Αφηρημένο

Ιστορικό

προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν μια ρύθμιση προς τα κάτω της GRIM-19 στο πρωτογενών ανθρώπινων καρκίνων του τραχήλου, και την αποκατάσταση της GRIM-19 υποχώρηση που επάγεται όγκου. Η επαγωγή της καταστολής όγκου ρ53 πρωτεΐνης ουβικιτινίωση και αποδόμηση από Ε6 oncoportein υψηλού κινδύνου HPV μέσω σχηματίζοντας ένα σταθερό σύμπλοκο με E6AP θεωρείται ως κρίσιμο μηχανισμός για την ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας του όγκου. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί ο πιθανός ρόλος της GRIM-19 στη διάσωση της πρωτεΐνης p53 και την πρόκληση του τραχήλου της μήτρας απόπτωση των καρκινικών κυττάρων.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του GRIM-19 και ρ53 ανιχνεύθηκαν σε φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς από 45 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή για λόγους άλλους από νεοπλασίες του είτε στον τράχηλο ή το ενδομήτριο, του τραχήλου της μήτρας και ο καρκίνος των ιστών από 60 ασθενείς με μη μεταστατικό πλακώδη επιθηλιακά καρκινώματα. Συνανοσοκατακρήμνιση και δοκιμασία pull-down GST πραγματοποιήθηκαν για την εξέταση της αλληλεπίδρασης των GRIM-19 με 18E6 και E6AP

in vivo και in vitro

αντίστοιχα. Ο ανταγωνισμός των 18E6 με E6AP σε δεσμευτική GRIM-19 εκτελώντας δοκιμασίες ανταγωνισμού pull-down σχεδιάστηκε για να εξετάσει τη διάσπαση των σύνθετων Ε6 /E6AP από GRIM-19. Η Επαυξημένης του E6AP ουβικιτινίωση με GRIM-19 ανιχνεύτηκε in vivo και in vitro δοκιμασία ουβικιτινίωση. Τα αποτελέσματα του GRIM-19 εξαρτώμενη-συσσώρευση ρ53 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση διερευνήθηκαν με ΜΤΤ, κυτταρομετρία ροής και μικροσκοπία ηλεκτρονίων μετάδοσης αντίστοιχα. Η καταστολή του όγκου ανιχνεύθηκε με το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα επίπεδα της GRIM-19 και p53 ήταν ταυτόχρονα προς τα κάτω ρυθμίζονται στους καρκίνους του τραχήλου. Η αποκατάσταση των GRIM-19 μπορεί να επάγει ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του E6AP, και να διαταράξει το συγκρότημα /Ε6ΑΡ E6 μέσω της αλληλεπίδρασης του Ν-άκρου της GRIM-19 τόσο με Ε6 και Ε6ΑΡ που προστατεύονται από την αποικοδόμηση της ρ53 και προώθησε την κυτταρική απόπτωση. μελέτες όγκων ξενομοσχεύματος αποκάλυψε επίσης την καταστολή της υποβάθμισης του p53 παρουσία GRIM-19. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η GRIM-19 μπορεί να μπλοκάρει Ε6 συγκρότημα /E6AP? και συνεργικά καταστέλλουν την ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας όγκου με p53

Παράθεση:. Zhou Υ, Wei Υ, Zhu J, Wang Q, Bao L, Ma Y, et al. (2011) GRIM-19 διαταράσσουν Ε6 /E6AP Συγκρότημα για τη διάσωση p53 και επάγουν απόπτωση σε καρκίνους του τραχήλου. PLoS ONE 6 (7): e22065. doi: 10.1371 /journal.pone.0022065

Επιμέλεια: Scott A. Coonrod, το Cornell University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Απρ του 2011? Αποδεκτές: 14, Ιουν 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιούλη, 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Program): 2007CB914503 https://www.973.gov.cn, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81071683, 81001168 81072127 και 91029710) http: //www.nsfc .gov.cn, «ενδέκατη πενταετές» Εθνικό πρόγραμμα Στήριξης Τεχνολογίας (2008BAI57B03) https://kjzc.jhgl.org, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί CA105005, CA78282 και Ρ30-CA134274 https://grants.nih.gov. έργο Anhui Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (20090413117, 11040606M178) https://www.ahkjt.gov.cn, και επαρχιακού Φυσικών Επιστημών Ερευνητικό Πρόγραμμα της Anhui Provincial Ανώτατη Πανεπιστημιακή Εκπαίδευση (KJ2010B375) https://www.ahedu.gov.cn/. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υψηλού κινδύνου ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HR-HPV), όπως HPV18 και HPV16, δεν είναι μόνο μια σημαντική αιτία του καρκίνου [1] του τραχήλου της μήτρας, αλλά και τα παθογόνα από ένα υποσύνολο των άλλων όγκων, όπως το κεφάλι και λαιμού πλακωδών καρκινωμάτων [2], του καρκίνου του πνεύμονα [3] καρκίνο ανώτερης αναπνευστικής οδού [4] και τον καρκίνο anogenital [5]. Η έκφραση ιικών ογκοπρωτεϊνών Ε6 σε καρκινώματα του τραχήλου HPV-θετικών [6] μπορεί να αλληλεπιδράσει με το Ε6 σχετιζόμενη πρωτεΐνη (E6AP) για να σχηματίσει Ε6 σύμπλοκο /Ε6ΑΡ που επάγει ειδικά ουβικιτινίωση και ταχεία αποικοδόμηση της ρ53, η πυρηνική μεταγραφή παράγοντα Χ-box δέσμευσης 91 (NFX1-91) και ΡΟΖ πρωτεΐνες που περιέχει την περιοχή μέσω της οδού πρωτεασώματος [7], [8], [9], [10]. υποβάθμιση του p53 αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την επιβίωση των όγκων HR-HPV-μολυνθεί? έτσι μπλοκάροντας Ε6 /E6AP συγκρότημα υποβάθμιση διαμεσολαβητικό p53 μπορεί να είναι μια ελκυστική προσέγγιση για τη θεραπεία των καρκίνων με λοίμωξη HR-HPV [11], [12], [13], [14].

GRIM-19 ταυτοποιήθηκε αρχικά ως μια πρωτεΐνη όγκου-κατασταλτικό που εμπλέκονται σε κυτταρικό θάνατο [15] μέσω της σύνδεσης και καταστολή της STAT3 [16], [17]? Η έκφρασή του ρυθμίζεται προς τα κάτω σε νεφρική, του προστάτη και του τραχήλου της μήτρας [16], [17], [18], [19], [20]. Επιπλέον, GRIM-19 καταστέλλει την επαγόμενη ογκογονίδιο αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού και κυτταρικής κινητικότητας [21]? και εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω αλληλεπίδρασης με ογκοκατασταλτικό p16INK4a [22]. Έτσι, GRIM-19 ασκεί διακριτούς μηχανισμούς σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων. Εδώ αναφέρουμε ότι GRIM-19 επάγει τη συσσώρευση p53 μέσω διακοπής του συγκροτήματος Ε6 /E6AP και επαγωγή της αυτόματης ουβικιτινίωση E6AP του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Αυτή η μελέτη δείχνει μια νέα λειτουργία και μοριακό μηχανισμό με τον οποίο GRIM-19 αναστέλλει HR-HPV που προκαλείται ογκογένεση με την προστασία των p53 από την υποβάθμιση.

Αποτελέσματα

GRIM-19 και p53 είναι ταυτόχρονα προς τα κάτω σε τραχήλου της μήτρας καρκίνοι

προηγουμένως μελέτη μας έδειξε ότι GRIM-19 επάγει υποχώρηση του όγκου του τραχήλου της μήτρας σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή ρόλο των GRIM-19 στη ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου [20]. Από καταστολέας όγκου ρ53 είναι επίσης χαμηλό εκφράζεται σε όγκους του τραχήλου της μήτρας, εξετάσαμε περαιτέρω αν υπάρχει ένας συσχετισμός μεταξύ των επιπέδων GRIM-19 και ρ53. Τα επίπεδα του GRIM-19 και ρ53 ήταν σημαντικά (

ρ

& lt? 0,01) χαμηλότερη στους όγκους, και συσχετίζονται άμεσα μεταξύ τους σε & gt? 99% του τραχήλου της μήτρας όγκων (Σχ. 1). Συνεπής με χαμηλό p53 στους όγκους, ένας καλά μελετημένη γονιδίου στόχου ρ53, Puma, επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω στους όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς (Εικ. 1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GRIM-19 και p53 επίπεδα ήταν ταυτόχρονα καταστέλλεται, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή σύνδεση μεταξύ GRIM-19 και p53 στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

(A) Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα (50 μg) από πρωτογενείς όγκους του τραχήλου της μήτρας (Τ ) και φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς (Ν) εξετάστηκαν για την έκφραση της GRIM-19, ρ53 και PUMA με κηλίδωση Western. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της κηλίδωσης Western δείχνεται. Τ1-Τ4 ήταν από μεμονωμένους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Τ1 και Τ2 διαγνώστηκαν ως στάδιο ΙΙα? και Τ3 και Τ4 διαγνώστηκαν ως στάδιο Ια πλακώδη επιθηλιακά καρκινώματα. (Β) Ποσοτική ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης όπως μετράται με την οπτική πυκνότητα κάθε ζώνης. Η αναλογία της πυκνότητας από GRIM-19, ρ53, PUMA πάνω από το αντίστοιχο GAPDH (45 περιπτώσεις του φυσιολογικού ιστού και 60 περιπτώσεις του ιστού του όγκου) υπολογίσθηκε.

Η

GRIM-19 αυξάνει τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 σε του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ GRIM-19 και p53, τα κύτταρα HeLa είτε με υπερέκφραση (pG19) ή νοκ ντάουν (siG19) της GRIM-19 χρησιμοποιήθηκαν, και τα επίπεδα των GRIM-19 και p53 αξιολογήθηκαν με κηλίδωση Western (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε σύγκριση με τον αντίστοιχο μάρτυρα (ρ /SICON) κύτταρα, ρ53 και γονιδίων στόχων του PUMA και ρ21 αυξήθηκε σε HeLa /κυττάρων pG19 (Εικ. 2Α, αριστερό πάνελ) και μειώθηκε σε HeLa /κύτταρα siG19 (Σχήμα 2Α, δεξιά πάνελ ). Επιπλέον, δύο άλλες τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, SiHa και CaSki, επιμολύνθηκαν είτε με μια ζοφερή-19 πλασμίδιο έκφρασης ή dsRNA στοχεύουν GRIM-19 και σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους. Αποτελέσματα παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν σε HeLa ελήφθησαν σε αυτά τα κύτταρα πολύ (Εικ. 2Β). Επιπλέον, οι δοκιμές επί άλλων HPV-free κυτταρικές γραμμές όγκου (Α549 και HO8910) δεν αποκάλυψαν τα ίδια αποτελέσματα όπως παρατηρείται σε HeLa (Σχ S1). Έτσι, τα επίπεδα του GRIM-19 συσχετίζονται απευθείας με αυτές του ρ53 σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα

. (Amp A &? Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης GRIM-19 και ρ53 σε πρωτογενείς καρκίνους του τραχήλου. Κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα διεξήχθη χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. (C) Επίδραση της GRIM-19 στην έκφραση του mRNA p53. Το mRNA της GRIM-19 (αριστερό πάνελ) σημαντικά υψηλή περιεκτικότητα σε HeLa /κύτταρα pG19 (*

σ

& lt? 0.01), ο δεξιός πίνακας δείχνει την έκφραση του mRNA p53. Οι διαφορές δεν είναι στατιστικά σημαντικές. (D) GRIM-19 δεν επηρέασε την δραστικότητα ρ53 υποκινητή. Ένας δημοσιογράφος p53-Luc χρησιμοποιήθηκε. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με δείγματα εις τριπλούν σε κάθε δοκιμή. (Ε) GRIM-19 αυξάνει την ημιζωή του ρ53. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CHX (100 μg /ml) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα και τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν για κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από ένα από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχνεται (αριστερό πάνελ). Το υπόλοιπο αξία για ρ53 υπολογίστηκε ως ο λόγος των τιμών πυκνομετρική της ρ53 επί GAPDH σε κάθε δείγμα (δεξί πάνελ). Οι μέσες υπόλοιπες τιμές από τρία ανεξάρτητα πειράματα απεικονίζονται. (F) GRIM-19 ανέστειλε την υποβάθμιση του p53

in vivo

. Πριν τη συλλογή των κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 για 4 ώρες, και ανοσοκαταβύθιση με αντίσωμα p53 διεξήχθη. Κηλίδωση Western των προϊόντων ΠΕ χρησιμοποιώντας αντίσωμα ουβικιτίνης. αντισώματα GAPDH χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η συγκρίσιμη φόρτωση.

Η

Για να διερευνηθεί αν GRIM-19 αυξήθηκε ρ53 μέσω μεταγραφικής ρύθμισης, τα επίπεδα του mRNA p53 εξετάστηκαν με ποσοτικό προσδιορισμό RT-PCR και αναφοράς λουσιφεράσης εκτελέστηκαν σε HeLa /PCON και HeLa /pG19 κύτταρα. Το επίπεδο του mRNA p53 ήταν ανεπηρέαστη από υπερέκφραση GRIM-19 (Σχ. 2C). Επιπλέον, ρ53 υποκινητή γνώμονα ανταποκριτή λουσιφεράσης δεν αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές στην δραστικότητα της ρ53 υποκινητή σε HeLa /PCON και κύτταρα HeLa /pG19 (Εικ. 2D), γεγονός που υποδηλώνει ότι GRIM-19 δεν εμπλέκεται στη μεταγραφική ενεργοποίηση του ρ53.

τραχήλου όγκους, ρ53 σπάνια μεταλλαγμένο [23], και αυτό αποικοδομείται ταχύτατα από Ε6 /Ε6ΑΡ [6], [24], εξετάσαμε έπειτα είτε αύξηση των επιπέδων ρ53 οφείλεται σε αυξημένη ημίσεια ζωή της πρωτεΐνης . HeLa /pG19 και HeLa /κυττάρων PCON υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα επίπεδα κυκλοεξιμίδιο και πρωτεΐνη p53 παρακολουθήθηκαν συναρτήσει του χρόνου. Πράγματι, ο χρόνος ημιζωής της πρωτεΐνης p53 ήταν σημαντικά (

ρ

& lt? 0,01) παρατεταμένος σε HeLa κύτταρα /pG19 σύγκριση με HeLa /κύτταρα PCON (Σχήμα 2Ε)..

In vivo

δοκιμασία ουβικιτινίωση έδειξε επίσης ότι ουβικιτινιωμένες ρ53 σε HeLa κύτταρα /pG19 μειώθηκε δραματικά σε σύγκριση με HeLa /κύτταρα PCON (Σχήμα 2F).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GRIM-19 αποκατασταθεί επίπεδα p53 μέσω σταθεροποίησης πρωτεΐνης και όχι μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω του τραχήλου της μήτρας όγκους.

GRIM-19 σταθεροποιεί πρωτεΐνη p53 με την αλληλεπίδραση με θεωρείται Ε6 και E6AP πρωτεΐνες

Ε6 /E6AP μεσολάβηση της υποβάθμισης p53 ως ένα σημαντικό μηχανισμό για την έναρξη και την ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα [23], [25]. Από GRIM-19 δεσμεύεται να 16E6 [26], υποθέσαμε ότι GRIM-19 παρεμβαίνει με πολύπλοκες Ε6 /E6AP, προστατεύοντας έτσι p53 από την υποβάθμιση. Χρησιμοποιώντας προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης με κυτταρολύματα από κύτταρα HeLa, βρήκαμε την αλληλεπίδραση του GRIM-19 με E6AP

in vivo

(Εικ. 3Α). Στη συνέχεια εξετάστηκε η αλληλεπίδραση GRIM-19-E6AP

in vitro

με δοκιμασίες pull-down GST. E6AP κωδικοποιεί τρία διαφορετικά ισόμορφα πρωτεΐνη (I, II και III) που διαφέρουν σε Ν τερματικό ουρές τους, τα οποία έχουν την ικανότητα να διεγείρουν Ε6 μεσολάβηση ουμπικιτίνης εξαρτώμενη αποικοδόμησης της ρ53 πρωτεΐνης [27]. Επειδή πολλές λειτουργικές περιοχές του E6AP είχε προηγουμένως εντοπιστεί [28], δημιουργήσαμε τρία ανασυνδυασμένα πλασμίδια που εκφράζουν His-tagged E6AP-ΙΙΙ εξαλείψεις ισομορφή που βασίζεται: pE6AP-Δ1 (1-286 αα), pE6AP-Δ2 (287-521 αα) και pE6AP-Δ3 (522 – 872 αα). θέσεις σύνδεσης E6 βρίσκονταν μεταξύ αα 287-521 του E6AP-ΙΙΙ, ενώ η περιοχή HECT για θέσεις δέσμευσης ubiquitin βρισκόταν στο τμήμα από 522-872 aa (Σχ. 3C) [29]. Βρήκαμε ότι μόνο E6AP-Δ3 δεσμεύεται σε GST-tagged GRIM-19 με δοκιμασία pull-down GST (Σχ. 3Β-C), αλλά όχι το καταλυτικά ανενεργό E6AP που περιέχει μια μετάλλαξη σε Cys στη θέση 840 (Σχ S2), αυτά τα αποτελέσματα υποστήριξε το συμπέρασμά μας ότι GRIM-19 μπορεί να δεσμεύσει τον τομέα HECT της E6AP. Για να χαρτογραφήσει την ακριβή αλληλεπιδρούν περιοχή της GRIM-19 με E6AP, χρησιμοποιήσαμε GST-tagged GRIM-19 διαγραφές pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Δ2 και pGST-G19-Δ3? Και διαπίστωσε ότι τα αμινοξέα 1-35 της GRIM-19 ήταν επαρκείς για δέσμευση πρωτεϊνών E6AP (Σχ. 3D).

δοκιμασίες (Α) Συν-ανοσοκαταβύθιση διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η αλληλεπίδραση μεταξύ GRIM-19 με E6AP

in vivo

. Τα κυτταρολύματα από κύτταρα HeLa ανοσοκαταβυθίστηκαν με φυσιολογική IgG και αντι-GRIM-19 αντισώματα και Western αποτύπωμα με αντι-E6AP. Input (preIP) λωρίδα αντιπροσωπεύει το 10% του εκχυλίσματος που χρησιμοποιείται στην αντίδραση ανοσοκαθίζησης. HC = IgG βαριάς αλυσίδας. (Β) πειράματα pull-down GST πραγματοποιήθηκαν για την εξέταση της αλληλεπίδρασης των His-tagged διαγραφές E6AP με GST-συντηγμένο GRIM-19 πρωτεΐνη

in vitro

. (C) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει E6AP διαφόρων λειτουργικών πεδίων, συμπεριλαμβανομένων των θέσεων δέσμευσης για GRIM-19. (Δ) Η αλληλεπίδραση του GST-GRIM-19 διαγραφές με E6AP. * Υποδηλώνει τη θέση της ζώνης με σωστό μοριακό μέγεθος. (Ε) δοκιμασίες συνανοσοκαθίζησης διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η αλληλεπίδραση μεταξύ GRIM-19 με 18E6. Τα κυτταρολύματα από κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με τον p18E6-Flag υποβλήθηκαν σε ΙΡ με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Input (preIP) λωρίδα αντιπροσωπεύει το 10% του εκχυλίσματος που χρησιμοποιείται στην αντίδραση ανοσοκαθίζησης. LC = IgG ελαφριά αλυσίδα. (F) Η αλληλεπίδραση του GST-GRIM-19 διαγραφές με 18E6. * Υποδηλώνει τη θέση της ζώνης με σωστό μοριακό μέγεθος. (G) χαρτογράφηση διαγραφή των θέσεων δέσμευσης Ε6 ή E6AP στο GRIM-19.

Η

Έχουμε αναφέρει την αλληλεπίδραση των GRIM-19 με 16E6 πριν [26], τότε να διερευνηθεί η συσχέτιση της GRIM -19 και 18E6. Λόγω της χαμηλής έκφρασης των Ε6 και φτωχή αντιδραστικότητα των διαθέσιμων αντισωμάτων Ε6 που έχουν αναφερθεί από έναν αριθμό δημοσιεύσεων [30], [31], [32], [33], δεν καταφέραμε να ληφθεί μια ικανοποιητική 18E6 κηλίδος Western από το κυτταρικά λύματα. Ως εκ τούτου, ένα πλασμίδιο p18E6 σημαία που εκφράζει μια σημαία-tagged 18E6 πρωτεΐνη κατασκευάστηκε. Μέσω προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης σε κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με p18E6-Flag, βρήκαμε 18E6 συν-κατακρημνίζεται με GRIM-19

in vivo

(Σχ. 3Ε). Για να χαρτογραφήσει την ακριβή αλληλεπιδρούν περιοχή της GRIM-19 με 18E6, χρησιμοποιήσαμε τη θέση σύνδεσης της GRIM-19 με 18E6 χρησιμοποιώντας GST-tagged GRIM-19 διαγραφές (pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Δ2 και pGST-G19- Δ3)? Και διαπίστωσε ότι τα αμινοξέα 1-35 της GRIM-19 ήταν επαρκή για τη δέσμευση των πρωτεϊνών 18E6

in vitro

(Εικ. 3F).

Ως εκ τούτου, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι GRIM-19 μπορεί να συνδεθεί τόσο 18E6 και E6AP

in vivo και in vitro

, το οποίο θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην πρωτεΐνη συσσώρευση p53.

GRIM-19 διαταράσσει Ε6 /E6AP πολύπλοκο και να αυξήσει E6AP ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση

Δεδομένου ότι τόσο 18E6 και Ε6ΑΡ-Δ3 μπορεί να αλληλεπιδράσει με τα αμινοξέα 1-35 του Ν άκρου του GRIM-19 (Εικ. 3G), προσδιορίσαμε αν 18E6 ανταγωνίστηκε με E6AP στην πρόσδεση GRIM-19 εκτελώντας δοκιμασίες ανταγωνισμού pull-down. Με την παρουσία της καθαρισμένης πρωτεΐνης GST-G19 και την αύξηση της ποσότητας του E6AP-Δ3, η σύνδεση του 18E6 να GRIM-19 προοδευτικά μειώνεται καθώς E6AP-Δ3 αυξημένη (Σχ. 4Α). Αν και Ε6ΑΡ-Δ2 απέτυχαν να αλληλεπιδράσουν με GST-G19, είναι γνωστό ότι αυτή η περιοχή φιλοξενεί θέσεις Ε6 δέσμευσης [28]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν GST-G19 και E6AP-Δ2 ανταγωνίζονται στη δέσμευση με 18E6. Με την παρουσία του E6AP-Δ2, GST-G19-δεσμεύεται 18E6 μειώθηκε σε σύγκριση με 18E6 παρουσιάζονται μόνα τους (Εικ. 4Β). Επιπλέον, δεν παρατηρήσαμε μια ένωση E6AP-Δ2 με GST-G19 με την παρουσία του 18E6, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες δεν μπορούν να σχηματίσουν μια ετεροτριμερή συγκρότημα του 18E6 /E6AP-Δ2 /GST-G19.

(Α ) ανταγωνιστική προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για να αναλυθεί η πρόσδεση του 18E6 σε GST-GRIM-19 πρωτεΐνη σύντηξης σε παρουσία αυξανόμενων ποσοτήτων E6AP-Δ3 που κυμαίνονται από 0-6 μg. (Β) Τραβήξτε προς τα κάτω πειράματα για να προσδιοριστεί η δέσμευση του 18E6 σε GST-GRIM-19 πρωτεΐνες. Όπου ενδείκνυται πρωτεΐνες E6AP-Δ2 (10 μg) προστέθηκαν σε αντίδραση pull-down GST. (C) GRIM-19 επαυξημένης E6AP υποβάθμιση

in vivo

. Πριν τη συλλογή των κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 για 4 ώρες, και ανοσοκαταβύθιση με αντίσωμα E6AP διεξήχθη. Κηλίδωση Western των προϊόντων ΠΕ χρησιμοποιώντας αντίσωμα ουβικιτίνης. αντισώματα GAPDH χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η συγκρίσιμη φόρτωσης. (D)

In vitro

E6AP δοκιμασία ουβικιτίνωσης. Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ουβικιτίνη, Ε1, Ε2 (UbcH5c), batereria-εκφράζεται και καθαρίζεται GST και GTS-GRIM-19, E6AP (άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη καταλυτικά ανενεργός CA) από εκχύλισμα φύτρου σίτου αναμίχθηκαν για

in vitro

δοκιμασία ουμπικουιτίνωση E6AP και ανοσοαποτύπωση με ουβικιτίνης αντίσωμα. (Ε) κυτταρολύματα Σύνολο από κύτταρα HeLa που εκφράζουν τις υποδεικνυόμενες πλασμίδια έκφρασης ήταν Western αποτύπωμα με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Έχει εδραιωθεί ότι E6AP μπορεί η ίδια στόχευση για ουβικιτινίωση, η οποία αντιπροσωπεύει ένα μηχανισμό για τον έλεγχο δική ημιζωή της [7], [34]. Εμείς στη συνέχεια να διερευνήσει εάν η έκφραση του GRIM-19 μπορεί να επηρεάσει την αποικοδόμηση του E6AP, παρουσία υπερεκφράζεται GRIM-19, ουβικιτινιωμένες E6AP σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με HeLa /κύτταρα PCON (Εικ. 4C). In vitro ουβικιτινίωση δοκιμασία έδειξε ότι GRIM-19 αύξησε την autoubiquitination του άγριου τύπου E6AP, αλλά όχι κυρίαρχη-αρνητική CA μεταλλαγμένο της χρησιμοποιώντας καθαρίζεται Ε1 και Ε2 (UbcH5c), βακτήρια-εκφράζεται GRIM-19, και άγριου τύπου E6AP και CA μεταλλαγμένο E6AP μεταφραστεί σε σύστημα εκχύλισμα φύτρου σιταριού (Εικ. 4D). Πράγματι, βρήκαμε E6AP πρωτεΐνη μειώθηκε σε κύτταρα με υπερέκφραση GRIM-19 (Εικ. 4Ε, S1).

Εν ολίγοις, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι GRIM-19 αποτρέπει την υποβάθμιση του p53 με την παρεμπόδιση σχηματισμού Ε6 /E6AP συγκρότημα και προωθεί ουβικιτινίωση και υποβάθμιση των E6AP.

GRIM-19 καθυστερήσεις G0 /G1 μετάβαση, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση, και να προωθηθεί η συσσώρευση ρ53 in vivo

Δεδομένου ότι επαγωγές διακοπής κύκλου κυττάρου και την κυτταρική ανάπτυξη καταστολή είναι οι κύριες λειτουργίες του p53, αξιολογήσαμε την επόμενη το αποτέλεσμα της GRIM-19 που εξαρτάται από τη σταθεροποίηση p53 σε κυτταρικό κύκλο. αναλύσεις Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν σημαντικά καθυστερημένη μετάβαση G0 /G1 σε HeLa κύτταρα /pG19 όταν συγκρίνεται με HeLa /κύτταρα PCON (Πίνακας 1). Επιπλέον, όπως υποδεικνύεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός των HeLa κυττάρων /pG19 ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,05). Κατασταλεί την ημέρα 3 και την ημέρα 4 (Εικ. 5Α) σε σύγκριση με HeLa κύτταρα /PCON

(Α ) Μία δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη στις ενδεικνυόμενες κύτταρα. ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως στο Υλικά και Μέθοδοι. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SE των 8 δειγμάτων. (Β) Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του HeLa /PCON και κύτταρα HeLa /pG19 εξετάστηκαν με μικροσκοπία ηλεκτρονίων μετάδοσης. Συμπύκνωση της χρωματίνης, την επέκταση και διεύρυνση των κενών πυρηνική μεμβράνη, ασαφής δομή πυρηνική μεμβράνη, κατάγματα της πυρηνικής μεμβράνης και ενδοπλασματικό δίκτυο επέκταση υποδείχθηκαν με βέλη. ER, ενδοπλασματικό δίκτυο? NM, πυρηνική μεμβράνη. (Γ) Το πλήρες μήκος και διασπάται μορφή της κασπάσης-3 και PARP σε HeLa /PCON και κύτταρα HeLa /pG19 προσδιορίστηκαν με αναλύσεις στυπώματος Western. (D) HeLa /Con και HeLa /G19 κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε 6-εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (10 ποντικοί για κάθε κυτταρική σειρά) και αναπτύχθηκαν για 6 εβδομάδες. Οι όγκοι συλλέχθηκαν, και μετρήθηκαν τα βάρη. Τα δεδομένα παρουσιάζουν τη μέση τιμή των 10 όγκων σε κάθε ομάδα. (Ε) Η έκφραση του GRIM-19, ρ53, ρ21, Puma, ρ27 και E6AP στους όγκους που προέρχονται από ποντικούς όπως προσδιορίζεται με στύπωμα Western αναλύσεις, και τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα που παρουσιάζονται. (F) Ένα μοντέλο για τη συνεργασία μεταξύ των GRIM-19 και p53. Όταν GRIM-19 είναι παρόν σε υψηλά επίπεδα, αλληλεπιδρά με το σύμπλεγμα Ε6 /Ε6ΑΡ, προωθεί ουβικιτινίωση τους, έτσι, την πρόληψη της υποβάθμισης ρ53. Η απώλεια της GRIM-19 επιτρέπει την επίθεση των πολύπλοκων Ε6 /E6AP για p53 και την υποβάθμιση του μέσω του πρωτεασώματος.

Η

Επειδή την προώθηση της κυτταρικής απόπτωσης είναι μια άλλη βασική λειτουργία του p53, πραγματοποιήσαμε κυτταρική απόπτωση δοκιμασίες συμπεριλαμβανομένων μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία (ΤΕΜ) και κηλίδωση Western με κασπάσης 3 και PARP αντισώματα. Μια σειρά από νωρίς τα χαρακτηριστικά της απόπτωσης, αναφέρονταν σε κύτταρα HeLa /pG19, συμπεριλαμβανομένων συμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης, διευρύνθηκε χάσμα πυρηνική μεμβράνη, ασαφής δομή πυρηνική μεμβράνη, κατάγματα της πυρηνικής μεμβράνης και ενδοπλασματικό δίκτυο επέκταση? Ωστόσο, αυτά τα φαινόμενα δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HeLa /PCON (Εικ. 5Β βέλη). Επιπλέον, η διάσπαση της κασπάσης 3 και PARP ήταν αυξημένη σε HeLa κύτταρα /pG19 σύγκριση με HeLa /κύτταρα PCON (Εικ. 5C).

Βρήκαμε επίσης τα βάρη των όγκων στα ποντίκια μεταμοσχευμένα με HeLa κύτταρα /pG19 ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με αυτά των ομάδων ελέγχου (

ρ

& lt? 0,05) (Εικ. 5D). GRIM-19 και ρ53, μαζί με ρ21, πρωτεΐνες PUMA και ρ27 ήταν σημαντικά αυξημένη, αλλά E6AP μειώθηκε στους όγκους που προέρχονται από HeLa κύτταρα /pG19 συγκριτικά με όγκους από κύτταρα HeLa /PCON (Σχ. 5Ε).

Τέλος, με βάση τις παρατηρήσεις μας, ένα μοντέλο για GRIM-19 επάγεται κυτταρικής απόπτωσης με διάσπαση του συμπλόκου Ε6 /Ε6ΑΡ και σταθεροποιητικό ρ53 σκεφτεί (Εικ. 5F). Αυτό το μοντέλο προτείνει ότι η παρουσία του GRIM-19 προάγει την αυτόματη ουβικιτινίωση και υποβάθμιση των E6AP μέσω αλληλεπίδρασης με αυτές τις πρωτεΐνες και συμβάλλει στην σταθεροποίηση p53, διακοπή της ανάπτυξης και της απόπτωσης.

Συζήτηση

υψηλού κινδύνου οι ανθρώπινοι ιοί θηλωμάτων (HR-HPV), όπως HPV18 και HPV16, που συνδέονται με 99,7% των καρκίνων του τραχήλου [35], τα οποία είναι τα πιο κοινά γυναικολογικούς όγκους στις αναπτυσσόμενες χώρες [36]. Οι ιικές ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 εκφράζονται σε καρκινώματα του τραχήλου HPV-θετικών [6], ενώ η ιική πρωτεΐνη Ε2 καταστέλλει τη μεταγραφή των ογκογονιδίων Ε6 /Ε7 και ενεργοποιεί την αντιγραφή ιϊκού DNA μαζί με το ιικό ελικάσης Ε1 [37], [38], [39]. Το Ε6 /Ε6ΑΡ μεσολάβηση αποικοδόμησης της ρ53 θεωρείται πλέον σημαντικός μηχανισμός στην έναρξη και ανάπτυξη των καρκίνων του τραχήλου [6], [11], [12], [25], [40], [41]. Πρόσφατες μελέτες πρότειναν ότι παρεμβολή του συμπλόκου Ε6 /Ε6ΑΡ μπορεί να σκοτώσει τραχήλου όγκους με την αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης p53 [11], [12], [40]. Στη μελέτη μας, σας παρουσιάζουμε μια νέα προσέγγιση για την πρόληψη της υποβάθμισης του p53 από την αποκατάσταση της GRIM-19 που διαταράσσει το συγκρότημα /E6AP Ε6.

Έχει αναφερθεί ότι GRIM-19 μπορεί να καταστείλει μεταγραφική δραστηριότητα της STAT3 μέσα σε πρωτεΐνες ανάπτυξη πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης, και αναστέλλουν τον καρκίνο [16], [17]. STAT3 έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την έκφραση της ρ53 μέσω μεταγραφικής καταστολής στα μονοπάτια σηματοδότησης ογκογονίδιο επαγόμενη src σε ορισμένες κυτταρικές σειρές τρωκτικών [42]. Μερικές μελέτες σε κυτταρικές σειρές καρκίνου έδειξαν συσχέτιση μεταξύ υψηλής συστατική δραστηριότητα STAT3 και του γονιδίου p53 μεταλλάξεις, αν και δεν είχαν καθοριστεί οι σχέσεις αιτίας και αποτελέσματος [43]. Σε ορισμένες κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκινώματα, την κατάσταση της ρ53 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση που προκαλείται από γονιδιακή NF-κΒ και STAT3 [44]. Έχουμε δείξει σε προηγούμενες δημοσίευση μας ότι GRIM-19 απώλεια συσχετίζεται με υψηλή δραστηριότητα STAT3 στην πρωτοβάθμια καρκίνων του τραχήλου [20]. Παρά το γεγονός ότι τέτοιες παρατηρήσεις δείχνουν μια πιθανότητα ότι η απώλεια της GRIM-19 προάγει την υψηλή δραστηριότητα STAT3 η οποία θα μπορούσε τελικά να μεταγραφικά προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης p53, οι μελέτες μας δεν αποκαλύπτουν (εικ 2C & amp?. Δ) οποιεσδήποτε αλλαγές στην έκφραση της λουσιφεράσης καθοδηγείται από την ανθρώπινη ρ53 υποκινητή και του mRNA ενδογενούς ρ53. Ως εκ τούτου, STAT3 απορρύθμιση μπορεί να μην έχουν άμεση συνέπεια στην έκφραση p53 στο μοντέλο μας. Έτσι, δύο GRIM-19 ανεξάρτητες οδούς: 1) μία ενεργοποίηση STAT3 και 2) μία ρύθμιση προς τα κάτω της ρ53 να συμβαίνουν ταυτόχρονα σε HPV μετασχηματισμένα καρκινώματα του τραχήλου για την προώθηση ογκογένεση μετά την απώλεια του GRIM-19 έκφρασης. Το πιο σημαντικό, παρεμβολή με την έκφραση STAT3 χρησιμοποιώντας RNA

i

ή τη λειτουργία του με τη χρήση κυρίαρχο αρνητικό προσεγγίσεις (Σχ S3) δεν μετέβαλε σημαντικά τη ζοφερή-19 συνέπειες για τη σταθεροποίηση p53. Ως εκ τούτου, η σταθεροποίηση της πρωτεΐνης p53 από GRIM-19 φαίνεται να λαμβάνει χώρα ανεξάρτητα από STAT3.

Σε αυτό το έγγραφο, ελέγξαμε επίσης αν GRIM-19 αναστέλλει την αποδόμηση ρ53 απουσία του Ε6. Δύο HPV αρνητικά κύτταρα HO8910 και Α549 που και οι δύο περιέχουν άγριου τύπου ρ53 [45] εξετάστηκαν για έκφραση p53 τους μετά υπερέκφραση του GRIM-19. Αν και GRIM-19 ήταν σε θέση να αυξήσει την αποικοδόμηση των E6AP σε αυτά τα δύο κύτταρα, τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 παρέμειναν αμετάβλητες (Σχ S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι GRIM-19 είναι σε θέση να αποτρέψει Ε6-εξαρτώμενη αποδόμηση ρ53.

Πρόσφατες εκθέσεις απέδειξαν ότι GRIM-19 μπορεί να αλληλεπιδράσει με κάποια άλλα σημαντικές φυσιολογικές πρωτεΐνες όπως HtrA2 [46]? Επιπλέον, ιικές πρωτεΐνες όπως U95 και vIRF1 μπορεί επίσης να συνδεθεί με GRIM-19 [21], [26], [47]. Έχουμε δείξει στο παρελθόν σύνδεσης μεταξύ 16E6 και GRIM-19 [26]? εδώ, βρήκαμε επίσης την αλληλεπίδραση του GRIM-19 με 18E6 και E6AP

in vivo

και

in vitro

, και η επαγωγή της αποδόμησης autoubiquitination του E6AP με GRIM-19. Στην HR-HPV λοίμωξη του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, GRIM-19 ήταν σε θέση να προκαλέσει συσσώρευση της πρωτεΐνης ρ53 και να αυξήσει τα γονίδια-στόχους της ρ53 όπως ρ21 και PUMA. Επιπλέον, παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στο προφίλ κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και τα χαρακτηριστικά μορφολογικά σημάδια απόπτωσης σε κύτταρα HeLa υπερέκφραση του GRIM-19. Έτσι, GRIM-19 και p53 μπορεί συνεργικά να καταστείλει του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

E6AP είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή της υποβάθμισης του p53 σε ανθρώπινους καρκίνους του τραχήλου σε ένα εξαρτώμενο τρόπο Ε6. Εκτός fromp53, Ε6 σύμπλοκο /Ε6ΑΡ έχει αναφερθεί ότι παρεμβαίνει σε αρκετές κυτταρικές λειτουργίες [48], συμπεριλαμβανομένων μεταγραφικοί ενεργοποιητές, όπως IRF3, συν-ενεργοποιητές όπως ASP300, επαγωγείς απόπτωσης όπως Bak, GADD34, procaspase-8 και τον προσαρμογέα ΡΑϋϋ, πρωτεϊνικές κινάσες της όπως Tyk2, προσκόλληση κυττάρου που σχετίζεται μόρια όπως παξιλλίνη και NFX1-91, ένα μόρια που εξασθενεί τη δράση της τελομεράσης. Στις περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις οι πολύπλοκοι στόχοι Ε6 /Ε6ΑΡ αυτές οι πρωτεΐνες σε αποικοδόμηση για να επιτρέψει ογκογόνο μετασχηματισμό [48]. E6 αλληλεπίδραση με E6AP έχει αναφερθεί ότι είναι σημαντικό για την καρκινογένεση του δέρματος σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικού [49], [50]. E6AP στοχεύει επίσης πρωτεΐνες σε Ε6-ανεξάρτητο τρόπο. Στην πραγματικότητα, αρκετές υποστρώματα όπως τα μέλη της οικογένειας Src κινασών πρωτεΐνης [51], Polycomb πρωτεΐνη Ring1B [52] και της προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (PML) πρωτεΐνη [53] έχουν αναφερθεί. Φυσικά συμβαίνουν σποραδικά μεταλλάξεις E6AP σχετίζονται με το σύνδρομο Angelman, μια σοβαρή μορφή διανοητικής καθυστέρησης, όπου η συσσώρευση μη διασπασμένη συσσωματωμάτων πρωτεΐνης έχει αναφερθεί [52], [54], [55], [56]. Έτσι, E6AP πρωτεΐνη σε συνδυασμό με Ε6 και σε ορισμένες περιπτώσεις από μόνη της παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην αποικοδόμηση πρωτεϊνών έλεγχο διαφόρων ανθρώπινων παθολογιών.

Επειδή E6AP ενεργεί επίσης ως διπλή συνενεργοποιητή λειτουργία για τους υποδοχείς στεροειδών ορμονών (SHRs) συμπεριλαμβανομένων υποδοχέα προγεστερόνης, υποδοχέα οιστρογόνου, υποδοχέας ανδρογόνου, υποδοχέας γλυκοκορτικοειδούς, υποδοχέα ρετινοϊκού-α οξύ και του υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης [29], [57], και τα αμινοξέα από 170-680 είναι το πεδίο ενεργοποίησης του E6AP [29], την αλληλεπίδραση της GRIM-19 με E6AP (522 έως 872 αα) μπορούσαμε να προβλέψουμε ότι GRIM-19 πιθανώς ρυθμίζει SHR-εξαρτώμενη μεταγραφή γονιδίου.

Εν περιλήψει, οι μελέτες μας για πρώτη φορά εμφανίζουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο GRIM-19 μπλοκ Ε6 /E6AP συγκρότημα? και η συνεργασία μεταξύ των δύο διακριτών ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα τραχήλου της μήτρας ιστών ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή μεταξύ Ιανουαρίου 2008 και τον Νοέμβριο του 2009 στο Anhui Επαρχιακό Νοσοκομείο συνδεδεμένες με Anhui Medical University, Hefei, Κίνα. Η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το διοικητικό συμβούλιο επανεξέτασης δεοντολογίας του Anhui Επαρχιακό Νοσοκομείο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή.

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που διεξάγονται σε ζώα στην παρούσα μελέτη έχουν εγκριθεί από το Εργαστήριο Ζώων της Επιτροπής Δεοντολογίας της Anhui Επαρχιακό Νοσοκομείο Ενταγμένο σε Anhui Medical University υπό τον αριθμό αδείας 201000179, και ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα των ζώων που ορίζονται από την εν λόγω επιτροπή.

οι όγκοι

Ένα μέρος των προσφάτως αποκοπεί ιστοί παραφίνη-ενσωματωμένες, κομμένα σε 5 έως 7 μm πάχους τομές για παθολογική διάγνωση, και το υπόλοιπο του ιστού καταψύχθηκε στους -80 ° C για περαιτέρω χρήση για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και RNA. Κλινικά στάδια προσδιορίστηκαν από πιστοποιημένο παθολόγο γυναικολογικό σύμφωνα με μια τροποποιημένη Διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας Μαιευτικής (FIGO) σύστημα σταδιοποίησης για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας το 2000. Τα 60 μη μεταστατικό πλακώδη επιθηλιακά καρκινώματα που εξετάστηκαν στις μελέτες αυτές ήταν HPV 16 ή HPV 18 θετικές και ανήκε στον τύπο Ια (13 ασθενείς), Ib (9 ασθενείς) και ΙΙα (38 ασθενείς). Επιπλέον, 45 κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστών από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή για λόγους άλλους από νεοπλασία είτε του τραχήλου της μήτρας ή του ενδομητρίου συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ως φυσιολογικοί μάρτυρες σε αυτή τη μελέτη.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

Ανθρώπινο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa, SiHa και CaSki και το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή από την American Type Culture Collection (ATCC) αναπτύχθηκαν DMEM με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών HO8910 αγοράστηκε από το κελί τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών [58], [59] και αναπτύχθηκαν σε πλήρες RPMI-1640. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση. Η σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές HeLa /PCON και HeLa /pG19 εκφράζουν φορέα ελέγχου και τα ανθρώπινα GRIM-19, αντίστοιχα, έχουν περιγραφεί προηγουμένως [20].

ξενομοσχεύματα όγκου

Ζώα εκτράφηκαν κάτω από πρότυπες εργαστηριακές συνθήκες. Δύο ομάδες (10 σε κάθε ομάδα) 6-εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (Πεκίνο πειραματικό κέντρο ζώο) εμφυτεύθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό των ποντικών με είτε HeLa /pG19 ή HeLa κύτταρα /PCON (1 × 10

7) σε 0,1 ml PBS που περιέχει 50% matrigel. Όλοι οι ποντικοί στεγάσθηκαν σε ένα περιβάλλον χωρίς παθογόνα. Στο τέλος του πειράματος (6 εβδομάδες μετά την εμφύτευση), ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία, οι όγκοι συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν. Ένα τμήμα του κάθε όγκου υποβλήθηκε σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημική και βιοχημικές αναλύσεις, και το υπόλοιπο καταψύχθηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

πλασμίδια

Τα πλασμίδια LZRSpBMN-συνδέτη-IRES-EGFP-STAT3C (STAT3C) εκφράζουν μια ουσιαστικά δραστική μεταλλαγμένο STAT3 και LZRS ΡΒΜΝ-σύνδεσμος-IRES-EGFP-STAT3DN (STAT3DN) εκφράζει μία κυρίαρχη αρνητική μεταλλαγμένο STAT3 ήταν δώρα από τον Δρ Hodge DR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [60]. Οι κενό φορέα pIRES-Puro2-Myc (PCON) και pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc (pG19) που εκφράζουν ένα Μγο-tagged GRIM-19 είχαν προηγουμένως περιγραφεί [20].