Αφηρημένο

Εισαγωγή

Η χρήση των αναστολέων της 5-άλφα αναγωγάσης (5-στους ARI) finasteride και dutasteride για προστάτη την πρόληψη του καρκίνου είναι ακόμη υπό συζήτηση. Το FDA πρόσφατα στο συμπέρασμα ότι η αυξημένη συχνότητα των όγκων υψηλής ποιότητας μεταξύ των 5-ARI-ασθενείς που έλαβαν θεραπεία δεν πρέπει να παραμεληθεί, και αποφάσισε να απαγορεύσει τη χρήση του 5-ΑΡΗ για την πρόληψη του καρκίνου του προστάτη. Η μελέτη αυτή διεξήχθη για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων της φιναστερίδης στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή του προστάτη και τα συναφή ένζυμα /πρωτεΐνες σε φυσιολογικό προστάτη καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπου και των.

Υλικά και Μέθοδοι

RWPE-1, LNCaP, PC3 και DU145 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 60% συρροή και εκτέθηκαν για διαφορετικές περιόδους είτε 10 μΜ ή 50 μΜ finasteride που αραιώθηκε σε μέσο καλλιέργειας. Τα ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν, και ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητες και ΤΙΜΡ-1 και την έκφραση της πρωτεΐνης ΤΙΜΡ-2 προσδιορίστηκαν. Η βιωσιμότητα των κυττάρων, η μετανάστευση και εισβολή αναλύθηκαν, και οι υπόλοιπες κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε υποδοχέα ανδρογόνου (AR) ανίχνευση με στύπωση Western τεχνικές. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Αποτελέσματα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δεν επηρεάστηκε σημαντικά από την φιναστερίδη έκθεσης. Finasteride σημαντικά μειωτικά δραστηριότητες ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε RWPE-1 και τα κύτταρα PC3 και ΜΜΡ2 στα κύτταρα DU145. έκφραση ΤΙΜΡ-2 σε κύτταρα RWPE-1 ρυθμίζεται αυξητικά μετά την έκθεση. Η εισβολή των κυττάρων και των τεσσάρων κυτταρικών σειρών δοκιμάστηκαν ανεστάλη με την έκθεση σε 50 μΜ της φιναστερίδης, και η αναστολή της μετανάστευσης εμφανίστηκε μόνο για RWPE-1 και LNCaP κύτταρα. AR εκφράστηκε από LNCaP, RWPE-1 και τα κύτταρα PC3.

Συμπεράσματα

Αν και η συζήτηση σχετικά με την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη υψηλής ποιότητας μεταξύ των ασθενών 5-ARI-θεραπεία παραμένει, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η φιναστερίδη μπορεί να μετριάσει την επιθετικότητα του όγκου και την εισβολή, η οποία θα μπορούσε να ποικίλλει ανάλογα με την ανδρογόνων ανταπόκριση των κυττάρων του προστάτη ενός ασθενούς

Παράθεση:. Moroz Α, Delella FK, Almeida R, Lacorte LM, Favaro WJ, Deffune Ε, et al. (2013) Finasteride αναστέλλει την ανθρώπινη προστάτη Cancer Cell εισβολή μέσω ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 ρύθμιση προς τα κάτω. PLoS ONE 8 (12): e84757. doi: 10.1371 /journal.pone.0084757

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Ιαν 2013? Αποδεκτές: 27 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Δεκ 2013

Copyright: © 2013 Moroz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια FAPESP (Συμβούλιο Έρευνας για το κράτος του Σάο Πάολο) χρηματοδότηση (διαδικασία n. 2010/16671-3) και Ph.D. CAPES υποτροφία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή κακοήθεια στους άνδρες και αντιπροσωπεύει το 8 δισεκατομμύρια $ και ένα μέσο κόστος των $ 81.658 ανά ασθενή, από τη διάγνωση μέχρι θανάτου, στις ΗΠΑ [1]. Ένας αριθμός παραγόντων είναι επί του παρόντος υπό διερεύνηση για την πρόληψη του καρκίνου του προστάτη [2]. Finasteride, ένας αναστολέας τύπου 2 5-άλφα αναγωγάσης (5-ARI) που μπλοκάρει τη μετατροπή της τεστοστερόνης (Τ) σε διυδροτεστοστερόνη (DHT) [3], είναι ένα πολύ γνωστό φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη [ ,,,0],4], και έχει προταθεί για να ενεργεί ως χημειοπροληπτική παράγων για καρκίνο του προστάτη. Η πρόληψη του καρκίνου του προστάτη Trial (PCPT) έδειξε μείωση 24,8% στη συνολική και χαμηλού βαθμού κινδύνου του καρκίνου του προστάτη με τη διοίκηση της φιναστερίδης. Ωστόσο, οι καρκίνοι υψηλής ποιότητας παρατηρήθηκαν στο 6,4% των ασθενών που φιναστερίδη-θεραπεία, σε σύγκριση με το 5,1% των ανδρών που έλαβαν εικονικό φάρμακο [5], [6]. Η διαπίστωση αυτή οδήγησε σε μια σημαντική ερώτηση: μήπως η φιναστερίδη να προκαλέσουν καρκίνο υψηλής ποιότητας ή να αυξήσει την ανίχνευση του; Αυτή η ερώτηση ακολουθήθηκε από μια έντονη συζήτηση σχετικά με τα πραγματικά περιστατικά ή τεχνητή υπερεκτίμηση των υποθέσεων υψηλής ποιότητας στους ασθενείς φιναστερίδη που έλαβαν [3], [7], η οποία χωρίζεται ουρολόγους και ερευνητές του προστάτη. Πιο πρόσφατα, η ΜΕΙΩΣΗ δίκη ανέφεραν παρόμοια αποτελέσματα μετά από θεραπεία Dutasteride 5-ARI. Αναγνωρίζοντας τη σημασία του θέματος αυτού, η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) έχει να αναλύονται πάλι πρόσφατα τα δεδομένα από το PCPT και να μειώσει δοκιμές και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η φιναστερίδη και dutasteride θεραπείες μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο μιας πιο σοβαρή μορφή καρκίνου του προστάτη. Συνεπώς, αποφάσισαν να απαγορεύσει τη χρήση αυτών των παραγόντων για την πρόληψη του καρκίνου του προστάτη [8]. Επιπλέον, μια πρόσφατα δημοσιευμένη πειραματική μελέτη αποκάλυψε παρόμοια αποτελέσματα με το PCPT και τη μείωση των δοκιμών [9]. Οι συγγραφείς απέδειξαν ότι η συχνότητα των πτωχά διαφοροποιημένο καρκίνωμα του αυξήθηκε σε C57BL /6 ποντίκια TRAMP × FVB τροφοδοτείται με φιναστερίδη συμπληρωμένο δίαιτα, και θεωρείται αυτό ως ανεπιθύμητη επίδραση του finasteride θεραπεία, παρά μια τεχνητή επίδραση [9].

Υψηλής ποιότητας περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη, όπως αυτές που παρατηρούνται στους ασθενείς 5-ARI-θεραπεία, συνήθως συνδέονται με μια αυξημένη έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), μια οικογένεια από ψευδάργυρο και ασβέστιο που εξαρτώνται από ενδοπεπτιδάσες που είναι υπεύθυνες για εξωκυτταρικό μήτρα (ECM) αναδιαμόρφωση, η οποία συμβάλλει στην επεμβατική και μεταστατικό φαινοτύπους των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [10] – [13], και μειωμένη έκφραση του αναστολέα ιστού των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (TIMPs) [13], μια κατηγορία φυσικώς απαντώμενων αναστολέων των ΜΜΡ ότι σφιχτά ρυθμίζουν τη δραστηριότητα τους και εκφράζονται σε μία ποικιλία κυτταρικών τύπων [11].

Επειδή αποικοδόμηση ECM είναι γνωστό ότι είναι ένα σημαντικό στάδιο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου [10], [12], [13], η ομάδα μας διερευνά τις επιδράσεις της φιναστερίδης κατά MMP και TIMP διαμόρφωση, σε μια προσπάθεια να εξηγήσει γιατί οι ασθενείς φιναστερίδη ασθενείς είχαν καρκίνους του προστάτη υψηλότερης ποιότητας. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι η φιναστερίδη θεραπεία αύξησε την έκφραση της ΜΜΡ9 και μείωσε την έκφραση του ΜΜΡ2 στον αρουραίο κοιλιακό προστάτη [14], [15], και ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω τα επίπεδα του mRNA του ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 στον αρουραίο κοιλιακό προστάτη [ ,,,0],15]. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει πρόσφατα ότι η φιναστερίδη μειώνει επίσης την δραστικότητα ζελατινολυτική ΜΜΡ2 σε μια ποικιλία κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου προστάτη [16]. Διενεργήσαμε την παρούσα μελέτη για να διαπιστώσει αν η θεραπεία finasteride παρεμβαίνει στην μετανάστευση και επεμβατική δυναμικό του φυσιολογικού ανθρώπινου κυτταρική σειρά προστάτη οι καρκινικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών LNCaP, PC3 και DU145, τα οποία έχουν διαφορετικό υποδοχέα ανδρογόνων (AR) προφίλ RWPE-1 και.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιεργειών

Ένα φιαλίδιο κάθε RWPE-1 (μη-καρκινική, άγριου τύπου AR

+), LNCaP (όγκων, μεταλλαγμένο AR

+) και PC3 (όγκων, AR

-) κυτταρικές σειρές αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC ™). DU145 (όγκων, AR

-) κύτταρα ευγενική δωρεά από τον Δρ Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo από το Τμήμα Φυσιολογίας – UFSCar, Βραζιλία (αρχικά αποκτήθηκαν από την ATCC ™). Αν και δεν είναι ισογονιδιακό, επελέγησαν αυτές οι κυτταρικές γραμμές να είναι αντιπροσωπευτικό της 3 ξεχωριστές in vivo καταστάσεις έκθεσης finasteride: ένας ασθενής με κανονικό προστάτη (που αντιπροσωπεύεται in vitro από την κυτταρική γραμμή RWPE-1), ένας ασθενής με ευαίσθητο σε ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη (που αντιπροσωπεύεται in vitro από την κυτταρική γραμμή LNCaP) και έναν ασθενή με ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη (που αντιπροσωπεύεται in vitro από το PC3 και κυτταρικές γραμμές DU145). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν δύο μήνες μετά την απόκτηση των κυτταρικών σειρών. Τα κύτταρα RWPE-1 καλλιεργήθηκαν με κερατινοκυττάρων Ορός Ελεύθερη Medium (Invitrogen ™) συμπληρωμένο με 0.05 mg /ml βόειας εκχύλισμα υπόφυσης, 5 ng /ml ανασυνδυασμένου ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιακό διάλυμα (Invitrogen ™). Τα κύτταρα LNCaP, PC3 και DU145 καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας μέσο RPMI (Invitrogen ™) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (SFB) (Invitrogen ™) και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιακό διάλυμα (Invitrogen ™). Όλες οι διαδικασίες καλλιέργειας κυττάρων πραγματοποιήθηκαν υπό αυστηρές συνθήκες αποστείρωσης και διατηρούνται μέσα σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα (Thermo Scientific ™). Η αρχική φιαλίδιο από κάθε κυτταρική σειρά επεκτάθηκε μέχρι 10 φιαλίδια και ατομικά κρυοσυντηρούνται στο αντίστοιχο θρεπτικό μέσο κυτταρικής καλλιέργειας συμπληρωμένο με 20% FBS και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma-Aldrich ™) για να αποτελέσει την τράπεζα κυττάρου.

Finasteride έκθεσης και κυττάρων Βιωσιμότητας

Όλες οι κυτταρικές σειρές στη συνέχεια αποψυχθεί και ατομικά σπάρθηκαν σε 2 × 10

4 κύτταρα /cm

2 σε 6-φρεατίων καλλιέργειας (TPP ™). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι συγκεντρώσεις Finasteride επιλέχθηκαν με βάση μια προηγούμενη μελέτη, στην οποία 10 μΜ και 50 μΜ επάγεται σημαντική μεταβολική ρύθμιση κατά προστάτη καρκινικών κυττάρων [17]. Κατά την επίτευξη 60% συρροής, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με στείρο D-PBS (GIBCO /Invitrogen ™), και το μέσο καλλιέργειας συνιστάται (FBS δωρεάν) προστέθηκε ως ακολούθως: 1) αγωγή ελέγχου – συμπληρωμένο με 0.1% DMSO? 2) θεραπεία φιναστερίδη χαμηλή δόση – συμπληρωμένο με 0,1% DMSO συν 10 μΜ finasteride (Sigma ™)? και 3) κατεργασία φιναστερίδη υψηλής δόσης – συμπληρωμένο με 0,1% DMSO συν 50 μΜ finasteride (Sigma ™). Finasteride αραιώθηκε σε DMSO, και το διάλυμα DMSO /finasteride αραιώθηκε σε μέσο καλλιέργειας. Κατά τη διάρκεια όλων finasteride θεραπείες έκθεση, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα αντίθεσης φάσης ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Zeiss ™) για γενική μορφολογία και βακτηριακή και μυκητιακή μόλυνση. Μετά από 24, 48 και 72 ώρες έκθεσης, το ρυθμισμένο μέσο (CM) συλλέχθηκε και ατομικά αποθηκεύονται στους -80 ° C. Τα υπόλοιπα συνδεδεμένα κύτταρα μεμονωμένα ανακτώνται από θρυψίνη πέψη και ένα δείγμα αξιολογήθηκε για βιωσιμότητα με βαφή κυανούν τρυπανίου. Τα υπόλοιπα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν μεμονωμένα στις 1200 RPM για 10 λεπτά για να ληφθεί ένα σφαιρίδιο κυττάρων να παράγουν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα. FBS αφαιρέθηκε κατά τη διάρκεια της φιναστερίδης έκθεσης, διότι είναι γνωστό ότι περιέχουν υψηλά επίπεδα των MMPs, η οποία θα παρεμβαίνει με τις επακόλουθες ζελατινολυτικής δοκιμασίες.

προσαρμοσμένο μέσο και τηλέφωνα Απόσπασμα Επεξεργασία

Το CM συμπυκνώθηκε 10Χ χρησιμοποιώντας Centriprep® 10.000 MWCO (Millipore ™) σωλήνες με φυγοκέντρηση σε 4900 RPM για 30 λεπτά. Τα αντίστοιχα κυτταρικά σφαιρίδια υποβλήθηκαν σε εκχύλιση πρωτεϊνών με τη χρήση in-house παραχθέντων 50 mM Tris-HCl, 0.2 Μ NaCl, 10 mM ΟαΟ

2, 0,1% Triton Χ-100 ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης συμπληρωμένο με 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich ™) για να ληφθούν τα εκχυλίσματα κυττάρου. Το ρυθμιστικό εκχύλισης πρωτεΐνη επελέγη μετά από σύγκριση με ένα εμπορικά διαθέσιμο ρυθμιστικό διάλυμα (ρυθμιστικό RIPA, Thermo Scientific ™), η οποία αποκάλυψε καλύτερα διατηρημένο ζελατινολυτική δραστικότητα ΜΜΡ με ζυμογραφία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). εκχύλιση πρωτεΐνης διεξήχθη από επαναλαμβανόμενη χρήση πιπέτας και στροβιλισμό, ακολουθούμενο από 1 ώρα ηρεμίας σε πάγο και μία τελική φυγοκέντρηση στις 5000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C. Τέλος, οι CM και εκχυλίσματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™) φασματοφωτόμετρο και η πρωτεΐνη Α280 /260 πρωτόκολλο. Είναι σημαντικό να τονίσουμε ότι η CM ήταν FBS δωρεάν? Ως εκ τούτου, όλες οι πρωτεΐνες στο CM παρήχθησαν από τα κύτταρα.

ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 Δοκιμασίες Δραστηριότητας

Η συνολική (προ-μορφή + δραστική μορφή) ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητες στο CM και κυτταρικά εκχυλίσματα μετρήθηκαν με τη χρήση του Biotrak® Δραστηριότητα Αναλύσεις (GE Healthcare LifeSciences ™) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ίσες ποσότητες (100 μg) ομαδοποιημένων CM ή εκχύλισμα κυττάρου (ανά θεραπεία τριπλούν) μεταφέρθηκαν με πιπέττα σε μικροπλάκα 96-φρεατίων επικαλυμμένες με αντι-ανθρώπινο-ΜΜΡ2 ή αντι-ανθρώπου-ΜΜΡ9 αντισώματα. Πρότυπα ανθρώπινης ανασυνδυασμένης προ-mm2 ή προ-ΜΜΡ9 μεταφέρθηκαν με πιπέτα στα αντίστοιχα φρεάτια, με τιμές κυμαινόμενες μεταξύ 0,19 και 3 ng /ml (για ΜΜΡ2) και 0,125 έως 4 ng ισοδύναμης /ml (για ΜΜΡ9) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C και πλύση, 50 μι ενός 0.5 mM ρ-αμινοφαινυλυδραργύρου οξικό διάλυμα (ΑΡΜΑ) προστέθηκε με πιπέτα σε όλα τα φρεάτια για την ενεργοποίηση των προ-μορφών ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Ακολούθως, 50 μι αντιδραστηρίου ανίχνευσης (τροποποιημένη ουροκινάση + S-2444 ™ υπόστρωμα πεπτιδίου) προστέθηκε σε όλα τα φρεάτια. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 6 (για ΜΜΡ2) ή 2 ώρες (για ΜΜΡ9), και η ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD) μετρήθηκε στα 405 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη φασματοφωτομετρικής πλάκας. Τέλος, ένα γραφικό φορές αλλαγή έγινε με τη διαίρεση των λαμβανόμενων IODS από τα επεξεργασμένα CM /αποσπάσματα από τις αντίστοιχες τιμές ελέγχου τους. Εναλλακτικά, οι δραστηριότητες ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες ζυμογραφία ζελατίνης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 Protein Ποσοτικοποίηση

Η ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 τα επίπεδα πρωτεΐνης στο CM μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας στερεάς φάσης ELISA Biotrak® Ανθρώπινα δοκιμασίες (GE Healthcare LifeSciences ™) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ίσες ποσότητες (100 μg) ομαδοποιημένων CM (ανά θεραπεία τριπλούν) μεταφέρθηκαν με πιπέττα σε μικροπλάκα 96-φρεατίων επικαλυμμένες με αντι-ανθρώπινο-ΤΙΜΡ-1 ή αντι-ανθρώπου-ΤΙΜΡ-2 αντισώματα. Πρότυπα της ανθρώπινης ανασυνδυαστικής ΤΙΜΡ-1 ή ΤΙΜΡ-2 μεταφέρθηκαν με πιπέτα στα αντίστοιχα φρεάτια της πλάκας, με τιμές που κυμαίνονται από 3,13 μεγαλύτερη των 50 ng /ml (για ΤΙΜΡ-1) και 8 έως 128 ng /ml (για ΤΙΜΡ-2). Μετά από επώαση 2 ωρών στους 25 ° C και πλύση, 100 μι ενός συζυγούς υπεροξειδάσης διάλυμα με πιπέτα σε όλα τα φρεάτια και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω επί 2 ώρες στους 25 ° C. Στη συνέχεια, 100 μι ενός τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ) /υπεροξείδιο του υδρογόνου διάλυμα προστέθηκε σε όλα τα φρεάτια. Τα τρυβλία επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, και το IOD μετρήθηκε σε 630 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη φασματοφωτομετρικής πλάκας. Τέλος, ένα γραφικό φορές αλλαγή έγινε με τη διαίρεση των λαμβανόμενων IODS από τα επεξεργασμένα θεραπείες από τις αντίστοιχες τιμές ελέγχου τους.

Μετανάστευση Δοκιμασία

Το δυναμικό μετανάστευση όλες τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας το BD BIOCOAT ™ μετανάστευση Εισαγωγή (BD Biosciences ™). Η πορώδης μεμβράνη (μέγεθος πόρων 8 μm) ενυδατώθηκε με 500 μΙ μέσου διττανθρακικού που βασίζονται χωρίς ορό για 2 ώρες. Μετά την ενυδάτωση, 500 μΙ RPMI 1640 με 5% FBS (για LNCaP, PC3 και DU145 κύτταρα) ή 500 μΙ μέσου κερατινοκυττάρων με 5% FBS (για RWPE-1 κύτταρα) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο του 24 φρεατίων πλάκα. Αυτές οι κυτταρικές προστάτη σειρές είχαν προηγουμένως καλλιεργηθεί σε 50 μΜ μέσο ή ελέγχου μέσον finasteride για 72 ώρες, συλλέχθηκαν και ατομικά καλλιεργήθηκαν σε 200 μΙ μέσου χωρίς ορό (με ή χωρίς 50 μΜ finasteride) στο ένθετο σε πυκνότητα 1 × 10

5 συνολικά κύτταρα. Οι πλάκες επωάστηκαν με 5% CO

2 στους 37 ° C για 22 ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα που δεν μεταναστεύουν, τα οποία βρίσκονται στην κορυφή του ενθέτου μεμβράνης, αποξέονται με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν μέσω των πόρων της μεμβράνης, οι οποίες προσελκύονται από το FBS, μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με διάλυμα κυανού τολουϊδίνης 0,1% επί 2 λεπτά. Τα μεταναστεύσει κύτταρα ψηφιακά φωτογραφήθηκαν υπό μεγέθυνση 200Χ χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο (Nikon ™). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και 5 τυχαία πεδία φωτογραφήθηκαν και υποβλήθηκαν σε μέτρηση κυττάρων χρησιμοποιώντας το ελεύθερο λογισμικό ImageJ®. Ο δείκτης μετανάστευσης υπολογίστηκε ως η μέση τιμή ± SD των κυττάρων μετρήθηκαν ανά πεδίο, και κύτταρα ελέγχου συγκρίθηκαν με κύτταρα φιναστερίδη φάρμακο. Το ανθρώπινο δέρμα ινοβλάστες (WS1- ATCC) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι και εκτέθηκαν στις ίδιες συνθήκες δοκιμασίας όπως τα κύτταρα του προστάτη.

Επούλωση Δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων ερευνήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας μια διαφορετική μετανάστευση δοκιμασίας για την PC3 και κυτταρικές γραμμές DU145, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 4 χ 10

4 κύτταρα /cm

2 έως ότου επετεύχθη 100% συρροή. Οι μονοστιβάδες πληγώθηκαν (γδαρμένο) σε μια ευθεία γραμμή κατά μήκος του καλά με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο, καπάκι πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων ως ένα χάρακα, για να ληφθεί ένα κανονικό μηδέν. Οι τραυματίες μονοστιβάδες στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με D-PBS (GIBCO /Invitrogen ™) για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Το μέσο καλλιέργειας με ή χωρίς 50 μΜ της φιναστερίδης προστέθηκε στα φρεάτια ελέγχου και επεξεργασίας. Η περιοχή του τραύματος στη συνέχεια επιθεωρήθηκαν μετά από 24, 48, 72 και 96 ώρες χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Η ταχύτητα επούλωσης του τραύματος υπολογίστηκε ως το ποσοστό του αρχικού τραύματος μέχρι ολικό κλείσιμο του τραύματος σε διαφορετικά χρονικά σημεία, χρησιμοποιώντας το δωρεάν λογισμικό ImageJ®.

Δοκιμασία εισβολή Matrigel

Οι επεμβατικές δυνατότητες όλων τέσσερις κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας BD BIOCOAT ™ Matrigel ™ εισβολή Ενθέματα (BD Biosciences ™). Το Matrigel επικαλυμμένα πορώδη μεμβράνη (μέγεθος πόρων 8 μm) ενυδατώθηκε με 500 μΙ μέσου διττανθρακικού που βασίζονται χωρίς ορό για 2 ώρες. Μετά την ενυδάτωση, 500 μΙ RPMI 1640 με 5% FBS (για LNCaP, PC3 και DU145 κύτταρα) ή 500 μΙ μέσου κερατινοκυττάρων με 5% FBS (για RWPE-1 κύτταρα) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο του 24 φρεατίων πλάκα. Αυτές οι κυτταρικές προστάτη σειρές είχαν προηγουμένως καλλιεργηθεί σε 50 μΜ μέσο ή ελέγχου μέσον finasteride για 72 ώρες, συλλέχθηκαν και ατομικά καλλιεργείται σε 200 μΙ μέσου χωρίς ορό (με ή χωρίς 50 μΜ finasteride) στο ένθετο σε πυκνότητα 1 × 10

5 συνολικά κύτταρα. Τα τρυβλία επωάστηκαν σε επωαστήρα με 5% CO

2 στους 37 ° C για 22 ώρες, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα uninvaded στην κορυφή του ενθέτου μεμβράνης ξύνεται με μια μπατονέτα. Τα κύτταρα τα οποία εισέβαλαν στην μήτρα Matrigel και μετανάστευσαν προς την αντίθετη πλευρά της μεμβράνης, οι οποίες προσελκύονται από τις FBS, μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με διάλυμα κυανού τολουϊδίνης 0,1% επί 2 λεπτά. Τα εισέβαλε κύτταρα ψηφιακά φωτογραφήθηκαν υπό μεγέθυνση 200Χ χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο (Nikon ™). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και 5 τυχαία πεδία φωτογραφήθηκαν και υποβλήθηκαν σε μέτρηση κυττάρων χρησιμοποιώντας το ελεύθερο λογισμικό ImageJ®. Ο δείκτης εισβολή υπολογίστηκε ως η μέση τιμή ± SD των κυττάρων μετρήθηκαν ανά πεδίο, και κύτταρα ελέγχου συγκρίθηκαν με κύτταρα φιναστερίδη φάρμακο.

Western Blotting

Χρησιμοποιήθηκαν οι υπόλοιπες εκχυλίσματα κυττάρων για να προσδιοριστεί επίπεδα έκφρασης AR. Αυτός ο προσδιορισμός εκτελέστηκε λόγω αποκλίνοντος βιβλιογραφία σχετικά με την έκφραση αυτών των υποδοχέων με αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Εν συντομία, ένα δείγμα πρωτεΐνη (70 μg) που είχε προηγουμένως προσδιοριστεί ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™) φασματοφωτόμετρο φορτώθηκε σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Sigma Οο ™), η οποία στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε 10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl και 0.1% Tween-20 (TBS- Μ) για 1 ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με το αντίσωμα AR (Genetex ™). Οι μεμβράνες πλύθηκαν 5 φορές για 5 λεπτά σε TBS-T και επωάσθηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με τις κατάλληλες, συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα (Abcam ™). Μετά από έκπλυση σε TBS-Τ, οι μεμβράνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη και φωτογραφήθηκαν.

Στατιστική Ανάλυση

Τα ληφθέντα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό INSTAT ™ χρησιμοποιώντας το δύο-ουρά Τ test του Student (P & lt? 0,05) να συγκρίνουν τις διάφορες θεραπείες και τους αντίστοιχους ελέγχους τους (βιωσιμότητα, τη μετανάστευση, την εισβολή), ή με τη χρήση ANOVA και Dunnet του τεστ post hoc (MMPs και TIMPs προσδιορισμούς)

Αποτελέσματα

.

Finasteride έκθεσης και κυττάρων βιωσιμότητας

η βιωσιμότητα των κυττάρων δεν επηρεάστηκε σημαντικά από οποιαδήποτε από τις finasteride δόσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα. Κύτταρα δεν παρουσίασε πτυχές του κυτταρικού θανάτου ή απώλειας της βιωσιμότητας, ακόμα και μετά από 72 ώρες από 50 μΜ finasteride έκθεσης (Σχήμα S1).

ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 Αναλύσεις Δραστηριότητα

Σε συνθήκες ελέγχου, ήταν παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα PC3 εκκρίνεται διπλάσια ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε CM τους ως RWPE-1 κύτταρα (τιμές IOD – τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). LNCaP κύτταρα δεν εκκρίνουν ανιχνεύσιμα επίπεδα ΜΜΡ2 ή ΜΜΡ9 σε CM τους (IOD τιμές δεδομένων – δεν φαίνονται). Ωστόσο, τα κύτταρα DU145 εκκρίνονται υψηλές ποσότητες ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 (Σχήμα 1α). Για τους κυτταρικά εκχυλίσματα, καμία κυτταρική γραμμή παρουσίασε ανιχνεύσιμη ΜΜΡ2 ή ΜΜΡ9 δραστηριότητες, αποδεικνύοντας ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές δεν κατέχουν MMPs σε μεμβράνη τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

α) Ρυθμισμένο μέσο (CM) των μη επεξεργασμένων (Έλεγχος ) και φιναστερίδη-επεξεργασμένα κύτταρα DU145 συλλέχθηκε, συμπυκνώθηκε και αναλύθηκε για ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητες χρησιμοποιώντας δοκιμασία ζελατίνης ζυμογραφία. (S) Πρότυπα, (Ρ) εκχύλισμα ιστού ενός γαστρικού έλκους που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Αυτά τα κύτταρα που εκκρίνονται υψηλές ποσότητες ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε CM τους, όπως φαίνεται από τις φωτεινές ζώνες στο σκούρο φόντο. β) φιναστερίδη υψηλής δόσης (50 μΜ) μειωτικά δραστηριότητα ΜΜΡ2 έως και 43% μετά από 72 ώρες από την έκθεση, όπως αυτή ορίζεται ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ ™. Τα δεδομένα εκφράζονται ως πολλαπλή μεταβολή γραφικών των αξιών IOD που ελήφθησαν από τις ζώνες του (α) σχήμα για φιναστερίδη-επεξεργασμένα κύτταρα πάνω κύτταρα ελέγχου. (**) Στατιστικά σημαντική αξίες με p & lt? 0,01. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η

Κατά την φιναστερίδη έκθεση, παρατηρήθηκε ότι, για RWPE-1 κυττάρων στο απασχολούνται χαμηλή δόση (10 μΜ), 72 ώρες έκθεσης ήταν αρκετή για να προκαλέσει σημαντική αρνητική ρύθμιση τόσο της δραστηριότητας των δύο MMPs στην CM (Σχήμα 2α)? οι τιμές αυτές μειώθηκαν κατά 25% και 30% για ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9, αντίστοιχα, σε σχέση με τις τιμές ελέγχου. Από την άλλη πλευρά, για την απασχολούνται finasteride υψηλή δόση (50 μΜ), οι δραστηριότητες ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 είχαν σημαντικά μειωτικά σε όλα τα χρονικά σημεία που ελέγχθηκαν, μέχρι και 90% και 55% μετά από 72 ώρες έκθεσης, αντίστοιχα (Σχήμα 2α) .

α) Ρυθμισμένο μέσο των μη επεξεργασμένων (Control) και φιναστερίδη-επεξεργασμένα κύτταρα RWPE-1 συλλέχθηκαν, συμπυκνώθηκαν και αναλύθηκαν για ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητες με χρήση του αντίστοιχου Biotrak® δραστηριότητα Δοκιμασίες τους. φιναστερίδη χαμηλής δόσης (10 μΜ) για 72 ώρες από την έκθεση μειωτικά ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητα κατά 25% και 30%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τις τιμές ελέγχου. φιναστερίδη υψηλής δόσης (50 μΜ) μειωτικά ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητες σε όλα τα χρονικά σημεία δοκιμάστηκαν, έως και 90% και 55% μετά από 72 ώρες έκθεσης, αντίστοιχα. β) Ρυθμισμένο μέσο των μη επεξεργασμένων (Control) και φιναστερίδη-επεξεργασμένα κύτταρα RWPE-1 συλλέχθηκαν, συμπυκνώθηκαν και αναλύθηκαν για ΤΙΜΡ-1 και την έκφραση της πρωτεΐνης ΤΙΜΡ-2 με τη χρήση των αντίστοιχων Biotrak® τους προσδιορισμούς. Finasteride έκθεση, σε αμφότερες τις δόσεις, που προκαλείται από την προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης ΤΙΜΡ-2 στο χρονικό σημείο 72 ωρών, έως και 150% περισσότερο από ό, τι η έκφραση των επιπέδων ελέγχου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως πολλαπλή μεταβολή γραφικών των αξιών IOD που ελήφθησαν για φιναστερίδη-κατεργασμένων κυττάρων έναντι αυτών των κυττάρων ελέγχου. (*) Στατιστικά σημαντική αξίες με p & lt?. 0.05

Η

Στη γραμμή κυττάρων PC3, η έκθεση φιναστερίδη χαμηλή δόση που προκαλείται από τη σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητες μόνο στο χρονικό σημείο 24 ωρών (Σχήμα 3α ). Από την άλλη πλευρά, η φιναστερίδη υψηλής δόσης που επάγεται σημαντικά την προς τα κάτω ρύθμιση των ΜΜΡ2 στις 48 ώρα και 72 ώρες χρόνο σημεία και των ΜΜΡ9 σε όλα τα χρονικά σημεία που αξιολογήθηκαν, με έως και 70% μείωση (Σχήμα 3α).

α) Ρυθμισμένο μέσο των μη επεξεργασμένων και φιναστερίδη-επεξεργασμένα κύτταρα PC3 συλλέχθηκε, συμπυκνώθηκε και αναλύθηκε για ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστηριότητες με χρήση του αντίστοιχου Biotrak® δραστηριότητα Δοκιμασίες τους. Χαμηλή δόση finasteride έκθεσης (10 μΜ) δεν επάγει την καθοδική ρύθμιση του ΜΜΡ2 ή ΜΜΡ9 δραστηριότητες, εκτός στο χρονικό σημείο 24 ωρών. φιναστερίδη υψηλής δόσης προκάλεσε την προς τα κάτω ρύθμιση των ΜΜΡ2 στις 48 ώρα και 72 ώρες χρόνο σημεία και ΜΜΡ9 σε όλα τα εξετασθέντα χρονικά σημεία, μέχρι 70% μείωση. β) Ρυθμισμένο μέσο των μη επεξεργασμένων (Control) και φιναστερίδη-επεξεργασμένα κύτταρα PC3 συλλέχθηκε, συμπυκνώθηκε και αναλύθηκε για ΤΙΜΡ-1 και την έκφραση της πρωτεΐνης ΤΙΜΡ-2 με τη χρήση των αντίστοιχων Biotrak® τους προσδιορισμούς. Finasteride έκθεση δεν προκάλεσε οποιαδήποτε σημαντική τροποποίηση της έκφρασης ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2, εκτός από τη δόση των 10 μΜ finasteride σε 24 ώρες έκθεσης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως πολλαπλή μεταβολή των τιμών IOD ελήφθησαν για κύτταρα κατεργασμένα φιναστερίδη πάνω κύτταρα ελέγχου. (*) Στατιστικά σημαντικές τιμές με ρ & lt?. 0.05

Η

Δεδομένου ότι τα αποτελέσματα από τις άλλες κυτταρικές γραμμές έδειξαν ότι μόνο η φιναστερίδη υψηλής δόσης που ασκείται επιδράσεις στην ΜΜΡ δραστικότητα, μόνο στην υψηλή δόση σε 72 ώρα διερευνήθηκε για την κυτταρική γραμμή DU145. Για την κυτταρική σειρά DU145, φιναστερίδη υψηλή δόση προκάλεσε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των δραστηριοτήτων ΜΜΡ2 από περίπου 43% (Σχήμα 1β) (ρ & lt? 0,01). Ωστόσο, οι δραστηριότητες ΜΜΡ9 δεν διαμορφώνεται σημαντικά από finasteride έκθεση (Σχήμα 1β).

ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 Protein Ποσοτικοποίηση

Όταν οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν χωρίς finasteride, κύτταρα PC3 παράγονται δύο φορές πιο ΤΙΜΡ-1 από τα RWPE-1 κύτταρα? Ωστόσο, η ποσότητα του ΤΙΜΡ-2 ήταν η ίδια (τιμές IOD). LNCaP κύτταρα που παράγονται χαμηλά επίπεδα του ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 που πλησίασε το κατώτερο όριο ανίχνευσης της ανάλυσης (τιμές IOD). κύτταρα DU145 παράγονται υψηλές ποσότητες ΤΙΜΡ-1 (τιμές IOD – τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

Κατά finasteride έκθεση του υπό δοκιμή κυτταρικής γραμμής RWPE-1, και οι δύο δόσεις προκάλεσαν σημαντικά προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης ΤΙΜΡ-2 στο 72 ώρας. χρονικό σημείο, που ήταν μέχρι και 150% περισσότερο από ό, τι η έκφραση τη θεραπεία ελέγχου (Σχήμα 2β). Όσο για τα κύτταρα PC3, ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 έκφραση δεν έδειξε σημαντική διαφοροποίηση, εκτός από τη δόση finasteride 10 μΜ σε 24 ώρες έκθεσης (Σχήμα 3b). Finasteride δεν προκάλεσε οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση του ΤΙΜΡ-1 ή ΤΙΜΡ-2 σε κυτταρικές γραμμές LNCaP ή DU145 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Μετανάστευση Δοκιμασία

Στο κανονικό μέσο καλλιέργειας, το δοκιμαστεί κυτταρικές σειρές παρουσίασαν διαφορετικές δυνατότητες της μετανάστευσης. κύτταρα RWPE-1 μετανάστευσε περισσότερο (μέση τιμή 32 κύτταρα /πεδίο) από τα κύτταρα PC3 (μέση τιμή 24 κύτταρα /πεδίο), η οποία, με τη σειρά του, μετανάστευσαν πάνω από τα κύτταρα LNCaP (μέση τιμή 8 κύτταρα /πεδίο). DU145 ήταν η πιο μεταναστεύουσα κυτταρική γραμμή διερευνήθηκε (μέση τιμή 85 κύτταρα /πεδίο) (Σχήμα 4). Μετά από 72 ώρες έκθεσης finasteride (50 μΜ), μετανάστευση αναστάλθηκε σημαντικά σε κύτταρα RWPE-1 (ρ & lt? 0,01) και κύτταρα LNCaP (ρ & lt? 0,05). PC3 και τη μετανάστευση των κυττάρων DU145 ήταν ελαφρώς αναστέλλεται? Ωστόσο, η αναστολή δεν ήταν σημαντική (ρ & gt? 0,05) (Σχήμα 4). ινοβλάστες Ανθρώπινα WS1 (θετικός έλεγχος) μετανάστευσαν αμέσως μέσω των μεμβρανών (Σχήμα 4).

Οι κυτταρικές γραμμές του προστάτη είχαν προηγουμένως καλλιεργηθεί σε 50 μΜ finasteride ή τον έλεγχο μέσο για 72 ώρες και ατομικά καλλιεργείται σε 200 μΙ ελεύθερο ορού μέσο (με ή χωρίς 50 μΜ finasteride) στο ένθετο μετανάστευση σε πυκνότητα 1 × 10

5 συνολικά κύτταρα. Μετά από 22 ώρες, τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν μέσα από το 8 μm πορώδους μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν εντός πέντε τυχαία πεδία χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Αντιπροσωπευτικά φωτομικρογραφίες των μη επεξεργασμένων και φιναστερίδη-κατεργασμένων κυττάρων φαίνεται από την αριστερή πλευρά. Ανθρώπινα ινοβλάστες (κυτταρική σειρά WS1) χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα ελέγχου της μετανάστευσης-θετικά, και μία αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται στην πλευρά κάτω αριστερή. μπαρ κλίμακας = 40 μm. Finasteride ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση των κυτταρικών γραμμών RWPE-1 και LNCaP, αλλά όχι της PC3 και κυτταρικές γραμμές DU145. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD των μεταναστευόντων κυττάρων. (*) Στατιστικά σημαντική αξίες με p & lt? 0,05. (**) Στατιστικά σημαντική αξίες με p & lt?. 0.01

Η

Επούλωση Δοκιμασία

Για να επιβεβαιώσετε ότι τα PC3 και DU145 κυτταρική σειρά δυναμικών μετανάστευση δεν επηρεάστηκαν από το finasteride έκθεσης, ένα διαφορετικό δοκιμασία μετανάστευσης εκτελέστηκε για αυτές τις κυτταρικές σειρές. Αφού η περιοχή του τραύματος επιβλήθηκε από τις μονοστιβάδες, ήταν δυνατό να παρατηρηθεί ότι, και για τις δύο κυτταρικές σειρές, η φιναστερίδη ελαφρώς ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου (Σχήμα 5α και 5γ)? Ωστόσο, αυτή η διαφορά δεν ήταν σημαντική (Σχήμα 5β και 5δ), η οποία επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την προηγούμενη δοκιμασία ένθετο μετανάστευση (Σχήμα 4).

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε 4 × 10

4 κύτταρα /cm

2 έως ότου επιτεύχθηκε 100% συρροή. Οι μονοστιβάδες γδαρμένο σε μια ευθεία γραμμή, και οι τραυματίες μονοστιβάδες στη συνέχεια δεδομένο μέσο καλλιέργειας με ή χωρίς 50 μΜ finasteride. Η περιοχή του τραύματος επιθεωρήθηκε μετά από 24, 48, 72 και 96 ώρες χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες που δείχνει το κλείσιμο του τραύματος φιναστερίδης επεξεργασμένου και ελέγχου PC3 κύτταρα στους 0 έως 72 ώρες. Κόκκινο υπογράμμισε περιοχές αντιπροσωπεύουν την περιοχή ανοικτής πληγής. μπαρ κλίμακας = 50 μm. β) Το αρχικό ερυθρό επισημασμένες περιοχές μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ ™, και οι υπόλοιπες περιοχές υπολογίστηκαν ως ένα ποσοστό της αρχικής περιοχής του τραύματος. Μια γραφική πληγή-κλείσιμο έγινε διαιρώντας τις τιμές στην περιοχή τα οποία ελήφθησαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία για τον έλεγχο και τα κύτταρα φιναστερίδη-θεραπεία. Finasteride ελαφρώς ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων? Ωστόσο, η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (ρ & gt? 0,05). γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες που δείχνει το κλείσιμο του τραύματος φιναστερίδης επεξεργασμένου και ελέγχου κύτταρα DU145 στους 0 έως 72 ώρες. Κόκκινο υπογράμμισε περιοχές αντιπροσωπεύουν την περιοχή ανοιχτή πληγή. μπαρ κλίμακας = 50 μm. δ) Όπως παρατηρήθηκε για τα PC3 κύτταρα, η φιναστερίδη ελαφρώς ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων (p & gt?. 0.05)

Η

Matrigel Δοκιμασία εισβολή

Στο κανονικό μέσο καλλιέργειας, οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν διαφορετικές δυνατότητες εισβολής . DU145 και τα κύτταρα PC3 ήταν οι πιο επεμβατική κυτταρικές σειρές, με ένα μέσο 97 κύτταρα /πεδίο και 75 κύτταρα /πεδίο, αντίστοιχα (Σχήμα 6). Η κυτταρική γραμμή LNCaP, η οποία ήταν επίσης όγκων, περιέργως επέδειξε μία χαμηλή επεμβατική δυναμικό, με μέση τιμή 5 κύτταρα /πεδίο (Σχήμα 6). Το μη-ογκική κυτταρική γραμμή RWPE-1 έδειξαν επίσης χαμηλά επεμβατικές δυνατότητες, όπως αναμενόταν, με μέσο όρο 9 κύτταρα /πεδίο (Σχήμα 6).

Οι κυτταρικές γραμμές του προστάτη είχαν προηγουμένως καλλιεργηθεί σε 50 μΜ finasteride ή τον έλεγχο μέσο για 72 ώρες και ατομικά καλλιεργείται σε 200 μΙ μέσου χωρίς ορό (με ή χωρίς 50 μΜ finasteride) στο ένθετο εισβολή Matrigel® σε πυκνότητα 1 × 10

5 συνολικά κύτταρα. Μετά από 22 ώρες, τα κύτταρα που εισέβαλαν μέσα από τη μήτρα matrigel και πορώδους μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν μέσα σε πέντε τυχαία πεδία χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των μη επεξεργασμένων και φιναστερίδη-κατεργασμένων κυττάρων φαίνεται από την αριστερή πλευρά. μπαρ κλίμακας = 40 μm. Finasteride ανέστειλε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων όλων των ελεγχθέντων κυτταρικών γραμμών. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD των εισβάλλοντα κύτταρα. (*) Στατιστικά σημαντική αξίες, με p & lt? 0,05. (**) Στατιστικά σημαντική αξίες, με p & lt? 0,01. (***) Στατιστικά σημαντικές τιμές, με ρ & lt?. 0.001

Η

Finasteride ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. DU145 και PC3 κυττάρων εισβολής ήταν σημαντικά μειωμένη (ρ & lt? 0.001) ακολουθούμενη από RWPE-1 (ρ & lt? 0,01) και LNCaP (ρ & lt? 0,05). (Σχήμα 6)

Western Blotting

AR Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.