθυσμού κυττάρων αναμιγνύονται με τα κύτταρα CD133 + και CD133-

ex vivo

, ενώ ο CD133- πληθυσμού εξακολουθεί να δίνει αφορμή για CD133- κύτταρα (Σχήμα S1c). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν CD133 + κυττάρων που σχηματίζεται ξενομόσχευμα όγκου και προκάλεσε τόσο των κυττάρων CD133 + και CD133-, προτείνοντας αυτά τα CD133 + κύτταρα κατείχαν τις ιδιότητες των τικ. Επιπλέον, ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι CD133 + κύτταρα είχαν μια αύξηση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με διάφορες βλαστικών κυττάρων συμπεριλαμβανομένων, Oct4, Nanog, νεστίνη, KLF4, Notch 1, Notch 2 και Notch 3, c-myc, Gil1, Wnt5a και VEGF (Σχήμα 2D και σχήμα S2). Oct4 και Nanog εκφράζονται αποκλειστικά σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα [17], νεστίνη εκφράζεται σε πολυδύναμα νευρικά βλαστοκύτταρα [18], ενώ KLF4, c-myc, και τα γονίδια του Notch, η Shh και WNT μονοπάτια εκφράζονται σε TICs μιας ποικιλίας των καρκίνων [19], [20], [21]. Ο VEGF είναι ένα από τα πιθανά στόχων του υποξία επαγώγιμων παραγόντων-1α (HIF-1α) [22]. HIF1-α έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [23], η οποία έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι σε θέση να παράγουν κύτταρα με ιδιότητες βλαστικών κυττάρων στον καρκίνο του μαστού [24]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ότι CD133 + κύτταρα μειώθηκαν σε Ε-καδερίνης και αυξήθηκε το EMT δείκτες όπως Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και φιμπρονεκτίνη με ποσοτική RT-PCR και ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 2Ε). Είναι σημαντικό ότι η αύξηση των δεικτών ΕΜΤ σε κύτταρα CD133 + συσχετίστηκε επίσης με την αύξηση της ικανότητας για κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, τα χαρακτηριστικά των κυττάρων με αυξημένη EMT (Σχήμα 2F). Έτσι, CD133 + κύτταρα έχουν χαρακτηριστικά EMT και να αυξήσει τους δείκτες των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και ένα γονίδιο στόχο HIF.

(Α) Σφαίρα ικανότητα σχηματισμού των κυττάρων CD133 + και CD133-. CD133 + και CD133- κύτταρα, που χωρίζονται από MACS μετά από 4 ημέρες καλλιεργήθηκαν υπό υποξία και εξάντληση ορού, καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες ελεύθερες ορού, παρουσία EGF (10 ng /ml) και FGF2 (10 ng /mL). σχηματισμό σφαίρα υπολογίστηκε στις 2 εβδομάδες (& gt? 25 ή & lt? 25 δείχνει τον αριθμό των κυττάρων του κάθε σφαίρας.). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. (* Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με CD133 κύτταρα όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία t του Student) (Β) CD133 + κυττάρων μετά MACS διαχωρισμό κατά την 4η ημέρα της έκθεσης σε υποξία και εξάντληση ορού, καλλιεργούνται κάτω από συνθήκες ελεύθερου ορού με την παρουσία EGF (10 ng /mL) και FGF2 (10 ng /mL), που σχηματίζεται σφαίρες στις 2 εβδομάδες. Ανοσοφθορισμό δείχνει ότι αυτές οι σφαίρες είναι αδιαφοροποίητα σφαίρες (Μη διαφοροποιημένες), τα οποία είναι θετικά για CD133, και αρνητική για την πυρηνική β-κατενίνης, CDX2 και ΟΚ20. Οι σφαίρες στη συνέχεια σπείρονται σε matrigel και εκτέθηκαν σε κατάσταση που περιέχει ορό για άλλες 2 εβδομάδες. Ανοσοφθορισμός δείχνει ότι αυτές οι σφαίρες διαφοροποιημένα (Διαχωριζόμενες), τα οποία μειώνουν την έκφραση CD133, αύξηση στην έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης, CDX2 και ΟΚ20. Ράβδος κλίμακας, 20 μm (C) Ποσοστό κυττάρων θετικών για CD133, πυρηνικός β-κατενίνης, CDX2 και ΟΚ20 μετρήθηκαν. (D) και (Ε δύο άνω πίνακες) Ποσοτική RT-PCR για τα επίπεδα mRNA, (Ε κάτω πλαίσιο) ανάλυση ανοσοκηλίδος. (F) μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασία εισβολής για τα κύτταρα CD133 + και CD133- μετά MACS διαχωρισμό κατά την ημέρα 4 της έκθεσης σε υποξία και την εξάντληση του ορού. Τα δεδομένα των ΗΤ-29 κύτταρα εμφανίζονται ως αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα.

Η

CD133 + κύτταρα είναι ανθεκτικά στην υποξία και ορού εξάντληση απόπτωση που επάγεται

Στη συνέχεια, διερευνάται εάν τα κύτταρα CD133 + θα μπορούσε να είναι ανθεκτικά στην υποξία και εξάντληση ορού απόπτωση. Πράγματι, + κύτταρα CD133 βρέθηκαν να είναι ανθεκτικά σε απόπτωση όπως μετράται με τη δοκιμασία TUNEL, ενώ τα κύτταρα CD133- ήταν θετικά για χρώση TUNEL (Σχήμα 3Α). Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε περαιτέρω όταν ΗΤ-29 κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από τρεις ημέρες από την υποξία και η εξάντληση του ορού, και στη συνέχεια, οι πληθυσμοί των κυττάρων CD133 + και CD133- αντιστοίχως επανασπάρθηκαν για περισσότερες από 16 ώρες υπό τις ίδιες συνθήκες και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία APOPercentage. Εδώ βρήκαμε ότι στην CD133- πληθυσμό υπήρχε σημαντικά περισσότερο από ό, τι την απόπτωση στα κύτταρα CD133 + (Σχήμα 3Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δεικνύουν ότι το CD133 + κύτταρα είναι ανθεκτικά σε υποξία και ορό εξάντληση θάνατο που επάγεται κυττάρου. Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός του CD133 + κυττάρων αντοχή σε απόπτωση, ζητήσαμε πρώτα εάν η ανθεκτικότητα αυτή προέκυψε μέσω ενός μονοπατιού αποπτωτικής κασπάσες-εξαρτώμενη. Βρήκαμε ότι η έκφραση των γονιδίων κασπάσης όπως κασπάση 9 και 3 μειώθηκε σε κύτταρα CD133 + σε σύγκριση με τα κύτταρα CD133- τόσο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR (Εικόνα 3C) και ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 3D), αντίστοιχα. Επιπλέον, CD133 + κυττάρων έδειξε επίσης μια μειωμένη ποσότητα των δραστικών διασπώνται μορφές της κασπάσης 9 και της κασπάσης 3 (Σχήμα 3D). Ωστόσο, δεν βρήκαμε καμία εμφανής διαφορά μεταξύ CD133 + και τα κύτταρα CD133- στα επίπεδα της πρωτεΐνης του φωσφόρου-ΙΚΚα, πυρηνική NF-κΒ και προς τα κάτω τους στόχους της, όπως Bcl-2 και πρωτεΐνες survivin (Σχήμα S3). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η επιβίωση του CD133 + κυττάρων από υποξία και εξάντληση ορού διαμεσολαβείται κυρίως από την έλλειψη μη ενεργοποίησης κασπάσης 9 και της κασπάσης 3, αλλά ανεξάρτητος του ΝΡ κΒ, BCL-2 και survivin.

(Α ) χρώση TUNEL για απόπτωση πραγματοποιήθηκε μετά από διαχωρισμό MACS CD133- και CD133 + κυττάρων υπό υποξία και ορού εξάντληση για 4 ημέρες. + Κύτταρα (Β) CD133- και CD133 υπό εξάντληση υποξία και ορό για 3 ημέρες συλλέχθηκαν με διαχωρισμό MACS, επανακαλλιεργήθηκαν υπό υποξία και ορό εξάντληση, και δοκιμασία APOPercentage διεξήχθη 16 ώρες αργότερα. (Γ) Ποσοτική RT-PCR για τα επίπεδα mRNA. (DF) κυτταρολύματα των κυττάρων CD133 + και CD133- μετά MACS διαχωρισμό κατά την 4η ημέρα της έκθεσης σε υποξία και ορό εξάντληση παρασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για (D, F) ανάλυση ανοσοκηλίδος για τα επίπεδα της πρωτεΐνης, και (Ε) ΜΑΡΚ φωσφο-αντισώματος συστοιχία για αναλύοντας τα επίπεδα υποδεικνύονται μονοπατιών σηματοδότησης. Γραφήματα δείχνουν κάθε σηματοδότηση μετά κανονικοποιούνται με έλεγχο. CD133 + κύτταρα μειώθηκαν στην έκφραση και την ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και 3 και αυξημένη στην έκφραση των φωσφο-Hsp27. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. (* P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία t του Student.) Τα στοιχεία των ΗΤ-29 κύτταρα εμφανίζονται ως αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα

Η

Hsp27 είναι απαραίτητη για την επιβίωση των τικ κάτω. υποξία και ορού εξάντληση

Δεδομένου ότι ανακαλύψαμε ότι υπήρχε λιγότερη της δραστικής μορφής της κασπάσης 9 και 3 (Σχήμα 3D), από την επόμενη διερευνήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί ευθύνονται για την έλλειψη ενεργοποίησης της κασπάσης 9 και 3 στο CD133 + κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ταχεία και ευαίσθητη Phospho-RTK (φωσφο-Tyr) και φωσφο-ΜΑΡΚ Arrays (φωσφο-Ser /Thr), και σε σύγκριση με την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών σε πολλές διαφορετικές οδούς σε κύτταρα CD133 + για να CD133- κύτταρα, κάτω από το συνθήκες υποξίας και εξάντληση ορού. Σε γενικές γραμμές δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην φωσφορυλίωση τυροσίνης μεταξύ της CD133 + και CD133- κύτταρα (Σχήμα S4). Από την άλλη πλευρά, υπήρξαν αρκετές ser /ΤΙΐΓ φωσφορυλιώσεις κινάσης που αυξήθηκαν σε κύτταρα CD133 +, το πιο προφανές είναι Hsp27 (8,6 φορές), σε σύγκριση με τα κύτταρα CD133- (Σχήμα 3Ε). Ως εκ τούτου, έχουμε αξιολογηθεί περαιτέρω η συμμετοχή της Hsp27 στο CD133 αντίσταση κύτταρα + σε απόπτωση. Η αξιοπιστία της φωσφο-ΜΑΡΚ Arrays επιβεβαιώθηκε με ανάλυση western blot και CD133 + πράγματι αυξήθηκε σε ενεργοποίηση Hsp27, ενώ τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK και Akt δεν άλλαξαν (Σχήμα 3F). Ως εκ τούτου, τα στοιχεία αυτά δείχνουν την αντίσταση των κυττάρων CD133 + σε απόπτωση συνδέεται με την ενεργοποίηση της Hsp27.

Hsp27 είναι απαραίτητη για την επιβίωση των τικ κάτω από υποξία και ορού εξάντληση

Για να διερευνήσουν κατά πόσον δραστηριότητα Hsp27 είναι πράγματι σημαντικό να προστατεύσουμε CD133 + πληθυσμού από την απόπτωση, που χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά δύο Hsp27-Τα siRNAs και έδειξαν ότι η καταστολή της Hsp27 (Εικόνα 4Α) πράγματι ευαισθητοποιημένα απόπτωση του πληθυσμού CD133 + απαντώντας στην υποξία και την εξάντληση του ορού. Επιπλέον, Hsp27 ειδικό shRNA προκάλεσε μία μείωση στο αυξημένο ποσοστό CD133 + υπό υποξίας και μέσο ελεύθερο ορού συνθήκες, σε σύγκριση με το κωδικοποιημένο shRNA (Σχήμα 4Β). Μια αύξηση στην απόπτωση παρατηρήθηκε επίσης με δύο Hsp27 ειδικό Τα siRNAs στα CD133 + κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 4C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε πρωτογενή καλλιέργεια CCS (Σχήμα S5A). Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε επίσης μια αύξηση στην διάσπαση της κασπάσης 9 και 3 με Hsp27-ειδικό Τα siRNAs (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, δύο δομικά διαφορετικά αναστολείς Hsp27, κερσετίνη και KRIBB3 (ειδικό για φωσφορυλίωση Hsp27) [25], αύξησε επίσης την διάσπαση των κασπασών 9 και 3 σε κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 4D) και κύτταρα CCS (Σχήμα S5B) και προκαλούμενη από ένα μειωθούν στο αυξημένο ποσοστό + κυττάρων CD133 υπό υποξία και ορό εξάντληση (Σχήμα 4Ε) και είχε ως αποτέλεσμα την απόπτωση σε + κύτταρα CD133 (Σχήμα 4F), όπως ήταν αναμενόμενο, ο αναστολέας ΡΙ3Κ-Akt, LY294002 και αναστολέα ΕΚΚ, U0126 δεν προκάλεσε αυτές τις επιδράσεις ( Εικόνα S5c και S5D). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι η κερκετίνη είναι γνωστό ότι αναστέλλει Hsp27, Hsp70 και Hsp90. Έτσι, εξετάσαμε επίσης την ενεργοποίηση των Hsp90 και Hsp70 στην CD133 + και CD133- πληθυσμούς (Σχήμα 3F). Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι δεν υπάρχει διαφορά στην pHsp70 και pHsp90 μεταξύ των δύο πληθυσμών κυττάρων. Έτσι, μεταξύ των τριών πρωτεϊνών Hsp, Hsp27 φαίνεται να είναι η μόνη που δραστηριοποιείται στο CD133 + κυττάρων, με αποτέλεσμα η επίδραση Quercetin είναι πιθανό να προκαλείται από την αναστολή της Hsp27. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Hsp27 απαιτείται για την επιβίωση των τικ υπό υποξίας και ορό εξάντληση.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με lentivirally Hsp27 shRNA (shR1 και SHR2) ή ως κωδικοποιημένο shRNA, στη συνέχεια εκτίθενται σε υποξία και εξάντληση ορού . CD133 + και τα κύτταρα CD133- απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας διαχωρισμό MACS 4 ημέρες αργότερα.