Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ανώμαλη προέρχεται από αιμοπετάλια αυξητικού παράγοντα (PDGF ) σηματοδότηση έχει συνδεθεί με τον καρκίνο του προστάτη PCA) εξέλιξης (. Ωστόσο, ο ρόλος του στη ρύθμιση της ανάπτυξης των κυττάρων του προστάτη και η επιβίωση δεν έχει χαρακτηρισθεί καλά.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας πειραματικά μοντέλα που μιμούνται στενά την κλινική παθοφυσιολογία της εξέλιξης προστάτη, αποδείξαμε ότι PDGF είναι ένας παράγοντας επιβίωσης σε κύτταρα προστάτη μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του μυελοειδούς λευχαιμίας κυττάρων-1 (Mcl-1). θεραπεία PDGF που προκαλείται από την ταχεία πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης, πιθανώς διαμεσολαβείται από c-Abl και σηματοδότηση P68. Περιέργως, PDGF προωθείται σχηματισμός ενός πυρηνικού μεταγραφικού συγκρότημα που αποτελείται από β-κατενίνης και υποξία παράγοντα (HIF) -1α, και σύνδεση του με Mcl-1 προαγωγό. Η διαγραφή ενός θεωρούμενου στοιχείου απόκρισης υποξίας (HRE) εντός του προωθητή Mcl-1 εξασθενημένα αποτελέσματα PDGF επί Mcl-1 έκφρασης. Ο αποκλεισμός του υποδοχέα PDGF (PDGFR) σηματοδότησης με φαρμακολογική αναστολέα AG-17 καταργείται PDGF επαγωγή Mcl-1, και την απόπτωση που επάγεται σε μεταστατικά κύτταρα του προστάτη.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η μελέτη μας διαλευκανθεί μια ζωτικής σημασίας μηχανισμό επιβίωσης στα κύτταρα του προστάτη, γεγονός που υποδεικνύει ότι η διακοπή του σήματος επιβίωσης PDGF-Mcl-1 μπορεί να παρέχει μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία του προστάτη μετάσταση

Παράθεση:. Iqbal S, Zhang S, Driss Α, Liu ZR, Κιμ H-RC, Wang Υ, et al. (2012) PDGF απορυθμίζει Mcl-1 μέσω της ενεργοποίησης του β-κατενίνης και HIF-1α-Dependent σηματοδότηση στα κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (1): e30764. doi: 10.1371 /journal.pone.0030764

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21, Ιούν του 2011? Αποδεκτές: 20 Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιαν 2012

Copyright: © 2012 Iqbal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Υπουργείο άμυνας PC060566, American Cancer Society ΕΓΓ-10-140-01, Πανεπιστήμιο Emory Βραβείο Επιτροπής Ερευνών, Kennedy Σπόρος Grant (DW), Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου επιχορήγηση 1R43CA141870 (AW), το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγεί P01 CA98912, R01 CA122602 , Υπουργείο άμυνας PC060866 (LWKC), Γεωργία Συνασπισμό Καρκίνο διακεκριμένος μελετητής Grant (OK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι προέρχεται από αιμοπετάλια αυξητικούς παράγοντες (PDGF) οικογένεια αποτελείται από πέντε διμερή ισόμορφα: PDGF-AA, -αβ, -BB, -CC και -DD [1], τα οποία εξασκούν την κυτταρική δράση τους μέσω δύο δομικά παρόμοια υποδοχέων κινάσης τυροσίνης (ΡϋΟΡΡ-α και -β) που εκφράζεται από πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων [2]. Η σύνδεση του συνδέτη να PDGFRs αποτελέσματα στον διμερισμό και την αυτοφωσφορυλίωση των κινασών υποδοχέα, στη συνέχεια την πρόσληψη ορισμένων ομολογίας Src 2 (SH2) πρωτεΐνες προσαρμογέα που περιέχει την περιοχή (π.χ., Src, Grb2 και Shc) σε συγκεκριμένα φωσφορυλιωμένα υπολείμματα τυροσίνης. Αρκετές καταρράκτες σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του Ras-ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), φωσφολιπάση-γ και phos-phatidyl-ινοσιτόλη-3′-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt, έχουν χαρακτηριστεί ως τα σημαντικότερα κατάντη οδούς διαμεσολαβεί λειτουργίες PDGF [3] . Άλλα μόρια προσαρμογέα (π.χ., ο Fer και Fes τυροσίνης οικογένειας κινάσης) και μεταγραφικοί παράγοντες (π.χ., β-κατενίνης) εμπλέκονται επίσης σε PDGF σηματοδότηση σε ορισμένους τύπους κυττάρων [4], [5], [6], [7], [8].

έκφραση παρεκκλίνουσα PDGF έχει συχνά συνδέεται με την νεοπλαστική συνιστώσα των ανθρώπινων όγκων, ενώ τα PDGFRs βρίσκονται κυρίως στην ινοβλαστική και αγγειακών όγκων στρώματος [9], [10], [11], [ ,,,0],12], [13]. Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι προέρχονται από όγκους PDGF μπορεί να δρα κυρίως ως μόριο σηματοδότησης παρακρινική σε συμπαγείς όγκους. Υποστηρίζει την ιδέα αυτή, πρόσφατες μελέτες απέδειξαν ότι το PDGF είναι ένας ισχυρός προ-αγγειογόνο παράγοντα με την προώθηση της πρόσληψης και της ανάπτυξης των ινοβλαστών στρωματικών, περιαγγειακών κυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων, με τον τρόπο αυτό έμμεσα επηρεάζουν την ανάπτυξη του όγκου, το μεταστατικό διάδοσης και της αντίστασης στα φάρμακα [2], [3 ], [14], [15], [16]. Είναι ενδιαφέρον, αναδυόμενη αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι PDGF αυτοκρινείς σηματοδότησης μπορεί επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Μεταλλακτικές ενεργοποίηση ή συν-έκφραση των PDGF προσδεμάτων και υποδοχέων είναι ικανά να διεγείρουν την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό σε πολλά μη επιθηλιακά κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου γλοιοβλαστώματα και οστεοσάρκωμα [17]. Πιο πρόσφατα, οι αυτοκρινείς σηματοδότηση PDGF έχει συσχετιστεί με επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) σε κύτταρα καρκινώματος από το στήθος, του παχέος εντέρου, του προστάτη και του ήπατος, προτείνοντας ένα αιτιολογικό ρόλο του αυτοκρινούς PDGF σηματοδότηση σε μετάσταση [7], [8], [18], [19]. Παρ ‘όλα αυτά, παρά την καθιερωμένη συσχέτιση μεταξύ της απελευθερωμένης σηματοδότησης παρακρινείς PDGF και την εξέλιξη του όγκου, οι λειτουργίες και οι μηχανισμοί της αυτοκρινείς PDGF σηματοδότηση σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα παραμένουν ασαφείς [3], [17].

Εξαγορά της αντίστασης απόπτωση είναι χαρακτηριστικό των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων, η οποία μπορεί να παρέχουν πλεονεκτήματα επιβίωσης κατά τη διάρκεια της εισβολής, της μετάστασης και αποικισμός [20]. Εμείς συσχετίζεται πρόσφατα υπερέκφραση του μυελοειδούς λευχαιμίας κυττάρων-1 (Mcl-1), ένα μέλος της οικογένειας Bcl-2, με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη (PCA) προς μετάσταση στα οστά [21]. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουν αποδείξεις ότι ΡϋΟΡ-ΒΒ είναι ένας παράγοντας επιβίωσης σε μεταστατικά κύτταρα προστάτη με προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης Mcl-1 μέσω ενός μηχανισμού σηματοδότησης που προκαλείται από τους παράγοντες μεταγραφής β-κατενίνης και υποξία παράγοντα (HIF) -1α.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη ARCaP

Ε, ARCaP

Μ [22], LNCaP (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas , VA), C4-2 [23] και PC3 (ATCC) διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο σε Τ-μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) με 5% ορό εμβρύου βοός (FBS). Για τις θεραπείες με ισομορφές του PDGF, τα κύτταρα προστάτη εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (3000 κύτταρα /φρεάτιο) ήταν άνευ ορού όλη τη νύκτα, αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​απαλλαγμένο από ορό T-μέσου και επωάζονται παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων ανασυνδυασμένου ανθρώπινου ΡϋΟΡ ΑΑ, -αβ, -BB (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), ή ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) για υποδεικνυόμενους χρόνους. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ιντερλευκίνη-6 (IL-6) αγοράστηκε από την R & amp? D Systems. Για τη θεραπεία φάρμακο χημειοθεραπείας, docetaxel (Sanofi Aventis, Bridgewater, NJ) ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκαν για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό πολλαπλασιασμού CellTiter 96 AQ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο και βαφή κυανούν τρυπανίου.

Πλασμίδια και μικρά RNAs παρεμβολής (siRNAs)

Η περιοχή προαγωγέα πλήρους μήκους ανθρώπινο Mcl-1 κλωνοποιήθηκε σε ένα ανταποκριτή λουσιφεράσης πυγολαμπίδας φορέα pGL3-Basic (Promega, Madison, WI) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Steven W. Edwards (Πανεπιστήμιο του Λίβερπουλ, Λίβερπουλ, Ηνωμένο Βασίλειο) [24]. Η υποξία-αποκριτικού στοιχείου (HRE) (θραύσμα -900 -884 να) -truncated κατασκεύασμα ελήφθη με πέψη του υποκινητή πλήρους μήκους χρησιμοποιώντας ΚρηΙ (από τη θέση -3914 να -855) και έπειτα προσδέθηκε με την χρησιμοποίηση Τ4 DNA λιγκάσης (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ). Αμφότερα τα κατασκευάσματα πλασμιδίου επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας. Ο δημοσιογράφος pHIF1-Luc αγοράστηκε από Panomics (Fremont, CA). TOPFlash και παράγοντας Τ-κυττάρων FOPFlash (TCF) δημοσιογράφους λήφθηκαν από Upstate (Billerica, ΜΑ). πλασμίδιο ρΤΚ-RL αγοράστηκε από την Promega. Mcl-1 φορέα έκφρασης Ανθρώπινο (pCMV-Mcl-1) λήφθηκε από ΟηΟεηε, β-κατενίνης πλασμίδιο έκφρασης Inc. Ανθρώπινα παρεσχέθη από τον Dr. Zhi-Ren Liu. ON-TARGET

συν

SMARTpool τα siRNA εναντίον της β-κατενίνης, P68, PDGFR-α και PDGFR-β, και του ελέγχου siRNA ελήφθησαν από Dharmacon, Inc (Chicago, IL). HIF-1α και ελέγχου siRNA αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Παροδική διαμόλυνση των κατασκευασμάτων DNA και siRNAs διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 ή αντιδραστήρια Oligofectamine (Invitrogen), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή και δημοσιευμένες διαδικασίες μας [21], [25].

Ανάλυση Western Blot

Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Novagen (EMD Biosciences, San Diego, CA). ανάλυση ανοσοαποτύπωση ακολούθησαν τυποποιημένες διαδικασίες [25]. λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της σχετικής έκφρασης πρωτεΐνης ως κανονικοποιήθηκαν προς τους ελέγχους φόρτωσης. Πληροφορίες για τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη περιγράφεται στο Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

Ανοσοκαταβύθιση

Η ανοσοκατακρήμνιση Starter Pack (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σύνολο πυρηνικό προϊόντα λύσης (1 mg) ανοσοκατακρημνίστηκαν με 5 μα κουνελιού αντι-HIF-1α αντίσωμα, αντίσωμα αντι-β-κατενίνης ποντικού, ποντικού αντι-c-Abl και αντίσωμα αντι-ρ68 κουνελιού (συμπληρωματικές πληροφορίες, Πίνακας S1), ή φυσιολογικό IgG (R &? D Systems). Πρωτεΐνη Α /G Sepharose 4 Fast Flow σφαιρίδια προστέθηκαν για να καθιζάνουν πρωτεΐνες, στη συνέχεια πλύθηκε και εκλούστηκε. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία για ανάλυση στυπώματος Western.

Ανοσοφθορισμός και Συνεστιακή Imaging

ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] χρησιμοποιώντας ποντικού αντι-β-κατενίνης, κουνελιού αντι-ρ68 και αντι αντισώματα HIF-1α (Συμπληρωματικό Πίνακας S1). Είτε Alexa 488 ή 555 δευτερεύοντα αντισώματα (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:500 και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Πυρηνική χρώση πραγματοποιήθηκε με επώαση κυττάρων με 0,4 μmol /L 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) σε διαφάνειες στήριξης. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν σε ένα Zeiss LSM 510 META. Σε όλες τις περιπτώσεις, είτε ένας στόχος έλαιο Zeiss Σχέδιο-Αρο 63x ή 100x χρησιμοποιήθηκε (αριθμητικό άνοιγμα 1.3 και 1.4, αντίστοιχα). Όλες οι εικόνες είχαν την επέκταση αντίθεση εκτελούνται στο Adobe Photoshop.

Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) και RT-PCR

Το ολικό RNA παρασκευάστηκε με Qiagen RNeasy κιτ (Valencia, CA). Το πρώτο-κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας SuperScript ®III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Ποσοτική PCR διεξήχθη με το σύστημα LightCycler 480 (Roche Applied Science) χρησιμοποιώντας ένα Brilliant® SYBR® Πράσινη QPCR Master Mix (Stratagene) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τελικό σημείο RT-PCR, ο SuperScript® III One-Step RT-PCR κιτ (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών που περιγράφονται στο Συμπληρωματικό Πίνακα S2. αφυδρογονάση αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) πιΚΝΑ ενισχύθηκε με ένα ζεύγος εκκινητών που περιγράφηκε προηγουμένως [25] και χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση εισόδους RNA.

χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης (μάρκας)

Η διαδοχική ChIP (τσιπ re-chip) πείραμα διεξήχθη με τη χρήση του Active κιτ Motif Re-chip-it® (Active Motif, Carlsbad, CA). Εν συντομία, τα κύτταρα του προστάτη ήταν άνευ ορού επί μία νύκτα και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο άνευ ορού, επωάστηκαν με PDGF-ΒΒ ή PBS για ενδεικνυόμενους χρόνους. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα φορμαλδεΰδης 1% για να συνδέσει εγκάρσια τις αλληλεπιδράσεις DNA-πρωτεΐνης. Χρωματίνη ήταν ψαλιδισμένα για 8 λεπτά, χρησιμοποιώντας ένα κιτ ChIP-IT Express Ενζυμική Κούρεμα (Active Motif) [25]. Ένα τμήμα της χρωματίνης αντιστράφηκε και χρησιμοποιήθηκε ως ΟΝΑ εισόδου. Για ανοσοκαταβύθιση, 2 μg αντισώματος αντι-β-κατενίνης προστέθηκαν και επωάστηκαν για μία νύχτα, με φυσιολογική IgG ως μάρτυρα (Συμπληρωματικό Πίνακας S1). Εκλούεται χρωματίνη αφαλατώθηκε, και ένα κλάσμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρώτη αντίδραση chip. Η αντίδραση εκ νέου τσιπ Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε με 2 μg αντισώματος αντι-HIF-1α ή με IgG ελέγχου. PCR εναρκτήρες για την περιοχή HRE στο ανθρώπινο Mcl-1 προαγωγό περιγράφηκαν στο συμπληρωματικό πίνακα S2. Διεξήχθησαν αντιδράσεις PCR για 40 κύκλους, με συγκέντρωση εκκινητή ως 10 pmol /20 μΐ, χρησιμοποιώντας το κιτ AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Invitrogen).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ή περισσότερα πειράματα . Σφάλματα είναι Τ.Σ. τιμές των μέσων όρων των αποτελεσμάτων. Για

t-test

χρησιμοποιήθηκε κάθε φοιτητής δοκιμασία για στατιστική σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Οι τιμές των

p

≤0.05 ελήφθησαν ως μια σημαντική διαφορά μεταξύ των μέσων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Sigmaplot 11.0 (Systat Software, Inc., Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Mcl-1 είναι ένας παράγοντας επιβίωσης σε κύτταρα προστάτη

Προηγουμένως αποδείξαμε ότι Mcl-1 υπερέκφραση συνδυάζεται με

in vivo

οστό μεταστατική ροπή των ανθρώπινων κυττάρων προστάτη, και το σημαντικότερο, συσχετίζεται με την κλινική μετάσταση στα οστά προστάτη [21]. Σταθερά, χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη PCa ARCaP κυτταρικό μοντέλο που θα μπορούσε να μιμηθεί στενά την παθοφυσιολογία της οστικής μετάστασης σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [26], βρήκαμε ότι Mcl-1 έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη σε υψηλά οστό μεταστατικό ARCaP

Μ κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη στο τα χαμηλά επεμβατική ομόλογό ARCaP

E κύτταρα (Εικόνα 1Α). Υποθέσαμε ότι η ρύθμιση προς τα άνω των Mcl-1 μπορεί να αναθέσει μεταστατικό προστάτη πλεονεκτήματα κυττάρων επιβίωσης, επιτρέποντάς τους να ξεφύγουν από τη μοίρα αποπτωτικών κατά τη διάρκεια της εισβολής και της διάδοσης και με επιτυχία τη δημιουργία μακρινή μετάσταση [20]. Στήριξη αυτήν την έννοια, έκτοπη έκφραση των Mcl-1 αυξημένη αντίσταση των κυττάρων του προστάτη με docetaxel (Εικόνα 1Β), ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό φάρμακο σε ορμονοάντοχου και μεταστατικό προστάτη [27]. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του Mcl-1 μπορεί να ευθύνεται για, τουλάχιστον εν μέρει, την αντοχή σε απόπτωση σε μεταστατικά κύτταρα του προστάτη.

(Α) Mcl-1 έκφραση πρωτεΐνης στο γράμμωσης που σχετίζονται ARCaP

E και τα κύτταρα ARCaP

M. (Β) έκτοπη έκφραση του Mcl-1 σε ARCaP

Μ κυττάρων και οι επιπτώσεις στην docetaxel κυτταροτοξικότητα σε ARCaP

κύτταρα Μ. pCMV: τον έλεγχο των φορέων. (Γ) Αριστερό πλαίσιο: Τα δόση και το χρόνο που εξαρτάται από δράσεις του PDGF-ΒΒ επί της έκφρασης mRNA Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ? μεσαίο πάνελ: ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης mRNA Mcl-1 σε απόκριση προς θεραπεία PDGF-ΒΒ σε ARCaP

κύτταρα Μ (24 ώρες)? δεξί πλαίσιο: Οι επιδράσεις της αγωγής PDGF-ΒΒ (20 ng /ml, 72 ώρες) επί της έκφρασης της πρωτεΐνης Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ. ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της σχετικής έκφραση πρωτεΐνης Mcl-1. (D) Τα αποτελέσματα της εξωγενούς PDGF-ΒΒ από την κυτταροτοξικότητα του docetaxel σε ARCaP

κύτταρα Μ, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία MTS.

Η

ΡϋΟΡ-ΒΒ επάγει έκφραση Mcl-1 και ανταγωνίζεται την απόπτωση σε προστάτη κύτταρα

Είναι ενδιαφέρον, PDGF-ΒΒ βρέθηκε να επάγει σημαντικά Mcl-1 έκφρασης σε κύτταρα του προστάτη (Σχήμα 1Γ, Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη PDGF-ΒΒ αύξησε Mcl-1 mRNA σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, αν και οι βέλτιστες συνθήκες για τη μέγιστη συσσώρευση του mRNA Mcl-1 ποικίλει σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές PCa. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε τις επαγωγικές επιδράσεις του PDGF-ΒΒ επί Mcl-1 έκφραση σε επίπεδο πρωτεΐνης. Τα στοιχεία αυτά προσδιορίζονται PDGF-ΒΒ ως νέο ρυθμιστή των Mcl-1, το οποίο θα μπορούσε να παρέχει ένα μηχανισμό επιβίωσης για την προστασία των κυττάρων του προστάτη από την απόπτωση. Πράγματι, η προσθήκη PDGF-ΒΒ σε κυτταρικές καλλιέργειες PCa ανταγωνίστηκε αποτελεσματικά την κυτταροτοξικότητα του docetaxel σε ένα ευρύ φάσμα δόσεων (Σχήμα 1 D).

προφίλ έκφρασης του PDGF αυτοκρινή συστατικών σε κύτταρα προστάτη σηματοδότησης

Εξετάσαμε το μοτίβο έκφρασης του PDGFs και των υποδοχέων τους σε κύτταρα προστάτη (Σχήμα 2Α). αναλύσεις RT-PCR έδειξε ότι οι ισομορφές του PDGF εκφράστηκαν διαφορικά στο επίπεδο του mRNA, και μεταξύ αυτών, αυξημένη PDGF-Β και ΡϋΟΡ-D παρατηρήθηκαν σε C4-2 και ARCaP

Μ κυττάρων σε σύγκριση με το γονικό LNCaP και ARCaP

E κύτταρα, αντίστοιχα. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [19], τα κύτταρα PC3 βρέθηκαν να εκφράζουν υψηλά επίπεδα του PDGF-D, PDGFR-α και -β. Είναι ενδιαφέρον ότι, ΡϋΟΡΡ-α mRNAs φάνηκε να εκφράζεται ουσιαστικά σε κύτταρα PCa, η οποία επιβεβαιώθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης με ανάλυση κηλίδας Western. Αντίθετα, αν και τα mRNA ΡϋΟΡΡ-β ανιχνεύθηκαν με RT-PCR σε περισσότερες κυτταρικές σειρές προστάτη, ανάλυση ανοσοκηλίδωσης μπορούσε να επιβεβαιώσει μόνο έκφραση πρωτεΐνης σε ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κυττάρων (Σχήμα 2Α, δεξί πλαίσιο). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν μια λειτουργική αυτοκρινή PDGF σηματοδότηση σε ορισμένα κύτταρα του προστάτη.

(Α) προφίλ έκφρασης του PDGFR συστατικών σηματοδότησης σε κύτταρα PCa, όπως αναλύθηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western. (Β) Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) επί της φωσφορυλίωσης του ΡϋΟΡΡ-α και -β σε ARCaP

κύτταρα Μ. (Γ) Τα αποτελέσματα του καταστρέφουν ΡϋΟΡΡ-α ή /και -β για έκφραση πρωτεΐνης Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με ισότυπο ειδικού siRNAs που στοχεύουν ΡϋΟΡΡ-α (αριστερό πάνελ, 30 ηΜ) ή PDGFR- β (κεντρικό πίνακα, 100 ηΜ), ή ένα μίγμα από PDGFR-α και -β siRNAs (δεξί πάνελ) για 48 h, στερούνται ορού επί μία νύκτα, και επωάστηκαν παρουσία ή απουσία PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 72 ώρες. (Δ) Πάνω πίνακας: Τα χρονικά εξαρτώμενη επιδράσεις της AG-17 (100 ηΜ) επί της εκφράσεως του mRNA Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ? κάτω πλαίσιο: Οι επιδράσεις των AG-17 αγωγής επί της έκφρασης των Mcl-1 και διασπασμένη PARP με την παρουσία (20 ng /ml) ή απουσία PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) σε ARCaP

κύτταρα Μ. (Ε) Τα αποτελέσματα της AG-17 θεραπεία (100 nM, 72 ώρες) για τη βιωσιμότητα του ARCaP

Ε και ARCaP

κύτταρα Μ.

Η

αυτοκρινή μεσολαβεί ΡϋΘΡΡ σηματοδότησης ΡϋΟΡ ρύθμιση ΒΒ του Mcl-1 σε κύτταρα προστάτη

Τόσο ΡϋΟΡΡ-α και -β ήταν εντόνως εκφρασμένο σε οστό μεταστατικό ARCaP

κύτταρα Μ, και ταχέως φωσφορυλιωμένη σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε απόκριση προς τη διέγερση του εξωγενή PDGF-ΒΒ (Σχήμα 2Β). Ενδιαφέρον, εξάντληση του είτε ΡϋΟΡΡ-α ή -β με ισομορφής ειδικά siRNA δεν μπλοκάρουν την επαγωγική επίδραση της ΡϋΟΡ-ΒΒ επί Mcl-1 έκφρασης (Σχήμα 2C, αριστερά και κεντρικό πάνελ), υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του είτε υποδοχείς μπορεί να είναι επαρκής για την ρύθμιση προς τα πάνω του Mcl-1. Υποστηρίζοντας την υπόθεση αυτή, παροδική επιμόλυνση με ένα μίγμα siRNAs που στοχεύουν τόσο ΡϋΟΡΡ-α και -β ανέστειλε την βασική έκφραση Mcl-1, και ακύρωσε PDGF-ΒΒ διέγερση Mcl-1 ARCaP

Μ κυττάρων (Σχήμα 2C, δεξιά πάνελ ). Εναλλακτικά, η θεραπεία με AG-17 (Tyrphostin), έναν εκλεκτικό φαρμακολογικό αναστολέας της PDGFRs [28], μειωμένη Mcl-1 έκφραση τόσο του mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης και markably αυξημένη διάσπαση πολυ-ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP), ένα δείκτη της απόπτωσης . Αυτά τα αποτελέσματα εξασθένησαν από την παρουσία του ΡϋΟΡ-ΒΒ σε καλλιέργειες (Σχήμα 2D). Σταθερά, AG-17 θεραπεία και σε χαμηλές δόσεις (όπως 100 ηΜ) προκάλεσε αποτελεσματικά απόπτωση σε ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κυττάρων (Σχήμα 2Ε), υποδεικνύοντας έναν κεντρικό ρόλο του PDGFR σηματοδότησης στην επιβίωση των κυττάρων του προστάτη.

β-κατενίνης μεσολαβεί ρύθμιση PDGF του Mcl-1 έκφραση σε κύτταρα προστάτη

η ενεργοποίηση της οδού β-κατενίνη είναι μεταγενέστερος περίπτωση PDGF σηματοδότηση σε ορισμένα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [7], [ ,,,0],8], [29]. Η ανάλυση στυπώματος Western βρήκαν ότι β-κατενίνης και TCF4, ένα σημαντικό παράγοντα μεταγραφής β-κατενίνης που αλληλεπιδρούν [30], οι εκφράζονται διαφορικά σε PCa κύτταρα (Σχήμα 3Α), γεγονός που υποδηλώνει μία λειτουργική β-κατενίνης TCF4 σηματοδότηση στα κύτταρα αυτά. Στην πραγματικότητα, μια τεχνητή υποστηρικτής TCF ενεργοποιήθηκε τόσο στην LNCaP-C4-2 και ARCaP

E-ARCaP

κυτταρικών σειρών Μ, και οι δραστηριότητες δημοσιογράφος φάνηκε να σχετίζεται με αυξημένο

in vivo

μεταστατικό δυναμικό σε C4-2 και ARCaP

Μ κυττάρων (Σχήμα 3Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι τόσο β-κατενίνης και TCF4 ουσιωδώς παρουσιάζονται στον πυρήνα του ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κύτταρα (Σχήμα 3Α, χαμηλή πλευρά), που επέδειξε σημαντικά υψηλότερη βασική δραστηριότητες TCF από είτε LNCaP ή C4 -2 κύτταρα (από -100 φορές) (Εικόνα 3Β).

(Α) προφίλ έκφρασης των συστατικών σηματοδότησης β-κατενίνης σε κύτταρα TCF PCa. δραστηριότητα δημοσιογράφος (Β) TCF στο

E-ARCaP

Μ κυττάρων LNCaP-C4-2 και ARCaP. (Γ) Πάνω πίνακας: Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης σε ARCaP

κύτταρα Μ? Κάτω πίνακας: Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για τη δραστηριότητα ανταποκριτή TCF παρουσία (100 ηΜ) ή απουσία του AG-17. (D) Τα αποτελέσματα της έκτοπη έκφραση της β-κατενίνης (72 ώρες) επί Mcl-1 έκφραση τόσο του mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. (Ε) Τα αποτελέσματα της εξάντλησης της β-κατενίνης για τη ρύθμιση PDGF-BB των Mcl-1 έκφρασης σε ARCaP

κύτταρα Μ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με β-κατενίνης siRNA ή ελέγχουν siRNA (30 ηΜ) για 48 ώρες, στέρηση ορού όλη τη νύκτα, και επωάστηκαν παρουσία ή απουσία PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 72 ώρες. (F) Τα αποτελέσματα της εξάντλησης β-κατενίνης στη δραστικότητα ανταποκριτή Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με β-κατενίνης ή ελέγχουν siRNA (30 ηΜ) για 48 ώρες, και περαιτέρω επιμολυσμένα με ένα ανθρώπινο Mcl-1 ρεπόρτερ για 24 ώρες. Μετά ασιτία ορού όλη τη νύκτα, τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 48 ώρες.

Η

Κατά τη διάρκεια θεραπείας ΡϋΟΡ-ΒΒ, τον πυρηνικό παρουσία του β-κατενίνης γρήγορα αυξήθηκε σε ARCaP

Μ κυττάρων (Σχήμα 3C, άνω φωτογραφία). Σταθερά, δραστηριότητα ανταποκριτή TCF επίσης σημαντικά αυξημένη εξής PDGF-ΒΒ διέγερση, η οποία μετριάζεται από την προ-θεραπεία με AG-17 (Σχήμα 3C, κάτω πλαίσιο). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το PDGF-ΒΒ ενεργοποιημένα σηματοδότηση β-κατενίνης σε ένα ΡϋΟΡΡ-εξαρτώμενο τρόπο.

Για να ερευνηθεί ο ρόλος του β-κατενίνης στη ρύθμιση της Mcl-1 έκφραση, ARCaP

M κύτταρα ήταν παροδικά επιμολυσμένα με ένα κατασκεύασμα που εκφράζει άγριου τύπου β-κατενίνης. RT-PCR και στυπώματος Western αναλύσεις έδειξαν ότι η έκτοπη epression του β-κατενίνης increseased Mcl-1 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 3D). Αντίθετα, η εξάντληση β-κατενίνης χρησιμοποιώντας μια πισίνα siRNA ανέστειλε αποτελεσματικά τόσο την βασική έκφραση Mcl-1 και την επαγωγή της από ΡϋΟΡ-ΒΒ (Σχήμα 3Ε). Σταθερά, ενώ PDGF-ΒΒ επάγεται σημαντικά την δραστικότητα της λουσιφεράσης από ένα πλήρες μήκους ανθρώπινο Mcl-1 προαγωγού σε ARCaP

Μ κύτταρα επιμολυσμένα με μη στόχευση siRNAs ελέγχου, αυτή η επίδραση καταργήθηκε με παροδική εξάντληση του ενδογενούς β-κατενίνης (Σχήμα 3F). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η ενεργοποίηση της σηματοδότησης β-κατενίνης μπορεί να είναι επαρκής και απαιτείται για την Mcl-1 έκφραση σε κύτταρα PCa.

PDGF ενεργοποιεί σηματοδότηση ρ68-β-κατενίνης σε κύτταρα προστάτη

Ερευνήσαμε αν ένα c-Abl-ρ68-εξαρτώμενη μονοπάτι εμπλέκεται στην ενεργοποίηση ΡϋΟΡ της σηματοδότησης β-κατενίνης σε κύτταρα προστάτη [7]. Οι αναλύσεις στυπώματος Western βρήκαν ότι c-Abl και ρ68 εκφράστηκαν διαφορικά σε PCa κύτταρα (Σχήμα 4Α). Κατά την επεξεργασία PDGF-ΒΒ, η φωσφορυλίωση τυροσίνης της c-Abl και ρ68 ενεργοποιούνται ταχέως, όπως αποδεικνύεται από δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοστύπωμα (Σχήμα 4Β, αριστερά και μεσαία πλαίσια). Είναι σημαντικό ότι η παρουσία του β-κατενίνης σε ανοσοκαθιζήματα ρ68 ήταν επίσης αυξημένη σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας μια ενισχυμένη φυσική σύνδεση μεταξύ β-κατενίνης και πρωτεϊνών ρ68 (Εικόνα 4Β, μεσαίο πλαίσιο), η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από ένα αντίστροφο πείραμα ανοσοκαταβύθισης (Εικόνα 4Β, δεξιά πλευρά). Στην πραγματικότητα, PDGF-ΒΒ που προκαλείται ταχεία πυρηνική μετατόπιση του ρ68 εντός 30 λεπτών (Εικόνα 4C), η οποία συνδέεται με αυξημένη συν-εντοπισμό του ρ68 και β-κατενίνης στον πυρήνα (Εικόνα 4D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το PDGF-ΒΒ θα μπορούσε να ενεργοποιήσει τον καταρράκτη c-Abl-ρ68 και μετέπειτα σηματοδότηση β-κατενίνης σε κύτταρα PCa.

(Α) έκφραση του c-Abl και ρ68 σε κύτταρα PCa. (Β) Αριστερό πλαίσιο: Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) επί της φωσφορυλίωσης της c-Abl? μεσαίο πάνελ: Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την φωσφορυλίωση της ρ68 και της έκφρασης των β-κατενίνης στα ανοσοϊζήματα ρ68 σε ARCaP

κύτταρα Μ. Η φωσφορυλίωση του ρ68 στις θέσεις της τυροσίνης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα παν-φωσφορυλιωμένη-Tyr αντίσωμα? δεξί πλαίσιο: Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την έκφραση των ρ68 στα ανοσοκαθιζήματα β-κατενίνης σε ARCaP

κύτταρα Μ. (Γ) Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την πυρηνική μετατόπιση του ρ68 σε ARCaP

κύτταρα Μ. (D) συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση των αποτελεσμάτων του PDGF-ΒΒ από την συν-εντοπισμό της β-κατενίνης και ρ68 στον πυρήνα σε ένα πείραμα χρονικής πορείας σε ARCaP

κύτταρα Μ. (Ε) Τα αποτελέσματα της εξάντλησης ρ68 στη ρύθμιση PDGF των Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ρ68 ή ελέγχουν siRNA (30 ηΜ) για 48 ώρες, στέρηση ορού όλη τη νύκτα, και επωάστηκαν παρουσία ή απουσία PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες (άνω πάνελ) ή 72 ώρες ( κάτω πάνελ). Πάνω πίνακας: Ανάλυση RT-PCR της έκφρασης του mRNA του ρ68 και Mcl-1? κάτω πλαίσιο: ανάλυση στυπώματος Western της πρωτεΐνης έκφρασης του ρ68, β-κατενίνης και Mcl-1. (F) Τα αποτελέσματα της εξάντλησης ρ68 επί της δραστικότητας ανταποκριτή Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ρ68 ή ελέγχουν siRNA (30 ηΜ) για 48 ώρες, και περαιτέρω επιμολυσμένα με ανθρώπινο Mcl-1 ρεπόρτερ για 24 ώρες. Μετά ασιτία ορού όλη τη νύκτα, τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 48 ώρες.

Η

Για να εξεταστεί αν ρ68 απαιτείται για τη ρύθμιση των Mcl-1 έκφρασης, ARCaP

M κύτταρα επιμολύνθηκαν με ρ68 siRNA ή ελέγχουν siRNA, και αναλύθηκαν για την έκφραση των Mcl-1 σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Ε, εξάντληση των ρ68 ανέστειλαν ενδογενούς β-κατενίνης και εξασθενημένα αποτελεσματικά PDGF-ΒΒ διέγερση Mcl-1 έκφρασης. Σταθερά, δραστηριότητα υποκινητή Mcl-1 ανεστάλη σημαντικά με την κατεργασία με ρ68 siRNA σε ARCaP

κύτταρα Μ, είτε με είτε χωρίς την παρουσία του ΡϋΟΡ-ΒΒ στις καλλιέργειες (Σχήμα 4F). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν μια απαραίτητη λειτουργία της ρ68 στη ρύθμιση των Mcl-1 στα κύτταρα του προστάτη.

PDGF-ΒΒ προωθεί την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης μεταξύ των β-κατενίνης και HIF-1α σε προστάτη κύτταρα

προηγούμενο μας μελέτες έδειξαν ένα σημαντικό ρόλο του HIF-1α σε οστό μεταστατικά κύτταρα προστάτη [25]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η επιμόλυνση ενός HIF-1α-ειδικό siRNA μείωσε σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης Mcl-1 σε ARCaP

Μ κύτταρα (Σχήμα 5Α), γεγονός που υποδηλώνει μπορεί να απαιτείται ότι HIF-1α για Mcl-1 ρύθμιση σε κύτταρα PCa. Για να εξεταστεί κατά πόσον PDGF-ΒΒ θα μπορούσε να επάγει φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ HIF-1α και β-κατενίνης, πυρηνικές πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν από ARCaP

Μ κυττάρων σε επεξεργασία με ΡϋΟΡ-ΒΒ για διάφορους χρόνους. Η ανάλυση στυπώματος Western βρήκαν ότι και οι δύο HIF-1α και β-κατενίνης ταχέως αυξήθηκαν στον πυρήνα (Σχήμα 5Β). Μία δοκιμασία συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι σε απόκριση PDGF-ΒΒ διέγερση, πυρηνική παρουσία β-κατενίνης ταχέως αυξήθηκε στους ανοσοκαθιζήματα HIF-1α (Σχήμα 5C, άνω πάνελ). Η αμοιβαία συν-ανοσοκατακρήμνιση με ένα αντίσωμα αντι-β-κατενίνης επιβεβαίωσε αυξημένη συσχέτιση των πυρηνικών HIF-1α με β-κατενίνης μετά την αγωγή PDGF-ΒΒ (Εικόνα 5C, κάτω πλαίσιο). Η ενισχυμένη συν-εντοπισμό της β-κατενίνης και HIF-1α πρωτεΐνες αποδείχθηκε περαιτέρω με συνεστιακή μικροσκοπία, η οποία φάνηκε να επιτύχετε τη μέγιστη ένταση στα 30 λεπτά μετά την PDGF-ΒΒ διέγερση (Σχήμα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε repsonse να PDGF-ΒΒ διέγερση, β-κατενίνης αλληλεπιδρά φυσικά με HIF-1α στον πυρήνα, η οποία μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του Mcl-1 μεταγραφή σε κύτταρα PCa.

(Α) Η επιδράσεις της εξάντλησης HIF-1α επί Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με HIF-1α ή ελέγχουν siRNA (30 ηΜ) για 72 ώρες, και αναλύθηκαν για Mcl-1 έκφραση μέσω ανοσοστύπωσης. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των αποτελεσμάτων του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης και HIF-1α σε ARCaP

κύτταρα Μ. (Γ) δοκιμασίες συνανοσοκαθίζηση των αποτελεσμάτων του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την αλληλεπίδραση μεταξύ β-κατενίνης και HIF-1α στον πυρήνα σε ARCaP

κύτταρα Μ. (D) συνεστιακή μικροσκοπία των αποτελεσμάτων των PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την συν-εντοπισμό της β-κατενίνης και HIF-1α στον πυρήνα σε ARCaP

κύτταρα Μ.

Η

Ένα υποτιθέμενο μοτίβο HRE απαιτείται για την ενεργοποίηση του PDGF-ΒΒ του Mcl-1 προαγωγό

HIF-1α δεσμεύεται με την HRE

cis

-Στοιχεία εντός των υποκινητών των γονιδίων υποξίας που ανταποκρίνεται και ρυθμίζει τους έκφρασης [31]. Εξετάσαμε αν PDGF-ΒΒ-επαγόμενη πυρηνική συσσώρευση του HIF-1α συσχετίστηκε με την ενεργοποίηση του HRE εξαρτώμενη μεταγραφή. Σε ARCaP

κύτταρα Μ, θεραπεία ΡϋΟΡ-ΒΒ αύξησε σημαντικά την έκφραση λουσιφεράσης καθοδηγείται από ένα τεχνητό υποκινητή HRE (pHIF-Ιυο) (Σχήμα 6Α). Είναι ενδιαφέρον, ένα υποθετικό μοτίβο HRE ταυτοποιήθηκε εντός της περιοχής υποκινητή της ανθρώπινης Mcl-1, το οποίο βρίσκεται ανάμεσα -900 και -884 νουκλεοτιδίων στο 5′-ανάντι του θέση έναρξης μεταγραφής [24]. Προκειμένου να διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος αυτού

cis

-element στη ρύθμιση PDGF του Mcl-1 μεταγραφή, χαρακτηρίσαμε μία διαγραφή μεταλλάγματος του υποτιθέμενου HRE μοτίβο χρησιμοποιώντας περιοχή προαγωγέα ανθρώπινης Mcl-1 ως το εκμαγείο (Σχήμα 6Β). Το προκύπτον κατασκεύασμα αναφοράς (ρ-Mcl-1-Luc: ΔHRE), ή το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης που κινείται από τον πλήρους μήκους Mcl-1 προαγωγό (ρ-Mcl-1-Luc), εκφράστηκε παροδικά σε ARCaP

Μ κυττάρων αντίστοιχα, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΡϋΟΡ-ΒΒ ή PBS. IL-6, η οποία έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν Mcl-1 μεταγραφής σε PCa και χολαγγειοκαρκίνωμα κυττάρων μέσω ενός μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (Stat3) -εξαρτώμενη μηχανισμός [32], [33], συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος. δοκιμασία λουσιφεράσης δραστηριότητα έδειξαν ότι το PDGF-ΒΒ επαγόμενη την ενεργοποίηση του ρ-Mcl-1-Luc υποκινητή σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι η IL-6 σε ARCaP

κύτταρα Μ. Σημαντικά, η διαγραφή του μοτίβου HRE μειώνεται όχι μόνο η βασική δράση του Mcl-1 προαγωγέα, αλλά κατήργησε επίσης τις επαγωγικές επιδράσεις του PDGF-ΒΒ σε δραστηριότητα ανταποκριτή. Αντίθετα, ρ-Mcl-1-Luc: ΔHRE, που περιέχει μια αλληλουχία Stat3 δεσμεύσεως στη θέση μεταξύ -92 και -83 [32], παρέμειναν ενεργοποιείται κατά IL-6 θεραπεία (Σχήμα 6C). Μια παρόμοια επίδραση της διαγραφής HRE σχετικά με την διαφορική απόκριση του Mcl-1 προαγωγό για να PDGF-ΒΒ και IL-6 παρατηρήθηκε επίσης σε C4-2 κύτταρα (Συμπληρωματικό Εικόνα S2). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεωρούμενη HRE

cis

-element απαιτείται για την ενεργοποίηση του PDGF-ΒΒ του Mcl-1 έκφραση σε κύτταρα PCa.

(Α) Τα αποτελέσματα του PDGF-ΒΒ από την HIF -1 δραστηριότητα δημοσιογράφος ARCaP

κύτταρα Μ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με HIF-1 ρεπόρτερ ή pGL3 για 24 ώρες, σε παντελή στέρηση ορού και επωάζονται παρουσία ή απουσία του PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 48 ώρες. (Β) Σχηματικό διάγραμμα του ανθρώπινου Mcl-1 υποκινητή και μετάλλαξη διαγραφής του κατά την υποθετική θέση HRE. (Γ) τα αποτελέσματα της διαγραφής του πιθανή θέση HRE σχετικά με τη ρύθμιση PDGF της δραστικότητας υποκινητή Mcl-1 σε ARCaP

κύτταρα Μ. IL-6 (200 ng /ml) συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος. (D) ChIP-Re-chip δοκιμασία των αποτελεσμάτων της θεραπείας PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για την σύνδεση της β-κατενίνης και HIF-1α σε ανθρώπινη περιοχή Mcl-1 προαγωγού σε ARCaP

κύτταρα Μ.

ΡϋΟΡ-ΒΒ προάγει την σύνδεση τόσο β-κατενίνης και HIF-1α σε περιοχή προαγωγού Mcl-1

Ερευνήσαμε αν ΡϋΟΡ-ΒΒ προωθείται ειδική σύνδεση και των δύο β-κατενίνης και HIF-1α προς Mcl-1 προωθητής από έναν προσδιορισμό διαδοχική chip. Κλασματοποιημένα χρωματίνη από ελέγχους και PDGF-ΒΒ αγωγή ARCaP

Μ κυττάρων ήταν αρχικά ανοσοκατακρημνίσθηκε με ένα αντίσωμα β-κατενίνης και τα ιζήματα υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία εκ νέου τσιπ με ένα αντίσωμα HIF-1α.