Αφηρημένο

Η παραλλαγή πλασμοκύττωμα μετατόπιση 1 γονιδίου (

PVT1

) είναι ένα lncRNA που έχει οριστεί ως ογκογονίδιο λόγω της συμβολής της με το φαινότυπο των πολλαπλών μορφών καρκίνου. Αν και ο μηχανισμός με τον οποίο

PVT1

διαδικασίες ασθενειών επιρροές έχει μελετηθεί σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, ο ρόλος του στην αυχενική ογκογένεση παραμένει άγνωστος. Έτσι, η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει το ρόλο του

PVT1

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

in vitro

και

in vivo

.

PVT1

έκφραση μετρήθηκε με ποσοτική PCR (qPCR) εις 121 επεμβατική τραχηλικό καρκίνωμα (ICC) δείγματα, 30 δείγματα φυσιολογικού τράχηλου και του τραχήλου της μήτρας κυτταρικές σειρές. Λειτουργικές δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τόσο siRNA και LNA μεσολάβηση knockdown να εξετάσει επιδράσεις

PVT1 ‘

s επί τραχηλικής πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή, απόπτωση, και αντίσταση σισπλατίνη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι

PVT1

έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη στο ΔΠΔ ιστό σε σχέση με την κανονική του τραχήλου της μήτρας και υψηλότερη έκφραση του

PVT1

συσχετίζεται με φτωχότερη συνολική επιβίωση. Σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές,

PVT1

knockdown είχε σαν αποτέλεσμα μειώθηκε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή, ενώ η απόπτωση και η σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα αυξήθηκαν σημαντικά σε αυτά τα κύτταρα. Τέλος, δείχνουμε ότι

PVT1

έκφραση αυξάνεται σε απόκριση προς υποξία και ανοσοδιέγερση απόκριση και ότι αυτό το lncRNA συνεργάτες με τον πολυλειτουργικό και στρες αποκρίνονται πρωτεΐνη, Νουκλεολίνης. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας παρέχουν ισχυρές ενδείξεις για ογκογόνο ρόλο του

PVT1

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και δανείζουν εικόνα για πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους

PVT1

υπερέκφραση βοηθά το αυτοκίνητο του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεση.

Παράθεση : Iden M, Fye S, Li K, Chowdhury T, Ramchandran R, Rader JS (2016) Η lncRNA

PVT1

Συμβάλλει στην καρκίνο του τραχήλου φαινότυπο και Συνεργάτες με κακή πρόγνωση των ασθενών. PLoS ONE 11 (5): e0156274. doi: 10.1371 /journal.pone.0156274

Επιμέλεια: Bibekanand Mallick, Εθνικό Ινστιτούτο Τεχνολογίας, Rourkela, Ινδία

Ελήφθη: 15 Αύγ, 2015? Αποδεκτές: 11 του Μαΐου, 2016? Δημοσιεύθηκε: May 27, 2016

Copyright: © 2016 προσδιο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα Έρευνας για την Υγεία των Γυναικών στο Ιατρικό Κολέγιο του Ουισκόνσιν (https://obgyn.mcw.edu/research/whrp/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο σε οποιοδήποτε μέρος της προετοιμασίας αυτού του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Long μη κωδικοποιητικού RNA ( lncRNAs) παρέχουν σημαντικούς στόχους για διαγνωστικά καρκίνου και θεραπευτικά λόγω της κρίσιμο ρόλο τους σε πολυάριθμες κυτταρικές διαδικασίες όπως επιγενετικές μεταβολές, ενισχυτή γονίδιο και δραστικότητα καταστολέα όγκων, και miRNA απομόνωσης. LncRNAs είναι διάχυτη στο γονιδίωμα, δείχνουν συχνά κύτταρο τύπου και χρονική ειδική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, και μπορούν να επηρεάσουν πολλές κυτταρικές διεργασίες μέσω πολλαπλών χωριστοί μηχανισμοί [1]. Πλασμοκύττωμα παραλλαγή μετατόπιση 1 (

PVT1

) είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη lncRNA ~ 50kb κατάντη του

MYC

που έχει προσελκύσει σημαντική προσοχή από το πεδίο του καρκίνου λόγω των συχνών συν-πολλαπλασιασμού της με

MYC

σε πολλές συμπαγείς όγκους [2]. Οι πρώτες μελέτες που παρέχουν αποδείξεις ότι

PVT1

μπορεί να συμβάλει στην καρκινογένεση αποδειχθεί συχνές μετατοπίσεις στην πλασμοκυτωμάτων ποντίκι [3,4] και τα λεμφώματα ανθρώπινης του Burkitt [5-7]. Οι ογκογόνο δράση του

PVT1

έχουν υπογραμμίζεται περαιτέρω από πιο πρόσφατες μελέτες που αποδεικνύουν υπερέκφραση και ενίσχυση του σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου [8-17]. Το πιο σημαντικό,

PVT1

έκφρασης έχει συσχετίστηκε σημαντικά με κλινικά χαρακτηριστικά, όπως ο κίνδυνος, υποτροπή και η επιβίωση σε διάφορους καρκίνους [8,11-13,18].

Παρά τον πλούτο της γνώσης σχετικά με τις ογκογόνο ιδιότητες του

PVT1

σε πολλές μορφές καρκίνου, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με την ακριβή βιολογική λειτουργία του. Στην πραγματικότητα, η χούφτα μελέτες που παρέχουν

PVT1

μηχανιστικά δεδομένα υπερβολικά υποδηλώνουν ότι εξασκεί τα αποτελέσματά της σε ένα κύτταρο-τύπου ή /και ασθένεια-ειδικό τρόπο. Για παράδειγμα,

PVT1

λειτουργία έχει αποδοθεί σε δεσμευτικές και τη σταθεροποίηση της Myc [19] και Nop2 [17] πρωτεΐνες στο στήθος και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, αντίστοιχα. Σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα,

PVT1

ενεργεί για να καταστείλει την έκφραση της ρ15 και ρ16 μέσω φυσικών αλληλεπίδρασή της με την πρωτεΐνη ομάδα Polycomb, ΕΖΗ2 [20]. Επίσης, μέσω της πρόσληψης και της ρύθμισης του υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης διέγερσης ΕΖΗ2,

PVT1

επάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς [21]. Τέλος, υπολογιστική ανάλυση των

PVT1

δείχνει ότι μπορεί να δράσει μέσω δέσμευσης και παγίδευσης των μελών της οικογένειας mir-200 στον ιστό του καρκίνου του μαστού [14]. Λόγω της πολυπλοκότητας και του εύρους των αποτελεσμάτων τους, οι μελέτες αυτές υπογραμμίζουν τη σημασία της νόσου συγκεκριμένης έρευνας του

μηχανισμούς PVT1

.

Το ενδιαφέρον μας στο

PVT1

προέρχεται από την εργασία μας και αποδεικνύοντας άλλων ότι είναι μια συχνή θέση ενσωμάτωσης HPV σε καρκίνο του τραχήλου, υποδηλώνοντας περαιτέρω μια σημαντική βιολογική λειτουργία [22-24]. Έτσι, επιδιώξαμε να καθορίσει καλύτερα το ρόλο του

PVT1

στην τραχηλική καρκινογένεση εξετάζοντας

PVT1

πρότυπα έκφρασης σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς όγκους και κυτταρικές σειρές και τα λειτουργικά αποτελέσματα αυτής της lncRNA στις διαδικασίες σχετικά με τον καρκίνο όπως ο πολλαπλασιασμός, κυτταρική κινητικότητα, την απόπτωση, και χημειοαντίσταση. Τέλος, επειδή πολλοί lncRNAs στηρίζονται σε εταίρους πρωτεΐνη να πραγματοποιήσει τα αποτελέσματά τους, χρησιμοποιήσαμε χρωματογραφία συγγένειας RNA και αλληλούχιση φασματομετρία μάζας για τη διαλεύκανση του τραχήλου της μήτρας καρκινικό κύτταρο-ειδικό

PVT1

εταίρους πρόσδεσης.

Μέθοδοι

το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Ιατρικού Κολεγίου του Wisconsin IRB (PRO00011466? Μοριακός Χαρακτηρισμός του καρκίνου του τραχήλου).

καλλιέργειας κυττάρων

SiHa (ATCC® HTB35 ™), HeLa (ανθρώπινο τραχηλικό καρκινικές κυτταρικές σειρές ATCC® CCL2 ™), και DoTc2 4510 (ATCC® CRL-7920 ™) και HPV 16 Ε6 /Ε7 μετασχηματισμένων, η κανονική εξωτραχηλικά κύτταρα (Ect1 /E6E7? ATCC® CRL-2614 ™ ) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ο καρκίνος του τραχήλου κύτταρα διατηρήθηκαν σε είτε Minimum Essential Medium Eagle (ΕΜΕΜ? SiHa και HeLa) ή Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (ΜΕΜ? DoTc2) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? ATCC). Ect1 /E6E7 κύτταρα διατηρήθηκαν σε κερατινοκύτταρα μέσο ελεύθερο ορού (GIBCO) με 0,1 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου EGF, 0,05 mg /ml βόειας εκχύλισμα υπόφυσης, και επιπλέον χλωριούχο ασβέστιο 44,1 mg /L. Η ATCC πιστοποιεί όλες τις κυτταρικές σειρές, εξετάζοντας τα προφίλ DNA τους μικρή διαδοχική επανάληψη (STR). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υψηλή υγρασία με μία ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη-ΕϋΤΑ (0,25% θρυψίνη, 0,53 mM EDTA? ATCC) και μετρήθηκαν με Trypan μπλε 0,4% διάλυμα (Amresco, Solon, ΟΗ) και ο θάλαμος μέτρησης αιμοκυτόμετρο. Για ορισμένα πειράματα, η σισπλατίνη (1 mM? Sigma, St. Louis, ΜΟ) ανασυστάθηκε σε απεσταγμένο νερό και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε σισπλατίνη σε συγκέντρωση 10 μΜ, 50 μΜ και 100 μΜ σε μέσο ανάπτυξης για 4 ώρες σε μέσο καλλιέργειας. Η σισπλατίνη που περιέχουν μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης 4 ώρες αργότερα και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Για πειράματα διερεύνησης

PVT1

έκφρασης μετά την υποξία και ανοσοδιέγερση απόκριση, τα κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν αντίστοιχα σε επεξεργασία με χλωριούχο κοβάλτιο (150 μΜ? Sigma) ή ιντερφερόνη άλφα (ΙΡΝ-α? 10 μΜ? Sigma) για 48 ώρες πριν από την εκχύλισης RNA (μέθοδοι παρακάτω). Τέλος, άλλα κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε αγωγή με κυκλοεξαμίδιο (10 μΜ? Sigma). Για διαφορετικά χρονικά σημεία πριν να υποβληθούν σε λύση για Myc κηλίδωση Western

Οι επιμολύνσεις

Τα κύτταρα (2,0 χ 10

5) κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλίο 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 2 μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) σχεδιασμένη κατά

PVT1

συνδυάζονται σε μια ισομοριακή αναλογία (20 ή 40 ηΜ? FlexiTube Hs_PVT1_5 και Hs_PVT1_6? Qiagen, Valencia, CA) ή ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (AllStar Αρνητικός μάρτυρας? Qiagen) συζευγμένο με Alexa Fluor 488. οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας DharmaFECT1 (GE Dharmacon, Lafayette, CO) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης παρακολουθήθηκε μέσω μικροσκοπίας φθορισμού και επιβεβαιώθηκε μέσω ποσοτικής PCR (qPCR) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. επιμολύνσεις siRNA διεξήχθησαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές τραχηλικού SiHa και HeLa και χρησιμοποιούνται στον πολλαπλασιασμό, απόπτωση και κυτταρικό θάνατο, και προσδιορισμοί μετανάστευση και εισβολή.

Για κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) ολιγονουκλεοτίδιο επιμολύνσεις, κύτταρα (2,0 χ 10

5) απλώθηκαν σε ένα δίσκο 6 φρεατίων και την επόμενη μέρα επιμολυσμένα με 10 ηΜ PVT1_10 ή PVT1_15 LNA (Exiqon, Woburn, ΜΑ) ή ένα κωδικοποιημένο LNA ελέγχου (αρνητικός έλεγχος Α, Exiqon) χρησιμοποιώντας DharmaFECT 1 (GE Dharmacon) σε συγκέντρωση 0,2 μΐ ανά 100 μΐ μέσου ανάπτυξης. Οι αλληλουχίες των PVT1_10 LNA, PVT1_15 LNA και αρνητικός μάρτυρας Α είναι 5′-AACACGTCTATACGC-3 ‘, 5′-AGATCACTGTAAATCC-3′ και 5’-GGCAGGATCTATGGCA-3 ‘, αντίστοιχα. Η επιμόλυνση μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και κατάντη δοκιμασίες διεξάγονται 48 ώρες αργότερα. LNA-επιμολυσμένα κύτταρα SiHa χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν τα αποτελέσματα του siRNA διαμόλυνσης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων

PVT1

knockdown σε σισπλατίνη ανταπόκριση, τα πειράματα αποδόμησης Myc, και επιδράσεις στην έκφραση του mRNA νουκλεολίνη-εξαρτώμενη.

απομόνωση RNA, σύνθεση cDNA, και ποσοτική PCR (qPCR)

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας mirVana miRNA απομόνωση Kit (Ambion, Austin, ΤΧ) και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Για ορισμένα πειράματα, ζωντανά καλλιεργημένα κύτταρα πλύθηκαν με 1χ PBS και διαχωρίζεται σε κυτταροπλασματικά και πυρηνικά τμήματα RNA με χρήση μη ιονικών απορρυπαντικών, ακολουθώντας τις οδηγίες του κιτ PARIS (Life Technologies). RNA απομονώθηκε από κάθε τμήμα και υποβάλλεται σε αγωγή με ϋΝάση χρησιμοποιώντας ελεύθερο DNA Kit (Life Technologies). Έκφραση του

PVT1

,

MYC

και ελέγχου

RPS18

αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας EvaGreen qPCR βασικού μείγματος (MidSci, St. Louis, ΜΟ) σε StepOnePlus Real-Time PCR System ( Life Technologies). Το πρόγραμμα θερμικών κύκλων περιελάμβανε ένα αρχικό στάδιο ενεργοποίησης ενζύμου στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους που αποτελούνται από ένα στάδιο μετουσίωσης 10sec στους 95 ° C, και ένα 1min στάδιο ανόπτησης /επέκτασης στους 60 ° C για όλους τους εκκινητές. ένταση φθορισμού μετρήθηκε στους 62 ° C στο τέλος του κάθε κύκλου. Οι πρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές για

PVT1

ήταν 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3 ‘και 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3′, 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ‘και 5′-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ για το

MYC

, και 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 ‘για το

RPS18

(για κανονικοποίηση δεδομένων) .s για

PVT1

ήταν 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3′ και 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3 ‘ , 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ‘και 5’-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3 »για

MYC

, και 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3» για

RPS18

(για εξομάλυνση δεδομένων).

η έκφραση των miRNAs διεξήχθη χρησιμοποιώντας δοκιμασίες TaqMan® microRNA (Life Technologies) για HSA-miR-1204 (002872), HSA-miR-1205 (002778), HSA-miR-1206 (002878), HSA-miR-1207 -3P (002.826), HSA-miR-1207-5P (241060_mat), HSA-miR-1208 (002880), και RNU48 (001.006? για εξομάλυνση δεδομένων) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας mirVana miRNA Kit Απομόνωση και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) με την προϋπόθεση εκκινητές για κάθε miRNA. qPCR ενίσχυσης στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα PCR StepOnePlus Real-Time χρησιμοποιώντας παραμέτρους του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας μέθοδο 2- ΔΔCt για σχετική έκφραση του γονιδίου, που εκφράζεται ως 2-ΔΔCt.

RNA φθορισμού in situ υβριδισμού (FISH) και ανοσοκυτοχημεία

ViewRNA ΤΥΠΟΣ 6 σετ ανιχνευτή ( Affymetrix, Santa Clara, CA) σχεδιασμένα ενάντια

PVT1

(NR_003367.2) χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει

PVT1

έκφραση

in vitro

. Τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια που παρέχονται στο QuantiGene ViewRNA ISH Kit κυττάρων Δοκιμασία (Affymetrix). Εν συντομία, τα κύτταρα SiHa σπάρθηκαν επάνω σε κυκλική καλυπτρίδες 12 mm και αναπτύχθηκαν σε 70-90% συρροή πριν σταθεροποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με 1Χ PBS και επωάζονται για 5 λεπτά σε διάλυμα απορρυπαντικού για διαπερατοποίηση. Τα κύτταρα πλύθηκαν μια φορά και επωάστηκαν με Διάλυμα Εργασίας πρωτεάσης για 25 λεπτά. Ανιχνευτές αραιώθηκαν (1: 100) σε προθερμασμένο Ανιχνευτών αραιωτικό και επωάζονται με τα κύτταρα για 3 ώρες στους 40 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν, υβριδοποιήθηκαν με Εργασίας προενισχυτή Mix διαλύματος για 30 λεπτά στους 40 ° C, πλύθηκαν πάλι, και υβριδοποιήθηκε με Εργασίας Ενισχυτής Mix διαλύματος για 30 λεπτά στους 40 ° C. Μετά από περισσότερα πλύση, τα κύτταρα υβριδοποιήθηκαν με τους σημασμένους ανιχνευτές για 30 λεπτά στους 40 ° C. Μετά από αυτή την επώαση, καλυπτρίδες πλύθηκαν, χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ, και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν με ένα Zeiss LSM 510 ομοεστιακό μικροσκόπιο βρίσκεται στο Παιδικό Ινστιτούτο Έρευνας Imaging Core στο Ιατρικό Κολέγιο του Ουισκόνσιν. Εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το Adobe Photoshop CS5.1.

Για την συν-χρώση Νουκλεολίνης με

PVT1

RNA FISH, ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε πριν από την χρώση με βήμα DAPI παραπάνω. Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS + 1% BSA και 0.1% Tween-20 και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως (PBS + 10% BSA, 0% φυσιολογικό ορό γαϊδάρου και 0.1% Tween-20). Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα σε ρυθμιστικό δέσμευσης που περιέχει ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι Νουκλεολίνης (1: 1000? Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Κυττάρων και πάλι πλύθηκαν 3 φορές και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε διάλυμα που περιέχει ένα μπλοκ FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα για την οπτικοποίηση του Νουκλεολίνης. Μετά από μία τελική πλύση, καλυπτρίδες στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας Vectashield αντιξεθωριάσματος Τοποθέτηση Μεσαίο με DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) και απεικονίζεται όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κυτταρικού πολλαπλασιασμού ELISA BrdU (χρωματομετρική) σετ (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 48 ώρες μετά την διαμόλυνση, 1,0 χ 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλίο 96 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επισημάνθηκαν με BrdU για 2 ώρες, σταθερό, και επωάστηκαν με αντι-BrdU-POD. Χωρίς περιορισμούς υπεροξειδάσης συζυγή απομακρύνθηκαν με πλύσιμο. Το υπόστρωμα στη συνέχεια προστέθηκε και τιμές απορρόφησης (370 ηΜ-492 ηΜ) μετρήθηκαν 15 λεπτά αργότερα.

Ο προσδιορισμός κυττάρων Η βιωσιμότητα PrestoBlue® χρησιμοποιήθηκε επίσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα SiHa επιμολύνθηκαν με LNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων (1.0 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και εκτέθηκαν σε σισπλατίνη (Sigma) σε ένα εύρος συγκεντρώσεων μεταξύ 10-200 μΜ για 4 ώρες. Η σισπλατίνη μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο ανάπτυξης μετά την έκθεση 4 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, οι τιμές φθορισμού μετρήθηκαν μετά από επώαση των κυττάρων με το αντιδραστήριο PrestoBlue® για 1 ώρα στους 37 ° C.

κυτταρικού θανάτου και της απόπτωσης δοκιμασίες

Ο κυτταρικός θάνατος αποτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον κυτταρικό θάνατο ανίχνευση ELISA Kit (Hoffmann-La Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες κατασκευής. Εν συντομία, 48 ώρες μετά την διαμόλυνση, 0,5 χ 10

5 κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Cellular νουκλεοσώματα δεσμεύονταν στην προετοιμασμένη πλάκα ELISA μέσω συνιστώσες της ιστόνης. Αντι-DNA-υπεροξειδάση προστέθηκε, και μη δεσμευμένο συζυγή υπεροξειδάσης απομακρύνθηκαν με πλύση. Το υπόστρωμα στη συνέχεια προστέθηκε και τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν 15 λεπτά αργότερα (405 ηΜ-490 ηΜ). Η απόπτωση χαρακτηρίζεται από μέτρηση δραστική κασπάση-3 (ng /mg ολικής προϊόν λύσης κυττάρου) χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη κασπάση-3 (Active) ELISA Kit (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα (1,0 χ 10

6) λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης κυττάρων (Life Technologies) συμπληρωμένο με Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης (Sigma) και φθοριούχο φαινυλμεθανιοσουλφονύλιο (Sigma).

Η κυτταρική μετανάστευση και προσδιορισμούς εισβολής

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, μέσα που περιέχουν ορό απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με 1χ PBS στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε ΕΜΕΜ χωρίς ορό. Μετά την περίοδο ασιτίας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας HyQTase και επιστρώθηκαν (1 χ 10

5 κυττάρων) και πάνω σε Corning Transwell Permeable υποστηρίζει (Corning, Tewksbury ΜΑ). Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης, Transwell μεμβράνες εξισώνονται σε μέσο ανάπτυξης 24 h πριν από κύτταρο σπορά. Για τις δοκιμασίες εισβολή, Transwell μεμβράνες επικαλύφθηκαν με Matrigel Matrix (Corning? 1: 6 σε ΕΜΕΜ) και ξηραίνεται για 6 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία και εν απουσία του χημειοελκτικό (ΕΜΕΜ + 20% FBS) και συλλέχθηκαν 6 ώρες ή 48 ώρες αργότερα για ανάλυση της μετανάστευσης και της εισβολής, αντίστοιχα. κύτταρα μη-μετανάστη απομακρύνθηκαν από την άνω όψη της μεμβράνης Transwell με μια μπατονέτα, ενώ οι μετανάστες κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ) και οπτικοποιούνται /μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο.

κηλίδωση Western

Φρέσκα κατεψυγμένα τραχηλικού ιστού ή 3,6 χ 10

6 κύτταρα πλύθηκαν με 1χ PBS και λύθηκαν για 10 λεπτά επί πάγου με τη χρήση κυττάρων ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης (Life Technologies) συμπληρωμένο με 1 mM PMSF (Sigma) και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma). Undigested κυτταρικά υπολείμματα δισκιοποιούνται δια φυγοκεντρήσεως εις 10.000 RPM και η υπολειπόμενη λύμα ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bradford (Sigma). Lysate (20 μα) εξαντληθεί σε κριτήριο Tris-HCl γέλη πολυακρυλαμιδίου (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, αποκλείστηκαν με 1Χ TBS + 10% άπαχο ξηρό γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (Myc ή Νουκλεολίνης, 1: 1000? Cell Signaling Technology) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα, οι μεμβράνες πλύθηκαν, επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με IgG αντι-κουνελιού συζευγμένο με HRP κατσίκας (1: 5000? Cell Signaling Technology), και αναπτύχθηκε με τη χρήση ECL (Life Technologies). Η χημειοφωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Molecular Imager XRS ChemiDoc + (Bio-Rad Laboratories) και οπτικοποιήθηκε ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Software Lab εικόνας (Bio-Rad Laboratories).

χρωματογραφία συγγένειας RNA και φασματομετρία μάζας αλληλούχιση

Αρκετές επικάλυψη με νόημα και αντινόημα ολιγονουκλεοτίδια μονόκλωνου DNA (ssDNA oligos? 100 nt μακρύ) δημιουργήθηκαν κατά τις πλήρεις αλληλουχίες των εξωνίων 2 και 9 του

PVT1

(NR_003367.3? Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL) . Εξώνια 2 και 9 επιλέχθηκαν με βάση την αυξημένη τάση τους για τη δέσμευση, όπως καθορίζεται

in silico

πρωτεΐνη. ssDNA υβριδοποιήθηκαν για να ληφθεί δίκλωνο DNA (dsDNA), όλα εκ των οποίων είχε μία αλληλουχία Τ7 υποκινητή στο 5 ‘άκρο. Το Τ7 υποκινητή που περιέχει dsDNA ήταν

in vitro

-transcribed χρησιμοποιώντας το κιτ MaxiScript Τ7 (Ambion) και προκύπτον RNA μετά 3′-βιοτινυλιώνονται με το κιτ Pierce Desthiobiotinylation (ThermoScientific). Desthiobiotinylated RNAs επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη δεσμευμένη μαγνητικά σφαιρίδια από την Pierce Magnetic RNA-Protein pull-down Kit (Thermo Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά την πλύση, 200 μg SiHa λύματος ολόκληρων κυττάρων προστέθηκε στα RNA δεσμευμένο στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια και επωάστηκαν στους 4 ° C με ήπια ανάδευση για 90 λεπτά. Μετά από 3 πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Thermo Scientific 20164), τα δεσμευμένα RNA πρωτεΐνες εκλούστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και αναλύθηκαν με SDS-PAGE σε ένα πήκτωμα ακρυλαμιδίου 12%. Μετά από χρώση αργύρου, πρωτεϊνικές ζώνες του ενδιαφέροντος Φασματομετρίας Μάζας αλληλουχία σε Taplin Φασματομετρίας Μάζας Διευκόλυνσης (Harvard Medical School, Boston, MA). Μάζα φασματομετρία «χτυπήματα» αναλύθηκαν για τον αριθμό των μοναδικών και συνολικών πεπτιδίων που λαμβάνονται και την περιοχή κάτω από την καμπύλη. Κάθε χτύπημα ήταν

in silico

θρυψίνη πέψη και ο αριθμός των πεπτιδίων που λαμβάνονται με

in silico

πέψη συγκρίθηκε με τον αριθμό των πεπτιδίων που λαμβάνονται στα αποτελέσματα φασματομετρίας μάζας. Μόνον οι πρωτεΐνες που είχαν περισσότερα από τα θραύσματα θρυψίνη εύπεπτο παρόν 20% ή θεωρήθηκαν να είναι αληθινό χτυπήματα. Κηλίδωση Western (όπως περιγράφεται παραπάνω) μετά από χρωματογραφία συγγενείας RNA χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω για την επικύρωση αληθινό χτυπήματα.

ανοσοκαταβύθιση RNA

RNA ανοσοκαταβύθιση (RIP) ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της Magna RIP RNA-Binding Protein ανοσοκατακρήμνισης Kit (EMD Millipore) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σύνολο κυτταρολύματος από 1,7 χ 10

κύτταρα SiHa 7 χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκατακρήμνιση με Myc και Νουκλεολίνης αντισώματα (ίδια όπως και για κηλίδωση Western). Ως μη ειδικό έλεγχο IgG, καθαρισμένη IgG κουνελιού διεξήχθη παράλληλα. Μετά την πέψη των πρωτεϊνών, RNA εκχυλίζεται και υποβάλλεται σε επεξεργασία με ϋΝάση χρησιμοποιώντας ελεύθερο DNA Kit (Life Technologies). Επίπεδα

PVT1

προσδιορίστηκαν ποσοτικά στην είσοδο και ανοσοκατακρημνίσθηκαν RNA.

Ανάλυση και Στατιστικά Δεδομένα

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τις διαφορές μεταξύ των μέσων δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του Student

δοκιμές

t (two-tailed). Τα αποτελέσματα έχουν γραφικά ως μέσο ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. καμπύλες Cisplatin δόσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μεταβλητή μοντέλο κλίση. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις και γραφικών παραστάσεων των δεδομένων εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA), εκτός από την ανάλυση επιβίωσης που διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS11.0 (Chicago, IL). Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier χαράχθηκαν και σε σύγκριση με τη χρήση log-rank (Mantel-Cox) δοκιμές. Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

PVT1

έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε όγκους από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και σχετίζεται με φτωχότερη επιβίωση

PVT1

είναι ένα γονίδιο με πολλαπλά εξώνια με συνεχόμενη περιοχή γονιδιώματος του περιέχει ένα σύμπλεγμα 6 σχολιασμένη microRNAs (miRNAs).

PVT1

και τοπικό επίπεδο έκφρασης των miRNAs προσδιορίστηκαν από qPCR για καρκινικά και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

PVT1

έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη στους όγκους από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έναντι παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (n = 127 όγκων? N = 30 παρακείμενο φυσιολογικό? Ρ & lt? 0,001? Σχήμα 1Α). Έκφραση των miRNAs 1204 και 1206 (αλλά όχι 1205, 1207-3p, 1207-5p, ή 1208? S1A-S1D Εικ) ήταν σημαντικά υψηλότερο σε όγκο έναντι φυσιολογικό γειτονικό ιστό του τραχήλου της μήτρας (Σχήμα 1Β και 1Γ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, επειδή

PVT1

και

MYC

συχνά συν-ενισχύεται σε καρκίνο, εξετάσαμε επιπλέον έκφραση

MYC

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Παρά το γεγονός ότι παρατηρείται μια τάση προς αύξηση της

MYC

στον καρκίνο σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικό, η διαφορά στο μέσο έκφρασης των

MYC

δεν ήταν στατιστικά σημαντική μεταξύ των δύο ομάδων (S1E σχήμα).

(Α)

PVT1

έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε πρωτογενείς όγκους του τραχήλου της μήτρας (n = 127) σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του τραχήλου της μήτρας (η = 30? ρ & lt? 0.001). Η έκφραση των miRNAs 1204 (Β? Ρ & lt? 0,05) και 1206 (C? Ρ & lt? 0.001), αλλά όχι άλλων τοπικών miRNAs, ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη σε τραχηλικό ιστό του όγκου (n = 38) σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (n = 18) . (D) οικόπεδα Kaplan-Meier έδειξε τη σύνδεση της τριτοβάθμιας όγκου

PVT1

επίπεδα με σημαντικά φτωχότερη χρόνους επιβίωσης σε σύγκριση με το χαμηλότερο

PVT1

επίπεδα (p = 0.03).

Η

Οι 127 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας χωρίστηκαν σε υψηλές και χαμηλές

PVT1

εκφράζοντα ομάδες, χρησιμοποιώντας το διάμεσο

PVT1

επίπεδο έκφρασης, για τη διερεύνηση συσχετισμό τους με την πρόγνωση. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier και δοκιμές-rank συνδεθείτε, βρήκαμε ότι τα υψηλά

PVT1

έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερη αθροιστική χρόνος επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (p = 0,03? Σχήμα 1D). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι, σε γενικές γραμμές,

PVT1

έκφραση είναι αυξημένη σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς όγκους και ότι όσο υψηλότερη είναι η έκφραση

PVT1

, η φτωχότερη πρόγνωση.

PVT1

έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Για να ξεκινήσετε μας

in vitro

εξέταση στο ρόλο του

PVT1

του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, προσδιορίσαμε

PVT1

επίπεδα έκφρασης σε διάφορα εμπορικά διαθέσιμα τράχηλο κυτταρικές γραμμές που παράγονται μέσω qPCR (Σχήμα 2Α). Από 4 τραχήλου γραμμές, HPV 16-θετικά κύτταρα SiHa παρουσίασαν την υψηλότερη

PVT1

έκφραση, ενώ το χαμηλότερο

PVT1

έκφραση παρατηρήθηκε σε HPV 16 Ε6 /Ε7 μετασχηματισμένων κυττάρων που προέρχονται από φυσιολογικό ectocervix (Ect1 /E6E7). Στη συνέχεια, προσπάθησε να εντοπίσει συγκεκριμένους ογκογόνους παράγοντες άγχους που μπορεί να οδηγήσει ενισχυμένη

PVT1

έκφρασης σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Για το σκοπό αυτό, θα εκτίθενται τα κύτταρα SiHa (που χρησιμοποιείται για το υπόλοιπο των σπουδών μας) σε διάφορες μετασχηματιστική ερεθίσματα πριν από τη μέτρηση των επιπτώσεων στο

PVT1

έκφρασης μέσω qPCR. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι

PVT1

έκφραση σε κύτταρα SiHa αυξήθηκε σημαντικά σε απόκριση σε επώαση 48 ωρών με INF-α ή το μιμητικό υποξία, χλωριούχο κοβάλτιο (COCI

2? Σχήμα 2Β). Άλλα ερεθίσματα, όπως του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας (IGF), φορβόλης 12-μυριστικού 13-οξικού (πρωτεΐνη ενεργοποιητή κινάσης C), και γ-ακτινοβολία δεν επηρεάζει σημαντικά

PVT1

έκφραση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τέλος, διερευνήθηκε υποκυτταρική εντόπιση του

PVT1

χρησιμοποιώντας RNA FISH και βρήκε έκφραση του

PVT1

τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων SiHa. Περαιτέρω, ο έλεγχος αντινόημα επιμολυσμένα SiHa (Σχήμα 2C) παρουσίασαν παρόμοια πυρηνικά και κυτταροπλασματικά

PVT1

χρώση, από τα οποία ήταν απούσα σε

PVT1

knockdown κυττάρων (Σχήμα 2D). Συνοπτικά,

PVT1

εκφράζεται σε διάφορες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινο τράχηλο, μπορεί να αυξηθεί από το ανοσοποιητικό και υποξικές ερεθίσματα, και εντοπίζεται σε ολόκληρο τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα υποδηλώνοντας ότι αυτό lncRNA μπορεί να συμμετέχει σε διάφορες διεργασίες του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων , ενδεχομένως μέσω περισσότερων του ενός μοναδικού μηχανισμού.

(Α)

PVT1

έκφραση σε εμπορικώς διαθέσιμες κυτταρικές γραμμές τραχήλου της μήτρας. Χαμηλότερη

PVT1

έκφραση παρατηρήθηκε σε HPV 16 Ε6 /Ε7 μετασχηματισμένων κυττάρων που προέρχονται από φυσιολογικό ectocervix (Ε6 /Ε7-Ecto), ενώ SiHa κύτταρα καρκίνου του τραχήλου παρουσίασε το υψηλότερο

PVT1

έκφραση σε σύγκριση με 2 άλλα καρκίνο του τραχήλου που προέρχονται από γραμμές (HeLa και DoTc2). (Β) Έκφραση

PVT1

σε κύτταρα SiHa αυξήθηκε περαιτέρω κατά την επεξεργασία 48h με INF-α (10 μΜ) ή το χλωριούχο κοβάλτιο υποξία μιμητική (COCI

2? 150 μΜ). Αντιπροσωπευτικές εικόνες των πειραμάτων FISH RNA σε κύτταρα SiHa επιμολυσμένα είτε με μάρτυρα (C) ή

PVT1

(D) LNAs. Έλεγχος LNA-επιμολυσμένα κύτταρα εμφάνισαν σήματα στικτή για

PVT1

(κόκκινο) τόσο στον πυρήνα (χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ σε μπλε) και το κυτταρόπλασμα. Τόσο η πυρηνική και κυτταροπλασματική

PVT1

χρώση ήταν απούσα στο

PVT1

LNA-επιμολυσμένα κύτταρα. Φάση εικόνα (κάτω αριστερά πάνελ) απεικονίζει τη μορφολογία των κυττάρων. μπαρ κλίμακα (λευκό) = 10 μm. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01

Η

PVT1

αποσιώπηση μειώνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας, τη μετανάστευση και την εισβολή

Στη συνέχεια, τα κύτταρα SiHa επιμολυσμένα με

PVT1

-targeted siRNA (siPVT1) έχουν χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει τα αποτελέσματα αυτής της lncRNA για τραχήλου της μήτρας πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την κινητικότητα. Η επιμόλυνση με το

PVT1

-targeting siRNAs οδήγησε σε, κατά μέσο όρο, το 70% knockdown του

PVT1

σύγκριση με τους μάρτυρες επιμολυσμένα κύτταρα (σχήμα 3Α). Περαιτέρω, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο τοπικό miRNA (1204-1208) ή

MYC

έκφραση mRNA σε siPVT1 έναντι ομελέτα κύτταρα ελέγχου-επιμολυσμένα (siCONT? S2 σχήμα). siPVT1-επιμολυσμένα κύτταρα SiHa παρουσίασαν σημαντική μείωση στην ενσωμάτωση BrdU, ένα μέτρο της αντιγραφής κυττάρων, στις 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση σε σύγκριση με siCONT, γεγονός που υποδηλώνει ότι

PVT1

παίζει έναν ρόλο στην οδήγηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 3Β). Αυτές οι επιδράσεις των

PVT1

νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό SiHa επιβεβαιώθηκαν επίσης από επιμόλυνση με

PVT1

-targeted LNA. Τέλος, σε σύγκριση με τα κύτταρα siCONT, κύτταρα siPVT1 εμφάνισαν σημαντική μείωση στην μετανάστευση (Σχήμα 3C) και εισβολή (Σχήμα 3D) δυναμικό. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτές οι επιδράσεις των

PVT1

νοκ ντάουν που μιμείται σε άλλο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή, HeLa (S3 σχήμα), παρέχοντας περαιτέρω υποστήριξη για ένα ρόλο αυτού του lncRNA στην αυχενική καρκινογένεση.

(Α ) η επιμόλυνση των SiHa καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων με τα siRNA που στοχεύουν

PVT1

(siPVT1) είχε ως αποτέλεσμα μια κατά προσέγγιση 70% νοκ ντάουν στο

PVT1

lncRNA έκφρασης σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα κωδικοποιημένο ελέγχου siRNA (siCONT) . κύτταρα (Β) SiHa επιμολυσμένα με siPVT1 εμφάνισε μια σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με κύτταρα siCONT. Τα επιμολυσμένα κύτταρα SiHa αξιολογήθηκαν επίσης για τις αλλαγές στο (C) μετανάστευση και (D) εισβολή 6 ώρες ή 48 ώρες μετά την εισαγωγή του χημειοελκτικό (FBS), αντιστοίχως. κύτταρα siPVT1 έδειξαν μια σημαντική μείωση τόσο κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε σύγκριση με κύτταρα siCONT. Τα ποσοτικά αποτελέσματα απεικονίζονται γραφικά στα αριστερά, ενώ εκπρόσωπος εικόνες είναι στα δεξιά. *** P & lt? 0.001, **** p & lt? 0,0001

Η

PVT1

σίγηση αυξάνει την απόπτωση και την ανταπόκριση στη σισπλατίνη σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα

Μέχρι σήμερα, siRNA μεσολάβηση στρατηγικές νοκ ντάουν που στοχεύουν

PVT1

έχουν αποδείξει το ρόλο της στην ευαισθησία σισπλατίνη σε κακόηθες μεσοθηλίωμα υπεζωκότα [25] και του γαστρικού καρκίνου κύτταρα [26]. Ωστόσο, η αντι-αποπτωτική υπογραφή που προκαλείται από

PVT1

σε άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων [8,18,20,26] μπορεί να υποδεικνύει ότι η συμβολή της στην αντίσταση σισπλατίνη είναι πιο εκτεταμένες. Έτσι, την επόμενη πειράματά μας σχεδιάστηκαν για να διερευνήσει το ρόλο του

PVT1

στην απόπτωση και σισπλατίνη ευαισθησία του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Επεκτείνοντας τις προαναφερθείσες διαπιστώσεις, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το

PVT1

knockdown σε κύτταρα SiHa σημαντικά αυξημένα επίπεδα κυτταροπλασματικής θραυσμάτων ιστόνης που σχετίζονται με DNA (Σχήμα 4Α) και την ενεργό κασπάση-3 (Εικόνα 4Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι

PVT1

μπορεί επίσης να συμβάλει στην αυχενική καρκινογένεση μέσω αναστολής του κυτταρικού θανάτου και της απόπτωσης. Περαιτέρω,

PVT1

νοκ ντάουν είτε με siRNA (Σχήμα 4C) ή LNA ολιγονουκλεοτίδια (Σχήμα 4D) οδηγεί σε αυξημένη ανταπόκριση των κυττάρων SiHa με σισπλατίνη. Συλλογικά, η φαινοτυπική κυττάρων (απώλεια του

PVT1

) λειτουργικά δεδομένα δείχνουν ότι

PVT1

απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό, τη συντήρηση και την αντίσταση σισπλατίνη του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων.

siPVT1 κύτταρα παρουσίασαν μια σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο (α) και την απόπτωση (Β) σε σύγκριση με τα κύτταρα siCONT. (Γ) Πολλαπλασιασμός των κυττάρων SiHa siPVT1 μειώθηκε σημαντικά σε απόκριση σε πολλαπλές δόσεις σισπλατίνης. (D) καμπύλη δόσης-απόκρισης για τον έλεγχο και την

PVT1

LNA-επιμολυσμένα κύτταρα SiHa ακόλουθες 4 θεραπεία h με σισπλατίνη.