Αφηρημένο

Μερικές

στελέχη Escherichia coli

παράγουν τοξίνες που ορίζονται cyclomodulins (CMS) που παρεμβαίνουν με το ευκαρυωτικό κυτταρικό κύκλο των κυττάρων του ξενιστή, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή σύνδεση μεταξύ αυτών των βακτηριδίων και των καρκίνων. Υπάρχουν διαθέσιμα σχετικά λίγα στοιχεία σχετικά με τον αποικισμό των όγκων του παχέος εντέρου από cyclomodulin- και γενοτοξική παράγουν

Ε. coli

. Κάναμε μια ποιοτική και φυλογενετική ανάλυση του βλεννογόνου που σχετίζεται με

Ε. coli

φιλοξενούν γονίδια cyclomodulin-κωδικοποιεί από 38 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) και 31 με εκκολπωμάτωση. Η λειτουργικότητα αυτών των γονιδίων διερευνήθηκε σε κυτταρικές καλλιέργειες και το γονοτοξική δραστικότητα των στελεχών άνευ γνωστού γονιδίου CM κωδικοποιεί διερευνήθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλότερη επικράτηση της Β2 phylogroup

Ε. coli

φιλοξενούν τα γονίδια που παράγουν colibatin σε βιοψίες ασθενών με CRC (55,3%) από ό, τι σε εκείνα των ασθενών με diverticulosis (19,3%), (ρ & lt? 0,01). Ομοίως, μια υψηλότερη επικράτηση της Β2

Ε. coli που φιλοξενούν τις

CNF1 γονιδίων που κωδικοποιούν σε βιοψίες ασθενών με CRC (39,5%) από ό, τι σε εκείνα των ασθενών με diverticulosis (12,9%), (ρ = 0,01). Λειτουργική ανάλυση αποκάλυψε ότι η πλειονότητα αυτών των γονιδίων ήταν λειτουργικά. Ανάλυση της ικανότητας του

E. coli

να τηρούν εντερικά επιθηλιακά κύτταρα Int-407 έδειξε ότι πολύ προσκολλημένη

Ε. coli

στελέχη ανήκαν κυρίως σε phylogroups Α και D, ανεξάρτητα από την προέλευση των στελεχών (CRC ή εκκολπωμάτωση), και ότι οι περισσότεροι

Ε. coli

στελέχη που ανήκουν στο Β2 phylogroup εμφανίζεται πολύ χαμηλά επίπεδα πρόσφυσης. Επιπλέον, το 27,6% (n = 21/76)

E. coli

στελέχη στερείται γνωστών γονιδίων cyclomodulin-κωδικοποιούν προκαλείται από βλάβες του DNA

in vitro

, όπως εκτιμάται από τον κομήτη δοκιμασία. Σε αντίθεση με cyclomodulin παράγουν

E. coli

, τα στελέχη αυτά ανήκαν κυρίως στην Α ή Δ

Ε. coli

phylogroups, και επέδειξε μία μη σημαντική διαφορά στην κατανομή των CRC και εκκολπωμάτωσης δείγματα (22%

έναντι

32,5%, ρ = 0,91). Εν κατακλείδι, cyclomodulin παράγουν

Ε. coli

ανήκουν ως επί το πλείστον σε Β2 phylogroup αποικίσουν τον βλεννογόνο του παχέος εντέρου ασθενών με CRC

Παράθεση:. Buc E, Dubois D, SAUVANET P, Raisch J, Delmas J, Darfeuille-Michaud A, et al. (2013) υψηλός επιπολασμός του βλεννογόνου Associated

Ε. coli

Παραγωγή Cyclomodulin και Genotoxin στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (2): e56964. doi: 10.1371 /journal.pone.0056964

Συντάκτης: John R. Battista, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Λουιζιάνα και A & amp? Μ College, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 12, 2012? Αποδεκτές: 18 του Ιανουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Buc et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Ministère Français de l’Εκπαίδευση Nationale, de la Recherche et de la Technologie, l’Institut national de la Santé et de la Recherche médicale (Inserm U1071), l’Institut National de la Recherche Agronomique (USC 2018) και la Ligue contre le καρκίνο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι σήμερα η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και τις γυναίκες, και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, με 1,2 εκατομμύρια εκτιμάται περιπτώσεις και 609.000 εκτιμάται θανάτους ετησίως [1]. Σποραδικές λογαριασμούς CRC για περίπου το 95% του παχέος περιπτώσεις [2]. Οι γενετικοί παράγοντες συνήθως πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύουν περίπου το 20% της αιτιώδους συνάφειας του καρκίνου με το περιβάλλον συμβάλλοντας το υπόλοιπο κινδύνου 80% [3]. CRC είναι ως εκ τούτου σε μεγάλο βαθμό συνδέονται με την έκθεση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως τα βακτήρια που συμβάλλουν σημαντικά στην παχέος περιβάλλον. Αποδεικτικά στοιχεία έχει συσσωρευτεί δείχνουν ότι η σύνθεση της ανθρώπινης εντερικής μικροχλωρίδας επηρεάζει την κατάσταση της υγείας του ξενιστή. Μικροβιακή dysbiosis παρατηρείται σε ασθενείς CRC και απόδειξη της βακτηριακής αλληλεπιδράσεων στην CRC έχει αναφερθεί για

Streptococcus bovis

,

Enterococcus spp.

,

Helicobacter pylori

,

Bacteroides fragilis

και

Escherichia coli

(για επισκόπηση βλέπε [4]). Διάφορες μελέτες καταδεικνύουν σαφώς μια σχέση μεταξύ του βλεννογόνου προσκολλημένη

Ε. coli

και CRC. Μελέτες των ασθενών με καρκίνο στο Ηνωμένο Βασίλειο και τη Γερμανία αποκάλυψε ότι βλεννογόνο που σχετίζεται με

Ε. coli

συχνότερα εντοπίζονται στον ιστό του παχέος εντέρου από ασθενείς με αδενοκαρκινώματα από το ότι από τους ελέγχους [5], [6]. Swidsinski

et al.

Ανέφερε ότι μόνο το 3% του παχέος εντέρου βιοψίες βλεννογόνου από ασυμπτωματικές μάρτυρες που εξετάστηκαν ήταν θετικά για

Ε. Coli

με μια βακτηριακή καθολική PCR [5]. Σε αντίθεση, βιοψίες από το 92% των ασθενών με κολονικής αδενώματα ή καρκινώματα έτρεφε βακτήρια, με το

E. coli

είναι κυρίαρχο στο 70% των ασθενών [5]. Ομοίως, Martin

et al.

Βρέθηκε ότι το 70% των ασθενών είχαν CRC βλεννογόνο που σχετίζεται βακτήρια, και ότι ένα σημαντικό ποσοστό των βακτηρίων ανήκε στο

E. coli

είδη. Είναι ενδιαφέρον, Bronowski

et al.

Έδειξε ότι κάποιο

Ε. coli

στελέχη φέρουν μολυσματικά γονίδια προηγουμένως χαρακτηριστεί ως ειδική σε ουροπαθογονικό

Ε. coli

(UPEC) [7]. Όπως

Ε. coli

στελέχη μπορεί να προκαλέσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στην εντερική οδό [8], όπως φαίνεται με άλλα βακτήρια [9], [10].

Ε. coli

είναι το κυρίαρχο Aero-αναερόβια Gram-αρνητικών ειδών της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας και συμμετέχει στην προώθηση της σταθερότητας των αυλού μικροβιακής χλωρίδας και στη διατήρηση της φυσιολογικής εντερικής ομοιοστασίας της [11]. Ως συμβιωτικών,

Ε. coli

συνυπάρχει με τον οικοδεσπότη του θηλαστικού σε καλή αρμονία και σπανίως προκαλεί την ασθένεια. Ωστόσο, ορισμένα στελέχη φέρουν ένα συνδυασμό των παθογόνων γονιδίων που τους επιτρέπουν να προκαλέσει εντερική (InPEC, Εντερική παθογόνοι

Ε. Coli

) και εξω-εντερικές (εμπι, εξωεντερικές παθογόνοι

Ε. Coli

) λοιμώξεις (για επισκοπήσεις βλέπε [12] – [14]). Φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι

Ε. coli

αποτελείται από τέσσερις κύριες φυλογενετικές ομάδες (Α, Β1, Β2, και Δ) [15], [16]. Παθογόνα στελέχη ανήκουν κυρίως σε ομάδες Β2 και D, ενώ οι περισσότεροι κοπράνων στελέχη ανήκουν στις ομάδες Α και Β1. Στελέχη των ομάδων Β2 και D συχνά μεταφέρουν λοιμογόνους παράγοντες που λείπουν στην ομάδα Α και Β1 στελέχη [17] – [19].

Μεταξύ

Ε. Οι coli

λοιμογόνοι παράγοντες, αρκετές τοξίνες, που ονομάζεται cyclomodulins, προσελκύοντας αυξανόμενη προσοχή επειδή είναι γονιδιοτοξικά ή /και ρυθμίζουν την κυτταρική διαφοροποίηση, την απόπτωση, και τον πολλαπλασιασμό (για ανασκόπηση βλέπε [4]). Κυτταροτοξικά παράγοντας νεκρωτική (CNF) ενεργοποιεί Rho ΟΤΡάσες, η οποία οδηγεί σε κυτταροσκελετικές αλλοιώσεις και επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο. Ο συντελεστής του κύκλου αναστολής (CIF) στοχεύουν Nedd8 συζευγμένο Cullins να επισκιάσουν ξενιστή-κύτταρο σηματοδότηση μονοπατιών [20], [21]. Το colibactin genotoxin είναι ένα υβριδικό πολυκετιδίου-μη πεπτιδική ριβοσωμική ένωση [22]. μηχανήματα βιοσύνθεση της κωδικοποιείται από το

PKS

γονιδιωματικής νησιού. Colibactin προκαλεί DNA δίκλωνα σπασίματα και χρωμοσωμική αστάθεια σε ανθρώπινα ευκαρυωτικά κύτταρα [22], [23]. Η τοξίνη cytolethal διατατική (CDT) επάγει επίσης βλάβη στο DNA πιθανώς μέσω δραστικότητα ϋΝΑση, και μια στενά συνδεδεμένη ενζύμου που παράγεται από

Helicobacter hepaticus

προάγει την εξέλιξη της ηπατίτιδας να προ-κακοήθη, δυσπλαστικές αλλοιώσεις και αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων, παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι η CDT έχει καρκινογόνο δυναμικό

in vivo

[24] – [26]

στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε την επικράτηση της cyclomodulin- και genotoxin γονιδίων που κωδικοποιούν το βλεννογόνο. -associated

Ε. coli

στελέχη από δείγματα εκτομή του ΚΕΣ και εκκολπωμάτωση. Ερευνήσαμε επίσης την γενοτοξική δράση του βλεννογόνου που σχετίζεται με

Ε. coli

στερείται γνωστά γονίδια genotoxin-κωδικοποιούν και την ικανότητά τους να προσκολλώνται στα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η δεοντολογική έγκριση για τη μελέτη που χορηγείται από την επιτροπή δεοντολογίας στην έρευνα Κλερμόν-Φεράν. Αυτό IRB επιτρέπεται για την άρση της γραπτής συγκατάθεσης και ενέκρινε τη διαδικασία της απόκτησης λεκτική συναινέσεις από τους πιθανούς θέματα, γιατί η έρευνα δεν συνεπάγεται διαδικασίες για τις οποίες γραπτή συγκατάθεση απαιτείται κανονικά εκτός του πλαισίου έρευνας και δεν παρουσιάζει κανένα κίνδυνο βλάβης σε άτομα. Τα βιολογικά δείγματα συλλέχθηκαν από εκτομές του παχέος εντέρου, που ήταν απαραίτητα για τη θεραπεία των ασθενών. Οι ερευνητές εξήγησαν τη μελέτη για τις δυνατότητες θέμα προφορικά, παρέχοντας όλες τις σχετικές πληροφορίες, όπως τον σκοπό, τις διαδικασίες, θεωρούμενη κινδύνους. Μετά από αυτή την προφορική εξήγηση, το δυναμικό θέμα ήταν εφοδιασμένο με ένα δελτίο πληροφοριών μελέτης. Μετά δίνοντας τη δυνατότητα φορά αντικείμενο για να διαβάσετε το δελτίο πληροφοριών μελέτη, ο ερευνητής απάντησε οποιεσδήποτε πρόσθετες ερωτήσεις το δυναμικό υποκείμενο μπορεί να είχε. Μια προφορική συμφωνία για να συμμετάσχει στην έρευνα ελήφθη για όλους τους ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Οι ημερομηνίες των προφορική συγκατάθεση εντοπίστηκαν σε μη αναγνωρίσιμο τρόπο.

Ασθενείς

Για να μελετήσουμε μακροσκοπικά δείγματα από εκτομή των δειγμάτων του παχέος εντέρου, συγκρίναμε τους ασθενείς με CRC και σε ασθενείς με εκκολπωμάτωση ως ομάδα μη-καρκίνου. Εξήντα-εννέα ασθενείς μελετήθηκαν μεταξύ Μαρτίου 2007 και Νοεμβρίου 2009 στο πανεπιστημιακό νοσοκομείο του Clermont-Ferrand, Γαλλία. Τριάντα-οκτώ είχαν CRC, και 31 είχαν περίπλοκη εκκολπωμάτωση (Πίνακες S1, S2, S3). Οι ασθενείς από την ομάδα CRC είχε απλά και χειρουργήσιμη καρκίνο του παχέος εντέρου αναπτύσσονται είτε στο εγγύς κόλον (από το τυφλό έντερο στο ηπατικό κάμψη του ανοδική κόλον) ή στο περιφερικό κόλον (σιγμοειδές κόλον). CRC του εγκάρσιου ή απόγονος του παχέος εντέρου αποκλείστηκαν λόγω του χαμηλού την εμφάνισή τους και να αποφύγουν τους κινδύνους μεροληψίας. Σε όλες τις περιπτώσεις, η λειτουργία συνίσταται στη τμηματική εκτομή του παχέος εντέρου που εμπλέκονται από τον όγκο, με άμεση αναστόμωση χωρίς εκτροπή στόμιο. Οι ασθενείς με περίπλοκες CRC (απόφραξη, διάτρηση ή λοίμωξη) αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Οι ασθενείς από την ομάδα εκκολπωμάτωση είχε εκκολπωμάτωση συμμετοχή του παχέος εντέρου σιγμοειδές και απαιτείται χειρουργική επέμβαση, λόγω της ιστορίας της επιπλοκής (επαναλαμβανόμενες εκκολπωματίτιδα, απόστημα, περιτονίτιδα). Αποκλείσαμε ασθενείς με οξεία ή χρόνια φλεγμονή κατά τη στιγμή της χειρουργικής επέμβασης, και εκείνοι με στένωση. Σε περίπτωση μιας πρόσφατης επίθεσης του εκκολπωματίτιδα, αντιβιοτικά σταμάτησαν τουλάχιστον 3 εβδομάδες πριν από τη χειρουργική επέμβαση. αναλογία των φύλων ήταν 1,05 και 0,72 για CRC και DIV ασθενών αντίστοιχα. Το ηλικιακό εύρος ήταν 35-95 ετών για ασθενείς με καρκίνο (μέση ηλικία, 71 ετών και η μέση ηλικία, 67 ετών) και 34-81 ετών για τους ασθενείς εκκολπωμάτωση (μέση ηλικία, 58 ετών και η μέση ηλικία, 60 ετών). Τα δείγματα ελήφθησαν σε εκτομή του παχέος εντέρου, στη θέση των κακοηθών όγκων για ασθενείς CRC και στην κανονική βλεννογόνο των ασθενών εκκολπωμάτωση. Παθολογική ανάλυση επιβεβαίωσε τα νεοπλασματικά χαρακτηριστικά των δειγμάτων στο CRC ασθενείς, και η έλλειψη της φλεγμονής ή δυσπλασίας σε ασθενείς με εκκολπωμάτωση. Η σειρά CRC αποτελείται 21 εγγύς και άπω 17 δείγματα του παχέος εντέρου. στάδιο TNM αναφέρεται στους Πίνακες S1 και S2. προετοιμασία του εντέρου ήταν από το στόμα πικοθειϊκό νατρίου ή προφορική πολυαιθυλενογλυκόλη το βράδυ πριν από την επέμβαση. Όλοι οι ασθενείς εκτομή είχαν λάβει κεφοξιτίνης (2 g ενδοφλεβίως) κατά τη στιγμή της τομής και κανένας δεν είχε λάβει αντιβιοτικά κατά τις 4 εβδομάδες πριν από τη δειγματοληψία.

Επεξεργασία δείγματος

Τα δείγματα βλεννογόνου τοποθετήθηκαν σε 10 ml στείρου αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό ρΗ 7.4 (PBS) και μεταφέρονται σε πάγο στο εργαστήριο. Τα δείγματα ζυγίστηκαν (50 έως 100 mg το καθένα) και πλύθηκε εξαντλητικά τρεις φορές σε 10 κ.εκ. PBS για να απομακρυνθεί το μεγαλύτερο μέρος των κοπράνων βακτηρίων. Κάθε στάδιο έκπλυσης ακολουθήθηκε από φυγοκέντρηση στα 900g για 5 λεπτά. Τα δείγματα στη συνέχεια συνθλίβεται (Ultra-Turrax, ΙΚΑ) και επωάζονται για 15 λεπτά σε ένα περιστροφέα σωλήνος σε θερμοκρασία δωματίου υπό την παρουσία Triton 0.1Χ. Δέκα φορές αραιώσεις του προϊόντος λύσης στη συνέχεια απλώθηκαν σε Drigalski άγαρ και άγαρ χρωμογόνο chromID CPS3® (bioMérieux), που επιτρέπουν τον προσδιορισμό της

E. coli

.

Ε. coli

αποικίες συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C και η ταυτοποίηση των βακτηρίων επιβεβαιώθηκε με το σύστημα αυτοματοποιημένου Vitek II® (bioMérieux). Όταν είναι δυνατόν ένα μέγιστο των 96

Ε. coli

αποικίες ανά δείγμα συλλέχθηκαν για μοριακή τυποποίηση. Τα βακτήρια υποκαλλιεργήθηκαν επί 24 ώρες στους 37 ° C σε πλάκες 96-φρεατίων σε μέσο Luria Bertani, συμπληρωμένο με 15% γλυκερόλη και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C.

Μοριακή τυποποίηση και φυλογενετική ομαδοποίηση

Δέκα αποικίες ανά δείγμα ήταν δακτυλογραφημένες με μοριακές μεθόδους για την αναγνώριση του

Ε. coli

στελέχη (

Ε. coli

γονότυποι) αποικισμό των δειγμάτων. Δύο μέθοδοι προσδιορισμού του γονότυπου χρησιμοποιήθηκαν, μία ακολουθία «Εντεροβακτηριακών Επαναληπτική διαγονιδιακές συναίνεση» (ERIC) -PCR, χρησιμοποιώντας ERIC2 εκκινητή (5′-AAG ΤΑΑ ΟΤΟ ACT GGG GTG AGC G-3 ‘) και ένα «Random Amplified Πολυμορφικό DNA» (RAPD) – PCR χρησιμοποιώντας εκκινητή 1283 (5’-GCG ATC CCC Α-3 ‘) [27], [28]. Ένα αντιπροσωπευτικό στέλεχος στη συνέχεια αναλύθηκαν και αποθηκεύεται στους -80 ° C σε μέσο Luria-Bertani συμπληρωμένο με 15% γλυκερίνη.

Ε. coli

στελέχη συνέχεια ταξινομούνται σύμφωνα με το

Ε. coli

σύστημα συλλογής αναφοράς (ECOR) [16] σε φυλογενετικές ομάδες Α, Β1, Β2 και D χρησιμοποιώντας πολλαπλή PCR τεχνική [29]. Στέλεχος RS218, που φιλοξενεί όλα τα γονίδια στο στόχαστρο της multiplex PCR, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

Ανίχνευση και ταυτοποίηση των γονιδίων που παράγουν cyclomodulin

Cyclomodulin γονιδίων που κωδικοποιούν ανιχνεύθηκαν με dot-blot πειράματα υβριδισμού DNA σε όλες τις

Ε. coli

στελέχη. Οι ανιχνευτές που λαμβάνονται με PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30] (Πίνακες S4 και S5) χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης ιχνηλάτη PCR DIG (Roche Applied Sciences, Switserland) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δύο δείγματα DNA μικρογραμμαρίων σταθεροποιήθηκαν σε θετικά φορτισμένες μεμβράνες νάυλον με φωτισμό υν για 20 λεπτά. Ο υβριδισμός πραγματοποιήθηκε με την επισήμανση και την ανίχνευση κιτ της Roche (Roche Applied Sciences), όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή. Κάθε κηλίδα ελέγχθηκε με ανιχνευτή γονίδιο 16S rRNA. Η

PKS

νησί, το οποίο περιέχει το σύμπλεγμα γονιδίων colibactin παράγουν, ελέγχθηκε με έναν ανιχνευτή επικάλυψη των

clbK

και

clbJ

γονίδια. Η

CNF

γονίδια ανιχνεύθηκαν με ένα μίγμα ανιχνευτών ειδικά για

cnf1

,

cnf2

, και

cnf3

. Η

cdtB

γονίδια εντοπίστηκαν από δύο πειράματα υβριδισμού με το

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV

και

cdtB-Ι-cdtB-IV

μείγματα καθετήρα. Η

cif

γονιδίου ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα εσωτερικό ειδικό ανιχνευτή. Οι ευαισθησίες και ιδιαιτερότητες των ανιχνευτών ελέγχθηκαν σε κάθε μεμβράνη με κηλίδωση εκχυλίσματα DNA όλων των στελεχών ελέγχου cylomodulin. Θετικές υβριδισμούς με έναν ανιχνευτή cyclomodulin υποβλήθηκαν σε επιβεβαιωτικές δοκιμασίες PCR όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30]. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 50 ng DNA δείγματος, 0.2 mM κάθε δεοξυνουκλεοζιτών τριφωσφορική (dNTP), 0.4 μΜ από κάθε εκκινητή, 3 mM MgCl2, και 1.0 U πολυμεράση DNA RedGoldStar (Eurogentec, Βέλγιο) στο αντίστοιχο ρυθμιστικό αντίδρασης. Εκκινητές που βρίσκονται στις περιοχές του νησιού PKS (τα γονίδια clbA και clbQ) 5 ‘και 3’ χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσει την πλήρη παρουσία του νησιού colibactin που παράγουν.

κυτταροπαθογόνου δοκιμασίες

HeLa κύτταρα (που προέρχονται από καρκίνο του τραχήλου) αγοράστηκαν από την ATCC (CCL ATCC®-2

TM) διατηρήθηκαν σε ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2 στους 37 ° C σε κατάλληλο μέσο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10% (ο /ο) ορό εμβρύου μόσχου (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% Ε-γλουταμίνη (Life-Technologies), 200U πενικιλλίνης, 50 mg στρεπτομυκίνης, 0,25 mg του amphoterocin Β ανά λίτρο, και 1% HEPES ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (Lonza). Μπορούν σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96-φρεατίων σε 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο για 24 H. ερευνήθηκαν τα κυτοπαθικά αποτελέσματα του CNF και CDTs σε όλα τα στελέχη από κύτταρο-λύμα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, τα αποτελέσματα της CDT και CNF ανιχνεύθηκαν με δοκιμή κύτταρο-λύματος-αλληλεπιδρούν. Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας στους 37 ° C με ανακίνηση σε μέσο ζωμού Luria-Bertani, βακτηριακά κύτταρα υποβλήθηκαν σε ηχητική επεξεργασία και αποστειρώνεται με διήθηση με χρήση φίλτρων χωριστά 0,22-μm-μεγέθους πόρων. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα αποστειρωμένα σε υπερήχους προϊόντα λύσης (τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης: 4 μg /ml) μέχρι την ανάλυση. Τα αποτελέσματα της colibactin και CIF ανιχνεύθηκαν με δοκιμή κύτταρο-βακτήριο που αλληλεπιδρούν, με βάση την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων HeLa και των βακτηρίων. Ολονύκτιες καλλιέργειες ζωμού Luria-Bertani του

Ε. coli

πλύθηκαν τρεις φορές και αραιώνονται σε μέσο αλληλεπίδρασης. καλλιέργειες κυττάρων HeLa μολύνθηκαν σε πολλαπλότητες μόλυνσης (ΜΟΙ, αριθμοί των βακτηρίων ανά κύτταρο κατά την έναρξη της μόλυνσης) 100 και 200. Τα κύτταρα πλύθηκαν 4 ώρες μετά τον εμβολιασμό και επωάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας κυττάρων με 200 μg /ml γενταμικίνη μέχρι την ανάλυση . Μετά από 72 ώρες επώασης στους 37 ° C υπό ατμόσφαιρα 5% CO2, το μέσο απομακρύνθηκε με τρεις πλύσεις των κυτταρικών μονοστοιβάδων HeLa. Οι μορφολογικές αλλαγές χαρακτηριστικές της CDT, CNF, colibactin, και CIF παρατηρήθηκαν μετά από χρώση με Giemsa λεκέ. Ταυτοποίηση βασίστηκε στην ικανότητα του είτε βακτηριακού προϊόντος λύσης που περιέχει CNF και CDT ή ολόκληρα ζωντανά βακτήρια που παράγουν colibatin και CIF να επάγουν μια κυτταροπαθητική επίδραση επί των επιθηλιακών κυττάρων αναλύονται σε 3 ημέρες μετά τη μόλυνση. Colibactin, CDT και CIF που προκαλείται κυτταροπαθολογικές επιδράσεις, όπως αποδεικνύεται από διευρυμένη πυρήνων και κυττάρων διάταση (megalocytosis), ενώ CNF επαγόμενη πολυπυρήνωση, και η διεύρυνση των κυττάρων HeLa. Πολυπυρήνωση παρατηρείται σε & gt? 50% των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με CNF παράγουν βακτήρια και σε περίπου 10% των μη μολυσμένων κυττάρων ή κυττάρων που έχουν μολυνθεί με άλλα στελέχη CM παράγουν. Για CNF και CDT, το κυτοπαθικό αποτέλεσμα παρατηρείται μόνο με βακτηριακά προϊόντα λύσης. Αντίθετα, για colibactin και CIF, απαιτείται επαφή μεταξύ των βακτηρίων και των κυττάρων του ξενιστή. Η ανίχνευση του άλφα-αιμολυσίνης πραγματοποιήθηκε για όλα τα στελέχη που μελετήθηκαν από ολονύκτια ανάπτυξη στους 37 ° C σε Columbia αίμα προβάτου (5%) άγαρ (Oxoid, Dardilly, Γαλλία).

Ε. coli

25922 (ATCC) χρησιμοποιήθηκε ως στέλεχος αναφοράς για την παραγωγή α-αιμολυσίνης.

ηλεκτροφόρηση γέλης Single-cell

Η γενοτοξική δράση του

Ε. coli

στελέχη στερούνται γνωστών γονιδίων που κωδικοποιούν CM-διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης μονού κυττάρου (δοκιμασία κομήτη). καλλιέργειες κυττάρων HeLa μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 500 με

E. coli

καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα σε ζωμό Luria-Bertani. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές 3 ώρες μετά τον εμβολιασμό και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε μέσο καλλιέργειας κυττάρων με 200 μg /ml γενταμυκίνη στους 37 ° C υπό 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Αυτά στη συνέχεια πλύθηκαν με μέσο PBS και συνδυάστηκαν με 0.5% χαμηλού σημείου τήξεως αγαρόζης (Bio-Rad, Marnes La Coquette, France) διαλύεται σε στείρο PBS στους 37 ° C. Το κύτταρο-αγαρόζη μίγμα εφαρμόστηκε σε μία πλάκα μικροσκοπίου προεπικαλυμμένα με 1,5% κανονικό σημείου τήξεως αγαρόζης (Molecular Biology Grade, Bio-Rad) διαλυμένο σε στείρο PBS στους 37 ° C. Μία καλυπτρίδα εφαρμόστηκε και αφέθηκε να στερεοποιηθεί στους 4 ° C για 60 λεπτά. Τα πλακίδια στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε 50 mL ρυθμιστικού λύσης (10 mM Tris-HCl, 2.5 Μ NaCl, 100 mM EDTA που περιέχει 1% Triton Χ-100, 10% DMSO, ρΗ 10) για 2 ώρες στους 4 ° C στο σκοτάδι. Τα πλακίδια βυθίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (1 mM EDTA 300 mM NaOH ρΗ 13) για 1 ώρα στους 4 ° C και ένα ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόσθηκε (1 V /cm) για 40 λεπτά. Τα πλακίδια εξουδετερώθηκαν με 400 mM Tris-HCI ρΗ 7,5 και ξηραίνεται. 40 μΐ αραίωσης 1: 10.000 του SybrGreen εφαρμόστηκε απευθείας στη διαφάνεια. Μεμονωμένα κύτταρα ή κομήτες είχαν προβληθεί από Zeiss Axioplan2 μικροσκόπιο φθορισμού. Το Β2

Ε. coli

στέλεχος IHE3034 και

Ε. coli

DH10β pBACpks χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι [22]. Το Β2

Ε. coli

στέλεχος IHE3034 Δ

CLBP

και

Ε. coli

DH10β ρΒΑΟ χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες [22].

Πρόσφυση δοκιμασία

Int-407 κύτταρα (που προέρχονται από ανθρώπινο εντερικό εμβρυϊκά νήστιδα και ειλεό) αγοράστηκαν από την ATCC (CCL ATCC® -6

TM) διατηρήθηκαν σε ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2 στους 37 ° C σε κατάλληλο μέσο. Μπορούν καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% (ο /ο) ορό εμβρύου μόσχου (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% Ε-γλουταμίνη (Life-Technologies), 200U πενικιλλίνης, 50 mg στρεπτομυκίνης, 0,25 mg του amphoterocin Β ανά λίτρο και 1% HEPES ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (Lonza). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /cm2 σε πλάκες καλλιέργειας επί 48 H. εκτελέστηκε Η μόλυνση σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης 10 βακτήρια ανά κύτταρο. Τα μολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 900 g για 10 λεπτά στους 25 C και τοποθετήθηκαν στους 37 ° C για 3 H. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS? ΡΗ 7,2). Τα επιθηλιακά κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με 1% Triton Χ-100 (Sigma) σε απιονισμένο νερό. Τα δείγματα αραιώθηκαν και απλώθηκαν σε Luria-Bertani (LB) πλάκες άγαρ να προσδιοριστεί ο αριθμός των CFU που αντιστοιχεί στο συνολικό αριθμό των σχετιζομένων μετά κυττάρων βακτηρίων. Στελέχη

Ε. coli

Κ12 και

Ε. coli

LF82 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες αντίστοιχα [32]. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο αριθμός των προσκολλημένων βακτηρίων ανά κύτταρο μετά από μία περίοδο μόλυνση 3Η.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του Fisher ακριβής και δοκιμών chi-square. Για συγκρίσεις πολλαπλών ομάδα, μια αρχική chi-square test για ετερογένεια έγινε, και μόνο εάν αυτό έδωσε τιμή Ρ & lt? 0.05 ήταν οι ατομικές ζεύγη συγκρίσεις δοκιμαστεί

Αποτελέσματα

Ε. coli

στελέχη στον καρκίνο του παχέος εντέρου και εκκολπωμάτωση δείγματα

Η ανάλυση του

Ε. coli

στελέχη ανέφεραν ότι ο αριθμός των δειγμάτων χωρίς να

Ε. coli

ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς εκκολπωμάτωση (19,4%, n = 6/31) σε σχέση με εκείνους με CRC (2,6%, η = 1/38), ρ = 0.04 (Πίνακας 1). Πολλοί παχέος δείγματα έτρεφε μόνο ένα

Ε. coli

γονότυπο. Αυτό παρατηρήθηκε στο 42,1% (n = 16/38) των δειγμάτων CRC και μόνο 25,8% (n = 8/31) του εκκολπωμάτωση, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (p = 0,12). Τα περισσότερα στελέχη που απομονώθηκαν από CRC ανήκε στο phylogroup Β2 (73,7%, n = 28/38), σε αντίθεση με αυτά που απομονώνονται από εκκολπωμάτωση (41,9%, n = 13/31), ρ & lt? 0,01 (Πίνακας 2). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο

Ε. coli

διανομή phylogroup παρατηρήθηκε, μεταξύ άλλων και για B2

Ε. coli

στελέχη που απομονώθηκαν από το εγγύτερο (82,4%, n = 14/17) και άπω κόλον (66,7%, n = 14/21), ρ = 0.23 (Πίνακας 2). Συνολικά

Ε. coli

στελέχη που ανήκουν στο Β2 phylogroup αποίκισαν όγκους του παχέος εντέρου πιο συχνά από ό, τι έκαναν τα δείγματα εκκολπωμάτωση.

Η

Διανομή CM-γονιδίων που κωδικοποιούν σύμφωνα με

Ε. coli

φυλογενετικές ομάδες

Η κατανομή των CM-γονιδίων που κωδικοποιούν το

Ε. coli

στελέχη που φαίνονται στον Πίνακα 3 και στους Πίνακες S1, S2, S3. Η πιο συχνή χαρακτηριστικό ήταν η colibactin κωδικοποίησης

PKS

νησί (80% του CM που παράγουν

Ε. Coli

, n = 28/35 και 24,1% του συνόλου των

Ε. Coli

στελέχη, n = 28/116). Όλα τα στελέχη που συνδέονται με την βλεννογόνο του κόλου ασθενών με CRC ή εκκολπωμάτωση φιλοξενούν το colibactin κωδικοποιεί

PKS

νησί ανήκε phylogroup Β2 (ρ & lt? 0,001 για την ομάδα Β2

έναντι

ομάδες Α, Β1 και D, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό). Επιπλέον, το 16,4% (n = 19/116) των στελεχών κατείχαν το

CNF

γονίδιο? από αυτά μόνο ο ένας ήταν

cnf2

-θετικό και καμία δεν ήταν

cnf3

-θετικό, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα στελέχη δεν ήταν ζωικής προέλευσης [33], [34]. Όλες τις φωτογραφίες

cnf1

-harboring στελέχη ανήκαν επίσης να phylogroup Β2, και αντιπροσώπευαν το 36,7% (n = 18/49) των στελεχών της phylogroup. Όσο για το

PKS

νησί, η ένωση

cnf1

με phylogroup Β2 ήταν ισχυρή (p & lt? 0,001 για την ομάδα Β2

έναντι

ομάδες Α, Β1 και D, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό ), και το 33% (n = 16/49) της Β2 στελέχη κατείχαν τόσο η

PKS

νησί και το

cnf1

γονίδιο (p & lt? 0,001 για την ομάδα Β2 έναντι των ομάδων Α, Β1 και D , μεμονωμένα ή σε συνδυασμό), όπως παρατηρήθηκε στο παρελθόν [30], [35]. Όλα όμως τα τρία στελέχη που φέρουν

cnf1

γονίδιο παρουσίασαν την άλφα-αιμολυτικό φαινότυπο. Ωστόσο, οι τρεις μη-αιμολυτικό

cnf1

-θετικό στελέχη έτρεφε το

hlyC

γονίδιο. Η

cdtB

γονίδια παρατηρήθηκαν σε έξι στελέχη. Παρά το γεγονός ότι τέσσερα από τα έξι

CDT

-θετικό στελέχη ανήκαν σε phylogroup Β2, δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση με ένα συγκεκριμένο φυλογενετικό ομάδα, ακόμη και με τις διάφορες

cdtB

γονίδιο υποτύπους.

cdtB-Ι

/

γονίδια cdtB-IV

(n = 5), παρατηρήθηκαν πιο συχνά από ό, τι εκείνες του

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV

ομάδα γονιδίων (n = 1). Το μόνο

CDT-III

-θετικό στέλεχος έτρεφε επίσης το

cnf2

γονίδιο, ένα συνδυασμό των γονιδίων συχνά αναφερθεί στο πλασμίδιο pVir και κυρίως παρατηρείται σε στελέχη της προέλευσης των βοοειδών [36], [37 ]. Η

cdtB

γονιδίων έδειξε καμία ιδιαίτερη σχέση με την colibactin-κωδικοποίηση

PKS

νησί ή το

cnf1

γονίδιο. Δεδομένου ότι

CDT

γονίδια έχουν μελετηθεί εκτενώς σε Shiga τοξίνη που παράγει

Ε. coli

(STEC) στελέχη [38] – [40], αποφασίστηκε να διερευνηθεί

cdtB

-θετικό στελέχη για

STX

και

ΠΑΕ

γονίδια. Όχι

STX

ή

ΠΑΕ

γονίδιο εντοπίστηκε σε

cdtB

-θετικό στελέχη. Η

cif

γονίδιο ανιχνεύθηκε σε τρία στελέχη που ανήκαν σε phylogroups Α (n = 1) και Β1 (n = 2) και φιλοξενούνται καμία άλλη CM-γονίδια που κωδικοποιούν. CIF είναι ένας τελεστής του συστήματος τύπου 3 έκκριση που κωδικοποιείται από τον τόπο των εντεροκυττάρων εξάλειψη (Lee) παρατηρήθηκε σε εντεροπαθογόνοι

E. coli

(EPEC) και εντεροαιμορραγικό

Ε. coli

(EHEC) [41], [42] και τα τρία θετικά στελέχη σε αυτή τη μελέτη κατείχε το

ΠΑΕ

γονίδιο αλλά ούτε

stx1

ούτε

stx2

γονίδια , και ως εκ τούτου ανήκε στην παθότυπο EPEC.

η

η φαινοτυπική ανίχνευση cyclomodulins

κυττάρων-λύματος-αλληλεπιδρούν τεστ χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση CNF και CDT παραγωγή σε όλα τα στελέχη. Η ανίχνευση colibactin και CIF παραγωγής, οι οποίες απαιτούν δοκιμές κύτταρο-βακτήριο που αλληλεπιδρούν, ήταν δυνατή μόνο σε μη αιμολυτική στελέχη, επειδή τα στελέχη που παράγουν αιμολυσίνη, σε αντίθεση με τα αντίστοιχα προϊόντα λύσης, που προκαλείται από την ταχεία κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματα δίνονται στους Πίνακες S1, S2, S3. Colibactin, CDT και CIF που προκαλείται κυτταροπαθολογικές επιδράσεις, όπως αποδεικνύεται από διευρυμένη πυρήνων και κυττάρων διάταση (megalocytosis), ενώ CNF επάγεται πολυπυρήνωση σε ≥50% των κυττάρων και η διεύρυνση των κυττάρων HeLa (Εικόνα 1). Για CNF και CDT, η κυτταροπαθητική επίδραση ήταν παρατηρήσιμη μόνο με βακτηριακά προϊόντα λύσης, ενώ μια επαφή μεταξύ βακτηριδίων και κύτταρα ξενιστές ήταν απαραίτητη για colibactin και CIF, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (Σχήμα 1) [22], [31], [42]. Η παρατήρηση ενός κυτοπαθικό αποτέλεσμα συσχετίστηκε με την παρουσία γονιδίων που κωδικοποιούν CM-. Τρία στελέχη που φέρουν μια

PKS

νησί απομονωμένο από εκκολπωμάτωση, άπω και εγγύς κόλον δείγματα δεν προκάλεσε κανένα κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα. Ένα στέλεχος που απομονώθηκε από ένα δείγμα εκκολπωμάτωση είχε ένα μη λειτουργικό

cnf1

γονίδιο και δύο

CDT

-θετικό στελέχη δεν έδειξαν κυτοπαθικό αποτέλεσμα. Για το στέλεχος της απόκρυψης

cnf2

και

CDT

-lll γονίδια, & gt? 50% των κυττάρων πολυπυρήνωση πιστοποιείται με την παραγωγή του CNF και το ευρύ megalocytosis αποδίδεται στην παραγωγή CNF ή ο συνδυασμός του με CDT-III . Ένα κυτταροπαθολογικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για τα στελέχη που φιλοξενούν το

cif

γονίδιο. Συνολικά, περισσότεροι CM-γονιδίων που κωδικοποιούν ήταν λειτουργικές, κυρίως

CNF

και

cif

(93% και 100%, αντίστοιχα).

Για CNF και CDT, το κυτοπαθικό αποτέλεσμα είναι παρατηρήσιμη μόνο με βακτηριακά προϊόντα λύσης. Αντίθετα, για colibactin και CIF, απαιτείται μια επαφή μεταξύ βακτηριδίων και κύτταρα ξενιστές. Colibactin, CDT και CIF κυτταροπαθογόνου αποτελέσματα, όπως φαίνεται από την διευρυμένη πυρήνων και κυττάρων διάταση (megalocytosis), ενώ η CNF που προκαλείται πολυπυρήνωση και η διεύρυνση των κυττάρων HeLa.

Η

Διανομή CM-γονιδίων που κωδικοποιούν σύμφωνα με το υπόδειγμα προέλευσης και ο phylogroupe

Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα 4, Σχήμα 2 και πίνακες S1, S2, S3. Είκοσι πέντε CRC δείγματα μεταξύ των 38 (65,8%) περιείχαν CM-θετικό

Ε. coli

και μόνο 6 δείγματα εκκολπωμάτωση μεταξύ 31 (19,4%), υποδεικνύοντας ότι CM-φιλοξενούν στελέχη προτίμηση συνδέονται με CRC (ρ & lt? 0,01). Αυτή η διαφορά σχετίζεται με υψηλό αριθμό CM-θετικών Β2

E. coli

σε CRC δείγματα σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρήθηκε σε δείγματα εκκολπωμάτωση (Σχήμα 2). Κατά συνέπεια, στελέχη που φέρουν colibactin κωδικοποιεί

PKS

νησιού ήταν παρούσα σε 55.3% των δειγμάτων CRC (n = 21/38) και μόνο σε 19,3% των δειγμάτων εκκολπωμάτωσης (n = 6/31), υποδεικνύοντας ότι

PKS

θετικά στελέχη ήταν σημαντικά (p & lt? 0,01) περισσότερο διαδεδομένη στην CRC. Σε μικρότερο βαθμό,

CNF

και

CDT

θετικό

Ε. coli

ήταν σημαντικά (p≤0.02) πιο διαδεδομένη στην CRC από ό, τι στα δείγματα εκκολπωμάτωση. Οι διαφορές αυτές ήταν κυρίως λόγω του υψηλού επιπολασμού του

PKS

-,

CNF

– και

CDT

-θετικό

Ε. coli

στο άπω δείγματα CRC σε σύγκριση με εκείνη σε δείγματα εκκολπωμάτωση (p≤0.01). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η CM-θετικά

Ε. coli

διανομής διαφέρει ανάλογα με δείγματος προέλευσης.

Α

Ε. coli

στελέχη (n = 70) που απομονώθηκε από δείγματα CRC (n = 38), και Β,

E. coli

στελέχη (n = 46) που απομονώθηκαν από τα δείγματα εκκολπωμάτωση (n = 31).

Η

γονοτοξικότητας του

Ε. coli

στερείται CM-γονιδίων που κωδικοποιούν

Εμείς διερευνηθεί εάν

Ε. coli

στερείται γνωστών γονιδίων που κωδικοποιούν CM-μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο DNA σε κύτταρα-ξενιστές. Χρησιμοποιώντας HeLa καλλιεργημένα κύτταρα, η γονοτοξικότητας των στελεχών διερευνήθηκε με δοκιμασία μονοκύτταρους ηλεκτροφόρηση γέλης (ή κομήτη δοκιμασία), το state-of-the-art τεχνική για την ανίχνευση βλαβών στο DNA που προκαλούνται από χημικές γενοτοξίνες. Ένα σύνολο των 76 κλινικών

Ε. coli

στελέχη ερευνήθηκαν? 15 προήλθε από το εγγύτερο καρκίνο του παχέος εντέρου, 21 από το περιφερικό καρκίνο του παχέος εντέρου και 40 από εκκολπωμάτωση. Αυτά τα στελέχη ανήκαν σε Α (n = 29), D (n = 21) και Β2 (n = 17) phylogroups. Είναι ενδιαφέρον ότι, 27,6% (n = 21/76) του

E. coli

στελέχη στερούνται γνωστών γονιδίων που κωδικοποιούν CM-επαγόμενη ο σχηματισμός των κομητών, οι οποίες είναι τυπικές της βλάβης DNA του κυττάρου ξενιστή (Σχήμα 3 και Πίνακες S1, S2, S3). Επιπλέον, σε αντίθεση με CM-παραγωγή

E. coli

στελέχη, τα οποία ανήκουν κυρίως στον phylogroup Β2, αυτές κομήτη θετικά στελέχη ανήκαν κυρίως σε μια (52%, n = 11/21) και D (29%, n = 6/21) phylogroups. Κομήτες παρατηρήθηκαν με 13 στελέχη (32,5%) μεταξύ των 40 που απομονώθηκαν από ασθενείς με εκκολπωμάτωση, και με 8 στελέχη (22%) μεταξύ των 36 ασθενών με CRC. Η κατανομή αυτών των υποθετικών γονοτοξική στελέχη στα δείγματα ήταν επομένως διαφορετική από εκείνη του CM-κωδικοποιεί στελεχών.

βλάβη στο DNA δεν ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HeLa μολύνθηκαν με τον

E.