Αφηρημένο

Παρά τις πρόσφατες βελτιώσεις στα αποτελέσματα των ασθενών που χρησιμοποιούν νεότερες υποδοχέα ανδρογόνων (AR) αναστολείς της οδού, αντίσταση θεραπεία σε ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) εξακολουθεί να παραμένει ένα κλινικό πρόβλημα. εναλλακτικών οδών αντίστασης συν-στόχευσης είναι σημαντικό ενδιαφέρον για τη θεραπεία CRPC και να καθυστερήσει την έναρξη της αντίστασης. Τόσο η ΑΚΤ και ΜΕΚ μονοπάτια σηματοδότησης ενεργοποιούνται ο καρκίνος του προστάτη αναπτύσσεται αντοχής σε θεραπείες AR-στόχο. Αυτή η προ-κλινική μελέτη διερευνά συνεργασίας που στοχεύουν αυτές τις οδούς σε μοντέλα καρκίνου του προστάτη AR-θετική. Χρησιμοποιώντας διάφορα

in vitro

μοντέλα νοσηρών καταστάσεων καρκίνου του προστάτη συμπεριλαμβανομένων των εξαρτώμενων (LNCaP), CRPC (V16D και 22RV1) και ENZ ανθεκτικά ανδρογόνων καρκίνο του προστάτη (MR49C και MR49F), θα αξιολογεί την καταλληλότητα των στόχευση τόσο ΑΚΤ και ΜΕΚ μονοπάτια. Τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι η αναστολή ΑΚΤ προκαλεί απόπτωση και αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές null ΡΤΕΝ ανεξάρτητα από την ευαισθησία τους σε ορμονοθεραπεία? Ωστόσο, η αναστολή της ΑΚΤ δεν είχε καμία επίδραση στην θετική 22RV1 κυτταρική γραμμή ΡΤΕΝ. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η αναστολή της ΜΕΚ είχε μεγαλύτερη επίδραση στην 22RV1 κυττάρων σε σύγκριση με LNCaP, V16D ή ENZ ανθεκτικά κύτταρα και τα κύτταρα MR49C MR49F.

In vitro

, συνδυασμός ΑΚΤ και αποκλεισμό ΜΕΚ είχε αποδείξεις για συνέργεια παρατηρείται σε ορισμένες κυτταρικές σειρές και αναλύσεις, αλλά αυτό δεν ήταν συνεπείς σε όλες αποτελεσμάτων.

In vivo

, ο συνδυασμός της ΑΚΤ και ΜΕΚ αναστολή οδήγησε σε πιο συνεπή αναστολή της ανάπτυξης του όγκου ξενομοσχευμάτων MR49F και πλέον συγκεκριμένες νόσους επιβίωση σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία αναστολέα ΑΚΤ. Όπως και στην μας

in vitro

μελέτη, 22RV1 ξενομοσχεύματα ήταν πιο ανθεκτικά στην αναστολή ΑΚΤ ενώ ήταν πιο ευαίσθητοι σε αναστολή ΜΕΚ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η στόχευση ΑΚΤ και ΜΕΚ σε συνδυασμό μπορεί να είναι μια πολύτιμη στρατηγική για τον καρκίνο του προστάτη, όταν και οι δύο οδοί ενεργοποιούνται και να υποστηρίξει περαιτέρω τη σημασία της χαρακτηρίζουν την κυρίαρχη ογκογόνο οδό στον όγκο κάθε ασθενή, προκειμένου να επιλέξετε τη βέλτιστη θεραπεία.

Παράθεση: Toren P, Kim S, Johnson F, Zoubeidi Α (2016) συνδυασμένη ΑΚΤ και ΜΕΚ Pathway αποκλεισμός σε προ-κλινικά μοντέλα της Enzalutamide-ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 11 (4): e0152861. doi: 10.1371 /journal.pone.0152861

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 7, Οκτωβρίου, 2015? Αποδεκτές: 20 Μαρ 2016? Δημοσιεύθηκε: 5η Απριλίου του 2016

Copyright: © 2016 Toren et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η χρηματοδότηση παρέχεται από το Discovery Grant, τον καρκίνο του προστάτη Καναδά και της AstraZeneca στο Α Zoubeidi. PT υποστηρίχθηκε από την καναδική Ίδρυμα Υποτροφιών Ουρολογικής Εταιρείας. AstraZeneca είχε εμπλακεί σε συζητήσεις σχετικά με το σχεδιασμό της μελέτης και την αναθεώρηση του χειρογράφου, αλλά η συλλογή και ανάλυση δεδομένων και την απόφαση να δημοσιεύσει έγινε από τους συγγραφείς. Οι άλλοι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. AZ περιγράφει τη λήψη χρηματοδότησης της έρευνας από την AstraZeneca και Gilead Sciences. PT αποκαλύπτει λαμβάνουν χρηματοδότηση της έρευνας από Innocrin Pharma. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ιατρική ή χειρουργικό ευνουχισμό παραμένει στην πρώτη γραμμή της συστημικής θεραπείας του μεταστατικού καρκίνου του προστάτη (PCA), δεδομένου ανακάλυψή του πάνω από 70 χρόνια [1]. Δυστυχώς, θεραπεία παραμένει άπιαστο επόμενη ευνουχισμό και οι ασθενείς αναπόφευκτα πρόοδο στην ανάπτυξη ανθεκτικών ευνουχισμού του καρκίνου του προστάτη (CRPC). Ισχυροί υποδοχέα ανδρογόνου (AR) αναστολείς οδού όπως enzalutamide (ENZ) και αμπιρατερόνη χρησιμοποιούνται τώρα ευρέως για τη θεραπεία των ασθενών με CRPC. Ενώ η επιβίωση βελτιώνεται, αντοχή αναπτύσσεται ωστόσο αναπόφευκτα σε αυτούς τους παράγοντες [2]. Αναμένεται ότι με την αυξημένη κλινική χρήση αυτών των πιο ισχυρών οδού AR αναστολείς ότι στόχευσης κατά των οδών αντίσταση μη-AR γνώμονα θα αποκτήσει όλο και μεγαλύτερη σημασία [3]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση και μονοπάτια που στοχεύουν εμπλέκονται στην αντίσταση έχει σημαντική κλινική σημασία.

Η PI3K /AKT /mTOR και RAF /MEK /ERK μονοπάτια σηματοδότησης διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική επιβίωση, αντίσταση θεραπεία, και συνεργάζονται για να διευκολύνουν προστάτη εξέλιξη σε CRPC [4-8]. Τόσο ΑΚΤ [9, 10] και ERK [11, 12] οδών σηματοδότησης είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα με CRPC και σχετίζονται με την κακή έκβαση [13, 14]. Υπάρχει εκτεταμένη cross-talk μεταξύ των δύο αυτών οδών, καθώς και με άλλες οδούς ογκογόνο [15, 16]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι τόσο η ΑΚΤ και ERK ενεργοποιούνται μετά από θεραπεία με ENZ σε κύτταρα προστάτη [17]. Στόχευση AKT από μόνη της δεν είναι αρκετή για να προκαλέσει θνησιμότητα υπό όρους, λόγω της ανάδρασης σηματοδότησης ΑΚΤ οδηγεί στην ενεργοποίηση των AR και ως εκ τούτου, με στόχο από μόνη της δεν είναι μια καλή στρατηγική για την καταπολέμηση της αντοχής ENZ [18]. Είναι ενδιαφέρον, διπλή αναστολή των ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και μονοπάτια MEK /ERK έχει δείξει υπόσχεση σε προ-κλινικά μοντέλα άλλων καρκίνων [19-22]. Αποτελέσματα του συνδυασμού ενός αναστολέα mTOR με έναν αναστολέα ΜΕΚ στο διαγονιδιακό

NKx3

.

1-ΡΤΕΝ

μοντέλο καρκίνου του προστάτη ποντικού υποστηρίζει περαιτέρω το σκεπτικό για μια συνδυασμένη προσέγγιση στον καρκίνο του προστάτη [14] θεραπεία.

Ως εκ τούτου, έχουμε δημιουργήσει τη διερεύνηση συνδυασμού ΑΚΤ συν θεραπεία με αναστολέα ΜΕΚ σε ανθρώπινο μοντέλα καρκίνου του προστάτη, ιδιαίτερα ENZ ανθεκτικά μοντέλα καρκίνου του προστάτη. Επιλέξαμε ένα πάνελ των κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων ENZ ανθεκτικών LNCaP που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές, καθώς και η κυτταρική γραμμή 22RV1. Η κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη 22RV1 κατέχει ενεργοποίηση του μονοπατιού MEK /ERK [23], ενώ το ENZ ανθεκτικά MR49C και MR49F αναγνωρίζονται ως περισσότερο εξαρτάται από την οδό ΑΚΤ [24]. Έχουμε αποδείξει ότι ο συνδυασμός αποκλεισμό της ΑΚΤ και ΜΕΚ δεν βελτιωθεί απαντήσεις σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία σε ορισμένες από ourin

in vitro

και

in vivo πειράματα

καρκίνο του προστάτη. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα αποτελέσματα ποικίλλουν σημαντικά μεταξύ των συστημάτων μοντέλο με την απουσία πρόσθετο όφελος σε ορισμένες περιπτώσεις, τονίζοντας την ανάγκη να προσδιοριστούν κατάλληλα ποιοι ασθενείς θα ωφεληθούν περισσότερο από μια προσέγγιση συνδυασμού.

Υλικά και Μέθοδοι

καρκινικές κυτταρικές γραμμές του προστάτη

Το ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη LNCaP και 22RV1 κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ευγενική προσφορά από τον Dr. Leland WK Chung [25] (1992, MDACC, Χιούστον Tx). V16D (ευνουχίσει ανθεκτικά), κύτταρα MR49F και MR49C (enzalutamide ανθεκτικά) προήλθαν μέσω σειριακής διόδου ξενομόσχευμα των κυττάρων LNCaP όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26] (S1 Σχήμα). Εν συντομία, τα κύτταρα LNCaP ενέθηκαν σε ποντικούς και όταν το PSA στον ορό επιτυγχάνονται 50ng /ml ευνουχίστηκαν ποντίκια. Όταν η PSA στον ορό επιτυγχάνονται και πάλι 50 ng /ml 5-6 εβδομάδες αργότερα, οι όγκοι που ονομάζεται ανθεκτικό ευνουχισμού. κύτταρα V16D προήλθαν από ένα ξενομόσχευμα LNCaP ανθεκτικό σε ευνουχισμό. Οι όγκοι αποκόπηκαν και κυτταρικές σειρές που παράγονται σε ανδρογόνα μέσα άνευ. Για MR49C και κυτταρικές σειρές MR49F, όταν ξενομοσχευμάτων LNCaP φτάσει το ανθεκτικό ευνουχισμού κατάσταση, που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 mg /kg ENZ με επακόλουθη μείωση του PSA σε χαμηλές τιμές ορού. Όταν η PSA ορού επέστρεψε στο ευνουχισμού ανθεκτικά επίπεδα ή υψηλότερα, οι όγκοι ονομάζονται ENZ ανθεκτικά. Αυτοί οι όγκοι στη συνέχεια πέρασαν 3 φορές σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ευνουχισμού ENZ και κυτταρικές σειρές παρήχθησαν. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2, με 10 μΜ ENZ προστίθεται σε όλα τα μέσα για MR49C και τα κύτταρα MR49F.

Αντιδραστήρια

Το AZD5363 αναστολέα ΑΚΤ παρέχεται από την AstraZeneca (Μάκλσφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο). ENZ αγοράστηκε από τη Σαγκάη Haoyuan Chemexpress (Σαγκάη, Κίνα), PD0235901 από Σέλεκ Chem (Houston, TX) και LY294002 και UO126 από Sigma-Aldrich (St Louis, ΜΟ). LY294002 είναι ένας αναστρέψιμος αναστολέας ΡΙ3Κ? AZD5363 είναι ένας ανταγωνιστικός αναστολέας παν-ΑΚΤ [27]. PD0325901 είναι ένας ανταγωνιστικός αναστολέας ΜΕΚ1 /2 ενώ UO126 αναστέλλει ΜΕΚ1 /2 σε ένα μη-ανταγωνιστικό, επιλεκτικό τρόπο [28]. Στοκ διαλύματα του AZD5363, PD0235091, UO126 και LY294002 παρασκευάστηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Sigma-Aldrich)? ENZ παρασκευάστηκε με H

2O.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο WST-1 και /ή προσδιορισμό ιώδες κρύσταλλο, όπως περιγράφεται προηγουμένως [26].

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

η ανάλυση κυτταρικού κύκλου με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Σχετική περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με FACS ροής Canto II κυτταρόμετρο χρησιμοποιώντας το λογισμικό cyflogic V1.2.1 (www.cyflogic.com) για ανάλυση.

Caspase-3 δραστικότητα δοκιμασίας

Caspase-3 δραστικότητα ήταν αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κασπάσης 3 κιτ δοκιμασίας, με το ακετύλ Asp-Glu-Val-Asp 7-αμιδο-4-μεθυλοκουμαρίνη (Ac-DEVD-AMC) φθορομετρική υπόστρωμα (Enzo Scientific). Τριάντα μικρογραμμάρια προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου επωάστηκε με κασπάση-3 υπόστρωμα AC-DEVD-AMC στους 37,5 ° C για 2,5 ώρες και η δραστικότητα κασπάσης-3 προσδιορίστηκε ποσοτικά με ένα φθοριόμετρο με διέγερση στα 365 nm που και 460 nm εκπομπή. Διπλώστε διαφορές αλλαγή από τον έλεγχο υπολογίστηκαν μετά την αφαίρεση των αναγνώσεων από τυφλά βυθίσματα χωρίς λύμα.

ανάλυση Western blot

Σύνολο πρωτεΐνες εξήχθησαν σε RIPA ρυθμιστικό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. 30-50 μα λύματος πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και στύπωμα Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα PSA, AR (Santa Cruz Biotechnology), βινκουλίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), PARP, ρ-ΑΚΤ Ser473 , ΑΚΤ, ρ-ΕΚΚ, ολική ΕΚΚ, ολική S6 και ρ-S6 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Ανίχνευση δευτερογενή αντισώματα διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα ODYSSEY IR απεικόνισης (Li-COR Biosciences) ή ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

Ποσοτική αντίστροφης μεταγραφής (RT) -PCR

εξαγωγή RNA και RT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [30]. Σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση της PCR ενίσχυση του cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών και ανιχνευτών:

AR

(Hs00171172_m1),

PSA

(Hs00426859_g1), και

GAPDH

(Hs03929097_g1 ) (Applied Biosystems, Foster City, CA) για την ΑΒΙ PRISM 7900 HT Ακολουθία Σύστημα ανίχνευσης (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας Έκφραση TaqMan Gene Master Mix (Applied Biosystems). έκφραση του γονιδίου-στόχου ομαλοποιήθηκε να

GAPDH

επίπεδα στα αντίστοιχα δείγματα ως εσωτερικός έλεγχος.

μεταχείριση των ζώων

παλιά έξι εβδομάδων αρσενικά ευνουχισμένα αθυμικά γυμνά ποντίκια (Harlan Sprague-Dawley, Inc.) ενέθηκαν υποδορίως με 2×10

6 MR49F κύτταρα (αιωρούνται σε 0,1 ml Matrigel? BD Biosciences) και στις δύο πλευρές. Εννέα ποντικοί ανά βραχίονα τυχαιοποιήθηκαν σε όχημα (0,1% μεθυλοκυτταρίνη), AZD5363 100mg kg δύο φορές ημερησίως, PD0325901 5mg kg OD /ή /και τον συνδυασμό. ENZ 10 mg /kg χορηγήθηκε πριν από τον ενοφθαλμισμό και συνεχίστηκε μέχρι όγκοι έφθασαν 200 χιλιοστά

3. μετρήσεις των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα και ο όγκος του όγκου υπολογίζεται με τον τύπο l x Π x Β x 0,5236. Τα φάρμακα χορηγήθηκαν ως ένα στοματικό καθετηριασμό 5 ημέρες, 2 off. επίπεδα PSA μετρήθηκαν εβδομαδιαία χρήση αυτοματοποιημένων ενζυματική ανοσοδοκιμασία (Cobas, Μόντρεαλ, Κεμπέκ, Καναδάς). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν το συνολικό φορτίο του όγκου ήταν & gt? 2.000 χιλιοστά

3 ή είχαν & gt? Απώλεια 20% του σωματικού βάρους. Για τους 22RV1 ξενομοσχεύματα, 2×10

6 κύτταρα εμβολιάστηκαν στο αριστερό πλευρό γυμνών ποντικών ευνουχισμού του. Οκτώ ποντικοί ανά βραχίονα τυχαιοποιήθηκαν σε όχημα, AZD5363 100mg /kg δύο φορές ημερησίως, selumitinib (AZD6244? Arry-142886) 25mg /kg δύο φορές την ημέρα, και το συνδυασμό. Οι 22RV1 ξενομοσχεύματα θυσιάστηκαν όταν ο όγκος του όγκου ήταν & gt? 1.500 χιλιοστά

3. Όλα τα ποντίκια παρακολουθούνται τακτικά για την κλινική κατάσταση τους υπό την επίβλεψη κτηνιάτρου στο Πανεπιστήμιο της Βρετανικής Κολομβίας. Κατά την θυσία, όλοι οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν βαθιά με ισοφλουράνιο πριν από την ευθανασία με CO2. Όγκοι που συλλέγονται κατά τη θυσία χωρίστηκαν σε μέρη και καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο ή μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη. Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με καναδική Συμβουλίου σχετικά Φροντίδα Ζώων κατευθυντήριες γραμμές και με την έγκριση της επιτροπής Animal Care του Πανεπιστημίου της Βρετανικής Κολομβίας (πρωτόκολλο # A12-0210).

Η ανοσοϊστοχημεία

Ένας ιστός μικροσυστοιχιών όλων των όγκων ξενομοσχεύματος MR49F κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ένα εγχειρίδιο microarrayer ιστού (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI). Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [31]. Όλες οι συγκρίσεις των εντάσεων κηλίδωσης έγιναν σε 20Χ μεγέθυνση σε δείγματα εις τριπλούν από έναν παθολόγο γνώριζαν την εκχώρηση της θεραπείας.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM, με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιείται για την ανίχνευση σημαντικών διαφορών μεταξύ πολλαπλών θεραπειών. Όταν ANOVA έδειξαν σημαντικές διαφορές (ρ & lt? 0,05), HSD δοκιμή post-hoc Tukey χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μέσων. ταχύτητα ανάπτυξης του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας γραμμική παλινδρόμηση. ανάλυση επιβίωσης Kaplan Meier σε σύγκριση με τον καρκίνο συγκεκριμένες επιβίωση (CSS) και τη συνολική επιβίωση, με τη δοκιμασία log-rank χρησιμοποιούνται για τη σύγκριση των ομάδων. CSS ορίστηκε ως χρόνος από την έναρξη της θεραπείας μέχρι συνολικού όγκου του όγκου ξεπέρασε 2.000 χιλιοστά

3 και η συνολική επιβίωση ως ο χρόνος από την έναρξη της αγωγής μέχρι τη θυσία. Ο δείκτης συνδυασμού (CI) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK). Μια CI & lt? 1 δείχνει συνέργεια, μια CI & gt? 1 δείχνει ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις

Αποτελέσματα

Επίδραση της στόχευσης ΜΕΚ και AKT μονοπάτια για AR σηματοδοτικό μονοπάτι

Για να διερευνήσουν το. συνάφεια της ΑΚΤ και ΜΕΚ περιόδων ΣΕΣ, που στοχεύουν αντίστοιχες πορείες χρησιμοποιώντας AZD5363 (αναστολέας της ΑΚΤ) και PD0325901 (ΜΕΚ αναστολέα). Αξιολογήσαμε επιδράσεις τους μόνα τους και σε συνδυασμό σε μοντέλα διαφορετικά στάδια του καρκίνου του προστάτη συμπεριλαμβανομένων των ευαίσθητων κυττάρων ανδρογόνου (LNCaP), ευνουχισμού ανθεκτικά (V16D, 22RV1) και ENZ-ανθεκτικών κυττάρων (MR49C και MR49F) (Σχήμα 1). Αποκλεισμός ΑΚΤ με AZD5363 αξιολογήθηκε από την επίδρασή της επί της ΑΚΤ καθοδικός τελεστής p6SK και όχι επί της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ εαυτό λόγω της φύσης του AZD5363. Βασικά, AZD5363 επάγει αυξημένη φωσφορυλίωση ΑΚΤ το οποίο είναι ανενεργό, ένα φαινόμενο συμβαίνει με πολλές ανταγωνιστικές, καταλυτική αναστολείς ΑΤΡ της ΑΚΤ, και οφείλεται στην πρωτεΐνη που κρατούνται σε μία υπερφωσφορυλιωμένη αλλά καταλυτικά αδρανή μορφή ως επακόλουθο της σύνδεσης ένωσης όπως έχει καθιερωθεί προηγουμένως . AZD5363 βρέθηκε ότι επάγει μια μείωση στην φωσφορυλίωση S6K σε όλες τις κυτταρικές σειρές? Αυτή η επίδραση ήταν εντονότερη στην PTEN μηδενική κύτταρα MR49C, MR49F, LNCaP και κυττάρων V16D σε σύγκριση με θετικά 22RV1 κύτταρα PTEN (Σχήμα 1). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τη χρήση άλλων αναστολέα ΜΕΚ (UO126) και αναστολέα ΑΚΤ (LY294006) ή σε συνδυασμό με Ay (σχήμα 1, S2 Εικ). Σε 22RV1 κύτταρα, PD325901 καταργεί τελείως την φωσφορυλίωση ERK ενώ AZD5363 είχε καμία επίδραση στην ΑΚΤ καθοδικός τελεστής S6K φωσφορυλίωση η οποία ήταν μόνο με συνδυασμό AZD5363 και PD0325901 (Σχήμα 1). Ωστόσο, δεν απαιτείται επιπλέον μείωση στα επίπεδα pERK παρατηρήθηκε με το συνδυασμό σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία αναστολέα ΜΕΚ. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η αναστολή της ΑΚΤ αυξήθηκε τόσο AR και PSA σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα RNA σε LNCaP και τα παράγωγά του (Σχήμα 1). Αν και AZD5363 αυξημένα AR και τα επίπεδα PSA σε όλες τις κυτταρικές σειρές, η επίδραση της PD0325901 επί AR και PSA επίπεδα μόνη ή σε συνδυασμό με AZD5363 κυμαινόταν μεταξύ κυτταρικών γραμμών (Σχήμα 1). Σε αντίθεση με LNCaP που βασίζονται κυτταρικές σειρές, PSA αυξήθηκε περαιτέρω από τον συνδυασμό των AZD5363 και PD0325901 σε 22RV1 κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα αποτελέσματα αυτά αντανακλώνται παρόμοια δεδομένα με την προηγουμένως δοκιμαστεί επιτυχημένο συνδυασμό AZD5363 και ENZ όπου οι αλλαγές στην έκφραση AR διέφερε επίσης μεταξύ 22RV1 και LNCaP με βάση κυτταρικές σειρές (S2 σχήμα) [32]. Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ΑΚΤ και ΜΕΚ συνεργάζονται για τη ρύθμιση της οδού AR.

(Α) Επίδραση της ΑΚΤ και ΜΕΚ αναστολή για οδών κατάντη σηματοδότησης. Εξαρτώμενη από ανδρογόνα προστάτη κυτταρική γραμμή LNCaP, CRPC (V16D και 22RV) και ENZ ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές MR49C, κυτταρικές σειρές MR49F υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ AZD5363, PD0325901 20 μΜ μόνα τους ή σε συνδυασμό για 48 ώρες. Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και κηλίδες Western διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας AR, PSA και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού πρωτεΐνες σηματοδότησης όπως υποδεικνύεται. αντιπροσωπευτικές αποτυπώσεις των διπλών πειραμάτων παρουσιάζονται. (Β-Γ) Επίδραση της ΑΚΤ και ΜΕΚ αναστολή στην οδό AR. MR49C, κυτταρικές σειρές MR49F και 22RV υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ AZD5363, PD0325901 20 μΜ μόνα τους ή σε συνδυασμό για 48 ώρες. RNA εκχυλίστηκε από διαφορετικές κυτταρικές σειρές και ποσοτική πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Taqman ανιχνευτές για AR (Β) και AR γονιδίου στόχου PSA (C). Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα των βιολογικών διπλότυπα με τεχνικές τριπλούν φαίνεται.

Η

Επίδραση του συνδυασμού των ΜΕΚ και αποκλεισμό AKT στην απόπτωση των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό

Για τον προσδιορισμό της βιολογικής δραστηριότητας της στόχευσης ΑΚΤ και ΜΕΚ σηματοδότησης μονοπάτια στην κυτταρική απόπτωση, που αντιμετωπίζονται πάνελ μας κυτταρικών σειρών με AZD5363, PD0325901 ή το συνδυασμό. δεδομένα μας έδειξαν ότι ο συνδυασμός της ΑΚΤ στόχευσης και ΜΕΚ επάγει την απόπτωση, όπως φαίνεται από την αυξημένη sub G0 /G1 πληθυσμό κυτταρικού κύκλου. Αυτή η επίδραση ήταν μεγαλύτερη από τη μονοθεραπεία AZD5363 σε CRPC κύτταρα V16D (17% έναντι 10%, Ρ = 0,009) και ENZ ανθεκτικά MR49C (29% έναντι 12%, ρ = 0.005) και MR49F (12% έναντι 3%, ρ = 0,006 ) κύτταρα. Καμία από τις θεραπείες εμφάνισαν οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στο κλάσμα sub G1 /Ο0 σε 22RV1 κύτταρα (Σχήμα 2). Σε αντίθεση, στα κύτταρα LNCaP ανδρογόνο-ευαίσθητα, η θεραπεία συνδυασμού θεραπεία δεν έδειξε περαιτέρω επαγωγή υπο G1 /G0 σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία AZD5363 (17% vs 16%, ρ = 0,76). S-φάση και G2 /M κλάσματα φάνηκε να μειωθεί σε ένα παρόμοιο ποσό σε MR49C, MR49F και V16D κύτταρα με AZD5363 ή το συνδυασμό, με σημαντικές διαφορές για τις δύο θεραπείες από τον έλεγχο (P & lt? 0.001). Επιπλέον, AZD5363 και συνδυασμός PD325901 θεραπεία επαγόμενης διασπασμένη PARP σε LNCaP που βασίζεται κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με ΡΤΕΝ θετικά κύτταρα 22RV1 κύτταρα (Σχήμα 2). Αν και δεν είναι στατιστικά διαφορετικές, παρόμοιες τάσεις παρατηρήθηκαν με κασπάσης 3 δοκιμασίες δραστηριότητας (Εικόνα 2).

(ΑΕ) προπιδίου ροής ιωδιούχο ανάλυση κυτταρομετρίας κυτταρικού κύκλου της αναγραφόμενης κυτταρικών γραμμών δείχνει κλάσμα αυξημένο αποπτωτικό κυτταρικό κύκλο (SubG1 /Ο0) (αριστερά πάνελ). Τα μέσα τριπλών πειραμάτων σχεδιάστηκαν +/- SEM. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα όλων των πληθυσμών του κυτταρικού κύκλου φαίνεται στο δεξί πάνελ. (F) έδειξε κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ AZD5363, PD0325901 20μΜ, ή του συνδυασμού για 48 ώρες. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και στύπωμα western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα PARP, βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από δύο ή περισσότερα πειράματα που δείχνονται. (G) δραστηριότητα κασπάσης-3 σε MR49C, κυτταρικές σειρές MR49F, 22RV1, LNCaP και V16D κατεργάζεται με AZD5363 ή /και PD0325901 για 24 ώρες. Μέση φορές μεταβολής +/- SEM συγκεντρωμένων τιμών από τουλάχιστον δύο βιολογικούς διπλότυπα απεικονίζονται.

Η

επόμενο διερευνηθεί αν το αποτέλεσμα που παρατηρείται σε απόπτωση των κυττάρων μπορεί να μεταφραστεί σε βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η στόχευση ΑΚΤ χρησιμοποιώντας AZD5363 επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 3) ενώ στόχευσης ΜΕΚ χρησιμοποιώντας είτε PD0325901 (Σχήμα 3) ή UO126 (S3 Εικ) είχαν μεγαλύτερη δραστικότητα σε 22RV1 κύτταρα σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές περαιτέρω επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα μας σχετικά με τον πληθυσμό του κυτταρικού κύκλου και της διάσπασης PARP. Αν και παρατηρούμενες τάσεις για μειωμένη βιωσιμότητα και συνεργία με το συνδυασμό σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία σε κύτταρα LNCaP και κυττάρων V16D, σε MR49C και κύτταρα MR49F ο συνδυασμός δεν φάνηκε συνεργιστική (Σχήμα 3). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας το συνδυασμό των ΜΕΚ αναστολέα U0126 με τον αναστολέα ΑΚΤ LY294006 στην MR49C, κύτταρα MR49F (S3 Εικ). Συνέργεια παρατηρήθηκε σε 22RV1 κύτταρα με δείκτη συνδυασμού & lt?. 1 (Σχήμα 3, S3 σχήμα)

κυτταρικές σειρές (ΑΕ) MR49C, MR49F, 22RV1, LNCaP και V16D υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AZD5363 ή /και PD0325901 ως ενδείκνυται για 48 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία WST-1. Τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα των βιολογικών τριπλούν με τεχνικές τριπλούν φαίνεται. Οι δείκτες συνδυασμού που φαίνεται ένθετο, με τιμές & lt?. 1 δείχνει συνέργια

Η

Στόχευση ΑΚΤ και ΜΕΚ οδών σε συνδυασμό αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και τη βελτιωμένη καρκίνος ειδική επιβίωση

Από την δραστικότητα της θεραπείας συνδυασμού έδειξε διαφορές που σχετίζονται με την έκφραση ΡΤΕΝ, ερευνήσαμε

in vivo

πώς στόχευση ΑΚΤ και ΜΕΚ θα επηρεάσει την ανάπτυξη του όγκου σε δύο πιθανές κλινικές ρυθμίσεις (PTEN θετικών και αρνητικών όγκων). Χρησιμοποιήσαμε ENZ-ανθεκτικά κύτταρα MR49F και CRPC 22RV1 κύτταρα για να αξιολογήσει την

in vivo

αποτελεσματικότητα του συνδυασμού της στοχοθέτησης οδών ΑΚΤ και ΜΕΚ.

Τα ξενομοσχεύματα MR49F ήταν ευαίσθητα σε AZD5363, καθιστώντας την αξιολόγηση της πρόσθετο όφελος με ΜΕΚ αποκλεισμό προκλητική. μονοθεραπείας με PD0325901 επέδειξε αναστολή ανάπτυξης όγκου και έδειξε μια μη σημαντική τάση προς χαμηλότερα PSA ορού σε σύγκριση με όχημα (Εικόνα 4). Η συνδυασμένη θεραπεία με AZD5363 και PD0325901 στα ξενομοσχεύματα MR49F δεν οδήγησε σε μεγαλύτερες μειώσεις στον όγκο του όγκου σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία AZD5363, αλλά ο συνδυασμός είχε βελτιωθεί σημαντικά καρκίνο ειδική επιβίωση (CSS) (Ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με φορέα και θεραπεία PD0325901- βραχίονες (Σχήμα 4). Η διάμεση CSS ήταν 17 ημέρες για τα ποντίκια που υπέστησαν αγωγή με φορέα, 25 ημέρες για τα ποντίκια PD0325901 αγωγή, και δεν επιτεύχθηκε για είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με PD0325901 AZD5363. Αριθ ποντίκια στο σκέλος του συνδυασμού ευθανατώθηκαν λόγω του μεγέθους του όγκου μετά από 35 ημέρες θεραπείας. PSA ορού ήταν σημαντικά μειωμένη τόσο στην AZD5363 και τους βραχίονες θεραπείας συνδυασμού σε σύγκριση με το όχημα (Σχήμα 4).

Μετά την εγκατάσταση των όγκων (200mm3) από υποδόρια ένεση ENZ ανθεκτικών κυττάρων MR49F σε ευνουχισμένους ποντικούς υπό την πίεση του 10 mg /kg ημερησίως ENZ, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 mg /kg, AZD5363 100 mg /kg δύο φορές ημερησίως, PD0325901 5mg /kg QD ή AZD5363 100 mg /kg δύο φορές την ημέρα + PD0325901 5 mg /kg QD. (Α) Εκπρόσωπος δεδομένα της MR49F μέσος όγκος του όγκου πάνω από 4 εβδομάδες εμφανίζεται. (Β) Μέση MR49F ταχύτητα ανάπτυξης του όγκου για κάθε ομάδα αγωγής +/- SEM υπολογίζονται χρησιμοποιώντας γραμμική παλινδρόμηση εκτίμηση της ταχύτητας ανάπτυξης του όγκου για κάθε ποντικό. (C) Μέση MR49F εβδομαδιαία PSA παρίσταται ως φορές μεταβολής από την αρχική τιμή για κάθε ομάδα αγωγής +/- SEM. (D) οικόπεδο Καταρράκτης των μεμονωμένων μετρήσεων PSA μετά από 3 εβδομάδες θεραπείας για όλα τα ξενομοσχεύματα MR49F στη μελέτη. καρκίνο (Ε-ΣΤ) Kaplan-Meier συγκεκριμένες επιβίωση και τη συνολική καμπύλες επιβίωσης για τα όπλα θεραπεία MR49F ξενομοσχευμάτων. (G) Μέση 22RV1 όγκος μετά από αγωγή με όχημα, AZD5363 100 mg /kg δύο φορές ημερησίως, selumetinib 25mg /kg QD ή AZD5363 100 mg /kg δύο φορές την ημέρα + selumetinib 25mg /kg QD. Η μέση φορές αλλαγή στο μέγεθος του όγκου σχεδιάζεται +/- SEM. (H) Waterfall διάγραμμα όγκων καρκίνου 22RV1 ξένου μοσχεύματος μετά από 6 εβδομάδες θεραπείας.

Η

Είμαστε δίπλα αξιολόγησε το συνδυασμό της ΑΚΤ και ΜΕΚ αναστολή της οδού χρησιμοποιώντας 22RV1 ξενομοσχευμάτων σε ευνουχισμένα ποντίκια. AZD5363 ήταν και πάλι χρησιμοποιήθηκε ως αναστολέας ΑΚΤ ενώ Selumetinib επιλέχθηκε ως αναστολέας ΜΕΚ η οποία μπορεί να είναι περισσότερο κλινικά σχετικό, όπως είναι επί του παρόντος σε κλινική αξιολόγηση και πρόσφατα εγκριθεί για τη θεραπεία του μελανώματος. Σε αντίθεση με το μοντέλο MR49F, 22RV1 όγκοι ήταν σχετικά ανεπηρέαστα από τις AZD5363, αλλά έκανε επιδεικνύουν αναστολή ανάπτυξης όγκου τόσο Selumetinib και ο συνδυασμός του Selumetinib συν AZD5363. Με όλα τα 22RV1 όγκοι που αναπτύσσονται σχετικά σθεναρά παρά τη θεραπεία, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας, αν και η μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε με το συνδυασμό θεραπείας (Σχήμα 4).

Η ανάλυση των επιμέρους όγκων ποντικών όγκου στο MR49F μοντέλο προτείνει ότι το συνδυασμένο αποκλεισμός μπορεί να επωφεληθεί ένα υποσύνολο των ποντικών (Σχήμα 5). Στο σκέλος μονοθεραπείας AZD5363, ενώ οι περισσότεροι όγκοι ανταποκρίθηκαν καλά, σε επιλεγμένες περιπτώσεις, η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου ήταν ελάχιστη. Ωστόσο, στην ομάδα θεραπείας συνδυασμού, δεν παρατηρήθηκαν ακραίες τιμές (Σχήμα 5). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η χρώση ανοσοϊστοχημείας των όγκων MR49F καταδεικνύεται pERK χρώση στους ποντικούς η οποία κατέδειξε αντίσταση στην AZD5363 (Σχήμα 5). Καμία σημαντική pERK χρώση παρατηρήθηκε στα ποντίκια που ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία (Σχήμα 5), ούτε ήταν οι διαφορές στη χρώση PS6 ή χρώσης Κί67 ανιχνευθεί μεταξύ της θεραπείας συνδυασμού και του βραχίονα μονοθεραπείας AZD5363 (Σχήμα 5).

(Α) Μεμονωμένα καμπύλες ανάπτυξης όγκου για όλους τους ποντικούς στη μελέτη ομαδοποιούνται ανά θεραπεία. (Β) Η ανοσοϊστοχημεία των pERK καταδεικνύει ανιχνεύσιμα επίπεδα σε 3 ποντίκια με πρώιμη αντοχή σε θεραπεία AZD5363 (κορυφή)? Τα 3 άλλα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με AZD5363 παρουσιάζονται για σύγκριση (κάτω). (Γ) Χρώση των δειγμάτων μικροσυστοιχιών καταδεικνύει ότι θετικά pERK χρώση ήταν εμφανής μόνο σε αυτά τα ποντίκια. (Δ) Το ποσοστό των PS6 μειώνεται με AZD5363 και σε μεγαλύτερο βαθμό με συνδυασμό AZD5363 + PD0325901. χρώση (Ε) Κί67 ως δείκτης πολλαπλασιασμού. Μια μικροσυστοιχία ιστός κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας δείγματα όγκου σε κάθε ομάδα (7-9 ανά ομάδα). Οι μέσες βαθμολογίες της χρώσης έντασης βαθμολογούνται από τυφλό παθολόγο φαίνεται +/- SEM.

Η

Συζήτηση

Παρά την επιτυχία του ευνουχισμού και νεότερες αναστολείς της οδού ισχυρή AR όπως enzalutamide, αντίσταση θεραπεία συμβαίνει σε όλες τις περιπτώσεις. Επίμονη σηματοδότησης AR είναι συνήθως κλινικά εμφανής από την αύξηση του PSA. Η επιμονή του AR-σηματοδότησης μπορεί να οδηγείται από διάφορους μηχανισμούς αντοχής συμπεριλαμβανομένων παραλλαγών ματίσματος AR, ενδονεοπλαστική παραγωγή ανδρογόνων και την ενεργοποίηση των αναπληρωματικών οδών που υποστηρίζουν AR σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ΑΚΤ και ΜΕΚ οδών [33]. Η συνδυαστική θεραπεία με προστάτη κατέχει δυνατότητες για την αύξηση της επιβίωσης των ασθενών με αποκλεισμό αυτών των οδών αντίσταση.

Πρόωρη κλινική εμπειρία σε ασθενείς με προστάτη υποδηλώνει ότι η στόχευση ΑΚΤ από μόνη της δεν είναι μια αποτελεσματική στρατηγική. Κλινικές δοκιμές της μονοθεραπείας με αναστολέα της ΑΚΤ στην CRPC έδειξαν περιορισμένη επιτυχία με αυτήν την προσέγγιση [34, 35]. Πριν από

in vitro

εργασία υποδηλώνει ότι η αναστολή της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ μπορεί να οδηγήσει σε αυξητική ρύθμιση της Raf /MEK /ERK μονοπάτι [36], και τα αποτελέσματά μας στο μοντέλο ξενομοσχεύματος MR49F προτείνει επίσης αυτό μπορεί να συμβεί σε ορισμένες περιπτώσεις . Το καλά αναγνωρισμένο στιχομυθία μεταξύ αυτών των οδών παρέχει μια λογική για το συνδυασμό των δύο αυτών των αναστολέων [19-22, 37-39]. Η κλινική εμπειρία με διπλή στόχευση των ΜΕΚ και τις οδούς AKT είναι περιορισμένη? πρώτα αποτελέσματα σε προχωρημένες κακοήθειες υποδεικνύει ότι η διπλή στόχευση των δύο οδών βελτιώνει την ογκολογική αποτελεσματικότητα στο κόστος της μεγαλύτερης τοξικότητας [40].

Η μελέτη μας υπογραμμίζει τις διαφορές που μπορεί να προκύψουν μεταξύ AR θετικά πρότυπα του προστάτη και ιδιαίτερα τη σημασία της PTEN κατάσταση κατά τη στόχευση των οδών ΑΚΤ και ΜΕΚ. Είναι ενδιαφέρον ότι, με στόχο την ΑΚΤ οδού αυξημένη μεταγραφή PSA στα επιβιώσαντα κύτταρα και το αποτέλεσμα αυτό, σημειώνεται προηγουμένως από άλλους [41], μπορεί να είναι σημαντικό να εξεταστούν στο σχεδιασμό μελλοντικών κλινικών δοκιμών με αυτούς τους παράγοντες στόχους αφού PSA χρησιμοποιείται συνήθως ως δείκτης της προχώρηση. Στα ENZ ανθεκτικά μοντέλα LNCaP που προέρχονται, ΜΕΚ αναστολή πρόσθεσε ένα μέτριο όφελος σε σχέση με την αναστολή ΑΚΤ? Είναι ενδιαφέρον ότι η συνέργεια εμφανίστηκε μεγαλύτερη

in vivo

από

in vitro

. Σε 22RV1 κύτταρα, η αναστολή της ΜΕΚ μόνο είχε σημαντική επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και σηματοδότησης, αλλά ο συνδυασμός των ΜΕΚ και η αναστολή της ΑΚΤ αποδειχθεί ελάχιστο πρόσθετο όφελος

in vitro

. Έτσι, ενώ βελτιώσεις στην αντικαρκινική δράση σημειώθηκαν από ορισμένους μετρήσεις με το συνδυασμό σε κάθε μοντέλο, κάθε μοντέλο εμφανίστηκε σε σχέση εθιστεί σε ΑΚΤ και ΜΕΚ, αντίστοιχα, περιορίζοντας έτσι το όφελος της θεραπείας συνδυασμού.

Συνδυασμένη στόχευση του ΜΕΚ και μονοπάτι ΑΚΤ έχει διερευνηθεί σε διάφορες άλλες μορφές καρκίνου σε προ-κλινικά μοντέλα, με τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την χρήση του συνδυασμού [19-22, 37-39]. Σε μια προ-κλινική του καρκίνου του προστάτη

in vivo μελέτη

, PD0325901 εκτιμήθηκε σε συνδυασμό με τον αναστολέα του mTOR ραπαμυκίνη [14]. Ενώ δεν παρατηρήσαμε οποιαδήποτε σημαντική μείωση στην Ki67 με το συνδυασμό, αυτό μπορεί να σχετίζεται με τη συλλογή όλων των όγκων μας κατά το τέλος της μελέτης στο οποίο σημείο οι όγκοι ξενομοσχεύματος ήταν ανθεκτική στη θεραπεία. Πρόσφατα, Park et al, έδειξε το συνδυασμό selumitinib και του αναστολέα ΡΙ3Κ παν-GSK2126458 βελτιωμένη αναστολή της ανάπτυξης όγκου σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία είτε σε AR-αρνητικά DU145 και ξενομοσχεύματα PC3 [42]. Συνολικά, τα αποτελέσματα τους σε AR-αρνητικά μοντέλα είναι συγκρίσιμα με τα αποτελέσματα μας. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αποτελεσματικότητα της ΑΚΤ στόχευσης και ΜΕΚ είναι ανεξάρτητη από την κατάσταση της ασθένειας του καρκίνου του προστάτη και ότι η αποτελεσματικότητα συσχετίζεται με την ενεργοποίηση αυτών των οδών στον όγκο.

Η μελέτη μας περιορίζεται από διάφορους πτυχές της μοντέλα καρκίνου του προστάτη μας. LNCaP κύτταρα φαίνεται να εξαρτάται από την οδό ΑΚΤ υψηλά. Παρ ‘όλα αυτά, όπως AR θετική, PSA-κυτταρικές γραμμές που παράγουν με ένα ενεργοποιημένο μονοπάτι ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, κάνουν μοιάζει με ένα σύνηθες φαινότυπο CPRC συναντώνται [43]. Επιπλέον, ENZ ανθεκτικά μοντέλα μας επιδεικνύουν αρκετές φαινοτύπων σύμφωνο με τις κλινικές ENZ ανθεκτική νόσο, όπως επίμονο AR πυρηνικού εντοπισμού, η μετάλλαξη AR F876L, και προς τα πάνω ρύθμιση του steroiodogenic ενζύμων [26, 32, 44]. 22RV1 κύτταρα λιμάνι παραλλαγές συρραφής των ανδρογόνων, τα οποία προβλέπουν μια φτωχότερη ανταπόκριση σε αναστολείς AR-μονοπατιού [45]. Η παρουσία του enzalutamide-αγωνιστική F876L μετάλλαξη και την παρουσία δεσπόζουσας AR παραλλαγές ματίσματος περιορίζεται η ικανότητά μας να ελέγξουμε την αποτελεσματικότητα των συνδυασμένων ΑΚΤ και την αναστολή της ΜΕΚ μαζί με αναστολή AR σε προηγμένα μοντέλα καρκίνου του προστάτη. Περαιτέρω, ενώ in vitro μελέτες μας δεν έγιναν στον ανδρογόνων ανεπάρκεια των μέσων ενημέρωσης, δεν είναι σαφές εάν αυτό θα οδηγούσε σε σημαντικά διαφορετικά αποτελέσματα, ιδίως όσον CRPC όγκοι μπορούν να παράγουν το δικό τους ανδρογόνα μέσω

de novo

σύνθεση οδών [46] . Κατά συνέπεια, τα αποτελέσματά μας σε συνθήκες ευνουχισμού

in vivo

δεν ήταν σημαντικά διαφορετική.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας σε ENZ ανθεκτικά μοντέλα CRPC κυττάρων δείχνουν ότι η θεραπεία συνδυασμού με ΑΚΤ και η αναστολή ΜΕΚ μπορεί να είναι μια ορθολογικό συνδυασμό σε ένα υποσύνολο των ανθεκτικών περιπτώσεων καρκίνου του προστάτη που χρειάζονται περαιτέρω έρευνα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης τη σημασία της στόχευσης αναστολέων για οδούς όγκου τα οποία είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται? σε καλά επιλεγμένα μονοθεραπεία ασθενείς μπορεί να είναι τόσο αποτελεσματική όσο η θεραπεία συνδυασμού. Συνολικά, αυτό τονίζει την ανάγκη για ορθολογική, βιοδεικτών με γνώμονα την επιλογή των ασθενών, όπως οι στοχευμένες θεραπευτικές ουσίες αξιολογήθηκαν σε κλινικές δοκιμές.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. κύτταρα MR49C είναι ανθεκτικά σε ENZ.

5X10

4cells σπάρθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων, στη συνέχεια κατεργάζεται με διαφορετικές συγκεντρώσεις ENZ (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 μΜ). Μετά από έκθεση 72 ωρών, το μέσο καλλιέργειας άλλαξε φρέσκο ​​μέσο μόνο (Ανάκτηση) ή με ENZ (συνέχεια). 48 ώρες αργότερα, η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με δοκιμασία κρυσταλλικό ιώδες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152861.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. Επίδραση του συνδυασμού ΑΚΤ συν ΜΕΚ αναστολή με εναλλακτικό αναστολέων επί κυτταρική σηματοδότηση.

(Α) MR49C και κυτταρικές γραμμές MR49F υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ LY294006, UO126 10 μΜ, ή συνδυασμό για 48 ώρες.