Abstract

Η καμπτοθεκίνη αντικαρκινικό φάρμακο αναστέλλει την αντιγραφή και τη μεταγραφή με την παγίδευση του DNA τοποϊσομεράση Ι (Top1) ομοιοπολικά με το DNA σε ένα «διασπάσιμο συγκρότημα». Για να εξετάσει τα αποτελέσματα της καμπτοθηκίνης στη σύνθεση του RNA γονιδίωμα-ευρεία χρησιμοποιήσαμε Bru-Seq και δείχνουν ότι η θεραπεία της καμπτοθεκίνης κατά κύριο λόγο επηρεάζονται επιμήκυνση της μεταγραφής. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η καμπτοθηκίνη αυξημένη RNA διαβάζει θέσεις τερματισμού μεταγραφής παρελθόν όσο και σε στοιχεία ενισχυτή. Μετά την απομάκρυνση της καμπτοθεκίνης, η εξάπλωση της μεταγραφής ως ένα κύμα από το 5′-άκρο των γονιδίων χωρίς ανάκτηση της μεταγραφής προκύπτει από RNA πολυμεράσες αδιέξοδο στο σώμα των γονιδίων. Ως αποτέλεσμα, καμπτοθεκίνη ανέστειλε κατά προτίμηση την έκφραση μεγάλων γονιδίων όπως πρωτο-ογκογονίδια, και αντι-αποπτωτικών γονιδίων ενώ τα μικρότερα ριβοσωμικές γονίδια πρωτεϊνών, προ-αποπτωτικών γονιδίων και γονιδίων-στόχων p53 έδειξε σχετική υψηλότερη έκφραση. Cockayne ινοβλάστες ομάδα σύνδρομο Β (CS-Β), τα οποία είναι ελαττωματικά σε μεταγραφή-συζευγμένο επιδιόρθωση (TCR), έδειξε ένα προφίλ ανάκτηση σύνθεσης RNA που είναι παρόμοια με τους φυσιολογικούς ινοβλάστες γεγονός που υποδηλώνει ότι TCR δεν εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του ή την ανάκτηση σύνθεσης RNA από transcription- κλείδωμα Top1 βλάβες. Αυτά τα ευρήματα των αποτελεσμάτων της καμπτοθεκίνης στη μεταγραφή έχουν σημαντικές συνέπειες για τις δραστηριότητες αντικαρκινικές και μπορεί να βοηθήσει στο σχεδιασμό των βελτιωμένων συνδυαστικών θεραπειών που περιλαμβάνουν Top1 δηλητήρια.

Παράθεση: Veloso Α, Β Biewen, Paulsen MT, Berg Ν, Carmo de Andrade Λίμα L, Prasad J, et al. (2013) Genome-Wide Μεταγραφική Επιπτώσεις του Αντικαρκινικού Agent καμπτοθηκίνη. PLoS ONE 8 (10): e78190. doi: 10.1371 /journal.pone.0078190

Επιμέλεια: Didier Auboeuf, INSERM, Γαλλία

Ελήφθη: 5, Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 2 Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 του Οκτώβρη, 2013

Copyright: © 2013 Veloso et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από το Εθνικό Ινστιτούτο Περιβαλλοντικών Επιστημών (1R21ES020946) και το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών Γονιδιώματος του Ανθρώπου (1R01HG006786). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

DNA τοποϊσομεράση Ι (Top1) χαλαρώνει στρεπτική ένταση που δημιουργείται στο DNA έλικα ως συνέπεια της αντιγραφής, μεταγραφής και επαναμοντελοποίηση χρωματίνης [1,2]. Η Top1 μεσολάβηση αντίδραση περιλαμβάνει τη δέσμευση στο DNA, η διάσπαση ενός κλώνου της έλικας του DNA που ακολουθείται από το πέρασμα του άλλου κλώνου μέσω της θραύσης και τέλος την επανασφράγιση του διαλείμματος κλώνου DNA ομοιοπολική. Η καμπτοθεκίνη αντικαρκινικό φάρμακο αναστέλλει ειδικά Top1 [3] δρώντας πριν από το στάδιο επανασφράγισης, αποτελεσματικά παγίδευση Top1 ομοιοπολικά δεσμευμένο στο DNA σε ένα «διασπάσιμο συγκρότημα». Η καμπτοθεκίνη και άλλα Top1 δηλητήρια που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της ωοθήκης, του τραχήλου της μήτρας, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, του πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη και του εγκεφάλου καρκίνων [4]. Η αντικαρκινική δράση της καμπτοθεκίνης είναι συνδεδεμένη με την τοξικότητα αντιγραφή διαμεσολαβείται [5]. Η ανασταλτική επίδραση της καμπτοθεκίνης στη μεταγραφή έχει επίσης αναγνωριστεί να συμβάλλει στην τοξικότητα σε μη-διαιρούμενα κύτταρα [6,7].

προηγουμένως έδειξαν ότι τα σύμπλοκα Top1-DNA καμπτοθεκίνης σταθεροποιημένο επιβραδύνουν επιμήκυνση αλλά όχι την έναρξη της μεταγραφής [8]. Στην πραγματικότητα, παρατηρήσαμε αυξημένη χωρητικότητα της RNA πολυμεράσης II στην περιοχή του υποκινητή του

DHFR

γονίδιο που συσχετίζεται με αυξημένο ρυθμό έναρξη της μεταγραφής [8]. Σε απάντηση στην επιμήκυνση της μεταγραφής απόφραξη, Top1 στοχεύεται για αποικοδόμηση σε ουβικιτίνη τρόπο εξαρτώμενο [9] και μετέπειτα υπολείμματα αμινοξέων υπολειμματική DNA δεσμευμένο μπορεί να απαιτεί την δράση της τυροσυλ-DNA φωσφοδιεστεράσης 1 (TDP1) για την απομάκρυνσή τους, προκειμένου για μεταγραφή επιμήκυνση να επαναλάβει [10]. Απόφραξη της μηχανής μεταγραφή με Top1 συμπλέγματα παγιδεύεται στο DNA από καμπτοθεκίνης έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί στην επαγωγή διαλείμματα διπλού κλώνου DNA [6] και το σχηματισμό του DNA-RNA υβριδικών δομών (R-loops) ενεργοποίηση της κινάσης στρες ATM [7 , 11]. Επιπλέον, αυτή η πίεση μεταγραφής έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της οδού απόκρισης της ρ53 [12-15] και επαγωγή 53BP1 μεσολάβηση επεξεργασίας βλάβη του DNA [16]. Top2 και PARP1 παίξει επικαλυπτόμενες ρόλους Top1 σε μη διαιρούμενα κύτταρα υποδηλώνοντας ότι ο συνδυασμός των Top1, top2 και ναρκωτικά PARP-στόχευσης μπορεί να είναι αποτελεσματική σε μη διαιρούμενα κύτταρα όγκου [15].

Μετά την αναστροφή της καμπτοθεκίνης, η αντίδραση τοποϊσομεράσης ολοκληρώνεται και σύμπλοκα μεταγραφής σκέφτηκε να επαναλάβει την επιμήκυνση. Είναι ενδιαφέρον, μπορούμε προηγουμένως παρατηρηθεί ότι η ανάκτηση της σύνθεσης του RNA από το

dhfr

γονιδίου σε κύτταρα CHO μετά την απομάκρυνση καμπτοθεκίνης επαναλαμβάνεται ως κύμα σε ένα «κατεύθυνση 5′-3 χωρίς εμφανή ανάκτηση κατάντη του γονιδίου [8] . Αυτό υποδηλώνει ότι τα σύμπλοκα μεταγραφής μπλοκαριστεί από παγιδευμένο Top1 σύμπλοκα είναι σε θέση να επαναλάβει την επιμήκυνση, μετά από αναστροφή της καμπτοθεκίνης [8]. Η πρωτεΐνη Cockayne ομάδα συμπληρωματικότητας Β (CSB) ελαττωματικά στην μεταγραφή-συζευγμένο επιδιόρθωση (TCR) έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA ομοιοπολικά-συνδεδεμένο Top1 [17]. Προτάθηκε ότι αυτό σε συνδυασμό με μια πιο αργή ανάκαμψη της συνολικής σύνθεσης RNA στο CS-Β κύτταρα συσχετίζοντας με υπερευαισθησία σε καμπτοθεκίνη έκθεση [15,17,18]. Ωστόσο, άλλες μελέτες έχουν βρει κανένα ελάττωμα στην ανάκτηση σύνθεση του RNA παρακάτω CSB νοκ ντάουν [16].

Για να αναλύσουμε το άμεσο αποτέλεσμα της καμπτοθηκίνης στη μεταγραφή του γονιδιώματος σε επίπεδο και να εξερευνήσετε την ανάκτηση της μεταγραφής μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου, χρησιμοποιήσαμε το αναπτύχθηκε πρόσφατα μέθοδο Bru-Seq [19]. Αυτή η τεχνική βασίζεται στην μεταβολική επισήμανση του RNA χρησιμοποιώντας bromouridine (Bru) ακολουθούμενη από την ειδική απομόνωση του Bru-επισημασμένου εν τω γεννάσθαι RNA, παρασκευή βιβλιοθηκών και βαθιά αλληλούχιση [19]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η καμπτοθεκίνη Top1 αναστολέας προκαλεί προτιμησιακή αναστολή της έκφρασης των μεγάλων γονιδίων μέσω απόφραξη της επιμήκυνσης της μεταγραφής σε συνδυασμό με την έλλειψη ανάκτηση της σύνθεσης από RNA πολυμεράσες μπλοκαριστεί στο σώμα των γονιδίων. Επιπλέον, βρήκαμε κανένα ελάττωμα στην ανάκαμψη σύνθεση του RNA στο CS-Β κύτταρα, μετά από αναστροφή καμπτοθεκίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι TCR μπορεί να μην απαιτείται για την αποκατάσταση μετά από topo I αναστολή αναστροφής.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμές, η θεραπεία καμπτοθεκίνη και Bru-Seq

hTERT απαθανάτισε διπλοειδή ινοβλάστες ανθρώπινης ακροποσθίας (δώρο από τον Δρ Μαίρη Davis, Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας του Πανεπιστημίου του Michigan) και CS-Β ινοβλάστες (GM00739, Coriell Cell Repository) ήταν καλλιεργούνται ως μονοστιβάδες σε ΜΕΜ που παρέχεται με 10% ορό εμβρύου βοοειδούς και αντιβιοτικά (Invitrogen). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 45 λεπτά με 20 μΜ καμπτοθεκίνης (Sigma) και επισημάνθηκαν για 15 λεπτά με 2 mM bromouridine είτε κατά τη διάρκεια των τελευταίων 15 λεπτών της θεραπείας καμπτοθεκίνης ή μετά έκπλυση. Οι Bru-Seq και BruChase-Seq διαδικασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Εν ολίγοις, το ολικό RNA απομονώθηκε από τα δείγματα κυττάρων χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) ακολουθούμενη από την ειδική απομόνωση του Bru-επισημασμένου RNA χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-BrdU (BD Biosciences) συζευγμένο με μαγνητικά σφαιρίδια (Dynabeads, Goat anti-Mouse IgG, Invitrogen) . Το απομονωμένο RNA μετά μετατράπηκε σε βιβλιοθήκη DNA κλώνου-ειδική χρησιμοποιώντας το Illumina TruSeq Kit (Illumina) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

Illumina Hi-Seq αλληλουχίας και η ανάλυση των δεδομένων

αλληλουχίας των cDNA βιβλιοθηκών έγινε από το προσωπικό του Πανεπιστημίου του Michigan αλληλουχίας πυρήνα χρησιμοποιώντας το sequencer Illumina HiSeq 2000. Βάση κλήση έγινε χρησιμοποιώντας Illumina Casava v1.8.2. και διαβάστε χαρτογράφηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ΤΟΡΗΑΤ C, δέχονται μόνο αναφέρει ότι θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί μοναδικά στο γονιδίωμα. Εμείς υπολογιζόμενες τιμές RPKM από τις Bru-Seq δεδομένων και απεικονίζονται τα δεδομένα χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη-χτισμένο πρόγραμμα περιήγησης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

Δεδομένα διαθεσιμότητα

Τα πρωτογενή δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν στις αναλύσεις έχει κατατεθεί στο Gene Expression NCBI του Omnibus και είναι ελεύθερα διαθέσιμο. Έχουμε ανεβάσει τα πρωτότυπα αρχεία BAM χαρτογράφηση του γονιδιώματος και των παραγώγων τους καταλόγους σύνθεση ως αρχεία κρεβάτι. Ο αριθμός προσχώρηση είναι GSE48678 και η πλήρης σύνδεση είναι https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48678.

Αποτελέσματα

καμπτοθεκίνη αναστέλλει κατά προτίμηση την σύνθεση του RNA των μεγάλων γονιδίων

αμφισβητηθεί ανθρώπινους ινοβλάστες για 45 λεπτά με 20 μΜ καμπτοθεκίνη και σημασμένο RNA με 2 mM Bru για τα τελευταία 15 λεπτά με την παρουσία καμπτοθεκίνης. Η αλληλούχιση διαβάζει από το εκκολαπτόμενο RNA Bru περιέχουν χαρτογραφηθεί όλη γονίδια που καλύπτουν τόσο τα εξώνια και εσώνια και σχετικούς ρυθμούς μεταγραφής καθορίστηκαν για όλα τα γονίδια με την άθροιση του αριθμού των διαβάζει όλη γονιδίων και διαιρεμένο με το μήκος του γονιδίου. Η πυκνότητα ανάγνωσης εκφράστηκε ως «διαβάζει ανά χίλια ζεύγη βάσεων ανά εκατομμύριο διαβάζει» (RPKM). στατιστικά στοιχεία του δείγματος μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα S1. θεραπεία καμπτοθεκίνη ανέστειλε ποσοστά μεταγραφή γονιδίων 1142 κατά περισσότερο από 2 φορές, αυξάνοντας παράλληλα τη μεταγραφή γονιδίων 919 κατά περισσότερο από 2 φορές (Σχήματα 1 Α και Β, Εικόνα S1, S2 σε File S1 και S2 Πίνακα). Αν τα γονίδια βρέθηκαν να έχουν αυξηθεί σε σχέση με τα ποσοστά της μεταγραφής είναι πραγματικά να συντεθούν σε απόλυτη υψηλότερο ποσοστό δεν έχει προσδιοριστεί, δεδομένου ότι τα δεδομένα που δημιουργούνται από Bru-Seq αναπαριστά την κατανομή των διαβάζει και όχι απόλυτες τιμές έκφρασης. Ως εκ τούτου, όταν η σύνθεση είναι μειωμένη στο σώμα των μεγάλων γονιδίων, αλληλούχιση διαβάζει πρέπει να συγκεντρώσουν αλλού (δηλαδή σε μικρές γονίδια και κατά την έναρξη της μεγάλης γονιδίων).

Ανθρώπινο ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ καμπτοθεκίνης για 45 λεπτά με 2 mM Bru προστίθεται κατά τη διάρκεια των τελευταίων 15 λεπτών της θεραπείας καμπτοθεκίνης για την επισήμανση τω γεννάσθαι RNA που ακολουθείται από Bru-Seq. (Α), Long γονίδια, όπως

έναρξη ΤΡΙΟ

, ελαττώματα έκθεμα επιμήκυνση, αλλά όχι της μεταγραφής, μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνης. (Β), Short γονίδια, όπως

BAMBI

, δείχνουν μια σχετική αύξηση της σύνθεσης RNA μετά από αγωγή καμπτοθεκίνης. (C), Επίδραση της καμπτοθεκίνης στη σχετική μεταγραφή ως συνάρτηση του μεγέθους του γονιδίου. Αναλογία Bru-Seq σήμα μεμονωμένων γονιδίων σε αγωγή με καμπτοθεσίνη πάνω κύτταρα ελέγχου ως συνάρτηση του μεγέθους του γονιδίου. Οι πλέον γονίδια αναστέλλεται κατά προτίμηση σε μικρότερες γονίδια. (D), η διάμεση διάρκεια των γονιδίων επάγεται & gt? 2 φορές με καμπτοθεκίνη (919 γονίδια) είναι 8927 bp, ενώ τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω & gt? 2 φορές (1145 γονίδια) έχουν μέσο μήκος των 136.355 bp. Οι χάρτες γονίδιο είναι από τα γονίδια REFSEQ (UCSC πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα).

Η

Τα στοιχεία δείχνουν μια προφανή αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έντασης ανάγνωσης και το μέγεθος του γονιδίου μετά από θεραπεία καμπτοθεκίνη (Σχήμα 1C). Το μέσο μέγεθος των γονιδίων με περισσότερο από ένα 2-φορές μειωμένη σχετικούς ρυθμούς μεταγραφής ήταν 107.089 bp. (Σχήμα 1 D). Το μεσαίο γονιδιωματική μέγεθος των 919 γονιδίων που δείχνουν αυξημένο σε σχέση με τα ποσοστά μεταγραφή μετά από θεραπεία καμπτοθεκίνη ήταν 7748 bp. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με ένα μηχανισμό δράσης με την οποία καμπτοθηκίνη αναστέλλει την επιμήκυνση της μεταγραφής χωρίς να αναστέλλει την έναρξη της μεταγραφής [8].

Η καμπτοθεκίνη επηρεάζει τον τερματισμό μεταγραφής και έκφρασης των ncRNA και ενισχυτή RNA (Erna)

Για πολλές σύντομες γονίδια, όπου δεν παρατηρήθηκε αναστολή της επιμήκυνσης ήταν εμφανής μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνη, η μεταγραφή ανάγνωση μέσα από το παρελθόν του σχολιασμένη 3 ‘ πολυ (Α) περιοχή ήταν προεξέχων (Σχήμα 2Α, Σχήμα S3 σε S1 File). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ένα ρόλο για τοποϊσομεράσης Ι σε τερματισμό της μεταγραφής σε αυτά τα γονίδια [20]. Εναλλακτικά, η αύξηση του αριθμού των διαβάζει πέρα ​​από τα σχολιασμένα θέσεις τερματισμού μπορεί να προκύψει από την επαγωγή της εναλλακτικής πολυ (Α) θέσεις μετά από θεραπεία καμπτοθεκίνης ή σταθεροποίηση του RNA μέσω της θέσεως 3’-διάσπασης. Πολλά γονίδια σε κύτταρα θηλαστικών έχουν δειχθεί ότι παράγουν αποκλίνουσες προαγωγό ανοδικά μεταγραφές (προτροπές) [19,21]. Η έκφραση κάποιων προτροπές ενισχύθηκε δραματικά με θεραπεία καμπτοθεκίνη (Σχήμα 2Β, εικόνα S4 A-C σε File S1). Επιπλέον, πολλά γονίδια μεταγράφονται με αποκλίνοντα έδειξε συντεταγμένων εξάρτημα έναρξη της διαδικασίας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αρνητική υπερελικότητας αναμένεται να συσσωρεύονται ως επακόλουθο της μεταγραφής σε απουσία δραστηριότητας τοποϊσομεράσης Ι μπορεί να ενισχύσει έναρξης μεταγραφής (Σχήμα S4 D-F). Τέλος, η θεραπεία καμπτοθεκίνη οδηγούν στην παραγωγή πιο ενισχυτή RNA (Erna) από πολλά γνωστά και υποθετικές στοιχεία ενισχυτή, όπως είναι η 5 ‘

FOS

ενισχυτή (Σχήμα 2C, Σχήμα S5 σε S1 File). Το λειτουργικό αποτέλεσμα της αυξημένης παραγωγής των Erna μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνη δεν είναι σαφής δεδομένου ότι ο σχετικός ρυθμός μεταγραφής του

FOS

γονίδιο δεν ήταν αυξημένα, παρά την αύξηση της παραγωγής Erna. Εκτός από την αναστολή της επιμήκυνσης των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, καμπτοθεκίνη ανέστειλε επιμήκυνση της μεταγραφής των μεταγραφών πρωτογενούς microRNA (Σχήμα 2D) και ενισχυμένη ή καταστέλλεται μακράς μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) (Σχήμα 2Ε & amp? F).

Ως στο Σχήμα 1, ανθρώπινους ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ καμπτοθεκίνης για 45 λεπτά με 2 mM Bru προστίθεται κατά τη διάρκεια των τελευταίων 15 λεπτών της θεραπείας καμπτοθεκίνης για την επισήμανση τω γεννάσθαι RNA που ακολουθείται από Bru-Seq. (Α), Μεταγραφική πλήρους ανάγνωσης του χώρου τερματισμού του

RhoB

γονίδιο που προκαλείται από καμπτοθεκίνη. (Β), Enhanced έναρξη της ASCC3

γονίδιο και συμπίπτει προς τα πάνω ρύθμιση των αποκλινουσών ανάντη ΑΜΕΣΗ RNA. (C), αυξημένη έκφραση Erna από το 5′-ανάντι ενισχυτή του

ΦΩΣ

από καμπτοθεκίνη. (D), καμπτοθεκίνη αναστέλλει την μεταγραφή του πρωτογενούς μεταγραφήματος του miRNA138-1. (Ε), καμπτοθεκίνη προκαλεί τη μεταγραφή του ncRNA MALAT1. (F), καμπτοθεκίνη αναστέλλει τη μεταγραφή του ένα πολύ μεγάλο σχολιαζομένων ncRNA στο χρωμόσωμα 2. Οι χάρτες γονίδιο είναι από τα γονίδια REFSEQ (UCSC πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα).

Η

Μεταγραφή ανακτά ως ένα κύμα από το 5 ‘άκρο μετά από καμπτοθεκίνη αφαίρεση

Η παγίδευση της τοποϊσομεράσης Ι σχετικά με DNA από καμπτοθεκίνη πιστεύεται ότι είναι ένα μερικώς αναστρέψιμη εκδήλωση [2]. Να διερευνήσει κατά πόσον η απομάκρυνση του καμπτοθηκίνης αντιστρέφει τις επιπτώσεις της στη μεταγραφή, χρησιμοποιήσαμε Bru-Seq να εξετάσει την εκκολαπτόμενη μεταγραφικό RNA στα κύτταρα μετά από απομάκρυνση του φαρμάκου. Για να πάρετε μια συνολική εικόνα της επίδρασης της καμπτοθηκίνης στην εκκολαπτόμενη σύνθεση του RNA των πολλαπλών γονιδίων, επιλέξαμε υψηλής έκφρασης γονιδίων (RPKM μεγαλύτερο από 1) και περισσότερο από 100 kb και να ευθυγραμμιστεί με τις περιοχές τους έναρξης της μεταγραφής. Βρήκαμε ότι η καμπτοθηκίνη που προκαλείται από ένα ισχυρό μήνυμα πάνω από τον έλεγχο εντός των πρώτων 10 kb γονιδίων που ακολουθείται από μια σοβαρή πτώση στο σήμα κάτω από τον έλεγχο περαιτέρω προς τα κάτω (Σχήμα 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή και την παγίδευση της τοποϊσομεράσης Ι από την καμπτοθεκίνη δεν αναστέλλει την έναρξη της μεταγραφής, αλλά αναστέλλει ισχυρά επιμήκυνση. Όταν καμπτοθεκίνης πλύθηκε έξω και τα κύτταρα σημάνθηκαν με bromouridine για 15 λεπτά υπό την απουσία του φαρμάκου, την ανάκτηση εξάπλωσης μεταγραφής από το 5′-άκρο στο γονίδιο ενώ δεν ανάκτηση του σήματος παρατηρήθηκε περαιτέρω κατάντη στο γονίδιο. Μετά έκπλυση του φαρμάκου και επώαση για 15 λεπτά σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου και στη συνέχεια επισήμανση τω γεννάσθαι RNA για τα επόμενα 15 λεπτά, το κύμα μεταγραφή μετακινηθεί περαιτέρω εντός του γονιδίου στο 3 ‘κατεύθυνση. Και πάλι, καμία ανάκτηση σήματος παρατηρήθηκε περαιτέρω προς τα κάτω μέσα στο γονίδιο. Είναι ενδιαφέρον ότι, το ποσοστό στο οποίο κύμα μεταγραφή εξαπλώνεται από το 5’-άκρο και στο σώμα των γονιδίων ήταν περίπου 1.1 με 1.3 kb /min (Σχήμα 3, Σχήμα S6 σε S1 File). Αυτό είναι πιο αργή από του εκτιμώμενου ποσοστού επιμήκυνσης περίπου 2 kb /min σε κύτταρα υπό κανονικές συνθήκες [22]. Αν επιμηκύνοντας RNA πολυμεράσες συγκρούονται με παγιδευμένα τοποϊσομεράσες, μη αναστρέψιμη βλάβη του DNA μπορεί να προκληθεί η οποία θα απαιτήσει περαιτέρω επεξεργασία [6]. Είναι πιθανό ότι αυτός ο μειωμένος συντελεστής επιμήκυνσης παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνη και έκπλυση οφείλεται σε απαίτηση για επισκευή Top1 /καμπτοθηκίνη που προκαλείται από βλάβη του DNA να λάβει χώρα πριν από την επιμήκυνση μπορεί να επαναλάβει.

(Α), Συγκεντρωτικά, RNA σύνθεση των γονιδίων μεγαλύτερα από 100 kb σε φυσιολογικά ανθρώπινα ινοβλάστες με τα γονίδια ευθυγραμμισμένα με μεταγραφικές θέσεις εκκίνησης (TSS). σύνθεση του RNA ανακτά ως κύμα κατά μία διεύθυνση 5′-προς-3 ‘μετά την απομάκρυνση της καμπτοθεκίνης χωρίς εμφανή ανάκτηση του RNA πολυμεράσες αδιέξοδο στο σώμα των γονιδίων. ποσοστά Επιμήκυνση της ανάκτησης κύματος μεταγραφή εκτιμήθηκε να είναι ~ 1,2 kb /min. (Β), Wave ανάκτησης της σύνθεσης του RNA μπορεί να φανεί προχωρεί από το 5’-άκρο του

CD44

γονίδιο χωρίς εμφανή ανάκτηση στο σώμα του γονιδίου. Το μπροστινό μέρος του κύματος μεταγραφή παρατείνεται περίπου 35 kb κατά την πρώτη ανάκτηση 30 λεπτά καταλήγοντας σε ένα ρυθμό επιμήκυνση περίπου 1,2 kb /min. (C) Παρόμοια ποσοστά επιμήκυνση μετά την αφαίρεση καμπτοθεκίνη αποτελέσματα για το

MEISE1

γονίδιο. βασικό χρώμα:

Μπλε

, ελέγχου (30 min επισήμανση Bru)?

Κίτρινο

, επισήμανση Bru κατά την τελευταία 15 λεπτά της θεραπείας καμπτοθεκίνη 45 λεπτά?

Πράσινο

, 45 λεπτά θεραπείας camptothecin ακολουθείται από απομάκρυνση του φαρμάκου και 15 λεπτά από την επισήμανση Bru?

Κόκκινο

, 45 λεπτά θεραπείας camptothecin που ακολουθείται από μια έκπλυση των ναρκωτικών, 15 λεπτά επώασης, και, τέλος, 15 λεπτά επισήμανση Bru.

Η

Δεν εμφανή ελαττώματα στην ανάκτηση της σύνθεσης του RNA στο CS- Β κυττάρων μετά από ανατροπή καμπτοθεκίνη

κύτταρα

που προέρχονται από ασθενείς με σύνδρομο Cockayne είναι υπερευαίσθητοι στην καμπτοθεκίνη [18]. Αυτή η υπερευαισθησία συνδέεται με μια ενισχυμένη επαγωγή θραύσεων διπλής έλικος σε S-φάση όπως περόνες αντιγραφής «συγκρούονται» με παγιδευμένο Top1 σύμπλοκα [18]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι η ανάκαμψη της σύνθεσης του RNA είναι πιο αργή στα κύτταρα CS [15,17,18], ενώ άλλες μελέτες έχουν βρει κανένα ελάττωμα στην ανάκτηση σύνθεση του RNA [16]. Χρησιμοποιώντας Bru-Seq ελέγξαμε εάν η ανάκαμψη της σύνθεσης εν τη γενέσει του RNA σε ινοβλάστες CS-Β μετά από θεραπεία καμπτοθεκίνη και την αναστροφή διέφερε από την ανάκαμψη των φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών. Ανάλυση του συνολικού σήματος μεταγραφή γονιδίων τουλάχιστον 100 kb ή περισσότερο έδειξαν ότι CS-Β κύτταρα ανακτώνται σύνθεση του RNA σε ένα κύμα από το 5′-άκρο αυτών των γονιδίων με παρόμοιο τρόπο όπως τα συνήθη ινοβλάστες (Σχήμα 4Α). Αυτό ήταν επίσης εμφανής για τα μεμονωμένα γονίδια (Σχήμα 4Β & amp? C, Σχήμα S7 στο File S1). Επιπλέον, δεν υπάρχει ανάκαμψη της μεταγραφής συνέβη στο πλαίσιο των οργάνων των γονιδίων που υποδηλώνει ότι μπλοκάρει RNA πολυμεράσες δεν είναι σε θέση να επαναλάβει την επιμήκυνση μετά την αφαίρεση της καμπτοθεκίνης. Η φαινόμενη κανονική αποκατάσταση της σύνθεσης RNA σε αυτά τα CS-Β κυττάρων ήταν σε έντονη αντίθεση με το ελαττωματικό ανάκτηση της σύνθεσης εν τη γενέσει του RNA σε αυτά τα κύτταρα μετά από ακτινοβόληση με UV (αδημοσίευτα δεδομένα).

(Α), Συγκεντρωτικά, RNA σύνθεση των γονιδίων μεγαλύτερα από 100 kb σε CS-Β κυττάρων με τα γονίδια που παρατάσσονται με μεταγραφικές θέσεις εκκίνησης (TSS), όπως στην Εικόνα 3. ποσοστά Επιμήκυνση της ανάκτησης κύματος μεταγραφή εκτιμήθηκε να είναι ~ 1.0-1.3 kb /min. Μεμονωμένα γονίδια σε ινοβλάστες από άτομο CS-Β δείχνουν παρόμοια ποσοστά ανάκτησης, σε ινοβλάστες από ένα φυσιολογικό άτομο για το (Β),

CD44

και (C)

MEIS1

. κλειδί Color όπως στο Σχήμα 3.

Η

καμπτοθεκίνη προσβεβλημένο από καρκίνο σχετική γονιδιακή έκφραση

Εκτελεί ανάλυση εμπλουτισμού γονίδιο DAVID βρήκαμε ότι τα γονίδια καμπτοθεκίνης επαγόμενη κωδικοποιούν στοιχεία του ριβοσώματος, μιτοχόνδριο και τα μονοπάτια p53 και τη σηματοδότηση της απόπτωσης ήταν ιδιαίτερα εκπροσωπήθηκαν (Σχήμα 5, πίνακες S2-4). Το σύνολο των γονιδίων βρέθηκε να αναστέλλεται αμέσως μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνης εμπλουτίστηκε για φωσφοπρωτείνες, πρωτο-ογκογονίδια και γονίδια που εμπλέκονται στην μιτωτική κυτταρικού κύκλου, της σύζευξης ουβικιτίνης και αντι-απόπτωσης. Μερικές αντιπροσωπευτικές μεγάλο πρωτο-ογκογονίδια αναστέλλεται από καμπτοθεκίνης παρουσιάζεται στο Σχήμα 6Α. Έχει δειχθεί ότι μπλοκάρισμα της επιμήκυνσης της μεταγραφής από καμπτοθεκίνη προκαλεί μια απόκριση στρες που οδηγεί στην ταχεία συσσώρευση της ρ53 που συνοδεύεται από φωσφορυλίωση του θέση Ser15 και ακετυλίωση της θέσης Lys382 [12]. Προς στήριξη της καμπτοθεκίνης διέγερση απόκρισης ρ53 σε ανθρώπινους ινοβλάστες, βρήκαμε ότι επάγεται καμπτοθεκίνης γονίδια στο μονοπάτι σηματοδότησης ρ53, συμπεριλαμβανομένων των

CDKN1A

(p21),

MDM2, BTG2

και

FAS

(Σχήμα 6Β). Μερικά από αυτά τα γονίδια επάγονται ήδη κατά τη διάρκεια της θεραπείας της καμπτοθεκίνης, ενώ μερικά γονίδια, όπως CDKN1A και MDM2, έδειξαν επαγόμενη έκφραση μόνο μετά από αναστροφή της φαρμακευτικής αγωγής. Η καμπτοθεκίνη μειωμένος τους σχετικούς ρυθμούς μεταγραφής του μεγάλου αντι-αποπτωτικών γονιδίων και ενισχυμένη έκφραση ενός συνόλου μικρότερου μεγέθους προ-αποπτωτικών γονιδίων (Σχήμα 6C). Pro-αποπτωτικών γονιδίων είναι γενικά πιο συμπαγής σε σύγκριση με το αντι-αποπτωτικών γονιδίων [23], έτσι παράγοντες κατά προτίμηση μειώνοντας έκφραση μεγάλων γονιδίων μπλοκάροντας επιμήκυνσης της μεταγραφής αναμένεται να μετατοπίσει την ισορροπία της γονιδιακής έκφρασης υπέρ της απόπτωσης. Παρόμοια μοτίβα αυξημένης και μειωμένης έκφρασης σε σχέση γονίδιο μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνη και αντιστροφή αποτελέσματα για CS-Β κυττάρων (Σχήμα S8 σε S1 File). Υπήρχαν, ωστόσο, ορισμένες διαφορές μεταξύ φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών και τα CS-Β κύτταρα παρατηρήθηκαν, όπως η έλλειψη των μειωμένων

GLI2

έκφραση και καμία επαγωγή των γονιδίων ρ53 ρυθμίζεται

DUSP5

,

FAS

,

MDM2

και

TRIM22

στο CS-Β κύτταρα

.

η

Pathways (Α) που αντιπροσωπεύεται από τα γονίδια Up- ρυθμιζόμενη τουλάχιστον 2 φορές, και (Β) προς τα κάτω ρυθμισμένα τουλάχιστον 2-φορές μετά την αγωγή καμπτοθεκίνης και ανάκτησης. Ανθρώπινα ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ καμπτοθεκίνης για 45 λεπτά και επωάστηκε για τα τελευταία 15 λεπτά με 2 mM Bru ( «0 min»), επωάστηκαν για 15 λεπτά με Bru μετά την αφαίρεση της καμπτοθεκίνης ( «15 λεπτά») ή επωάζονται για 15 min με Bru μετά από θεραπεία 45 λεπτά, ένα πλύσιμο και ανάκτησης 15 λεπτά ( «30 λεπτά»). Εμπλουτισμός ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov) και οι αριθμοί που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν τις τιμές p για τον εμπλουτισμό.

Η

(Α), παραδείγματα των μεγάλων πρωτο-ογκογονίδια αναστέλλεται από καμπτοθεκίνη και δείχνει καμία ανάκτηση (ή αργή ανάκαμψη) μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου. (Β), τα παραδείγματα των γονιδίων στόχων ρ53 που προκαλείται μετά από αγωγή καμπτοθεκίνης. (C), τα παραδείγματα των μεγάλων αντι-αποπτωτικών γονιδίων παρουσιάζει μειωμένους σχετική μεταγραφή (αριστερά) και παραδείγματα μικρών προ-αποπτωτικών γονιδίων που δείχνει βελτιωμένη σε σχέση μεταγραφή μετά από αγωγή καμπτοθεκίνης (δεξιά). (D), Model των μηχανισμών με τους οποίους καμπτοθεκίνη μπορεί να επάγει κυτταρικό θάνατο ή αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων. Η καμπτοθεκίνη προκαλεί μια απόκριση μεταγραφικό ρ53 και επιλεκτικά αναστέλλει μεγάλο πρωτο-ογκογονίδια και τα γονίδια επιβίωσης. Τα δεδομένα είναι χρωματικά κωδικοποιημένο όπου μπλε αντιπροσωπεύει ελέγχου (C), κίτρινο αντιπροσωπεύει 15 λεπτά Bru σήμανσης στο τέλος μιας θεραπείας καμπτοθεκίνης 45 λεπτά χωρίς ανάκτηση ( «0 min»), πράσινο αντιπροσωπεύει απομάκρυνση του φαρμάκου και 15 λεπτά Bru σήμανσης αμέσως μετά την έκπλυση ( «15 λεπτά») και, τέλος, το κόκκινο αντιπροσωπεύει την επισήμανση 15-30 λεπτά μετά την έκπλυση ( «30 λεπτά»).

Η

Συζήτηση

Η καμπτοθεκίνη και τα παράγωγά της είναι εγκεκριμένες από την FDA αντι -cancer φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία μιας ποικιλίας όγκων [4]. Δρουν με την παγίδευση συμπλοκών τοποϊσομεράσης Ι στο DNA μάλλον παρά αναστέλλοντας ενζυματική λειτουργία, αφού RNAi knockdown του Top1 δεν μειώνει την επιβίωση των κυττάρων στον ίδιο βαθμό ως θεραπεία καμπτοθεκίνης [4,24]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε Bru-Seq να διερευνήσει τις οξείες επιδράσεις της καμπτοθεκίνης σε διάφορες πτυχές της μεταγραφής και διαπίστωσε ότι καμπτοθεκίνη (i) ανέστειλαν επιμήκυνση της μεταγραφής, (ii) διεγερμένα μεταγραφική ανάγνωση μέσω των παλαιότερων στο 3′-άκρο των μικρών γονιδίων , (iii) αυξημένη έκφραση Erna από ορισμένα στοιχεία ενισχυτή (iv) που προκαλείται από την απόκριση της ρ53 και (ν) μετατόπισε το υπόλοιπο της έκφρασης των γονιδίων απόπτωσης-ρυθμιστική υπέρ της απόπτωσης. Σημαντικά, μεταγραφή ανακτάται με μειωμένο συντελεστή επιμήκυνσης ως ένα κύμα από το 5′-άκρο του γονιδίου με μη εμφανή ανάκτηση της σύνθεσης από RNA πολυμεράσες μπλοκαριστεί στο σώμα των γονιδίων. Δεν βρήκαμε κανένα στοιχείο ότι η ανάκτηση της σύνθεσης RNA ήταν διαφορετική σε ινοβλάστες CS-Β το οποίο είναι σε έντονη αντίθεση με την ανάκτηση της σύνθεσης RNA σε αυτά τα κύτταρα μετά το υπεριώδες φως (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Έτσι, οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την ανάκτηση της σύνθεσης του RNA μετά την αφαίρεση της καμπτοθεκίνης είναι ριζικά διαφορετικές από εκείνες που απαιτούνται μετά από UV ακτινοβολία που υποδηλώνει ότι η μεταγραφή σε συνδυασμό επισκευής έχει κανένα σημαντικό ρόλο στην επανεκκίνηση της μεταγραφής μετά την αφαίρεση της καμπτοθεκίνης. Συνεπώς, είναι κατανοητό ότι η παρατηρούμενη υπερευαισθησία του CS-Β κυττάρων σε καμπτοθεκίνη συνδέεται με κάποιο ρόλο της πρωτεΐνης CSB κατά την ανάκτηση της αντιγραφής μάλλον ότι στην ανάκτηση της μεταγραφής [18].

Η αδυναμία των κυττάρων να επανεκκίνηση της μεταγραφής μέσα από το σώμα των γονιδίων υποδηλώνει ότι αποκλείονται πολυμεράσες RNA απορρίπτονται αντί ανακυκλώνεται. Αυτό κατά προτίμηση θα θέσει πίσω την έκφραση των γονιδίων μεγάλο ακόμη και μετά από μία περιορισμένη έκθεση των κυττάρων σε καμπτοθεκίνη. Είναι ενδιαφέρον, πολλοί πρωτο-ογκογονίδια και αντι-αποπτωτικών γονιδίων ανήκουν στην τάξη των γονιδίων αναστέλλεται κατά προτίμηση με καμπτοθεκίνη. Το μοντέλο που προκύπτει είναι ότι η δηλητηρίαση των Top1 από τα αποτελέσματα της καμπτοθεκίνης στην αναστολή της μεγάλης πρωτο-ογκογονιδίων, αυξημένη έκφραση των μικρών προ-αποπτωτικών γονιδίων και ενεργοποίηση της ρ53 οδού (Σχήμα 6D). Η γνώση του μεγέθους των ογκογονιδίων που οδηγούν καρκινογένεση και είναι σημαντικές για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε ένα δεδομένο όγκο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επιλογή ασθενών που θα επωφεληθούν από τη θεραπεία ειδικά καμπτοθεκίνη και να συνδυάσουν ορθολογικά καμπτοθεκίνης με άλλους τρόπους θεραπείας. Για παράδειγμα, η έκφραση του μεγάλου BRCA1-πρωτεΐνης που συνδέεται με τον τομέα δακτυλίου 1 γονιδίου (BARD1) μειώθηκε κατά καμπτοθεκίνης. Τέτοια καταστολή θα αναμένεται να καταστείλει ομόλογο ανασυνδυασμό και επομένως θα πρέπει να οδηγήσει σε αυξημένη ευαισθησία σε αναστολείς PARP ή ακτινοθεραπεία. Πράγματι, έχει δειχθεί ότι ο συνδυασμός της καμπτοθεκίνης με αναστολείς PARP ή ακτινοθεραπεία βελτιώνει τον έλεγχο του όγκου [4,25-27].

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Υποστήριξη Στοιχεία.

Εικόνα S1. Μεγάλες γονίδια αναστέλλεται από καμπτοθεκίνη. (Α),

SULF1

, (Β),

NAV2

, (Γ),

SH3BP4

, (Δ),

KCNN2

, (Ε ),

PLCB4

και (F),

οι TLE4

γονίδια που δείχνει την αναστολή της επιμήκυνσης της μεταγραφής μετά από 45 λεπτά θεραπεία 20 μΜ καμπτοθεκίνης. Ανθρώπινα κύτταρα ινοβλάστης επωάστηκαν με 2 mM Bru κατά τη διάρκεια των τελευταίων 15 λεπτών της θεραπείας καμπτοθεκίνης για την επισήμανση τω γεννάσθαι RNA που ακολουθείται από Bru-Seq. Οι χάρτες γονίδιο είναι από τα γονίδια REFSEQ (UCSC πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα). Εικόνα S2. Παραδείγματα μικρών γονιδίων που δείχνουν σχετικό υψηλότερο μεταγραφή διαβάζει μετά τη θεραπεία καμπτοθεκίνη. (Α),

RGS2

, (Β),

HSPB3

, (Γ),

FUS

, (Δ),

TSPYL2

, (Ε ),

CHCHD7

και (F),

ΤΡ53

αντιπροσωπεύουν γονίδια τα οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά από μια 45 min κατεργασία με 20 μΜ καμπτοθεκίνης. Ανθρώπινα κύτταρα ινοβλάστης επωάστηκαν με 2 mM Bru κατά τη διάρκεια των τελευταίων 15 λεπτών της θεραπείας καμπτοθεκίνης για την επισήμανση τω γεννάσθαι RNA που ακολουθείται από Bru-Seq. Οι χάρτες γονίδιο είναι από τα γονίδια REFSEQ (UCSC πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα). Εικόνα S3. Αυξημένη μεταγραφή δι ‘υπερβάσεως παρελθόν το 3’-άκρο του μικρού γονιδίων. (Α),

FZD7

, (Β),

MYC

, (Γ),

CYR61

, (Δ),

DKK1

, (Ε ),

SSTR1

και (F),

IER5

. Ανθρώπινα κύτταρα ινοβλάστης υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ καμπτοθεκίνης για 45 λεπτά και επωάστηκαν με 2 mM Bru κατά την τελευταία 15 λεπτά της θεραπείας καμπτοθεκίνης για την επισήμανση τω γεννάσθαι RNA που ακολουθείται από Bru-Seq. Οι χάρτες γονίδιο είναι από τα γονίδια REFSEQ (UCSC πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα). Εικόνα S4. Επίδραση της καμπτοθηκίνης σε αποκλίνουσες ανάντη της μεταγραφής. Η καμπτοθεκίνη προκαλεί αποκλίνουσες μεταγραφής υποκινητή ανοδικά στο (Α),

CEP78

, (Β),

FER

και (Γ),

RAB33B

γονίδια και αυξήσεις αποκλίνουσες γονιδιακή μεταγραφή για το (D),

PLAG1

και

CHCHD7

, (Ε),

CCDC58

και

FAM162A

και (F),

IMMP1L

και

ELP4

γονίδια. Ανθρώπινα κύτταρα ινοβλάστης υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ καμπτοθεκίνης για 45 λεπτά και επωάστηκαν με 2 mM Bru κατά την τελευταία 15 λεπτά της θεραπείας καμπτοθεκίνης για την επισήμανση τω γεννάσθαι RNA που ακολουθείται από Bru-Seq. Οι χάρτες γονίδιο είναι από τα γονίδια REFSEQ (UCSC πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα). Εικόνα S5. Επίδραση της καμπτοθηκίνης σε υποθετικές ενισχυτές ορίζονται ως περιοχές με υψηλή H3K4m1 και H3K27ac ενώ οι χαμηλές H3K4m3 τροποποιήσεις των ιστονών. Ανθρώπινα κύτταρα ινοβλάστης υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ καμπτοθεκίνης για 45 λεπτά και επωάστηκαν με 2 mM Bru κατά την τελευταία 15 λεπτά της θεραπείας καμπτοθεκίνης για την επισήμανση τω γεννάσθαι RNA που ακολουθείται από Bru-Seq. Οι χάρτες γονίδιο, το σήμα της ιστόνης και DNase κομμάτια υπερευαισθησίας είναι από την κωδικοποίηση και Γονίδια REFSEQ (UCSC πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα). Εικόνα S6. Επίδραση της αντιστροφής καμπτοθηκίνης επί της σύνθεσης RNA σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες. Η ανάκτηση της σύνθεσης RNA παρατηρείται ως ένα κύμα σε ένα 5 ‘προς 3’ κατεύθυνση μετά την απομάκρυνση της καμπτοθεκίνης χωρίς φαινομενική υποχώρηση του RNA πολυμεράσες αδιέξοδο στο σώμα των γονιδίων για την (Α)

TOP1

, (Β)

Smad3

και (C)

TLE4

γονίδια. βασικό χρώμα:

Μπλε

, μεταγραφή διαβάζει στα κύτταρα ελέγχου?

Κίτρινο

, μεταγραφή διαβάζει από κύτταρα επισημαίνονται με Bru κατά την τελευταία 15 λεπτά των 45 λεπτών θεραπεία με καμπτοθεκίνη?

Πράσινο

, μεταγραφή διαβάζει από κύτταρα σημάνθηκαν για 15 λεπτά με Bru κατόπιν έκπλυσης της καμπτοθεκίνης μετά από μια θεραπεία 45 λεπτά?

Red

, μεταγραφή διαβάζει από κύτταρα σημασμένα με Bru 15 λεπτά μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου μετά από μια αγωγή 45 λεπτά. Εικόνα S7. Επίδραση της αντιστροφής της καμπτοθεκίνης για τη σύνθεση του RNA σε ινοβλάστες CS-B. Η ανάκτηση της σύνθεσης RNA παρατηρείται ως ένα κύμα σε ένα 5 ‘προς 3’ κατεύθυνση μετά την απομάκρυνση της καμπτοθεκίνης χωρίς φαινομενική υποχώρηση του RNA πολυμεράσες αδιέξοδο στο σώμα των γονιδίων για την (Α)

TOP1

, (Β)

Smad3

και (C)

TLE4

γονίδια. βασικό χρώμα:

Μπλε

, μεταγραφή διαβάζει στα κύτταρα ελέγχου?

Κίτρινο

, μεταγραφή διαβάζει από κύτταρα επισημαίνονται με Bru κατά την τελευταία 15 λεπτά των 45 λεπτών θεραπεία με καμπτοθεκίνη?

Πράσινο

, μεταγραφή διαβάζει από κύτταρα σημάνθηκαν για 15 λεπτά με Bru κατόπιν έκπλυσης της καμπτοθεκίνης μετά από μια θεραπεία 45 λεπτά?

Red

, μεταγραφή διαβάζει από κύτταρα σημασμένα με Bru 15 λεπτά μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου μετά από μια αγωγή 45 λεπτά. Εικόνα S8. Επίδραση της καμπτοθεκίνης για την έκφραση των γονιδίων που φαίνεται στο Σχήμα 7 στο CS-Β κύτταρα. (Α), μεγάλη πρωτο-ογκογονίδια αναστέλλεται από καμπτοθεκίνη και δείχνοντας /αργή ανάκαμψη μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου. Η

GLI2

γονίδιο δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία καμπτοθεκίνη στο CS-Β κύτταρα. (Β), τα γονίδια-στόχους της ρ53 όπου μόνο μερικοί προκλήθηκαν σε CS-Β κύτταρα μετά την αγωγή καμπτοθεκίνης. (C), τα παραδείγματα των μεγάλων αντι-αποπτωτικών γονιδίων που δείχνει μειωμένη σχετική μεταγραφή (leftt) και παραδείγματα μικρών προ-αποπτωτικών γονιδίων που δείχνουν αυξημένη σχετική μεταγραφή σε CS-Β κύτταρα μετά από θεραπεία καμπτοθεκίνη (δεξιά).