Αφηρημένο

Η εφαρμογή των φαγοκυτταρικών αγωνιστές των υποδοχέων στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου μελετήθηκε. Αγωνιστές (λαμιναρίνη, μόρια με τερματικό μαννόζη, Ν-φορμυλ-methioninyl-λευκυλ-φαινυλαλανίνη) έχουν σταθερά συνδεδεμένη με την επιφάνεια των κυττάρων του όγκου. Όταν ιδιαίτερη αγωνιστές των υποδοχέων φαγοκυτταρικής χρησιμοποιήθηκαν μαζί με LPS (Toll-σαν αγωνιστής των υποδοχέων), παρατηρήθηκε υψηλή συνέργεια προκαλώντας συρρίκνωση του όγκου και η προσωρινή ή οριστική εξαφάνιση. Μέθοδοι αγκύρωσης φαγοκυτταρικής αγωνιστές των υποδοχέων (αλληλεπιδράσεις χρέωση, αγκυροβόληση με βάση υδρόφοβες αλυσίδες, ομοιοπολικούς δεσμούς) και διάφορα καθεστώτα της φαγοκυτταρικής αγωνιστή /εφαρμογές μείγμα LPS εξετάστηκαν για να επιτευχθεί το μέγιστο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Συνδυασμοί μαννάνης /LPS και f-MLF /LPS (υδρόφοβο άγκυρες) σε κατάλληλο (παλμός) καθεστώτων οδήγησε σε ανάκτηση 80% και 60% για τα ποντίκια, αντίστοιχα. Προτείνουμε ότι η ουσιαστική συνέργεια μεταξύ των αγωνιστών της φαγοκυτταρικής και των υποδοχέων ΤοΙΙ (TLR) βασίζεται σε δύο γεγονότα. Ο συνδετήρας TLR επάγει πρώιμη και μαζική φλεγμονώδη διήθηση των όγκων. Το αποτέλεσμα αυτής της κυτταρικό διήθημα κατευθύνεται προς κύτταρα όγκου, έχοντας αγωνιστές φαγοκυτταρικών υποδοχέων στην επιφάνειά τους. Το αποτέλεσμα αυτών των διαδικασιών ήταν αποτελεσματική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Αυτή η νέα προσέγγιση αποτελεί εκμετάλλευση της έμφυτης ανοσίας μηχανισμών για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Janotová T, Jalovecká M, Auerová Μ, Švecová Ι, Bruzlová P, Maierová V, et al. (2014) Η χρήση των Αγκυροβολημένο Αγωνιστές της φαγοκυτικός υποδοχείς για τον Καρκίνο Ανοσοθεραπεία: Β16-F10 ποντικών Μελάνωμα μοντέλο. PLoS ONE 9 (1): e85222. doi: 10.1371 /journal.pone.0085222

Επιμέλεια: Λουκία Gabriele, Istituto Superiore di Sanità, Ιταλία

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 25 Νοεμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Janotová et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα όχι. CZ.1.07 /2.2.00 /15.0361 χρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο και Τσεχική Κρατικού Προϋπολογισμού. Περαιτέρω υποστηρίχθηκε από την εταιρεία Polak CZ s.r.o. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε εν μέρει από Polak CZ s.r.o. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με την ευρέως αποδεκτή καρκίνο ανοσοδιαμόρφωση υπόθεση [1] καρκινικών κυττάρων, η οποία ξεπέρασε την εξάλειψη και φάσεις ισορροπίας, δημιουργούν τις κρίσιμες τροποποιήσεις που είναι απαραίτητες για να παρακάμψουν τις δύο έμφυτη και προσαρμοστική ανοσολογική άμυνα (φάση διαφυγής). μηχανισμοί Πολυάριθμες διαφυγής περιλαμβάνουν ρύθμιση προς τα κάτω του όγκου-ειδικά αντιγόνα [2], απώλειας ή προς τα κάτω ρύθμιση των αντιγόνων MHC [3], ελαττώματα στην επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνων [4], η έκφραση της ανοσο-ανασταλτικής συνδετήρες επί κυττάρων όγκου [5] , επαγωγή της κεντρικής ή περιφερικής ανοχής [6] ή παραγωγή ενός μικροπεριβάλλοντος ανοσοκατασταλτική όγκου [7].

Ενώ το πιο σημαντικό συστατικό της αντικαρκινικής ανοσίας αντιπροσωπεύεται από κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα [8], μεταξύ των κυττάρων έμφυτη ανοσία, τα κύτταρα ΝΚ φαίνεται να παίζουν τον πιο σημαντικό ρόλο [9]. Ο ρόλος των άλλων έμφυτη κύτταρα ανοσία είναι πολύ λιγότερο γνωστών και σχεδόν τίποτα δεν είναι γνωστό σχετικά με την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων από άοπλους μακροφάγα ή κοκκιοκύτταρα [10].

Ωστόσο, Cui et al. [11] και Hicks et al. [12] έδειξε ότι τα ποντίκια με ένα SR /CR μετάλλαξη, επιτρέποντας την αναγνώριση των κυττάρων όγκου μέσω ενός μέχρι σήμερα άγνωστου μηχανισμού, σκοτώθηκαν με επιτυχία κύτταρα όγκου.

In vitro

πειράματα απέδειξαν ότι τα κύτταρα του εγγενούς ανοσίας (κύτταρα ΝΚ, μακροφάγα, ουδετερόφιλα) ήταν υπεύθυνοι για τον καρκίνο θανάτωση κυττάρου. Εκμετάλλευση των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (PRR) αγωνιστές για την τόνωση έμφυτη μονοπάτια σηματοδότησης [13] είναι μια άλλη εν μέρει επιτυχής προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου. Συγκρότημα μηχανισμός δράσης αγωνιστή PRR συνίσταται στην παραγωγή ιντερφερόνης τύπου Ι και άλλων προφλεγμονωδών κυτοκινών, ενισχυμένη ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων, η έκκριση του Th1 κυτοκινών, αντιγόνων διασταυρούμενη παρουσίαση, η ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ και η καταστολή των ρυθμιστικών Τ κυττάρων και μακροφάγων που σχετίζονται με όγκο [ ,,,0],14]. Κλινικές μελέτες επικεντρώθηκαν στη χρήση συνθετικών συνδετών των διοδίων-όπως υποδοχείς (TLR) 3,7,9 για τη θεραπεία όγκων [15].

Ωστόσο, εκτός από το γεγονός ότι η ενεργοποίηση των υποδοχέων (κυρίως TLR) οδηγεί σηματοδότησης για δημιουργία ισχυρής απάντησης στο επίπεδο της έμφυτης ανοσίας, ενδοδιηθητικά όγκου κύτταρα του ανοσοποιητικού πρέπει να αναγνωρίσουν τα καρκινικά κύτταρα ως τους πραγματικούς στόχους της επίθεσης τους. Προτείνουμε χειρισμό φαγοκύτταρα (ένα σημαντικό συστατικό της φλεγμονώδους διηθήματος) να είναι σε θέση να βρει τους στόχους τους με σύζευξη αγωνιστές φαγοκυτταρικών υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου για να ληφθεί μια ισχυρή αντικαρκινική δράση. Η επίδραση αυτή μπορεί να ενισχυθεί σημαντικά με την ταυτόχρονη επεξεργασία των υποδοχέων TLR με έναν αγωνιστή (π.χ., LPS).

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες ήταν διεξάγεται σύμφωνα με το δίκαιο της Τσεχικής Δημοκρατίας σχετικά με τη χρήση των πειραματόζωων, την ασφάλεια και τη χρήση των παθογόνων παραγόντων. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Ινστιτούτο Παρασιτολογίας, Κέντρο Βιολογίας της Ακαδημίας Επιστημών της Τσεχικής Δημοκρατίας και θεσμικές και Εθνικές Επιτροπές (πρωτόκολλα αριθ. 138/2008).

Η αναισθησία των ποντικών (που χρησιμοποιείται κατά τη διάρκεια της μεταμόσχευσης του μελανώματος κύτταρα) βασίστηκε σε ενδοπεριτοναϊκή ένεση Ketamine.HCl (75 mg /kg) και Xylazine.HCl (75 mg /kg). Για την επιβίωση ποντικών ανάλυση παρακολουθήθηκαν δύο φορές την ημέρα. Όπου η αύξηση του όγκου περιορισμένη ικανότητα ενός ζώου να κινηθεί κανονικά ή να φάει ή να πιει, στη συνέχεια, τα ποντίκια θυσιάστηκαν μέσω αυχενικής εξάρθρωσης.

Χημικά

Μέσα καλλιέργειας ιστών και τα συμπληρώματα, laminarin από

Laminaria άϊξίίαία

, μαννάνη από

Saccharomyces cerevisiae,

λιποπολυσακχαρίτες (LPS) από το

Escherichia coli

, lipoteichoic οξύ (LTA) από το

Bacillus subtilis

, διθειοθρεϊτόλη (DTT), τρις ​​( 2-καρβοξυαιθυλ) υδροχλωρική φωσφίνη (TCEP), DAPI, και f-MLF (Ν-φορμυλ-methioninyl-λευκυλ-φαινυλαλανίνη) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). 4 – (

N

μαλεϊμιδομεθυλ) κυκλο-hexanecarboxylic-οξύ Ν-υδροξυηλεκτριμιδικού εστέρα (SMCC) αγοράστηκε από την Thermo Scientific (Erembodegem, Belgium). Βιοσυμβατά αγκύρωσης για κυτταρικής μεμβράνης (BAM, Mw 4000) και Ν- (ηλεκτριμιδυλοξυ-γλουταρυλ) -L-α-φωσφατιδυλαιθανολαμίνη, διολέυλο (ϋΟΡΕ) ελήφθησαν από την NOF EUROPE (Grobbendonk, Βέλγιο). συζυγούς αντι-CD11b-FITC λήφθηκε από MACS Miltenyi Biotec.

Monomannosyldekalysine συντέθηκε από Vidia (Πράγα, Τσεχική Δημοκρατία). Mannose- (G)

5- (K)

12, mannose- (G)

5- (K)

10-STE (STE σημαίνει στεατικό οξύ), f-MLF- (G )

5- (K)

12, f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE, MLF- (G)

5- (K)

10-STE, και f-MLFKK συντέθηκαν με Schafer-N (Κοπεγχάγη, Δανία).

Σύνθεση λαμιναρίνη-ΒΑΜ, μαννάνη-ΒΑΜ, f-MLFKK-ΒΑΜ, και f-MLFKK-DOPE

Κατ ‘αρχάς, τόσο αμινωμένος laminarin και μαννάνη παρασκευάζονται με αναγωγική αμίνωση [16]. Laminarin (mannan) διάλυμα σε περιβάλλον οξικού αμμωνίου μειώθηκε κατά νάτριο κυανοβοροϋδρίδιο σε ρΗ 7.5 και 50 ° C για πέντε ημέρες. Διάλυμα περαιτέρω διαπίδυση χρησιμοποιώντας MWCO 3500 σωλήνωση διαπίδυσης (Serva, Heidelberg, Γερμανία) ενάντια σε PBS στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Peptide f-MLFKK περιείχε ήδη μία αμινομάδα.

Η σύνδεση του ΒΑΜ (περιέχει μία αλειφατική αλυσίδα) ή DOPE (δύο αλειφατικές αλυσίδες) για αμινο ομάδα λαμιναρίνη (μαννάνη, f-MLFKK) διεξήχθη σε ρΗ 7,3 σύμφωνα με στην Κάτω et al. [17]. Κατά τη διάρκεια μία ώρα σε θερμοκρασία ομάδα του ΒΑΜ αντίστοιχα δωματίου Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο (NHS). DOPE αντιδρά με αμινομάδα της λαμιναρίνης (μαννάνης), ή με ε-αμινομάδα της λυσίνης, αντίστοιχα. Διαλύματα που λαμβάνονται (σε ​​PBS) αποθηκεύτηκαν κατεψυγμένα στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

Σύνθεση λαμιναρίνη-SMCC, μαννάνη-SMCC, f-MLFKK-SMCC, και τους

in vivo

και

in vitro

εφαρμογή

Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Thermo Scientific, Pierce πρωτεΐνη Βιολογία Προϊόντα), παρόμοια με την προηγούμενη παράγραφο, NHS ομάδα του SMCC αντιδρά με αμινομάδα αμινωμένων laminarin και μαννάνη, ή με ε-αμινομάδα της λυσίνης σε f-MLFKK (ισομοριακές ποσότητες) αντιστοίχως. Για να εγγυηθεί πρόσδεσης του SMCC που περιέχουν προσδέματα σε καρκινικά κύτταρα, ήταν αναγκαίο να διασφαλίζει την ύπαρξη -SH ομάδων επί των κυττάρων. Είναι πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με Christiaansen et al. [18] με αναγωγή της κυστίνες. Στις

in vivo

πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε 50 mM TCEP διαλύματος σε PBS για το σκοπό αυτό. Αυτό το διάλυμα εγχύθηκε εντός του όγκου (ε.τ.) μία ώρα πριν από την εφαρμογή του λαμιναρίνη-SMCC, μαννάνη-SMCC ή f-MLFKK-SMCC διαλύματα (σε PBS). Σε

in vitro

πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε 5 mM διαλύματος TCEP σε PBS και μία ώρα επώασης σε πάγο.

Οι κυτταρικές σειρές και τα ποντίκια

ποντικού κύτταρα μελανώματος Β16-F10 και περιτοναϊκά μακροφάγα PMJ2R αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS, ΡΑΑ, Αυστρία) και αντιβιοτικά. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5% διοξείδιο του άνθρακα.

Θηλυκά SPF C57BL /6 ποντικοί ελήφθησαν από την Charles River Laboratories (Sulzfeld, Γερμανία). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε πλαστικά κλουβιά με κλινοσκεπάσματα ξύλο-chip που βρίσκεται σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο ελεύθερο δωμάτιο με σταθερή θερμοκρασία 22 ° C και σχετική υγρασία 65%. Pellet δίαιτα και νερό αποστειρώθηκαν. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε μια 12/12-ωρη φωτοπερίοδο περιβάλλον με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Οι ποντικοί που ζυγίζουν 18-20 g χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα.

μεταμόσχευση του όγκου

4 × 10

5 Β16-Ρ10 κύτταρα ανά ποντικό σε 0,1 ml RPMI χωρίς FCS εμβολιάσθηκαν υποδορίως (sc) σε ένα ξυρισμένο περιοχή στη δεξιά πλευρά.

επεξεργασία και αξιολόγηση της θεραπείας

τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες δώδεκα ημέρες μετά τη μεταμόσχευση του όγκου. Θεραπείες άρχισε αμέσως (εντός του όγκου εφαρμογές 50 μΙ αντίστοιχες λύσεις). Από αυτή τη στιγμή, οι ποντικοί κρατήθηκαν ατομικά.

Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα χρησιμοποιώντας παχύμετρο. Όγκος υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] χρησιμοποιώντας τον τύπο V = π /6 AB

2 (Α δηλώνει η μεγαλύτερη διάσταση του μάζας του όγκου και το Β σημαίνει τη μικρότερη διάσταση).

μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου ( %)

Μείωση της ανάπτυξης του όγκου (σε σύγκριση με τον έλεγχο) προσδιορίστηκε ως εξής:

η μέση (σε ποσοστό%) των τιμών που μετρήθηκαν τις ημέρες 4, 6, 8, 10, 12 και 14 μετά την έναρξη της θεραπείας υπολογίστηκε και επισημαίνονται ως «σημαίνουν μείωση της ανάπτυξης του όγκου».

Ανάλυση του διηθήματος των κυττάρων μέσω κυτταρομετρίας ροής. Cytokine δοκιμασία

Ο όγκος αποκόπηκε από το ποντίκι που υπέστησαν ευθανασία μέσω αυχενικής εξάρθρωσης. Αυτό στη συνέχεια πλύθηκε ήπια με ψυχρό RPMI 1640, κομμένο σε μικρά κομμάτια και τοποθετήθηκε σε 1 ml κρύο RPMI 1640 που περιείχε 0,33 mg /ml Liberase DL και 0,2 mg /ml ϋΝάσης Ι (και τα δύο Roche Diagnostics, Germany). Μετά από 1 ώρα επώαση σε περιστροφικό αναδευτήρα στους 37 ° C, συστάδες των αδρανών ιστού φυγοκεντρήθηκαν σε 160

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για την IL-1 βήτα, TNF άλφα, IL-6, (ELISA, eBioscience), και IL-8 (R &? D Systems) προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Το σφαιρίδιο που προέκυψε ήπια διέρχεται μέσω ενός πλαστικού σουρωτήρι (70 μm, BD Biosciences, USA) σε ψυχρό PBS (ρΗ 7,3) και πλύθηκαν με φυγοκέντρηση σε 160

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων (Corning Incorporated, USA) και αναλύθηκαν μέσω κυτταρομετρίας ροής.

Τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα διάλυμα προ-αραιωμένου ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν αντιγόνα επιφανείας ποντικού (όλα eBioscience, USA) σε PBS για 20 λεπτά στους 4 ° C. Στο κυτταρικό εναιώρημα που λαμβάνεται από τον όγκο, τα ακόλουθα υποτύπων λευκοκυττάρων προσδιορίστηκαν: λευκοκύτταρα (αντι-CD45 Mouse PerCP-Cy5.5? Κλώνος 30-F11? 0,2 mg /ml), Β κύτταρα (αντι-CD19 APC Mouse? Κλώνος eBio1D3 ? 0,2 mg /ml), τα Τ κύτταρα (αντι-Mouse FITC CD3e? κλώνος 145-2C11? 0,5 ​​mg /ml), CD4 + Τ κύτταρα (αντι-Ποντικού CD4 APC? κλώνος GK1.5? 0,2 mg /ml), CD8 + Τ κύτταρα (αντι-Ποντικού CD8a? κλώνος 53-6.7? 0,2 mg /ml), κύτταρα ΝΚ (αντι-Ποντικού ΝΚ1.1 ΡΕ? κλώνος ΡΚ136? 0,2 mg /ml), κοκκιοκύτταρα (αντι-Ποντικού Ly-6G (Gr-1 ) Alexa Fluor 700? κλώνος RB6-8C5? 0,2 mg /ml) και τα μονοκύτταρα /μακροφάγα (κύτταρα MF) (αντι-Ποντικού F4 /80 αντιγόνου PE-Cy7? κλώνος BM8? 0,2 mg /ml). Τα επισημασμένα δείγματα κυττάρων πλύθηκαν δύο φορές σε PBS με φυγοκέντρηση στα 160

g

για 2 λεπτά στους 4 ° C και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή BD FACSCanto II κυτταρόμετρο (BD Biosciences, USA), εξοπλισμένο με δύο λέιζερ με δυνατότητες διέγερση στα 488 nm και 633 nm. Είκοσι χιλιάδες γεγονότα μετρήθηκαν σε κάθε εναιώρημα σε τρία ανεξάρτητα επαναλήψεις. Τα επισημασμένα κυτταρικοί πληθυσμοί αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό BD FACSDiva 6.1.3. Απόλυτους αριθμούς των υποσυνόλων λευκοκυττάρων προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας CountBright

TM απόλυτη χάντρες καταμέτρηση (Invitrogen, USA). Ο έλεγχος όλων των ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων που αναγνωρίζουν αντιγόνα επιφανείας ποντικού διεξήχθη σε δείγμα σπληνοκυττάρων σε κάθε διάστημα του πειράματος. καταμέτρηση των κυττάρων υπολογίστηκε εκ νέου και εκφράζεται ως κύτταρα /mm

3 του καρκινικού ιστού.

Ιστολογίας

Οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν με 4% ουδέτερο διάλυμα φορμαλδεΰδης. Παραφίνη μπλοκ ήταν προετοιμασμένοι. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη /ηωσίνη.

Lung μεταστάσεις

Πνεύμονες σταθεροποιήθηκαν με 4% ουδέτερο διάλυμα φορμαλδεΰδης εξετάστηκαν με τη βοήθεια ενός μικροσκοπίου ανατομής. Η παρουσία των μεταστάσεων (μαύρα σημεία) εκτιμήθηκε.

In vitro

ανάλυση της κυτταροτοξική δράση των μακροφάγων που ενεργοποιούνται από ένα πρόσδεμα TLR σε κύτταρα μελανώματος που φέρουν υποδοχείς φαγοκυτταρικά

Η δοκιμασία με βάση την αρχή που περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ποντικού κύτταρα μελανώματος Β16-Ρ10 αναπτύσσονται σε συρροή σε 96 πλάκα καλλιέργειας ιστού φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark) επωάστηκαν (30 λεπτά, 37 ° C) με ένα διάλυμα φαγοκυτταρικής αγωνιστών υποδοχέων (0,02 mM λαμιναρίνη-ΒΑΜ ή 0,02 mM mannan- BAM ή 0,05 mm f-MLFKK-ΒΑΜ σε μέσο καλλιέργειας) και στη συνέχεια πλένονται. Κύτταρα ποντικού κυτταρική γραμμή μακροφάγων PMJ2R προεπωάστηκαν με LPS (1 μg /ml) για 2 ώρες στους 37 ° C, κατόπιν πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640, 10% FCS και προστέθηκε σε Β16-F10 σε αναλογία 5:01 . Αυτό το μίγμα επωάστηκε για 4 ώρες στους 37 ° C. Μετά την επώαση, PMJ2R και τα νεκρά κύτταρα πλύθηκαν προσεκτικά off. Ζώντας Β16-Ρ10 κύτταρα μελανώματος απελευθερώθηκαν από θρυψινοποίηση. Trypan blue εξαιρουμένων κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν με ένα αιμοκυτταρόμετρο.

Cell Signaling

2 × 10

5 του καθενός, Β16-Ρ10 κύτταρα και PMJ2R σπάρθηκαν μαζί με την παρουσία λαμιναρίνη-ΒΑΜ , χρησιμοποιήθηκαν ή Β16-Ρ10 κυττάρων με ομοιοπολικά δεσμευμένη λαμιναρίνη-SMCC. Μετά από προκαθορισμένο χρόνο επώασης τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (1% Nonidet Ρ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, και 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5)) με την παρουσία του αναστολείς πρωτεάσης (10 μg /ml απρωτινίνη, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 1 μg /ml πεπστατίνη) και αναστολείς φωσφατάσης (25 mM φθοριούχο νάτριο και 2 mM ορθοβαναδικό νάτριο). Τα κυτταρολύματα αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 4χ Laemmli, από πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Immobilon-P. Τα στυπώματα επωάστηκαν με αντι-φωσφο-NF-κΒ ρ65 (Ser536, Cell σηματοδότηση) και με αντι-β-ακτίνης Santa Cruz Biotechnology) αντίσωμα σε αραίωση 1:1000. Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγειας, Pierce), και η αφθονία τους προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα εικόνας CCD (ChemiDoc

TM System MP απεικόνισης, ΒΙΟ-RAD) και το λογισμικό ImageLab.

Δυνατότητα BAM και DOPE για την αγκύρωση των μορίων σε κυτταρικές μεμβράνες

Σύζευξη BAM ή DOPE με Β-φυκοερυθρίνη (ΡΕ) διεξήχθη σε ρΗ 7,3 στο σκοτάδι, όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. Μία ώρα διαρκεί αλληλεπιδράσεις ΡΕ-ΒΑΜ, ΡΕ-DOPE και ΡΕ με 1 × 10

5 κύτταρα μελανώματος διεξήχθησαν στους 37 ° C στο σκοτάδι εις τριπλούν. Μετά από φυγοκέντρηση (2 λεπτά. 4 ° C, 400 g) υπερκείμενα συλλέχθηκαν και ο φθορισμός του μετρήθηκε με άπειρη M200 αναγνώστη (Tecan, Ελβετία) σε 545 nm.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δύο tailed t-test του Student. επιβίωση του ποντικιού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Kaplan-Meier (MedCalc).

Αποτελέσματα

Η επίδραση των laminarin στη θεραπεία του καρκίνου

Η επίδραση της αγκυροβολημένα laminarin (laminarin-BAM) για την ανάπτυξη του όγκου και η συνέργεια του με LPS.

μελανώματος Β16-Ρ10 μεταμοσχεύθηκε σε 20 ποντικούς C57BL /6. Δώδεκα ημέρες μετά από αυτό, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε τέσσερις ομάδες που περιέχουν πέντε ποντικούς η καθεμία. Την ημέρα αυτή, ο όγκος του όγκου μετρήθηκε και θεραπεία όγκου άρχισε αμέσως μετά. Όπως δείχνει το Σχήμα 1Α, laminarin-ΒΑΜ δεν είχε σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου. Η επίδραση του LPS ήταν στατιστικά σημαντική με αποτέλεσμα το 63,2% μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για τον υπολογισμό της μέσης μείωση της ανάπτυξης του όγκου). Ο συνδυασμός των laminarin-ΒΑΜ και LPS έδειξε συνεργιστική και ισχυρή μείωση της ανάπτυξης του όγκου (μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου ήταν 90,2% σε σύγκριση με τον έλεγχο). Παρατηρήσαμε ότι το 60% των όγκων εξαφανίστηκε προσωρινά ή συρρίκνωση του μεγέθους του όγκου συνέβη. Μείωση της ανάπτυξης του όγκου ήταν στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με τον έλεγχο και με την επίδραση του ατόμου (λαμιναρίνη-ΒΑΜ, LPS) συστατικά. Όσον αφορά την επιβίωση, παράταση της στην περίπτωση μείγματος λαμιναρίνη-ΒΑΜ /LPS δεν ήταν στατιστικά σημαντική.

C57BL /6 ποντίκια (θηλυκά) εμβολιάστηκαν με 4 × 10

5 κύτταρα μελανώματος Β16-Ρ10 ποντικού ανά ποντικό σε 0,1 ml RPMI υποδορίως σε ένα ξυρισμένο περιοχή στη δεξιά πλευρά. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες των 5-6 δώδεκα ημέρες μετά τη μεταμόσχευση του όγκου. Θεραπείες άρχισε αμέσως από ενδοογκική εφαρμογές 50 μΙ των αντίστοιχων διαλυμάτων και συνεχίστηκε κάθε δεύτερη ημέρα επί 10 ημέρες (6 μαζί δόσεις). Μετά τη θεραπεία είχε αρχίσει, τα ποντίκια κρατήθηκαν χωριστά. Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα επί 14 ημέρες και ο όγκος τους υπολογίστηκε. (Α) είναι αγκυροβολημένα laminarin (laminarin-ΒΑΜ). Ομάδες των 5 ποντικών ελήφθησαν 0.2 mM laminarin-ΒΑΜ σε PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), μίγμα 0.2 mM λαμιναρίνη-ΒΑΜ και LPS (0.5 mg /ml) σε PBS, και μόνο PBS. (Β) είναι αγκυροβολημένα μαννόζη. Ομάδες των 6 ποντικών που λαμβάνεται 3 mM mannose- (G)

5) – (Κ)

10-STE σε PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), μίγμα από 3 mM mannose- (G)

5- (Κ)

10-STE και LPS (0.5 mg /ml) σε PBS, και μόνο PBS. (C) είναι αγκυροβολημένα μαννάνη. Ομάδες των 5 ποντικών ελήφθησαν 0.2 mM μαννάνη-ΒΑΜ σε PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), μίγμα 0.2 mM μαννάνη-ΒΑΜ και LPS (0.5 mg /ml) σε PBS, και μόνο PBS. (D) είναι αγκυροβολημένα formylpeptide αγωνιστή υποδοχέα από oligolysin. Ομάδες των 6 ποντικών ενέθηκαν με 3 mM f-MLF- (G)

5- (Κ)

12 σε PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), μίγμα από 3 mm f-MLF- (G )

5- (Κ)

12 και LPS (0.5 mg /ml) σε PBS, και μόνο PBS. (Ε) είναι αγκυροβολημένα formylpeptide αγωνιστή των υποδοχέων από το στεατικό οξύ. Το ίδιο καθεστώς όπως στο (Δ), 3 mm f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE χρησιμοποιούνται αντί των 3 mm f-MLF- (G)

5- ( K)

12. * P ≤ 0,05, ** P≤0.01, *** P≤0.005, **** P≤0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο ■ p ≤ 0,05, ■■ P≤0.01, ■■■ P≤0.005 σε σύγκριση με LPS oP≤ 0.05, ooP≤0.01, oooP≤0.005 σε σύγκριση με το συνδετήρα.

η

Συνέργεια του laminarin-ΒΑΜ με LPS, διάφορα καθεστώτα της αίτησης.

Μια σειρά πειραμάτων παρόμοια με την παραπάνω ανέφερε ένα πραγματοποιήθηκαν. Βελτιστοποίηση του χρόνου εφαρμογής του φαρμάκου μελετήθηκε. Ένα μίγμα από 0,2 mM λαμιναρίνη-ΒΑΜ και LPS (0.5 mg /ml) σε PBS χρησιμοποιήθηκε. Τα αποτελέσματα δίνονται στον Πίνακα 1, τονίζοντας την ουσιαστική σημασία των βραχυπρόθεσμων αλλά επαρκώς αποτελεσματική θεραπεία.

Η

Χρήση άλλο μέσο πρόσδεσης στην κυτταρική επιφάνεια λαμιναρίνη.

άμεση ομοιοπολική

in vivo

πρόσδεση του λαμιναρίνη-SMCC στα κύτταρα (με προηγούμενη αναγωγή του κυστίνες με TCEP) εφαρμόστηκε. Laminarin-SMCC (0,2 mM) χορηγήθηκε μαζί με LPS (0,5 mg /ml). Αυτή η θεραπεία προκάλεσε ισχυρότερη μείωση της ανάπτυξης του όγκου από λαμιναρίνη-ΒΑΜ /LPS, ωστόσο αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Μείωση (TCEP) και SMCC δεσμευτική δεν επηρέασε την ανάπτυξη του όγκου.

Τα πειράματα ελέγχου.

Για να αποδείξει την αναγκαιότητα της laminarin αγκύρωσης σε καρκινικά κύτταρα, χωρίς laminarin χρησιμοποιήθηκε αντί του laminarin-ΒΑΜ. Laminarin δεν μειώνουν την ανάπτυξη του όγκου και το μείγμα της με LPS δεν έδειξαν σημάδια της προσθετικότητας ή συνέργειας. Η ανάπτυξη του όγκου αναγωγική δράση του μίγματος αυτού αντιστοιχεί στην δραστικότητα του LPS μόνο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Άγκυρα και μόνο (λυσίνη-ΒΑΜ) δεν αποκάλυψε καμία αντικαρκινική δράση και το μείγμα της με LPS δεν έδειξαν σημάδια προσθετικότητα ή συνέργια καθώς και.

Η επίδραση των μορίων με τερματικό μαννόζη στη θεραπεία του καρκίνου

Σημασία της μαννόζης αγκύρωσης, η επιρροή των LPS.

Α 3 mM διαλύματος μαννόζης σε PBS δεν μείωσαν την ανάπτυξη του όγκου όταν εφαρμόζεται κάθε δεύτερη ημέρα, έξι ενέσεις συνολικά. Η προσθήκη LPS (0,5 mg /ml) δεν προκάλεσε καμία προσθετικότητα ή συνέργια, το μείγμα μειωμένη ανάπτυξη του όγκου ακόμη και λιγότερο από LPS μόνο. καρκινικά κύτταρα είναι σημαντικά αρνητικά φορτισμένα, έτσι ώστε να μελετηθεί η αλληλεπίδρασή τους με θετικά φορτισμένα μαννόζη-K

10, που περιέχει δέκα κατάλοιπα λυσίνης αλυσίδας. Μαννόζης-K

10 σε 3 mM συγκέντρωση δεν επηρέασε την ανάπτυξη του όγκου και την προσθήκη του LPS (0,5 mg /ml) δεν προκάλεσε η προσθετικότητα ή συνέργια. Ένα χαμηλό αποτέλεσμα (32,7% μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο) σημειώθηκε με τη χρήση 3 mM διάλυμα mannose- (G)

5) – (Κ)

12) σε PBS, δηλαδή ένωσης με 5 γλυκίνη spacer υπόλειμμα μεταξύ του συνδετήρα και αγκύρωσης μέρος του μορίου. Η μείωση αυτή ήταν στατιστικώς σημαντική (σε σύγκριση με τον έλεγχο) μόνο την 6η ημέρα της θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η προσθήκη ενός λιπόφιλου άγκυρας (mannose- (G)

5- (Κ)

10) -STE) οδήγησε σε περαιτέρω μείωση της ανάπτυξης του όγκου. Ένα διάλυμα αυτής της ένωσης σε PBS (3 mM) προκάλεσε μία στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου (Σχήμα 1Β). Μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου ήταν 75,6%. Η προσθήκη LPS (0,5 mg /ml) δεν προκάλεσε καμία προσθετικότητα ή συνέργια, αντιστρόφως, η μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου μειώθηκε σε 71,2%. Η επίδραση του LPS μόνο παρέμεινε η ισχυρότερη. Τα ποντίκια θανατώθηκαν 14 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας. Το διάλυμα του mannose- (G)

5- (Κ)

10-STE πλήρως κατασταλεί εμφάνιση μεταστάσεων. Επίπτωση και ένταση των μεταστάσεων συνοψίζονται στον Πίνακα 2.

Η

Η επίδραση του αγκυρωμένου μαννάνη (μαννάνη-ΒΑΜ) επί της ανάπτυξης του όγκου και η συνέργεια του με LPS.

ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με μαννάνη -BAM, LPS και ένα μίγμα των δύο (Σχήμα 1 C). Mannan-ΒΑΜ προκάλεσε ένα ασθενές (50,5%), αλλά στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου. Η επίδραση του LPS ήταν ελαφρώς υψηλότερη (μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου ήταν 63,2%). Ένας συνδυασμός και των δύο ενώσεων προκάλεσε μια ισχυρή συνεργική μείωση της ανάπτυξης του όγκου (88,6% σε σύγκριση με τον έλεγχο) και οι όγκοι εξαφανίστηκαν χρονικά στο 80% των ποντικών. Η μείωση της αύξησης του όγκου που προκαλείται από μίγμα μαννάνη-ΒΑΜ /LPS ήταν αρχικά στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με τα δύο ελέγχου και δύο μεμονωμένων συστατικών του μείγματος, αργότερα μόνο με τον έλεγχο. Παράταση της επιβίωσης ποντικών, που προκαλείται από τη θεραπεία με το μίγμα της μαννάνης-ΒΑΜ /LPS, δεν ήταν στατιστικά σημαντική.

Synergy μαννάνης-ΒΑΜ με LPS, διάφορα καθεστώτα εφαρμογής.

Ένα βέλτιστο καθεστώς αυτό θα επιτευχθεί καλύτερα με παλμό ενδοογκική εφαρμογή 50 μΙ 0,2 mM μαννάνη-ΒΑΜ και LPS (0,5 mg /ml) μίγματος τις ημέρες 0, 1, 2. 8, 9, 10,16, 17, 18,24, 25, 26 . Το καθεστώς αυτό προκάλεσε όχι μόνο σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου (94,7%), αλλά επίσης στατιστικά σημαντική παράταση της επιβίωσης (P≤0.005), βλέπε Εικόνα 2. παρατηρήθηκε ποσοστό επιβίωσης 80% για 100 ημέρες.

Μείγμα 0,2-ΒΑΜ και LPS (0,5 mg /ml) σε PBS εφάρμοσε στο καθεστώς παλμό (ημέρες 0,1,2. 8,9,10.16,17,18.24,25,26). Τόσο θεραπεία και ομάδα ελέγχου περιείχαν 5 ποντικούς η κάθε μία. *** Υποδεικνύει P≤0.005 σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

Χρήση άλλο τρόπο μαννάνης πρόσδεσης στην κυτταρική επιφάνεια.

άμεση ομοιοπολική

in vivo

πρόσδεση του 0.2 mM μαννάνη-SMCC σε κύτταρα (μειωμένο κυρίως από TCEP) ελέγχθηκε. Mannan-SMCC χορηγήθηκε μαζί με LPS (0,5 mg /ml). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, παρατηρήθηκαν υψηλά μείωση της ανάπτυξης του όγκου και υψηλή αναλογία των ποντικών με όγκους προσωρινής εξανεμίζεται. Η χρήση των τεσσάρων θεραπευτικών παλμών του μίγματος μαννάνη-SMCC /LPS προκάλεσε σχεδόν στατιστικά σημαντική παράταση της επιβίωσης. Μόνο σε αυτή την περίπτωση, η επιβίωση παρατηρήθηκε περισσότερο από 100 ημέρες.

Η

Τα πειράματα ελέγχου.

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, δωρεάν μαννόζη δεν μειώνουν την ανάπτυξη του όγκου. το μείγμα της με LPS επίσης δεν έδειξαν σημάδια προσθετικότητας ή συνέργειας, όλη η δραστηριότητα μειώνοντας όγκου του μίγματος αντιστοιχεί στην επίδραση του LPS μόνο. Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν με ελεύθερο μαννάνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δοκιμή νέων αρχών αγκύρωσης (ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, μείωση των κυττάρων από TCEP και SMCC δεσμευτική) δεν αποκάλυψε καμία αντικαρκινική δράση και συνδυασμό με LPS δεν έδειξαν σημάδια της προσθετικότητας ή συνέργειας, καθώς και. BAM αγκύρωσης δεν αποκάλυψε καμία αντικαρκινική δράση, όπως είχε ήδη περιγραφεί. Οσον αφορά το (G)

5- (Κ)

10-STE, όπως περιγράφεται παρακάτω, δεν αντικαρκινική δράση συνδέθηκε με αυτό το είδος της αγκύρωσης, καθώς και.

Η επίδραση της formylpeptide αγωνιστών υποδοχέα στον καρκίνο θεραπείας

Σημασία της αγκύρωσης των formylpeptide αγωνιστές των υποδοχέων.

Η επίδραση του LPS. Στο πρώτο πείραμα, οι αγωνιστές του formylpeptide υποδοχείς συνδέθηκαν στην επιφάνεια του κυττάρου όγκου επί τη βάσει της αλληλεπίδρασης φορτίου όπως ήδη αναφέρθηκε παραπάνω. f-MLF- (K)

12 χρησιμοποιήθηκε σαν ένας αγωνιστής. Ακόμη και σε 3 mM συγκέντρωση, δεν μειώνουν την ανάπτυξη του μελανώματος. Το αποτέλεσμα αγωνιστή ενισχύθηκε με τη χρήση ενός αποστάτη (5 γλυκίνης αλυσίδα υπολειμμάτων), η οποία επιτρέπει μεγαλύτερη ευελιξία της τερματικής ομάδας f-MLF. Η δομή της ανωτέρω ένωση ήταν f-MLF- (G)

5- (Κ)

12. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, το F-MLF- (G)

5- (Κ)

12 διάλυμα που προκαλούνται αδύναμο, αλλά παρ ‘όλα αυτά στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου (μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου ήταν 59,7%), η οποία ενισχύθηκε σημαντικά με την προσθήκη του LPS στο 78,3% μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου. Το F-MLF- (G)

5- (Κ)

12 αλληλεπίδραση /LPS θα πρέπει να θεωρείται ελαφρώς πρόσθετο, ως μίγμα τους έδειξε μόνο μια ελαφρώς υψηλότερη δράση από την πιο αποτελεσματικό συστατικό του μίγματος.

Το μόριο της formylpeptide αγωνιστή τροποποιήθηκε περαιτέρω. αλληλεπιδράσεις χρέωση συνδέθηκαν με αγκύρωση των αλειφατικών αλυσίδων σε λιπίδια στρώμα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Η δομή αυτής της ένωσης ήταν f-MLF- (G)

5- (Κ)

10-STE. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 1Ε, f-MLF- (G)

5- (Κ)

10-STE δρα συγκριτικά (55,0% μέση μείωση της ανάπτυξης του όγκου) ως την ένωση χωρίς στεατικό οξύ, που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενο πείραμα ( 59,7%). Συνδυασμός f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE με LPS οδήγησε σε μια ισχυρή συνεργική δράση, δείχνοντας αξιοσημείωτη μείωση της ανάπτυξης του όγκου (98,7%). Αυτή η μείωση ήταν στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με τα δύο συστατικά του μίγματος. Οι όγκοι σε πέντε από έξι ποντικούς (83,3%) εξαφανίστηκαν προσωρινά. Η αύξηση του χρόνου επιβίωσης στην ομάδα αυτή ήταν στατιστικά σημαντική (p ≤ 0,05).

Η χρήση άλλων τρόπων σύνδεσης του f-MLF στην κυτταρική επιφάνεια.

Μια σειρά από πειράματα αποκάλυψαν ότι αγκυροβολημένα 0,5 mm f-MLF κίνητρο σε μίγμα με LPS (0,5 mg /ml) είναι επαρκής για την ισχυρή μείωση της ανάπτυξης του όγκου. Χρησιμοποιώντας αυτές τις συγκεντρώσεις και διάφορους τρόπους αγκύρωσης και το χρονοδιάγραμμα πραγματοποιήσαμε πειράματα με στόχο να βρείτε τις καλύτερες προϋποθέσεις για την ισχυρότερη αντικαρκινική δράση.

Είναι

Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 4. Τα πειράματα επιβεβαίωσαν την ουσιαστική σημασία της μικρής αλλά αρκετά αποτελεσματική αρχική θεραπεία, όπου το μίγμα των 0,5 mm f-MLFKK-DOPE και LPS (0.5 mg /ml) αποδείχθηκε ότι είναι η καλύτερη. 60% των ποντικών που υπέστησαν αγωγή με αυτό τον τρόπο επέζησαν 100 ημέρες, ζουν περαιτέρω χωρίς παθολογικά συμπτώματα.

Η

Τα πειράματα ελέγχου.

Ελεύθερη 3 mm f-MLF δεν παρουσίασαν καμία μείωση της ανάπτυξης του όγκου και η δραστικότητα μείωσης του μίγματος του με LPS αντιστοιχεί στην δραστικότητα του LPS μόνο. Τα δεδομένα δεν δείχνονται. Άγκυρες (ϋΟΡΕ όπως λυσίνη-ναρκωτικές ουσίες, (G)

5- (K)

10-STE ως ανοσολογικά αδρανής MLF- (G)

5- (K)

10-STE) δεν δείχνουν καμία αντικαρκινική δραστικότητα και συνδυασμούς με LPS δεν έδειξαν σημάδια προσθετικότητας ή συνέργειας.

Ανάλυση του κυττάρου διεισδύουν σε όγκους μέσω κυτταρομετρίας ροής. δοκιμασίες κυτοκίνης

Τρία πειράματα του ίδιου σχεδιασμού διεξήχθησαν με τρία διαφορετικά προσδέματα φαγοκυτταρικά υποδοχέα:. λαμιναρίνη-ΒΑΜ, μαννάνη-ΒΑΜ και f-MLFKK-ΒΑΜ μόνη ή σε συνδυασμό με LPS

όλα τα πειράματα 3 ποντίκια από κάθε ομάδα (βλέπε λεζάντα στα σχήματα 3, 4, 5, 6) σκοτώθηκαν σε διαστήματα 12, 24 και 48 ωρών (3 ποντίκια ελέγχου θανατώθηκαν σε χρόνο 0). Τα κύτταρα για κυτταρομετρία ροής και τα υπερκείμενα για ELISA παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν.

Ομάδες 9 ποντικών έλαβαν μια μόνο δόση από 0,2-ΒΑΜ σε PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), μίγμα 0.2 mM λαμιναρίνη-ΒΑΜ και LPS (0.5 mg /ml) σε PBS, και μόνο PBS σε 50 μΐ αυτό 3 ποντίκια από κάθε ομάδα θανατώθηκαν σε 12, 24 και 48 ώρες διαστήματα, τα κύτταρα από εκτομή όγκων παρασκευάστηκαν με ενζυματική κατεργασία (Liberase DL και DNase Ι) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Για αντι-Ποντικού Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 χρησιμοποιήθηκε ανίχνευση κοκκιοκυττάρων.

Η

Ομάδες 9 ποντικών έλαβαν μια μόνο δόση από 0,2-ΒΑΜ σε PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), μίγμα 0.2 mM μαννάνη-ΒΑΜ και LPS (0.5 mg /ml) σε PBS, και μόνο PBS σε 50 μΐ αυτό 3 ποντίκια από κάθε ομάδα θανατώθηκαν σε 12, 24 και 48 ώρες διαστήματα, τα κύτταρα από εκτομή όγκων παρασκευάστηκαν με ενζυματική κατεργασία (Liberase DL και DNase Ι) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα ακόλουθα επισημασμένα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: (Α) αντι-Ποντικού Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 για την ανίχνευση κοκκιοκυττάρων, (Β) αντι-Ποντικού CD19 APC για την ανίχνευση των Β λεμφοκυττάρων και (C) αντι-Ποντικού ΝΚ1. 1 ΡΕ για κύτταρα ΝΚ.

Η

Ομάδες 9 ποντικών έλαβαν μια μόνο δόση των 0,5-MLFKK-ΒΑΜ, LPS (0,5 mg /ml), μίγμα 0,5 mm f-MLFKK-ΒΑΜ και LPS ( 0,5 mg /ml), και PBS μόνο σε 50 μλ αυτό Παρασκευή κυτταρικού εναιωρήματος και χρώση κοκκιοκυττάρων πραγματοποιήθηκαν όπως στο σχήμα 3.

Η

Ομάδες 9 ποντικών έλαβαν μια μόνο δόση των 0,5-MLFKK-ΒΑΜ, LPS (0,5 mg /ml), μίγμα 0,5 mM f-MLFKK-ΒΑΜ και LPS (0.5 mg /ml), και PBS μόνο σε 50 μλ αυτό 3 ποντίκια από κάθε ομάδα θανατώθηκαν σε 12, 24 και 48 ώρες διαστήματα. Μετά την παρασκευή των κυττάρων από εκτομή όγκων, που αντιστοιχούν υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της IL-1 βήτα. Οι IL-1 βήτα επίπεδα εκφράζονται ως pg IL-1 βήτα /mm

3 του ιστού του όγκου.

Η

Θεραπεία βασίζεται στη χρήση του λαμιναρίνη-ΒΑΜ, LPS και μίγμα τους.

οι αλλαγές στον αριθμό των κοκκιοκυττάρων (GR1 +) μόνο παρατηρήθηκαν στην περίοδο παρακολούθησης. Δύο ανεξάρτητα πειράματα εκτελέστηκαν. [24].