Abstract

Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η κλινική σημασία του συνδετική μορίου προσκόλλησης Α (JAM-Α) σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και η βιολογική λειτουργία του JAM -Ένα σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Δείξαμε ότι JAM-Α εκφράζεται κυρίως σε κυτταρικές μεμβράνες και υψηλή έκφραση του JAM-Α συνέβη στο 37% των δειγμάτων όγκου πνεύμονα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς. Υψηλή έκφραση του JAM-Α συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο TNM (P = 0,021), λεμφαδένα μετάσταση (P = 0,007), και μειωμένη συνολική επιβίωση (P = 0,02), Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η φίμωση JAM-Α από μικρά παρεμβαλλόμενα RNA ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S όριο. Ανάλυση Western blotting αποκάλυψε ότι knockdown του JAM-Α μείωσε τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης D1, CDK4, 6, και P-Rb. Έτσι, JAM-Α παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη NSCLC

Παράθεση:. Zhang Μ, Luo W, Huang Β, Liu Ζ, Sun L, Zhang Q, et al. (2013) Η υπερέκφραση του JAM-Α σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου. PLoS ONE 8 (11): e79173. doi: 10.1371 /journal.pone.0079173

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 30, 2013? Αποδεκτές: 23, Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30972967) και Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης της Κίνας (Αρ 20092104110018). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

συνενώσεως μόριο προσκόλλησης α (JAM-α) είναι ένας τύπος Ι διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών. JAM-Α είναι ευρέως κατανεμημένη σε ιστούς, συμπεριλαμβανομένων του πλακούντα, πνεύμονες, ήπαρ, νεφρά, πάγκρεας, καρδιά, εγκέφαλος, έντερα, και λεμφαδένες [1], [2], [3], [4]. JAM-Α εκφράζεται κυρίως σε διακυτταρικές συνδέσεις των επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων, JAM-Α βρίσκεται επίσης στην επιφάνεια των λευκοκυττάρων, λεμφοκυττάρων, αιμοπεταλίων, και ερυθροκυττάρων [5], [6], [7], [8]. JAM-Α εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, όπως προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, μετανάστευση των λευκοκυττάρων, την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, την αγγειογένεση, και ρεοϊός δέσμευσης [5], [9], [10], [11]. Το JAM-Α πρωτεΐνη αποτελείται από μία εξωκυτταρική περιοχή με δύο Ig-σαν θηλιές, μια περιοχή ενιαίο μεμβρανοδιατρέχουσας, και σε μικρή κυτταροπλασματική ουρά καταλήγει σε ένα μοτίβο ΡΟΖ-δεσμευτική. JAM-Α μπορούν να σχηματίσουν ομοδιμερή μέσω αυτής της Ν-τερματικό Ig βρόχου. Homophilic αλληλεπιδράσεις είναι σημαντικά για την προαναφερθείσα JAM-A λειτουργία στα κύτταρα [12]. Το Ο-τερματικό PDZ μοτίβο σύνδεσης μπορεί να διευκολύνει τις αλληλεπιδράσεις με διάφορες πρωτεΐνες ικρίωμα, όπως ΖΟ-1, AF-6, και PAR-3 [13], [14], [15]. JAM-Α διμερισμό και ΡΟΖ μοτίβα δέσμευσης είναι ζωτικής σημασίας για την καταρράκτη σηματοδότησης [16], [17]. Πρόσφατα, JAM-Α έχει εμπλακεί στην εξέλιξη του όγκου, αλλά ο ρόλος του JAM-A στην ανάπτυξη και τη διάδοση όγκων παραμένει ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα. Naik et al. [18] ανέφεραν ότι αρχικά JAM-A θα μπορούσε να μειώσει την εισβολή και την κινητικότητα του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές

in vitro

και JAM-Α έκφρασης σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού αρνητικά που συνδέονται με την επιθετικότητα του όγκου και τη μετάσταση. Παρόμοια clinical- ή

in vitro

παραγομένης δεδομένα αναφέρθηκαν από άλλους που περιλαμβάνουν καρκίνωμα του ενδομητρίου [19] και τον καρκίνο του παγκρέατος [20]. Αντιθέτως, Mc Sherry et al. [21], με τη χρήση ενός μεγαλύτερου κλινικά σύνολο δεδομένων, ανέφεραν μια θετική συσχέτιση μεταξύ JAM-Α έκφρασης και επεμβατικές πρόγνωση καρκίνου του μαστού. Ομοίως, τα μεγαλύτερα clinical-,

in vitro

-, και

in vivo

παραγομένης σύνολα δεδομένων πρόσφατα αναφερθεί σε καρκίνο του μαστού και επιδερμικό καρκίνωμα [22], [23], [24], [25], [26]. Η έκφραση του JAM-Α πρωτεΐνης σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) σε ιστούς και τη σχέση με διάφορους παράγοντες κλινικοπαθολογική δεν έχει πλήρως διερευνηθεί. Επιπλέον, ο ακριβής ρόλος του JAM-A στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα είναι ασαφής. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε JAM-Α έκφρασης σε ιστούς NSCLC με ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον, προσδιορίσαμε τη συσχέτιση μεταξύ JAM-Α έκφραση και πολλαπλασιασμός σε αρκετές κυτταρικές σειρές NSCLC. Δείξαμε ότι JAM-Α εκφράζεται σχετικά υψηλά ποσά σε ιστούς NSCLC και ορισμένους τύπους κυτταρικών σειρών NSCLC, και ότι κυτταρικής μεμβράνης που σχετίζονται με τα επίπεδα JAM-Α συσχετίζονται με την επιθετικότητα του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση του Διοικητικού συμβουλίου Institutional Review της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς με ΜΜΚΠ και όλες οι κλινικές έρευνες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις αρχές που ψηφίστηκε στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Ασθενείς και δείγματα

Ογδόντα δύο δείγματα NSCLC ελήφθησαν από το πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου μεταξύ 2002 και 2009? 42 δείγματα υποβλήθηκαν σε μελέτες παρακολούθησης. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν ραδιοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική εκτομή. Η διάγνωση ιστολογική και βαθμού διαφοροποίησης των όγκων προσδιορίστηκαν με αξιολόγηση των αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές ιστού-χρώση σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας της ταξινόμησης. Όλα τα 82 δείγματα επαναξιολογούνται σε σχέση με την ιστολογική υπότυπο, την κατάσταση διαφοροποίησης, και το στάδιο του όγκου. Πλακώδες καρκίνωμα και το αδενοκαρκίνωμα εντοπίστηκαν σε 36 και 46 από τις 82 περιπτώσεις, αντίστοιχα. Λεμφαδενικές μεταστάσεις παρατηρήθηκαν σε 31 ασθενείς. Οι όγκοι ταξινομήθηκαν σε στάδια Ι (n = 45), II (η = 30), και III (n = 17) σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης ρ-ΤΝΜ της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (7η έκδοση). Συνολική επιβίωση ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα από την αρχική διάγνωση στο θάνατο ή την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης.

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Προϋποθέσεις Πολιτισμού

HBE, Α549, Η1299, Η157, και κυτταρικές γραμμές Η460 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). κυτταρικές σειρές ΕΣΠ και LK2 αγοράστηκαν από τη Σαγκάη κυττάρων Τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Invitrogen), 100 IU /ml πενικιλλίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), και 100 mg /ml στρεπτομυκίνης (Sigma). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια στείρα πιάτα καλλιέργειας ιστού και περάστηκαν κάθε 2 ημέρες χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη (Invitrogen).

Ανάλυση ανοσοϊστοχημείας

χειρουργικά αποκόπηκαν δείγματα όγκου μονιμοποιήθηκαν με 10% ουδέτερη φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη, και 4-μm πάχους τομές παρασκευάστηκαν. Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ElivisionTM συν Polyer HRP (ποντικού /κουνελιού) IHC Kit (Maixin, Fuzhou, Κίνα). Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε βαθμιαίες σειρά αλκοόλ, και βράζεται σε 0.01 Μ EDTA (ρΗ 9.0) για 20 λεπτά σε ένα λέβητα. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε χρησιμοποιώντας υπεροξείδιο του υδρογόνου (0,3%), η οποία ακολουθήθηκε από επώαση με φυσιολογικό ορό κατσίκας για να μειωθεί η μη ειδική πρόσδεση. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με JAM-Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (αραίωση 1:100? Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA). Κουνέλι ανοσοσφαιρίνη, στην ίδια συγκέντρωση όπως το αντιγόνο-ειδικό αντίσωμα (Maixin) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Χρώση για όλες πρωτογενή αντισώματα διεξήχθη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. ElivisionTM συν Polyer HRP χρησιμοποιήθηκε σαν το δευτερογενές αντίσωμα. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική για την ανάπτυξη της αντίδρασης της υπεροξειδάσης. Αντιχρωματισμός των τμημάτων έγινε με αιματοξυλίνη, τα οποία στη συνέχεια αφυδατώθηκαν σε αιθανόλη πριν από την τοποθέτηση. Δύο ανεξάρτητοι ερευνητές εξέτασαν όλες τις διαφάνειες των όγκων τυχαία. Πέντε απόψεις εξετάστηκαν ανά διαφάνεια, και 100 κύτταρα παρατηρήθηκαν ανά προβολή σε μεγέθυνση 400Χ. Ανοσοκηλίδωση του JAM-Α βαθμολογήθηκε μετά από μια ημι-ποσοτική κλίμακα αξιολογώντας αντιπροσωπευτικές περιοχές του όγκου? η ένταση και το ποσοστό των κυτταρικών μεμβρανών είχαν υψηλότερη ανοσοχρώση από τα κύτταρα ελέγχου. χρώση μεμβράνης των καρκινικών κυττάρων θεωρήθηκε θετική ανοσοχρώση. Η ένταση του JAM-Α χρώση μεμβρανών βαθμολογήθηκε επίσης ως 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής), 2 (μέτρια) και 3 (υψηλή). βαθμολογίες ποσοστό ορίστηκαν ως εξής: 1, 1% -10%? 2, 11% -50%? 3, 51% -80%? και 4, 81% -100% [20]. Οι βαθμολογίες κάθε δείγματος όγκου πολλαπλασιάζονται για να δώσουν ένα τελικό σκορ 0-12 και η συνολική έκφραση του JAM-Α προσδιορίστηκε ως χαμηλή (≤4) ή υψηλή έκφραση (& gt? 4).

ποσοτική πραγματικού -Time PCR (Πράσινη Μέθοδος SYBR)

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems, Foster City, USA) σε ένα συνολικό όγκο 20 υΙ επί 7900HT Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems) ως εξής: 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα? και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Ένα βήμα διαχωρισμού διεξήχθη για να παραχθεί μια καμπύλη τήξης για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της ενίσχυσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Τα σχετικά επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης εκπροσωπήθηκαν ως σημείο αναφοράς ΔCt = Ct του γονιδίου-Ct και η φορές αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν από το 2

-ΔΔCt μέθοδο, όπου ΔΔCt = (Ct

γονιδίου-Ct

αναφοράς )

δείγματος, (Ct

γονιδίου-Ct

αναφοράς)

βαθμονομητή. Αστάρι ακολουθίες του JAM-Α ήταν 5′-ΟΤΟ AAG TTG TCC TGT GCC TAC TC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-ACC ΑΟΤ ΤΟΟ CAA GAA GGT CAC C-3′ (αντίστροφο). Αστάρι ακολουθίες της β-ακτίνης ήταν 5’-TGC CTA GAT CAA GAA GCA G-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TGC CTA GAT CAA GAA GCA G-3’ (αντίστροφο). Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν κάτω από τις ίδιες συνθήκες.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Θεραπεία

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) για JAM-Α συντέθηκε από Genepharma (Σαγκάη, Κίνα). Οι αλληλουχίες των siRNA ήταν ως εξής: 5′-GAA GUG AAG GAG AAU UCA ΑΤΤ-3 ‘(νοηματικό)? και 5’-UUG AAU UCU CCU UCA CUU CTT-3 ‘(antisense). Οι αλληλουχίες των μη-στόχευσης siRNA (αρνητικός έλεγχος) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος ήταν ως εξής: 5’-GAA UUC UCC CGU GUC ACG UTT-3 ‘(νοηματικό)? και 5’-ACG UGA CAC Ουυ CGG AGA ΑΤΤ-3 ‘(αντιπληροφοριακό). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 6-φρεατίων 24 ώρες πριν από τα πειράματα διαμολύνσεως. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 pmol JAM-A siRNA ή αρνητικό siRNA μάρτυρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 (5 υΐ /φρεάτιο? Life Technologies Corporation, Grand Island, ΝΥ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά την επιμόλυνση, η πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του JAM-Α αξιολογήθηκαν 48 ώρες αργότερα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν υπό τις ίδιες συνθήκες.

Ανάλυση Western Blot

Η ολική πρωτεΐνη από κύτταρα εκχυλίσθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCI [ρΗ 8,0], 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet Ρ40, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, και φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο [PMSF]? Beyotime, Haimen, Κίνα) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο δικιγχονινικού οξέος (BCA) (Beyotime). Εξήντα μ§ πρωτεΐνης διαχωρίστηκε με SDS-PAGE (10%) και μεταφέρθηκε σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), Μετά από αποκλεισμό με 5% BSA σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris-Tween 20 (TBST? 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, και 0,05% Tween-20), οι μεμβράνες επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: JAM-A (1:1000? Abcam)? και αντι-Ρ-Rb, αντι-P27, αντι-Ρ21, αντι-κυκλίνης Α, αντι-κυκλίνη Β, αντι-κυκλίνης D1, αντι-CDK4, αντι-CDK6, αντι-ΑΚΤ1 /2, και αντι-Ρ-ΑΚΤ Thr 308 (1:1000? Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Μετά την επώαση με υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-ποντικού ή κουνελιού IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) στους 37 ° C για 2 ώρες, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) και ανιχνεύεται με τη χρήση bioimaging Systems (UVP Inc., ορεινές, CA, USA). Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης υπολογίστηκαν με βάση GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν υπό τις ίδιες συνθήκες.

Κυτταρομετρία Ροής Δοκιμασία

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα παγωμένο επώασης (2% BSA σε PBS) και φυγοκεντρήθηκε, στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μι ρυθμιστικού διαλύματος επώασης και επωάστηκαν με ή χωρίς αντι-ανθρώπινο JAM-αντίσωμα συζευγμένο με FITC ποντικού (1:100? Biolegend, San Diego, CA, USA) ή ΡΙΤΟ-συζευγμένο IgG 1 ποντικού , κ αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου (1:100? Biolegend) σε πάγο για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα επώασης και επεξεργάστηκαν για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7.6.1 λογισμικού. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν υπό ταυτόσημες συνθήκες.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Test

Μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ΜΤΤ (Sigma) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, Η1299 και Α549 κύτταρα παροδικά εγκαρσίως με JAM-Α siRNA ή αρνητικού ελέγχου siRNA. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν σε συγκέντρωση 3 χ 10

πλάκες καλλιέργειας 3 κύτταρα /100 μΙ /φρεάτιο σε 96 φρεατίων όλη τη νύκτα. Κάθε επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΙ (5 mg /ml) /φρεάτιο διαλύματος ΜΤΤ κατά την τελευταία 4 ώρες της καλλιέργειας. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με DMSO (150 υΙ /φρεάτιο). Η οπτική πυκνότητα των φρεατίων μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός. Τρία ανεξάρτητα πειράματα με 5 εσωτερικές επαναλήψεις ανά πείραμα διεξήχθησαν υπό τις ίδιες συνθήκες.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με JAM-A ή αρνητικό μάρτυρα siRNA για 48 ώρες, στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 6-φρεατίων (1000 ανά φρεάτιο) και επωάστηκαν για 12 ημέρες. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με Giemsa. Ο αριθμός των αποικιών με & gt? 50 κύτταρα μετρήθηκε. Οι αποικίες μετρήθηκαν με το χέρι χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν υπό ταυτόσημες συνθήκες.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Τα κύτταρα (100.000) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 6 φρεατίων, συγχρονισμένες μετά ασιτία ορού για 24 ώρες, στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με οι αναφερόμενες ποσότητες του siRNA. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, πλύθηκαν με PBS, και χρωματίστηκαν σε 5 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου σε PBS συμπληρωμένο με RNase Α (Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν με τη χρήση συστημάτων BD. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν υπό τις ίδιες συνθήκες

Στατιστική Ανάλυση

SPSS (έκδοση 16.0 για τα Windows? SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις. Η δοκιμή χ-τετράγωνο χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ JAM-Α έκφρασης και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά. Καμπύλες κατά Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση επιβίωσης, και log-rank καθορίστηκε με βάση τις διαφορές. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για την σύγκριση άλλα δεδομένα. P-τιμές βασίζονται σε δύο όψεων στατιστική ανάλυση, και ένα ρ & lt?. 0,05 θεωρήθηκε για να δείξει τη στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

Έκφραση και Διανομής των JAM-Α σε NSCLC ιστοί

Αναλύσαμε την έκφραση και τη διανομή του JAM-Α σε 82 δείγματα NSCLC και τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς με χρήση ανοσοϊστοχημείας. JAM-Α εκφράζεται κυρίως σε κυτταρικές μεμβράνες? υψηλή έκφραση του JAM-Α βρέθηκε στο 37% των δειγμάτων όγκου πνεύμονα (Πίνακας 1), η οποία ήταν πολύ υψηλότερο από το βρογχικό επιθήλιο και πνευμονοκύτταρα σε αντίστοιχη μη ογκογόνους ιστούς των πνευμόνων (Εικ. 1). Ερευνήσαμε την σχέση μεταξύ της έκφρασης μεμβράνης JAM-Α και κλινικοπαθολογική παραμέτρους. Με βάση την μονοπαραγοντική ανάλυση, υψηλή έκφραση μεμβράνης JAM-Α συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο ΤΝΜ (P = 0.021) και μεταστάσεις λεμφαδένα (Ρ = 0.007), αλλά όχι με την ηλικία (Ρ = 0,818), το φύλο (Ρ = 0,96), διαφοροποίησης (Ρ = 0,174), την κατάσταση του όγκου (Ρ = 0,105), και ιστολογία του όγκου (Ρ = 0,818? Πίνακας 1). Αξιολογήσαμε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης μεμβράνης JAM-Α και τη συνολική επιβίωση σε 49 ασθενείς με NSCLC. Μετά την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, βρήκαμε ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του JAM μεμβράνης-Α είχαν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης (μέση επιβίωση = 50 ± 8,92 μήνες? 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI], 32,56 – 67,48 μήνες) από ό, τι οι ασθενείς με χαμηλό έκφραση της μεμβράνης JAM-Α (μέση επιβίωση = 61 ± 4,31 μήνες? 95% CI, 52,56 – 69,45 μήνες, P = 0,02? Εικ. 2).

(Α) Ισχυρή JAM-Α έκφρασης σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (400Χ). (Β) Ασθενής JAM-Α έκφρασης σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (400Χ). (C) Ισχυρή JAM-Α έκφραση σε πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (400Χ). (D) Ασθενής JAM-Α έκφραση σε πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (400Χ). (Ε) Ασθενής χρώση σε φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο σε μη καρκινικά πνευμονικού ιστού (Χ400). (F) αρνητικοί έλεγχοι για JAM-Α χρώση με μη-άνοση IgG αντίσωμα κουνελιού (400Χ).

Η

Οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση του JAM-Α είχε καλύτερη συνολική επιβίωση από ό, τι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του JAM -Α, όπως ορίζεται από τη δοκιμασία log-rank (P = 0,02).

η

JAM-Α κυτταρικού πολλαπλασιασμού εξάντληση Αναστέλλει τον Καρκίνο του πνεύμονα

Διαπιστώσαμε JAM-Α έκφρασης σε φυσιολογικά κύτταρα βρογχικών επιθηλιακών (ΗΒΕ) και έξι πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές με κηλίδα Western και ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Η1299 και Α549 κύτταρα εμφάνισαν υψηλά επίπεδα έκφρασης του JAM-Α, κύτταρα ΗΒΕ εμφάνισαν μέτρια επίπεδα έκφρασης του JAM-Α, και Η157, Η460, SPC, και LK2 παρουσίασαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης του JAM-Α (Σχ. 3Α, Β ). Επειδή JAM-A είναι ένας τύπος Ι διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, μπορούμε στη συνέχεια αναλύθηκαν τα επίπεδα της κυτταρικής μεμβράνης σχετιζόμενη JAM-Α χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας σε σχετικά υψηλές ενδογενείς JAM-A κυτταρικές σειρές (Η1299 και Α549) και σχετικά χαμηλή ενδογενή JAM-A κυτταρικές σειρές (Η460 και Η157). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, η έκφραση των επιφανειακών JAM-Α σε Η1299 και Α549 κύτταρα ήταν πολύ υψηλότερο από Η157 και Η460 κύτταρα. Έτσι, χρησιμοποιείται Η1299 και κύτταρα Α549 σε μελέτες απώλειας λειτουργίας.

JAM-Α έκφραση σε ένα πάνελ ανθρώπινων αεραγωγών που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές αξιολογούνται με κηλίδα Western, Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικά πειράματα Western blots. Τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλήφθηκε 3 φορές με όμοια αποτελέσματα. (Β) σχετική έκφραση του JAM-Α mRNA σε ένα πάνελ ανθρώπινων αεραγωγών που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές αξιολογούνται με πραγματικού χρόνου PCR. Η σχετική ποσότητα του JAM-Α mRNA, κανονικοποιημένη σε β-ακτίνη, συγκρίθηκαν με Η157 κύτταρα με βάση την εξίσωση RQ = 2

-ΔΔCt. Στήλες, σημαίνουν του RQ των τιμών εις τριπλούν σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα? μπαρ, max /min RQ. Τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται 3 φορές και διεξήχθη εις τριπλούν με παρόμοια αποτελέσματα. (Γ) Η επιφανειακή έκφραση του JAM-Α σε ένα πάνελ ανθρώπινων αεραγωγών που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές που αξιολογήθηκε από ένα κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. Συρρέοντα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και κυτταρομετρία ροής αναλύσεις προσδιορισμού διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα (άνω πάνελ), η μέση ένταση φθορισμού των τιμών εις τριπλούν σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα, Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. (Κάτω πίνακας). Τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται 3 φορές εις τριπλούν με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Για να καθοριστεί εάν ή όχι JAM-Α παίρνει μέρος στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα, χρησιμοποιήσαμε siRNA σε νοκ ντάουν JAM-Α έκφρασης σε Η1299 και Α549 κυτταρικές γραμμές. Σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο siRNA-επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές, JAM-Α-ειδικό siRNA αποτελεσματικά κατασταλεί ολικά επίπεδα JAM-Α πρωτεΐνη (Εικ. 4Α), JAM-Α mRNA επίπεδα (Σχ. 4Β), και τα επίπεδα έκφρασης επιφανείας (Εικ. 4C) στις δύο εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. Ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η1299 και Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με JAM-Α-ειδικό siRNA είχε μειωμένους ρυθμούς ανάπτυξης σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο siRNA (Σχ. 5Α). Στη συνέχεια διεξάγεται μια ανεξάρτητη μέθοδο (δοκιμασία σχηματισμού αποικίας) για την επικύρωση του αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του JAM-αναστολή σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα ΜΤΤ, JAM-Α νοκ ντάουν μείωσε αποτελεσματικά την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των 2 δοκιμαστεί καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (αρνητικός μάρτυρας εναντίον του JAM-A siRNA, H1229:231 ± 19 έναντι 55 ± 7, σ & lt? 0,01 ? A549:420 ± 31 έναντι 273 ± 21, p & lt? 0,01?. Σχ. 5Β)

(Α) αναλύσεις Western blot JAM-A απόδοση εξάντληση στα καρκινικά κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western (αριστερό πάνελ). ανάλυση αξίας πυκνομετρία 3 ανεξάρτητα πειράματα στυπώματος Western, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν έναντι GAPDH, Στήλες, μέση? μπαρ, SD, ** p & lt? 0,01 (δεξιά πλευρά). (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις του JAM-Α αποδοτικότητα εξάντληση σε καρκινικά κύτταρα, η σχετική ποσότητα του JAM-Α mRNA, κανονικοποιημένη σε β-ακτίνη, συγκρίθηκαν με το siRNA επιμολυσμένα ομάδα αρνητικού ελέγχου με βάση την εξίσωση RQ = 2

-ΔΔCt. Στήλες, σημαίνουν του RQ σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα? μπαρ, max /min RQ. Τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται 3 φορές εις τριπλούν με παρόμοια αποτελέσματα. (Γ) Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας αναλύσεις των JAM-A απόδοση εξάντληση έκφρασης επιφάνεια. Η1299 και Α549 κύτταρα παροδικά εγκαρσίως με αρνητικό μάρτυρα siRNA ή JAM-A siRNA? μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και κυτταρομετρία ροής αναλύσεις προσδιορισμού διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα (άνω πάνελ), η μέση ένταση φθορισμού των τιμών εις τριπλούν σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα, Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. ** P & lt? 0,01 (κάτω πίνακας). Τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται 3 φορές εις τριπλούν με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

δοκιμασίας (Α) ΜΤΤ διεξήχθη μετά JAM-A θεραπεία siRNA. Παρατηρήθηκε η απορρόφηση στα 490 nm σε διάφορα χρονικά σημεία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD αντιπροσωπευτικών πειραμάτων, * ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01. 3 ανεξάρτητα πειράματα με 5 εσωτερικές επαναλήψεις ανά πείραμα πραγματοποιήθηκαν με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) Εκτίμηση της κλωνογονικού δυνατότητες των JAM-Α-εξαντλημένο καρκινικά κύτταρα. Πλήρης πεδία ανά πλάκα φωτογραφήθηκαν και παρουσιάζονται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως δοκιμασία αντιπροσωπευτικών αποικίας σχηματισμός (αριστερό πάνελ), ο αριθμός των αποικιών των τιμών εις τριπλούν σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα μετρήθηκε, Στήλες, μέση? μπαρ, SD. ** P & lt? 0,01 (δεξιά πλευρά). 3 ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν διεξήχθησαν με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

JAM-ένα νοκ ντάουν αποτελέσματα σε G1 σύλληψης και Ανάπτυξης Αναστολή των κυττάρων του πνεύμονα Καρκίνος

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να διερευνήσει πιθανούς μηχανισμούς σύμφωνα με την οποία JAM -Ένα νοκ ντάουν μπορεί να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αναλύσαμε τον κυτταρικό κύκλο με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS), και έδειξε ότι το ποσοστό των κυττάρων στην G1 φάση αυξήθηκε (Η1299, αρνητικός έλεγχος έναντι JAM-A siRNA, 57,8 ± 2,8 έναντι 68,1 ± 2,5, ρ & lt ? 0,01? Α549 αρνητικός μάρτυρας εναντίον του JAM-A siRNA, 57.12 ± 2.77 έναντι 65.96.1 ± 2,52, p & lt? 0,05? Εικ. 6), ενώ τα κύτταρα στη φάση S μειώθηκαν σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με JAM-ένα νοκ ντάουν σύγκριση για τον έλεγχο των κυττάρων (Η1299, αρνητικός μάρτυρας εναντίον του JAM-A siRNA, 30.49 ± 2,8 έναντι 24,1 ± 2,74, p & lt? 0,05? Α549 αρνητικός μάρτυρας εναντίον του JAM-A siRNA, 29.33 ± 2.61 έναντι 23.49.1 ± 2,49, p & lt ? 0,05? Εικ. 6). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πρόοδος JAM-Α διαγραφή συλλήψεις κυτταρικού κύκλου στην G1 /S όριο. Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός στηρίζεται JAM-εξάντληση σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, ελέγξαμε περαιτέρω την επίδραση του JAM-A knockdown από το επίπεδο της έκφρασης των παραγόντων αρκετών κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται, οι οποίες περιλαμβάνουν κυκλίνη Α, κυκλίνη Β, κυκλίνη D1, CDK4, CDK6, P27, P21, και P-Rb. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι knockdown του JAM-Α μείωσε τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης D1, CDK4, CDK6, και P-Rb (Εικ. 7). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του JAM-Α έκφραση επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 και καταστέλλει την ανάπτυξη των πνευμόνων των καρκινικών κυττάρων.

αποτελεσματικότητα του JAM-A knockdown σε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με φθορισμό ενεργοποιημένων ταξινόμηση κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (αριστερό πάνελ), το ποσοστό των κυττάρων σε διαφορετική φάση του κυτταρικού κύκλου φαίνεται ως η μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, * ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt?. 0.01 (δεξί πάνελ)

Η

(Α) ανάλυση κηλίδας Western από ένα πάνελ πρωτεϊνών διεξήχθη σε siNC- ή-Α-επιμολυσμένα siJAM κυτταρικές σειρές Η1299 (αριστερό πάνελ) και Α549 κυτταρικές γραμμές (δεξί πάνελ). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) ανάλυση πυκνομετρία 3 ανεξάρτητα πειράματα στυπώματος Western, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν έναντι GAPDH, Στήλες, μέση? μπαρ, SD, * ρ & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

PI3K-Akt-β-κατενίνης Σήμα Cascade δεν αναστέλλεται από υψηλά επίπεδα έκφρασης της επιφάνειας JAM-Α σε καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα

Οι δημοσιευμένες μελέτες δείχνουν ότι JAM-Α περιορίζει εντερικών επιθηλιακών κυττάρων (IEC) πολλαπλασιασμός μέσω αναστολής της ενεργοποίησης ΡΙ3Κ-Akt-β-κατενίνης σήμα καταρράκτη [27]. Για να διερευνήσουν κατά πόσον ή όχι αυτό το σηματοδοτικό μονοπάτι είναι επίσης αποτελεσματικό σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, ελέγξαμε επίσης τις συνολικές και φωσφορυλιωμένη επίπεδα της Akt σε JAM A μελέτες απώλειας λειτουργίας. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι knockdown του JAM-Α δεν άλλαξε τα ενεργά επίπεδα της Akt, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα υψηλά επίπεδα JAM-Α σε Η1299 και Α549 κύτταρα δεν επηρέασε την ενεργοποίηση ΡΙ3Κ-Akt-β-κατενίνης καταρράκτη (Σχ. 7).

Συζήτηση

JAM-Α εκφράζεται σε διάφορα είδη όγκων και εμπλέκεται στην εξέλιξη του όγκου. Η έκφραση του JAM-Α πρωτεΐνης σε ιστούς NSCLC και τη σχέση με διάφορους παράγοντες κλινικοπαθολογική δεν έχει εξεταστεί πλήρως. Επιπλέον, ο ακριβής ρόλος του JAM-A στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα είναι ασαφής. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε το πρότυπο της έκφρασης και τη βιολογική λειτουργία του JAM-Α σε NSCLC. Δείξαμε ότι JAM-Α εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες των κυττάρων, και η έκφραση του JAM-Α σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα είναι υψηλότερη από τις αντίστοιχες φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. Το υψηλό επίπεδο έκφρασης του μεμβράνης JAM-Α συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο προηγμένη pTNM, μεταστάσεις λεμφαδένα, και μειωμένη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας αποκάλυψε ότι JAM-Α είναι μια πιθανή ογκογόνο πρωτεΐνη στον NSCLC και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως αρνητικός προγνωστικός δείκτης επιβίωσης σε ασθενείς με NSCLC.

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις δυνατότητες λειτουργίας του JAM-Α σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα , χρησιμοποιήσαμε siRNA για knockdown JAM-A έκφραση σε Η1299 και Α549 κυτταρικές γραμμές, οι οποίες εκφράζουν σχετικά υψηλά επίπεδα επιφανειακής JAM-A. σχηματισμός πολλαπλασιασμός και αποικιών στις δύο κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά κατέστειλε μετά την φίμωση JAM-A. Οι περισσότεροι από τους πολλαπλασιαστικών παραγόντων επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων, επηρεάζοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, έτσι αναλύσαμε τον κυτταρικό κύκλο και απέδειξαν ότι JAM-Α knockdown κυττάρων είχαν υψηλότερα επίπεδα G1 φάση και κάτω φάση S από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου. Έτσι, JAM-Α σίγηση ανέστειλε την μετάβαση G1-to-S σε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, που θα μπορούσαν να διαλευκανθεί ο μηχανισμός του JAM-Α επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα. Για τον προσδιορισμό του δυναμικού μηχανισμού του JAM-A στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, εξετάσαμε την επίδραση της JAM-ένα νοκ ντάουν στα μόρια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο. Αναλύσαμε την έκφραση της κυκλίνης Α, κυκλίνη Β, κυκλίνη D1, CDK4, CDK6, Ρ21, Ρ27, και Ρ-RB, και βρήκαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης D1, CDK4, CDK6, και Ρ-RB μειώθηκαν μετά JAM -Ένα νοκ ντάουν. Έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι η Ρ-RB είναι υπεύθυνη για ένα σημαντικό σημείο ελέγχου G1, μπλοκάροντας την είσοδο S-φάση και την ανάπτυξη των κυττάρων από σωματικά συσχετίζοντας με E2F παράγοντες και αποκλεισμό της ενεργοποίησης της έκφρασης του γονιδίου που κωδικοποιεί προϊόντα που είναι αναγκαία για την εξέλιξη του S-φάσης. Το συγκρότημα αποτελείται από πρωτεΐνη κυκλίνης D1, CDK4, CDK6 και θα φωσφορυλιώνουν Ρ-RB και την προώθηση της P-RB αδρανοποίησης. Συνεχίζεται φωσφορυλίωση επί P-RB με διάφορες CDKs οδηγεί στην απελευθέρωση του E2F, διευκολύνοντας έτσι την ενεργοποίηση γονιδίων κρίσιμων για την εξέλιξη S-φάσης [28], [29], [30]. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι JAM-Α ελέγχει θετικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC ρυθμίζοντας την έκφραση των μορίων συνδέονται με τον κύκλο κυττάρου, όπως κυκλίνη D1, CDK4, CDK6, και P-RB.

Δημοσιευμένες μελέτες υποδεικνύουν ότι JAM-Α περιορίζει τον πολλαπλασιασμό IEC μέσω αναστολής της ενεργοποίησης ΡΙ3Κ-Akt-β-κατενίνης [27]. Για να διερευνηθεί κατά πόσον υψηλά επίπεδα επιφανειακής JAM-Α από τις δύο εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές ή όχι επηρεάζει αρνητικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά τον ίδιο τρόπο όπως το IEC, ελέγξαμε επίσης τα ενεργά επίπεδα του Akt (φωσφορυλίωση) in-JAM Α μελέτες απώλειας λειτουργίας . Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι knockdown του JAM-Α σε Η1299 και κύτταρα Α549 δεν άλλαξε τα ενεργά επίπεδα της Akt, η οποία δείχνει ότι τα υψηλά επίπεδα του JAM-Α σε Η1299 και Α549 κύτταρα δεν επηρέασε καταρράκτη σήματος ΡΙ3Κ-Akt-β-κατενίνης ενεργοποίησης.

Ο ρόλος των JAM-α στην ανάπτυξη και διάδοση του όγκου παραμένει ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα. Naik et al. [18] ανέφεραν ότι αρχικά JAM-Α έκφραση συνδέεται αρνητικά με την επιθετικότητα του καρκίνου του μαστού και της μετάστασης σε 12 όγκους και το αντίστοιχο μη-νεοπλασματικό ιστό, καθώς και 50 και κακοήθεις αντίστοιχα δείγματα κόμβος μεταστατικό λέμφου. Ωστόσο, Mc Sherry et al. [21], χρησιμοποιώντας μεγαλύτερα σύνολα κλινικά δεδομένα (μια 270 μικροσυστοιχιών ασθενή διηθητικού καρκίνου του μαστού ιστό [TMA] και ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων των πληροφοριών γονιδιακής έκφρασης από 295 ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του μαστού), έδειξαν θετική συσχέτιση μεταξύ JAM-Α έκφρασης και της εισβολής πρόγνωση του καρκίνου του μαστού, η οποία επιβεβαιώθηκε και από μια άλλη έκθεση που δημοσιεύθηκε τους, χρησιμοποιώντας ένα μεγαλύτερο σύνολο δεδομένων [24]. Πρόσφατα, Murakami et al. [22], χρησιμοποιώντας TMA των 444 ασθενών με διηθητικό καρκίνο του μαστού, ανέφερε επίσης μια παρόμοια συσχέτιση. Στο πλαίσιο του διηθητικού καρκίνου του μαστού, λαμβάνοντας υπόψη το μεγαλύτερο σύνολο δεδομένων, τη συσχέτιση μεταξύ κλινικοπαθολογική δεδομένα και δεδομένα επιβίωσης αναλύθηκαν με McSherry et al. [21], [24] και Murakami et al. [22], υψηλής JAM-Α έκφραση θα πρέπει να είναι ένας αρνητικός προγνωστικός παράγοντας της έκβασης των ασθενών. Ο μηχανισμός μέσω του οποίου τα κύτταρα όγκου διατηρούν υψηλά JAM-Α κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου παραμένει να καθοριστεί. Gotte et al. [25] έδειξε ότι miR-145, το οποίο στόχους και ρυθμίζει προς τα κάτω JAM-A, ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα καρκίνου του μαστού. Αυτά τα δεδομένα μπορεί να εξηγεί τα υψηλά επίπεδα του JAM-Α στο συγκεκριμένο τύπο του όγκου [22]. Ωστόσο, έστω και miR-145 παίζει τον ίδιο ρόλο στην NSCLC στον καρκίνο του μαστού χρειάζονται περαιτέρω έρευνα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα αρνητικά, αλλά όχι θετικά αποτελέσματα του JAM-Α επί της προόδου όγκου αναφέρθηκαν επίσης βασίζονται σε σειρές κλινικών δεδομένων που συνεπάγονται ενδομητρικό καρκίνωμα [19] και τον καρκίνο του παγκρέατος [20], υποδηλώνοντας ότι ο ρόλος του JAM-Α στην πρόοδο του όγκου μπορεί να είναι τύπου που εξαρτάται από κύτταρο. Δημοσιευμένα στοιχεία έχουν επίκεντρο τους μηχανισμούς για την εξέλιξη του όγκου JAM-Α ρύθμισης, ακόμη και αν αμφιλεγόμενο, θα αποσαφηνίσει καλύτερα το θέμα αυτό. Θετική [21], [22], [23], [24], [25], [26] και τα αρνητικά [18], [19] έχουν συνέπειες των JAM-Α για την εξέλιξη του όγκου έχουν αναφερθεί

in vivo

,

in vitro,

ή χρησιμοποιώντας ένα γενετικό μοντέλο μαστικού όγκου.