PLoS One: TRAPPC4-ERK2 Αλληλεπίδραση Ενεργοποιεί ERK1 /2, Διαμορφώνει πυρηνικό εντοπισμό του και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου

Νοέμβριος 22nd, 2011 elhealth του καρκίνου άρθρα

Αφηρημένο

Το συγκρότημα σωματίδιο πρωτεΐνη διακίνησης 4 (TRAPPC4) εμπλέκεται στην κυστιδίων μεταφοράς, αλλά και τη σύνδεσή της με τη νόσο σπάνια έχει αναφερθεί. Ερευνήσαμε πιθανή αλληλεπίδραση της με ERK2, μέρος του /2 συμπλόκου ERK1 στο εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενης Kinase /Μιτογόνο-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (ERK-ΜΑΡΚ), με μία δύο-υβριδίων ζυμομύκητα οθόνη και επιβεβαιώθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση (Co -IP) και της γλουταθειόνης S-τρανσφεράσης (GST) pull-down. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι όταν TRAPPC4 είχε εξαντληθεί, ενεργοποιημένα ERK1 /2 μειώθηκε ειδικά στον πυρήνα, η οποία συνοδεύθηκε με καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Η υπερέκφραση του TRAPPC4 προωθείται η βιωσιμότητα των κυττάρων και προκάλεσε ενεργοποιηθεί ERK1 /2 για να αυξηθεί συνολικά, αλλά κυρίως στον πυρήνα. TRAPPC4 εκφράστηκε πιό ιδιαίτερα στον πυρήνα των κυττάρων CRC ό, τι στην κανονική επιθήλιο του κόλου ή αδένωμα που αντιστοιχούσε με πυρηνική χρώση των pERK1 /2. Έχουμε αποδείξει ότι εδώ TRAPPC4 μπορεί να ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση σε CRC μέσω αλληλεπίδρασης με ΕΚΚ2 και ακολούθως φωσφορυλίωσης ERK1 /2, καθώς και τη ρύθμιση της υποκυτταρική τοποθεσία του pERK1 /2 για την ενεργοποίηση της σχετικής μονοπάτι σηματοδότησης

Παράθεση:. Zhao SL, Χονγκ J, Xie ZQ, Tang JT, Su WY, Du W, et al. (2011) TRAPPC4-ERK2 Αλληλεπίδραση Ενεργοποιεί ERK1 /2, Διαμορφώνει πυρηνικό εντοπισμό του και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (8): e23262. doi: 10.1371 /journal.pone.0023262

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 12, 2011? Αποδεκτές: 10 του Ιούλη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Προγράμματος Key (Νο 30830055) με J-YF (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm) και από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα Προγράμματος Νέα Γενιά σε S-LZ (Νο 31000634) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Σαγκάη της Επιτροπής για την Επιστήμη και την Τεχνολογία στην S-LZ (Νο 10ZR1419000) (http : //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm), Σαγκάη Γραφείο Υγείας για τη νεολαία σε S-LZ (Νο 2009032) (https://wsj.sh.gov.cn/website/), Σανγκάη Jiao Tong-Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου του Ιδρύματος για την Επιστήμη και την Τεχνολογία στην S-LZ (09XJ21065) (https://www.shsmu.edu.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

TRAPPC4, το ανθρώπινο ορθόλογο του Trs23p ζύμης, επίσης γνωστή ως synbindin, είναι γενικά γνωστό ως νευρωνική κυτταροπλασματική πρωτεΐνη αρχικά προσδιορίζονται από δύο υβριδίων ζύμης διαλογή με τη χρήση του syndecan-2 (που ανήκει στην οικογένεια των κυτταρικής επιφάνειας πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης που ρυθμίζει τη συμπεριφορά των κυττάρων μέσω οδών μεταγωγής σήματος [1], [2], [3]) κυτταροπλασματική περιοχή σαν δόλωμα [4]. Θεωρείται ένα φυσιολογικό συνδέτη του syndecan-2 σε δενδριτικά σπονδυλικές στήλες που εμπλέκεται στην syndecan 2-σχηματισμός της σπονδυλικής στήλης που προκαλείται από την πρόσληψη ενδοκυτταρικά κυστίδια προς μετα-συναπτικές θέσεις σε νευρώνες ιππόκαμπου αρουραίου. TRAPPC4 έχει ανιχνευθεί σε αιμοποιητικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα CD34 + (HSPCs) και ως εκ τούτου είναι επίσης γνωστή ως HSPC172.

TRAPPC4 ως μέλος του σωματιδίου πρωτεΐνης διακίνησης (TRAPP) της οικογένειας των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυστιδίων μεταφοράς , μια διαδικασία που επιτελείται από σχεδόν κάθε κύτταρο και απαιτείται για τη σωστή στόχευση και την έκκριση των πρωτεϊνών. Επί του παρόντος, υπάρχουν 10 γνωστές υπομονάδες TRAPP μαγιά (Bet5p, 3ρ, Trs20p, 23ρ, 31Ρ, 33Ρ, 65 λεπτά, 85ιστ, 120p, 130), και ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχουν ορθόλογα για οκτώ από αυτά (TRAPPC1~5,6a, 6β, 8,9) [5]. Από κοινού, αποτελούν δύο τύποι συμπλοκών mutisubunit: TRAPP Ι και ΙΙ TRAPP. Στη ζύμη, αυτά τα σύμπλοκα λειτουργία σε ένα αριθμό διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης ενδοπλασματικό δίκτυο-to-Golgi μεταφοράς (TRAPP Ι) και ενός απροσδιορίστου βήμα στο trans δίκτυο Golgi (TRAPP II) [6], [7], [8] . Μελέτες σε φυσιολογικά κύτταρα νεφρού αρουραίου (NRK) και κύτταρα HeLa έδειξε επίσης ότι το σύμπλοκο TRAPP παίζει ένα ρόλο κατά τη διάρκεια της ER-Golgi μεταφορών [9], [10]. Ο τομέας PDZL σε TRAPPC4 είναι ένα από τα πιο μοναδικά χαρακτηριστικά του συγκροτήματος σπονδυλωτό σε σύγκριση με TRAPP ζύμη I. Δυσλειτουργία του TRAPP υπομονάδες έχουν ενοχοποιηθεί σε ανθρώπινες ασθένειες. Μεταλλάξεις σε TRAPPC1 (MUM-2) έχουν αναφερθεί να έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση των αντιγονικών πεπτιδίων σε μελάνωμα [11], και μεταλλάξεις σε TRAPPC2 (sedlin) έχουν συνδεθεί με σπονδυλοεπιφυσική tarda δυσπλασία (SEDT) [12]. Ωστόσο, ο ρόλος του στην ασθένεια TRAPPC4 σπάνια έχει μελετηθεί.

καρκίνος του παχέος (CRC) είναι μία σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας σε ολόκληρο τον κόσμο [13]. Παχέος καρκινογένεση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει την προοδευτική διάσπαση του εντερικού μηχανισμών πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων, απόπτωση, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση [14]. Το εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενης Kinase /Μιτογόνο-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (ERK-ΜΑΡΚ) είναι μία από τις πιο σημαντικές οδούς μεταγωγής σήματος για την κυτταρική φυσιολογία, και αρκετές βασικές αυξητικούς παράγοντες και πρωτο-ογκογονίδια προάγουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση μέσω αυτής της αλληλουχίας [15] . Κατά την ενεργοποίηση, το σύμπλοκο ERK1 /2 μεταναστεύει στον πυρήνα όπου φωσφορυλιώνει διάφορους παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν τα γονίδια για την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ρυθμίζουν την κυτταρική απόπτωση [16]. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί ενεργοποίησης και πυρηνική μετατόπιση των ERK1 /2 δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί.

Στην παρούσα μελέτη, ένα δύο-υβριδίων ζυμομύκητα οθόνης έγινε για τον εντοπισμό ERK1 και πρωτεΐνες δέσμευσης ERK2. TRAPPC4 βρέθηκε να συνδέεται με ΕΚΚ2. Επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση και την περαιτέρω διερευνηθεί ο ρόλος της TRAPPC4-ERK2 αλληλεπίδρασης σε CRC.

Αποτελέσματα

TRAPPC4 αναγνωρίστηκε ως παράγοντας ERK2-αλληλεπιδρούν με δύο-υβριδίων

η φωσφορυλίωση και την πυρηνική είσοδο του ERK1 /2 είναι κρίσιμη για την ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK-ΜΑΡΚ. Για τον προσδιορισμό των παραγόντων που σχετίζονται με τη διαδικασία, μια δύο-υβριδίων ζυμομύκητα οθόνη διεξήχθη με ERK1 και ERK2 ως δολώματα (πλήρους μήκους), σε συνδυασμό με μια ανθρώπινη βιβλιοθήκη HeLa ΜΑΤΟΗΜΑΚΕΚ cDNA. Από τις αποικίες που αναπτύσσονται σε-His Leu-Trp πλάκες που υποβλήθηκαν σε διαλογή, 57/61 ήταν θετικά για ΕΚΚ2 και 12/32 για ERK1 σε μία δοκιμασία β-γαλακτοσιδάσης. Πλασμίδια από αυτές τις θετικές αποικίες εκχυλίζονται, ενισχύθηκε σε βακτήρια και συν-μετασχηματίστηκε πάλι σε ζύμη μαζί με τα πλασμίδια δόλωμα για περαιτέρω δοκιμές με δοκιμασία β-γαλακτοσιδάσης. Έντεκα κλώνοι επιβεβαιώθηκε ότι έχουν μια θετική αλληλεπίδραση με ERK2 και δώδεκα με ERK1. Μεταξύ αυτών των πλασμιδίων που ήταν θετικοί για επιτυχίες ΕΚΚ2 και ERK1, TRAPPC4 ταυτοποιήθηκε σε πέντε και έξι από τις αλληλουχίες, αντίστοιχα, μετά από προσδιορισμό της αλληλουχίας. Αυτή ήταν η πρώτη φορά που εντοπίστηκε TRAPPC4 ως πιθανή πρωτεΐνη σύγκρουση των ERK2.

Επικύρωση της αλληλεπίδρασης TRAPPC4-ERK2

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση μεταξύ TRAPPC4 και ERK2, συνανοσοκαθίζησης και πειράματα pull-down GST διεξήχθησαν. Για συν-ανοσοκαταβύθιση, πλήρους μήκους TRAPPC4 cDNA ελήφθη και κλωνοποιήθηκε σε pCDEF-myc, ενώ η αλληλουχία ERK2 κλωνοποιήθηκε σε pCDEF-Flag. Τα προκύπτοντα pCDEF-Μγο-TRAPPC4 και pCDEF-Flag-ΕΚΚ2 φορείς επικυρώθηκαν με αλληλούχιση και συν-διαμολύνθηκε στην κυτταρική γραμμή 293Τ. Η ανάλυση στυπώματος Western (Εικ. 1Α) έδειξε ότι τα πλασμίδια θα μπορούσαν εκφράζουν σημαντικά επίπεδα των πρωτεϊνών. Μετά τη χρήση ενός αντισώματος αντι-Μγο για συν-ανοσοκαταβύθιση, τόσο το συγκρότημα και ERK2 σημαία band TRAPPC4-myc ανιχνεύθηκαν από τους συν-επιμολυσμένα κύτταρα pCDEF-Μγο-TRAPPC4 και pCDEF-Flag-ERK2, υποδεικνύοντας ότι υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ TRAPPC4 και ERK2. Στο θετικό δείγμα ελέγχου με συν-επιμολυσμένα pCDEF-Μγο-p16 και φορείς pCDEF-Flag-TSSK1, τόσο η ζώνη p16-Μγο band και TsSK-σημαία ανιχνεύθηκαν, υποδεικνύοντας ότι οι πρωτεΐνες θα μπορούσαν να συν-ανοσοκαταβυθίζεται με πρωτόκολλο μας βασίζεται στην η γνωστή αλληλεπίδραση μεταξύ p16 και TSSK1. Μόνο η ζώνη TRAPPC4-myc ανιχνεύθηκε όταν pCDEF-Μγο-TRAPPC4 συν-επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα σημαία, ενώ δεν ζώνη ανιχνεύθηκε όταν pCDEF-Flag-ΕΚΚ2 συν-επιμολυσμένα με κενό φορέα Myc, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν ανωτέρω είναι συγκεκριμένες και δεν διαμεσολαβείται από τις ετικέτες πρωτεΐνης

Α:. Συν-ανοσοκαταβύθιση TRAPPC4 και ERK2. Κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν με κενό φορέα pcDNA ή φορέα pcDNA να εκφράσουν Flag ετικέτα ERK2 (42 kD), ή Myc ετικέτα TRAPPC4 (26 kD). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με αντι-Flag-HRP αντίσωμα ή αντι-Μγο-HRP αντισώματος. Η παρουσία της ERK2-Flag και TRAPPC4-Myc σε εκχυλίσματα κυττάρων πριν από την ανοσοκατακρήμνιση ελέγχθηκε με τη χρήση αντι-Flag και αντισώματα αντι-Myc (Input). Η συν-επιμόλυνση των φορέων έκφρασης για ρ16-Myc και TSSK1-Flag χρησιμοποιήθηκε για το θετικό μάρτυρα (διαδρομή 1). Β: Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα των πειραμάτων επικύρωσης GST pull-down. (Α) ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των GST και GST-ERK2 πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται ως αρνητικός έλεγχος (λωρίδα 2) και δόλωμα (Λωρίδα 3) για τη δοκιμασία αναπτυσσόμενο. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-6 × αντίσωμα του μετά SDS-PAGE και μεταφορά μεμβράνης. Λωρίδα 1 έδειξε το μάρτυρα χωρίς GST ή GST-ERK2. (Β) ERK2 εκφράζεται ως πρωτεΐνη σύντηξης GST από βακτήρια συνδέθηκε σε σφαιρίδια και επωάστηκαν με TRAPPC4 εκφράζεται ως 6 × πρωτεΐνη σύντηξης His-TRAPPC4 για ένα κυλιόμενο πείραμα. GST-ERK2 πρωτεΐνης (διαδρομή 1), πρωτείνη GST (Λωρίδα 2) και πρωτεΐνη TRAPPC4 (lane4) ανιχνεύθηκαν με χρώση Coomassie. Λωρίδα 3 έδειξε τον δείκτη.

Καθώς είναι πιθανό ότι η TRAPPC4 και αλληλεπίδραση ERK2 μπορεί να είναι έμμεση, γιατί άλλοι παράγοντες πρωτεΐνης στο εκχύλισμα πλήρους κυττάρου μπορεί να εμπλέκεται στη μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης, π.χ. ενεργώντας ως παράγοντες «γεφύρωσης», έχουμε την επόμενη εξέτασε μια πιθανή άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας GST προσδιορισμοί pull-down. TRAPPC4 τραβήχθηκε κάτω με GST-ERK2 πρωτεϊνών σύντηξης (Εικ. 1Β, λωρίδα c), αλλά όχι με GST μόνο (Σχ. 1Β, λωρίδα b), υποδεικνύοντας ότι TRAPPC4 και ERK2 συγκεκριμένα και άμεσα αλληλεπίδρασε

in vitro

TRAPPC4 ρυθμίζει /2 φωσφορυλίωση ERK1 στην SW1116 κυτταρική σειρά

η φωσφορυλίωση των ERK1 /2 είναι ένα κρίσιμο βήμα στο μονοπάτι σηματοδότησης ERK. Τώρα που είχαμε δείξει ότι TRAPPC4 αλληλεπιδράσει με ERK2, είμαστε δίπλα εξέτασε τη σχετική συμβολή των TRAPPC4 στον /2 φωσφορυλίωση ERK1. Μετά τη μείωση του επιπέδου έκφρασης TRAPPC4 σε κύτταρα SW1116 με RNAi ή υπερεκφράζουν το με επιμόλυνση ενός πλασμιδίου που κωδικοποιεί το γονίδιο πλήρους μήκους, προσδιορίσαμε την αλλαγή στα επίπεδα pERK με κηλίδωση Western. Ανίχνευση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα πρωτεΐνης του συνολικού ERK1 /2 σε όλες τις ομάδες (Εικ. 2), το επίπεδο φωσφορυλίωση των ERK1 /2 ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά siRNA μεσολάβηση εξάντληση του TRAPPC4 (Εικ. 2Α) και επάνω -regulated μετά υπερέκφραση του (Εικ. 2Β). Επιπλέον, αντιμετωπίζονται δύο ομάδες κυττάρων με παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια ανάπτυξης (PDGF), ένας από τους ενεργοποιητές του μονοπατιού ERK-ΜΑΡΚ, και διαπιστώθηκε ότι το επίπεδο της φωσφορυλίωσης ERK1 /2 μετά τη θεραπεία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων, παρά τις διαφορές τους στα επίπεδα TRAPPC4 (Σχ. 2).

τα κύτταρα λύθηκαν, και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι φωσφο-ERK1 /2 (pERK1 /2), ή ERK1 /2, ή TRAPPC4. Η πυκνότητα των ζωνών στυπώματος Western κανονικοποιήθηκαν προς την ποσότητα του GAPDH πρωτεΐνης. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών επαναλήψεων πειραμάτων. *,

& lt? 0,05. A. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) προς knockdown έκφραση TRAPPC4 ή με negtive ελέγχου siRNA (siControl) ως έλεγχος? Επίσης τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PDGF να ενεργοποιήσει ERK-ΜΑΡΚ μονοπάτι, ή με διαλύτη του (PBS + 0,1 BSA) ως έλεγχος. Β κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον φορέα pCDEF-myc-TRAPPC4 να υπερεκφράζουν πρωτεΐνη TRAPPC4 ή με pCDEF-myc φορέα όπως έλεγχος? Επίσης τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PDGF να ενεργοποιήσει ERK-ΜΑΡΚ μονοπάτι, ή με διαλύτη (PBS + 0,1 BSA) ως έλεγχος.

TRAPPC4 ρυθμίζει τη χωρική κατανομή των φωσφορυλιωμένων ERK1 /2

από τη στιγμή που είχαν δείξει ότι TRAPPC4 θα μπορούσε να επηρεάσει την κατάσταση ενεργοποίησης των ERK1 /2, θελήσαμε να καθοριστούν οι επιπτώσεις της στην υποκυτταρικό εντοπισμό των pERK1 /2. Στη συνέχεια, σε σύγκριση pERK1 /2 και ERK1 /2 έκφραση στο διαχωρισμένο κυτταροπλασματική και πυρηνική κλάσματα όταν TRAPPC4 εξαντλήθηκε ή υπερεκφράζεται όπως περιγράφεται παραπάνω. Πάλι, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κυτταροπλασματική εισόδου πρωτεΐνη, και ΤΒΡ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την είσοδο πυρηνική πρωτεΐνη.

με κηλίδωση Western, βρήκαμε ότι μετά τη θεραπεία TRAPPC4 siRNA, το επίπεδο των pERK1 /2 μειώθηκαν σημαντικά στον πυρήνα (Εικ. 3Α). Εν τω μεταξύ, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην pERK1 /2 βρέθηκε στο κυτόπλασμα όταν ποσοτικοποιηθεί, αν και ελαφρά αύξηση προτάθηκε οπτικά (Σχ. 3Β). Από την άλλη πλευρά, όταν TRAPPC4 υπερεκφράστηκε, έκφραση pERK1 /2 ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά στον πυρήνα (Σχ. 4Α). Ενώ στο κυτταρόπλασμα, τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια μικρή οπτική αύξηση χωρίς σημαντικές διαφορές όταν ποσοτικοποιούνται (Εικ. 4Β).

κύτταρα SW1116 επιμολύνθηκαν με TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) προς knockdown έκφραση TRAPPC4 ή με negtive ελέγχου siRNA (siControl ) ως έλεγχος? Επίσης τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PDGF να ενεργοποιήσει ERK-ΜΑΡΚ μονοπάτι, ή με διαλύτη του (PBS + 0,1% BSA) ως έλεγχος. Κυτταρόπλασμα και πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται σε πειραματικές διαδικασίες, και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι φωσφο-ERK1 /2 (pERK1 /2), ή ERK1 /2, ή TRAPPC4. Η πυκνότητα των ζωνών στυπώματος Western κανονικοποιήθηκαν προς την ποσότητα του GAPDH πρωτεΐνης για την πρωτεΐνη κυτταρόπλασμα ή ΤΒΡ για πυρηνική πρωτεΐνη. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών επαναλήψεων πειραμάτων. *,

& lt?. 0.05

κύτταρα SW1116 είχαν επιμολυνθεί με φορέα pCDEF-myc-TRAPPC4 να υπερεκφράζουν πρωτεΐνη TRAPPC4 ή με pCDEF-myc φορέα ως έλεγχο? Επίσης τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PDGF να ενεργοποιήσει ERK-ΜΑΡΚ μονοπάτι, ή με διαλύτη του (PBS + 0,1% BSA) ως έλεγχος. Πυρηνική (Α) και κυτταρόπλασμα (Β) εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται σε πειραματικές διαδικασίες, και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι φωσφο-ERK1 /2 (pERK1 /2), ή ERK1 /2, ή TRAPPC4 . Η πυκνότητα των ζωνών στυπώματος Western κανονικοποιήθηκαν με το ποσό της ΤΒΡ για την πυρηνική πρωτεΐνη ή πρωτεΐνη GAPDH για πρωτεΐνη κυτταρόπλασμα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών επαναλήψεων πειραμάτων. *,

& lt?. 0.05

PDGF μπορεί να ενεργοποιήσει το μονοπάτι ERK-ΜΑΡΚ μέσω υποδοχέων κινασών τυροσίνης [17]. Όταν η SW1116 κυτταρική γραμμή διεγείρονται με PDGF, μια μικρή μείωση της pERK1 /2 παρατηρήθηκε οπτικά στο πυρηνικό κλάσμα μετά TRAPPC4 knock-κάτω, αλλά δεν ήταν σημαντική κατά την ποσοτικοποίηση. Εν τω μεταξύ, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή στην pERK1 /2 ποσοτικοποιήθηκε στην κυτταροπλασματική κλάσμα, μολονότι ελαφρά αύξηση προτάθηκε οπτικά (Εικ. 3). Ωστόσο, PDGF διέγερση των κυττάρων που υπερεκφράζουν TRAPPC4 οδήγησε σε σημαντική pERK1 /2 προς τα πάνω ρύθμιση στον πυρήνα, αλλά όχι στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 4).

TRAPPC4 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την εξάντληση των TRAPPC4 επάγει απόπτωση στην κυτταρική σειρά SW1116

Η ενεργοποίηση των κινασών ERK-MAP έχει συνδεθεί με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [16]. Για την περαιτέρω μελέτη της λειτουργίας των TRAPPC4 σε κύτταρα CRC, συγκρίναμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των κυττάρων SW1116 όταν η έκφραση TRAPPC4 μειώθηκε κατά siRNA ή υπερεκφράζεται με πλήρους μήκους γονίδιο TRAPPC4 επιμόλυνση με εκείνη του mock ελέγχου. Αποτελέσματα του Κυττάρου Μετρώντας Kit (CCK) -8 δοκιμασία αποκάλυψε μια σημαντική αναστολή της ανάπτυξης μετά την εξάντληση TRAPPC4 και την αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων όταν TRAPPC4 υπερεκφράστηκε τόσο ξεκινώντας από 24 ώρες μετά την διαμόλυνση (Εικ. 5Α).

Α: CCK-8 δοκιμασίας. κύτταρα SW1116 σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων μέχρι υποσυρρέοντα. Τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν με CCK-8 δοκιμασίας. Τρεις ανεξάρτητες φορά διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA TRAPPC4 να knockdown έκφραση TRAPPC4 ή με negtive ελέγχου siRNA που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (α), καθώς και με φορέα tranfered pCDEF-myc-TRAPPC4 να υπερεκφράζουν TRAPPC4 πρωτεΐνη ή με pCDEF-myc φορέα ως μάρτυρα (β). *,

& lt? 0,05. Β: Ανάλυση απόπτωση. Αφού τα κύτταρα SW1116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA TRAPPC4 ή negtive ελέγχου siRNA που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για 48 ώρες. Η απόπτωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία V Annexin με ιωδιούχο προπίδιο αντιχρωματισμός επιτρέποντας την ποσοτικοποίηση με κυτταρομετρία ροής. Τρεις ανεξάρτητες φορά διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± τυπική απόκλιση (SD). Υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (

& lt? 0,01)

συσσώρευση TRAPPC4 στον πυρήνα συνδέεται με χρώση pERK1 /2 σε ανθρώπινο ορθοκολικούς καρκίνους

όπως λίγα ήταν γνωστά για την έκφραση και εντοπισμός του TRAPPC4 σε ορθοκολικό καρκίνο

in vivo

, μπορούμε στη συνέχεια συγκρίνονται έκφραση του σε φυσιολογικό επιθήλιο του κόλου, αδενώματος και αδενοκαρκινώματος ιστούς με ανοσοϊστοχημεία, όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Σε κανονική επιθήλιο του κόλου χρώση TRAPPC4 περιορίστηκε στο κυτόπλασμα (Εικ. 6Α). 4,55% των κυττάρων στα δείγματα αδένωμα έδειξαν πυρηνική χρώση, ενώ ήταν 55,89% στα δείγματα adencarcinoma (

& lt? 0,01). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές παρουσιάστηκαν συνολικά έκφραση TRAPPC4 μεταξύ των τριών ομάδων (κανονική του παχέος εντέρου ομάδα επιθήλιο = 85,7%? Ομάδα αδενώματος = 72,7%? Ομάδας αδενοκαρκίνωμα = 79,4%?

& gt? 0,05).. (Tab 1 )

(α), pERK1 /2 (β) και ERK1 /2 (C) σε κανονική κολονικό επιθήλιο (α), αδένωμα (β), και το αδενοκαρκίνωμα (γ). Polygrams (d) δείχνουν έκφραση των πρωτεϊνών σε κυτταρόπλασμα (ροζ), πυρήνα (κίτρινο), και το σύνολο των (μπλε). Α: Έκφραση TRAPPC4 δεν έχει καμία σημαντική διαφορά στις τρεις ομάδες εντελώς, αλλά αυξάνει σε πυρήνα από Α έως Γ. Β: pERK1 /2 εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα, και το επίπεδο του αυξάνεται σημαντικά από το Α έως Γ. C: Έκφραση ERK1 /2 δεν έχει σημαντική διαφορά στις τρεις ομάδες τελείως, αλλά οι αυξήσεις στον πυρήνα από Α έως Γ. Αρχική μεγέθυνση × 200.

Επίσης, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ TRAPPC4 και pERK1 /2 ή χρώση ERK1 /2 στο κανονικό επιθήλιο του κόλου, αδένωμα και το αδενοκαρκίνωμα. Ενώ χρώση ERK1 /2 ανιχνεύθηκε τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Εικ. 6C), η χρώση του στον πυρήνα αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα αδενοκαρκίνωμα σε σύγκριση με τις άλλες δύο ομάδες. Επιπλέον, οι pERK1 /2 ενεργοποιημένα πρωτεΐνες όλα βρίσκονται στον πυρήνα, και υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων (Εικ. 6Β). Έτσι, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πυρηνικών TRAPPC4 /και 2 επίπεδα pERK1 (

= 0,996), καθώς επίσης και μεταξύ της έκφρασης των πυρηνικών TRAPPC4 /και 2 επίπεδα ERK1 (

= 0.994 ).

Συζήτηση

Τα δύο συστατικά του συμπλόκου ERK1 /2 βρίσκονται πάντοτε να συν-εντοπίζεται σε ορθοκολικά καρκινώματα [17], [18], [19], [20] , και η ERK1 και ERK2 MAPKs έχουν προσελκύσει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον λόγω της κρίσιμης συμμετοχή τους στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και surviva [17]. Ενεργοποιείται ERKs φωσφορυλιώνει και να ρυθμίζει τις δραστηριότητες μιας ολοένα αυξανόμενης ρόστερ των υποστρωμάτων που εκτιμάται ότι περιλαμβάνει πάνω από 160 πρωτεΐνες [21]. Ως εκ τούτου, ERK1 και ERK2 χρησιμοποιήθηκαν ως δόλωμα για τη διαλογή δύο υβριδίων-ζύμης σε έναν άνθρωπο βιβλιοθήκη Hela cDNA στο πρώτο βήμα αυτής της μελέτης. Ως αποτέλεσμα, μεταξύ των 23 πρωτεΐνες σύνδεσης (11 με ERK2 και 12 με ERK1), την πιθανή αλληλεπίδραση των TRAPPC4 και ERK2 αλλά όχι με ERK1 αποκαλύφθηκε για πρώτη φορά. Μας συνανοσοκαθίζησης και GST-pull-down πειράματα επιβεβαίωσαν περαιτέρω TRAPPC4 ως εταίρος αλληλεπίδρασης ERK2.

Από λίγα στοιχεία των πρωτεϊνών TRAPP στο CRC έχει αναφερθεί και ο ρόλος της αλληλεπίδρασης TRAPPC4-ERK2 είναι ακόμα άγνωστη, εμείς πρώτα αναλύεται η επίδραση της TRAPPC4 επί φωσφορυλιωμένων ERK1 /2, η ενεργοποιημένη μορφή του ERK1 /2. Βρήκαμε ότι, ως σύνολο, η υπερέκφραση του TRAPPC4 ενεργοποιημένου ERK1 /2, ενώ η εξάντληση του μειωμένα επίπεδα pERK1 /2 στο κόλον καρκίνος κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται SW1116. Έτσι, TRAPPC4 δρα ως θετικός ρυθμιστής για pERK1 /2.

Αν και μερικοί βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα, η πλειοψηφία των υποστρωμάτων ERK είναι πυρηνικές πρωτεΐνες [22]. Η ενεργοποιημένη ERKs μπορεί μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου φωσφορυλιώνει και ρυθμίζει διάφορους παράγοντες μεταγραφής, όπως Ets παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας, που τελικά οδηγεί σε αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση [23]. Περαιτέρω αξιολόγηση των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών κλασμάτων έδειξε ότι η θέση του pERK1 /2 μεταβάλλεται επίσης μαζί με τα επίπεδα έκφρασης TRAPPC4. Όταν TRAPPC4 χτυπήθηκε κάτω, το επίπεδο πυρηνικής pERK1 /2 ήταν κυρίως κάτω-ρυθμίζονται, αλλά καμία σημαντική διαφορά παρουσιάστηκε στο κυτταρόπλασμα. Όταν υπερεκφράζεται, έκφραση pERK1 /2 αυξήθηκε τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα, αλλά περισσότερο εντυπωσιακά στον πυρήνα. Έτσι, TRAPPC4 εμπλέκεται σε όχι μόνο τη φωσφορυλίωση της ERK1 /2, αλλά και τη χωρική κατανομή της στον ορθοκολικό επιθηλιακά κύτταρα. TRAPP πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι είναι μέρος ενός μεγάλου συγκροτήματος πολλαπλών πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην ER-to-Golgi και διακίνησης ενδο-Golgi [5], [7], [8]. Παρουσιάζουν ως αρκετές ισομορφές που διαφέρουν σε υπομονάδες, τη λειτουργία, και την τοποθεσία. Για παράδειγμα, TRAPPCI εμπλέκεται στην πρόσληψη των κυστιδίων ER-προέρχονται στο cis-Golgi [8], και TRAPPCII [7] απαιτείται για ανάδρομη μεταφορά από τα ενδοσώματα. Eva Loh

et al.

Αποκάλυψε ότι Bet3, η πιο συντηρημένη συνιστώσα του συγκροτήματος TRAPP, εκφράζεται σε οκτώ διαφορετικούς ιστούς ποντικού, υπάρχει σε δύο διακριτές ομάδες στο κυτταρόπλασμα και λειτουργίες κατά τη διάρκεια ER-Golgi μεταφορών [10] . Ως εκ τούτου, TRAPPC4 μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην πυρηνοκυτταροπλασματικής μεταφορών στην καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά ο μηχανισμός αυτός θα απαιτήσει πρόσθετη μελέτη.

PDGF μπορεί να σηματοδοτήσει μέσω του μονοπατιού ERK-ΜΑΡΚ και την ενεργοποίηση του καταρράκτη ERK μέσω υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Βρήκαμε ότι μετά τη θεραπεία με PDGF, την επίδραση της TRAPPC4 επί pERK1 /2 ήταν εντελώς ή μερικώς καλυπτόμενο. Τα αποτελέσματα μας έδωσε μια ένδειξη ότι TRAPPC4 μπορεί να εμπλέκεται σε ορισμένα στάδια της PDFG μεσολάβηση ενεργοποίηση του ERK1 /2 καταρράκτη. Όσον αφορά /2 φωσφορυλίωση ERK1, η επίδραση του TRAPPC4 μπορεί να μην είναι τόσο ισχυρή όσο αυτή του PDGF. Ωστόσο, η λεπτομερής μηχανισμός μένει να διερευνηθεί σε βάθος.

Επίσης, διαπιστώσαμε ότι TRAPPC4 επηρεάζονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και τον κυτταρικό θάνατο. Η εξάντληση των TRAPPC4 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται, ενώ η υπερέκφραση του συνέβαλε στην ανάπτυξη των κυττάρων. Έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιούνται /2 αλληλεπιδρά ERK1 με μερικά υποστρώματα, όπως φωσφοπρωτεΐνη εμπλουτισμένο σε αστροκύτταρα 15 (ΡΕΑ-15), και που συνδέονται Θάνατος πρωτεϊνικής κινάσης (DAPK), και διαχωρίζεται στο κυτταρόπλασμα [24]. Διαγραφή της PEA-15 διεγείρει σημαντικά ERK-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό και γονιδιακή μεταγραφή? ενώ ΡΕΑ-15 μπλοκ υπερέκφραση ο πολλαπλασιασμός μέσω της ικανότητάς του να δεσμεύει και να διαχωρίζει ERK1 /2 στο κυτταρόπλασμα [25]. DAPK διαχωρίζει ERK1 /2 στο κυτταρόπλασμα από την αλληλεπίδραση με ERK μέσω ενός D-περιοχή εντός του τομέα θανάτου του. και η αλληλεπίδραση προάγει την προ-αποπτωτικών λειτουργία του DAPK [26]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της ERK1 /2 πυρηνικό εντοπισμό παρεμποδίζει σήματα επιβίωσης ERK1 /2 με τη μεσολάβηση και επιπλέον αυξάνει τις προαποπτωτική σήματα. Στη μελέτη μας, μετά knockdown του TRAPPC4, η μείωση στην ενεργοποίηση του ERK1 /2 αντιστοιχούσε με λιγότερη πυρηνικού εντοπισμού, το οποίο μπορεί τελικά να οδηγήσει στην ανάπτυξη surpression και την απόπτωση. Ότι, περισσότερο πυρηνικού εντοπισμού όταν TRAPPC4 υπερεκφράζεται μπορεί να προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων.

Η πλειοψηφία της προηγούμενης έρευνας για την οικογένεια TRAPP επικεντρώθηκε σε ζύμη και φυσιολογικά κύτταρα ή ιστούς θηλαστικών [4], [5], [8] , [10]. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, μόνο έκφραση της TRAPPC2 έχει ερευνηθεί στην ασθένεια του SEDL [27]. Μέχρι σήμερα, η θέση των TRAPP υπομονάδων έχει κυρίως αναφερθεί στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων θηλαστικού [9], [10]. TRAPPC4 φέρεται να βρίσκεται στο αγκάθια των καλλιεργημένων νευρώνων του ιππόκαμπου [4], αλλά λίγες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της στην ασθένεια έχει ληφθεί. Εδώ, αναλύσαμε την έκφραση TRAPPC4 σε ανθρώπινο φυσιολογικό επιθήλιο του κόλου, αδένωμα, και τους ιστούς αδενοκαρκίνωμα με ανοσοϊστοχημεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πυρηνική TRAPPC4 εμφανίζεται μετά από φυσιολογικό επιθήλιο ιστό εξελίσσεται σε αδένωμα και το αδενοκαρκίνωμα. Έτσι, η μεταβολή στον εντοπισμό του TRAPPC4 μπορεί να σχετίζεται με ορθοκολικό καρκινογένεση. Το ερώτημα παραμένει αν μπορεί να προκύψουν από τυχόν γονιδιακές μεταλλάξεις ή δομικές αλλαγές που προκύπτουν σε TRAPPC4 κατά τη διάρκεια του παχέος καρκινογένεση. Εν τω μεταξύ, pERK1 /2, το οποίο εντοπίστηκε στον πυρήνα στη μελέτη μας, αυξήθηκε το αδενοκαρκίνωμα σε σύγκριση με ιστούς αδενώματος και φυσιολογικά επιθηλιακά ιστών. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η κύρια λειτουργία της οικογένειας TRAPP είναι στη ρύθμιση της φυσαλιδώδους μεταφορών και TRAPPC4 εμπλέκεται σε διακίνηση μεμβράνη στην μετα-συναπτική χώρους στους νευρώνες. Θα μπορούσε κανείς να ρωτήσει αν ο μηχανισμός πυρηνικής εντόπισης του TRAPPC4 σε CRC είναι σχετικό με τη μεταφορά pERK1 /2 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Στην πραγματικότητα, το συγκρότημα TRAPP φάνηκε να λειτουργεί ως παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEF) για ΥΡΤ1 και Ypt31 /32 GTPases τόσο

in vitro

και

in vivo

[28], [29 ]. Ενώ ΥΡΤ1 ΟΤΡάσης απαιτείται σε cis-Golgi για τη στόχευση και τη σύντηξη των κυστιδίων ER-προερχόμενο [30], [31], οι λειτουργίες των Ypt31 /32 GTPases είναι επίσης απαραίτητη για το σχηματισμό του trans-Golgi κυστίδια [32] . Μένει να δούμε αν υπάρχει ένα παρόμοιο μοριακό μηχανισμό για TRAPPC4 στο CRC ακόμα περαιτέρω μελέτες.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας κατέδειξε την αλληλεπίδραση των TRAPPC4 με ERK2. Σε ορθοκολικό καρκίνο, ρυθμίζει όχι μόνο την ενεργοποίηση του ERK1 /2, αλλά επίσης επηρεάζει την κατανομή των ενεργοποιημένων ERK1 /2. Ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση σε κύτταρα CRC. Κατά την εξέταση με προηγούμενες μελέτες, έχουμε εικάζουν ότι, CRC, TRAPPC4 δεσμεύει και ενεργοποιεί ERK1 /2, καθώς και συμμετέχει στην πυρηνική μεταφορά του pERK1 /2. Όταν TRAPPC4 έχει εξαντληθεί, λιγότερο ERK1 /2 είναι φωσφορυλιωμένη, και σχετικά πιο pERK1 /2 παραμένει στο κυτταρόπλασμα, η οποία οδηγεί σε καταστολή πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση. Όταν TRAPPC4 υπερεκφράζεται, περισσότερο ERK1 /2 ενεργοποιείται, και ακόμη περισσότερο μεταφέρεται στον πυρήνα, οδηγώντας τελικά σε αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη (Εικ. 7). Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να διευκρινιστεί αυτό το προτεινόμενο μοριακό μηχανισμό.

εξωκυτταρικά σήματα, όπως PDGF, ενεργοποιήστε καταρράκτες ERK (/RAF /RAS MER /ERK) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω υποδοχέων κινασών τυροσίνης (RTK) και utimately ρυθμίζουν και απόπτωση. TRAPPC4 δεσμεύει και ενεργοποιεί ERK1 /2, καθώς και συμμετέχει στην πυρηνική μεταφορά του pERK1 /2. Όταν TRAPPC4 έχει εξαντληθεί, λιγότερο ERK1 /2 είναι φωσφορυλιωμένη, και σχετικά πιο pERK1 /2 παραμένει στο κυτταρόπλασμα, η οποία οδηγεί σε καταστολή πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση. Όταν TRAPPC4 υπερεκφράζεται, περισσότερο ERK1 /2 ενεργοποιείται, και ακόμη περισσότερο μεταφέρεται στον πυρήνα, τελικά οδηγώντας σε αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη.

Υλικά και Μέθοδοι

Πλασμίδια και επιμολύνσεις

Ο πλήρους μήκους ERK1, ERK2, και TRAPPC4 cDNA ελήφθησαν με PCR από βιβλιοθήκη cDNA ανθρώπινης. Για δύο-υβριδίων ζυμομύκητα δοκιμασίες, θραύσματα πλήρους μήκους του ERK1 και ERK2 cDNAs κλωνοποιήθηκαν τόσο στο πλαίσιο με την

Sfi θέση

Ι στο πλασμίδιο pGB. Για προσδιορισμούς δέσμευσης, η πλήρους μήκους TRAPPC4 cDNA κλωνοποιήθηκε σε pCDEF-Myc, και πλήρους μήκους ERK2 cDNA κλωνοποιήθηκε σε pCDEF-Flag. ERK2 υποκλωνοποιήθηκε σε pGEX-5x για να παράγει γλουταθειόνη

-transferase πρωτεΐνες σύντηξης (GST), και TRAPPC4 υποκλωνοποιήθηκε σε ρΕΤ-28α για την παραγωγή πρωτεϊνών σύντηξης Του.

Για την συνανοσοκαθίζησης πειράματα παρακάτω, 1.6 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο 6-cm τρυβλία συν-επιμολύνθηκαν με φορείς pCDEF-Μγο-TRAPPC4 και pCDEF-Flag-ΕΚΚ2 εκφράζουν TRAPPC και ERK2, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο: αναλογία αντιδραστήριο επιμόλυνσης του 1:04 (4 μg κάθε πλασμίδιο). Αδειάστε έλεγχοι φορέας ήταν pCDEF-Myc ή pCDEF-Flag (τόσο από τη Σαγκάη Genomics).

ζύμης δύο υβριδίων δοκιμασίες

ζύμης δύο-υβριδίων πραγματοποιήθηκε για τον εντοπισμό ERK1 και ERK2 πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με χρησιμοποιώντας το Clontech Matchmaker σύστημα δύο υβριδίων (Cat. # K1612-1) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. πλασμίδια Δόλωμα PGB-ERK1-G και pGb-ERK2-G μετασχηματίστηκαν στο στέλεχος ζυμομύκητα Υ190. επιδράσεις Τοξικότητα και δοκιμασίες αυτο-ενεργοποίηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία β-γαλακτοσιδάσης. Ζύμη που μετασχηματίζεται με πλασμίδια δόλωμα καλλιεργήθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαλογή με το ανθρώπινο HeLa Matchmaker cDNA βιβλιοθήκη (Clontech, Cat # HL4048AH) και στη συνέχεια καλλιεργούνται σε Leu-Trp-His πλάκες για την επιλογή και την επικύρωση χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία β-γαλακτοσιδάσης. Πλασμίδια από θετικές αποικίες εκχυλίζονται, ενισχύθηκε σε βακτήρια και συν-μετασχηματίστηκε πάλι σε ζύμη μαζί με τα πλασμίδια δόλωμα για περαιτέρω έλεγχο σε ανιχνεύσεις β-γαλακτοσιδάσης. Τα πλασμίδια των θετικών επιτυχιών αλληλουχήθηκαν και αναλύθηκαν.

συνανοσοκαθίζηση (συν-ΙΡ) και GST-αναπτυσσόμενο ανάλυση

συνανοσοκαθίζησης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Τόσο η είσοδος και τα δείγματα ΠΕ αναλύθηκαν με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας διάφορα αντισώματα στις ακόλουθες αραιώσεις: Flag αντισωμάτων (1:1000), Myc αντίσωμα (1:1000) Flag-HRP αντισώματος (1:4000), Myc-HRP αντισώματος (1 :2000) (όλα από τη Σαγκάη Genomics, Σαγκάη, Κίνα), και κατσίκα IgG-HRP αντίσωμα αντι-ποντικού (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Η συν-επιμόλυνση των φορέων έκφρασης για ρ16 και TSSK1 (Shanghai Genomics, Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για το θετικό μάρτυρα συνανοσοκαθίζησης.

πρωτεΐνη GST και GST-ERK2 πρωτεΐνες σύντηξης εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (GE Healthcare, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο). Για την δοκιμασία pull-down, 1-5 mg από τις πρωτεΐνες GST ή GST σύντηξης αναμίχθηκαν με 40 ml ενός εναιωρήματος 50% σφαιριδίων γλουταθειόνης-σεφαρόζης 4Β για 2 ώρες σε ρυθμιστικό σύνδεσης [25 mM HEPES-NaOH (ρΗ 7.5) , 12.5 mM MgCl

2 10% γλυκερόλη, 5 mM DTT, 0,1% ΝΡ-40, 150 mM KCl και 20 mM ZnCl2]. Στη συνέχεια, 1-5 mg 6 × πρωτεϊνών σύντηξης-TRAPPC4 His προστέθηκε ακολουθούμενο από επώαση για άλλες 2 ώρες. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν εκτενώς, και ταυτοποιήθηκαν με κηλίδωση Western με 6 × Αντίσωμα Του (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK).

Κυτταρική καλλιέργεια

Η άνω και κάτω τελεία καρκινικό κύτταρο που προέρχεται SW1116 γραμμή (που αγοράστηκαν από την Τράπεζα κυττάρων του Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών) διατηρήθηκε από σειριακών διόδων σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό αδρανοποιημένο με θερμότητα εμβρυϊκό ορό (FCS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη.

Χρόνιες ασθένειες