Αφηρημένο

Μεταξύ των πολλών εντοπίστηκαν γονίδια ανδρογόνων-ρυθμίζονται, sGCα1 (διαλυτές γουανυλυλ κυκλάσης α1) φαίνεται να παίζει καθοριστικό ρόλο στην μεσολάβηση των προ-καρκινικών επιδράσεων των ανδρογόνων και τον υποδοχέα ανδρογόνων. Το κλασικό ρόλος για sGCα1 είναι να ετεροδιμερίζονται με την υπομονάδα sGCβ1, σχηματίζοντας sGC, το ένζυμο που μεσολαβεί σηματοδότηση νιτρικού οξειδίου με κατάλυση της σύνθεσης της κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης. δημοσιευμένα στοιχεία μας δείχνουν ότι sGCα1 μπορεί να οδηγήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη από ορμόνη και να παρέχουν καρκινικά κύτταρα μια λειτουργία προ-επιβίωσης, μέσω ενός νέου μηχανισμού για την αναστολή ρ53, δύο από τα οποία είναι ανεξάρτητα από sGCβ1, ΝΟ και cGMP. Όλες αυτές οι ιδιότητες καθιστούν sGCα1 ένα σημαντικό νέο στόχο για θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Έτσι, τα πεπτίδια σχεδιάστηκαν με στόχο sGCα1 με σκοπό να διαταράξουν δραστηριότητες προ-Cancer Αυτό πρωτεΐνης. Ένα πεπτίδιο (Α-8R) προσδιορίστηκε να είναι ισχυρή κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα καρκίνου προστάτη, ταχέως επάγει απόπτωση. Η κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε και στα δύο ορμονικά εξαρτώμενο και, σημαντικά, ορμόνη-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη κύτταρα, ανοίγοντας την πιθανότητα ότι αυτό το πεπτίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της συνήθως θανατηφόρος ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. Σε μελέτες ξενομοσχεύματος ποντικού, Πεπτίδιο Α-8R ήταν σε θέση να σταματήσει την ανάπτυξη του όγκου του όχι μόνο εξαρτώνται από τις ορμόνες κύτταρα, αλλά το πιο σημαντικό από μη-ορμονικής κύτταρα. Επιπλέον, ο μηχανισμός του Πεπτιδίου Α κυτταροτοξικότητα είναι η παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου, τα οποία έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως ένα σημαντικό τρόπο δράσεως των σημαντικών φαρμάκων κατά του καρκίνου. Έτσι, το παρόν έγγραφο παρέχει ισχυρά αποδεικτικά στοιχεία ότι η στόχευση σημαντικό AR-ρυθμιζόμενο γονίδιο είναι ένα νέο πρότυπο για την αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Gao S, Hsieh CL, Bhansali Μ, Kannan Α, Shemshedini L (2013) Ένα πεπτίδιο κατά Διαλυτό guanylyl Κυκλάσης α1: Μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (5): e64189. doi: 10.1371 /journal.pone.0064189

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 18 του Ιαν του 2013? Αποδεκτές: 13 Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 27, 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ένα σημαντικό ιστό-στόχο των ανδρογόνων και τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) είναι ο προστάτης. Όπως και η ανάπτυξη του φυσιολογικού προστάτη, η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη είναι επίσης εξαρτώνται από ανδρογόνα και AR [1]. Σε αμφότερες τις φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη και του προστάτη καρκινογένεση, ανδρογόνα και το AR είναι σημαντικές στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και την επιβίωση των κυττάρων του προστάτη. [2] Ανδρογόνων εκτομή με ευνουχισμό σε αρουραίους οδηγεί σε μείωση του πολλαπλασιασμού και αυξημένη απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων του αυλού του προστάτη, με αποτέλεσμα την παλινδρόμηση του προστάτη αδένα. Όταν τα φυσιολογικά επίπεδα ανδρογόνων αντικατασταθεί σε ευνουχισμένους αρουραίους, προστάτη πολλαπλασιασμός των επιθηλιακών κυττάρων είναι αυξημένη και απόπτωση μειώνεται, οδηγώντας σε ανασύσταση ενός φυσιολογικού προστάτη [3]. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι η μετάλλαξη του AR είναι επαρκής για την πρόκληση της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη και την πρόοδο [4] και ότι η υπερέκφραση του AR μετατρέπει ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη από ανδρογόνο-εξαρτώμενη για ανεξάρτητου από ανδρογόνα [5]. Όλα τα δεδομένα που συγκεντρώθηκαν μέχρι τώρα υποδεικνύουν έντονα ότι τα ανδρογόνα, μέσω της δραστηριότητας του AR, ρυθμίζουν το ρυθμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ αναστολή του ρυθμού του κυτταρικού θανάτου στον προστάτη [6]. Δυσλειτουργία αυτής της ισορροπίας μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου είναι αναμφίβολα κρίσιμη για την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι ένα σημαντικός μεσολαβητής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη είναι διαλυτό γουανυλυλ κυκλάσης α1 (sGCα1?. Όνομα γονίδιο

GUCY1A3

) [7]. sGCα1 αρχικά αναγνωρίστηκε σαν ένα συστατικό sGC, ένας ετεροδιμερής ένζυμο, που αποτελείται από sGCα1 και sGCβ1 υπομονάδες, ότι μεσολαβεί βιολογικές λειτουργίες του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) [8]. Σε αυτό το φυσιολογικώς σημαντική και πανταχού παρούσα μονοπάτι σηματοδότησης, το ΝΟ συνδέεται με και ενεργοποιεί sGC, οδηγώντας στο σχηματισμό της δευτερογενούς αγγελιοφόρου cGMP (3 ‘, 5’-κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης), η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί μια ποικιλία κατάντη στόχων, συμπεριλαμβανομένων της πρωτεϊνικής κινάσης G [9]. Το εργαστήριο μας εντοπίστηκαν πρόσφατα sGCα1 ως νέο AR-ρυθμιζόμενων γονιδίων [7]. Έχουμε δείξει ότι ο προαγωγός sGCα1 είναι ένας στόχος της ρύθμισης AR και έχει ως αποτέλεσμα σημαντικά υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης από sGCα1 από sGCβ1 σε κύτταρα LNCaP [7]. sGCα1 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη τόσο των εξαρτώμενων από ανδρογόνα και μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Σημαντικά, αυτή η επίδραση είναι ανεξάρτητη από sGCβ1, ΝΟ και cGMP, και ως εκ τούτου δραστικότητα του ενζύμου sGC [7]. Επιπλέον, η έκφραση sGCα1 είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη και είναι σημαντικά αυξημένα σε προστάτη καρκινικούς ιστούς, με επίπεδα έκφρασης αυξάνεται με την αύξηση στάδιο της νόσου και τα υψηλότερα επίπεδα παρατηρήθηκαν σε ορμόνες καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού [7]. Πιο πρόσφατα, το εργαστήριο μας ανέφεραν ότι sGCα1 μπορεί να εμποδίσει τη δράση των p53 σε και έτσι να ενισχύσει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [10].

Όλες αυτές οι λειτουργίες προ-καρκίνου του sGCα1 δείχνουν ότι αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να είναι μια καλή στόχος για θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε τα προηγούμενα δεδομένα μας δείχνουν ότι sGCβ1 και ενζυμική δραστηριότητα sGC δεν συμμετείχαν στην sGCα1 λειτουργίες προ-καρκίνου και έτσι υπέθεσε ότι sGCβ1 διμερισμό με sGCα1 μπορεί να διαταράξει τις λειτουργίες προ-πολλαπλασιασμό και pro-επιβίωσή του. Αυτό μας οδήγησε να εξετάσει μια προσέγγιση που βασίζεται σε πεπτίδια για διατάραξη sGCα1 λειτουργίες προ-καρκίνου, το σχεδιασμό πεπτίδια που μιμούνται τους τομείς ετεροδιμερισμού sGCβ1. Υποθέσαμε ότι τέτοια πεπτίδια θα είναι σε θέση να δεσμεύονται ειδικά σε sGCα1 και να διαταράξουν τις λειτουργίες του. Μεταξύ των τεσσάρων πεπτίδια που χρησιμοποιούνται, δύο εκ των οποίων παρουσίασαν κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Ένα πεπτίδιο, που ονομάζεται A-8R, έδειξε την ισχυρότερη δραστικότητα και έτσι επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Πεπτίδιο Α-8R δεν ήταν μόνο κυτταροτοξική σε καλλιεργημένα κύτταρα, αλλά επίσης είχε ισχυρή αντικαρκινική δράση έναντι ευνουχισμός ανθεκτικών όγκων του προστάτη σε μελέτες ξενομοσχεύματος ποντικού. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το πεπτίδιο Α-8R σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα από την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και την επαγωγή της βλάβης του DNA. Τα ευρήματά μας εδώ εντοπίσει ένα νέο πεπτίδιο που μπορεί να συλλάβει την ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC).

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και siRNA Η επιμόλυνση

LNCaP, C81, PC-3 και Cos κύτταρα αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. κύτταρα CWR-22Rv1 καλλιεργήθηκαν σε RMPI-1640 με 10% FBS και 50 μg /ml γενταμικίνη (Gibco). Έλεγχος siRNA, sGCα1 siRNA και ΑΚΤ siRNA (Dharmacon) στους 50 ηΜ τελική συγκέντρωση διαμολύνθηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη Simax (Invitrogen).

δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών

Δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών περιγράφηκε προηγουμένως [11]. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με 2 μg από κάθε pCI-Neo φορέα (αρνητικός έλεγχος από την Promega), sGCα1 /ρΟΙ-Neo χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen), και επιλέγονται σε RPMI 1640 πλήρες μέσο που περιέχει 0,9 mg /ml νεομυκίνη (Sigma). Οι αποικίες επελέγησαν με ανίχνευση sGCα1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας PCR και κηλίδωση Western.

Σύνθεση Πεπτιδίου

Όλα τα πεπτίδια που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη συντέθηκαν από ChiScientific, κατά καθαρότητα ≥95%, και ήταν διαλυμένο σε 70% DMSO (Acros Organic).

αδενοϊό Infection

κύτταρα C81 μολύνθηκαν με 5-50 ΜΟΙ είτε ενός αδενοϊού που εκφράζει Akt (SignaGen) ή κενό αδενοϊό ως έλεγχος. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία πεπτίδιο, που ακολουθείται από δοκιμασία κηλίδωση ή τον πολλαπλασιασμό Western.

πολλαπλασιασμό και την απόπτωση Δοκιμασίες

Για τον πολλαπλασιασμό, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιέχει 2% FBS εκχυλίζεται με κάρβουνο επικαλυμμένο με δεξτράνη (DCC). 48 ώρες αργότερα, η αιθανόλη ή 1 ηΜ R1881 προστέθηκε στα κύτταρα που ακολουθείται από κατεργασία του πεπτιδίου. Η δοκιμασία ΜΤΤ (Sigma) χρησιμοποιήθηκε όπως πριν [11] για τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων. Για την απόπτωση, 5000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φορέα (DMSO), Πεπτίδιο Α-8R (25 μΜ), Ετοποσίδη (50 μΜ) (Sigma) σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Η Κασπάση (3/7) δραστηριότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Αρο-ΟΝΕ Ομογενείς κιτ προσδιορισμού κασπάσης-3/7 (Promega). διάσπαση PARP χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη μέτρηση της απόπτωσης, και περιγράφεται κατωτέρω.

Western Blotting

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφεται [7] χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα εναντίον sGCα1 (Cayman Chemical), παν-Akt (Cell Signaling Technology), φωσφο-ΑΚΤ (S473, T308) (Cell Signaling Technology), φωσφο-ΡϋΚ1 (Cell Signaling Technology), φωσφο-GSK-3β (Cell Signaling Technology), PARP (Cell Signaling Technology), και β- ακτίνης (Abcam).

η ανοσοκυτταροχημεία

η ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί ο υποκυτταρικός εντοπισμός της sGCα1 και Βιοτίνη-επισημασμένου πεπτιδίου-8R σε κύτταρα LNCaP. ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντίσωμα αντι-sGCα1 (1:100 αραίωση? Santa Cruz Biotechnology), αντίσωμα αντι-βιοτίνης (1:200? Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκαν για immunocytochemisty όπως περιγράφεται [12]

Ανοσοκαταβύθιση, Βιοτίνη. pulldown, και συγγένεια

ανοσοκαθίζηση (ΙΡ) σε κύτταρα LNCaP πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Ολόκληρο-κυτταρικά εκχυλίσματα από κύτταρα LNCaP υποβλήθηκαν σε IP χρησιμοποιώντας Protein Α /G συν αγαρόζη (Santa Cruz). αντισώματα ΠΕ ήταν κατά sGCα1 (Cayman Chemical), sGCβ1 (Cayman Chemical), ή κουνέλι IgG (Santa Cruz) ως μάρτυρες. Για Βιοτίνη κυλιόμενο, 5 μg βιοτίνη-επισημασμένου Πεπτιδίου Α επωάστηκε με NeutrAvidin Αγαρόζη Η ρητίνη (Thermo Scientific) για 3 ώρες στους 4 ° C, μετά το οποίο προστέθηκε εκχύλισμα ολικού κυττάρου από κύτταρα LNCaP και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Ρητίνη πλύθηκε και εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, που ακολουθήθηκε από ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-PAGE. Για τη δοκιμασία συναγωνισμού, το ίδιο πείραμα επαναλήφθηκε με την ακόλουθη αλλαγή: LNCaP κυτταρικό εκχύλισμα διαιρέθηκε σε 3 ίσα μέρη, με κάθε τμήμα υποδοχής 5 μg πεπτιδίου Α-8R-Βιοτίνη και οχημάτων, 150 μg πεπτιδίου C-8R, ή 150 μg Πεπτίδιο Α-8R.

για πειράματα σύνδεσης συγγενείας, εκχύλισμα ολικού κυττάρου από κύτταρα C81 επωάστηκε με διαφορετικές συγκεντρώσεις του πεπτιδίου Α-8R tagged με FITC σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. IPs διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι sGCα1 ή IgG κουνελιού ως μάρτυρα. Πεπτίδιο Α-8R-FITC αναπτυσσόμενο μετρήθηκε με σήμα φθορισμού σε διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 485 και 521 nm, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού πολλαπλών φρεατίων.

ROS Μέτρηση και διάσωσης

ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την φθορίζουσα μήλη 5- (και-6) -χλωρομεθυλο-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξική (CM-H

2DCFDA) (Invitrogen). Μετά από θεραπείες με Πεπτίδιο Α-8R, κύτταρα C81 φορτώθηκαν με 20 μΜ CM-H

2DCFDA και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και ο φθορισμός μετρήθηκε στα διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 490 και 535 nm, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού πολλαπλών φρεατίων. Για NAC (N-ακετυλο κυστεΐνη) (Sigma) πείραμα διάσωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 1 ή 5 mM NAC για 2 ώρες πριν από την προσθήκη πεπτιδίων Α-8R.

Comet Δοκιμασία

κύτταρα C81 ήταν κατεργάζεται με Πεπτίδιο Α-8R για 1 ώρα, μετά από 2 ώρες προκατεργασία με 5 mM NAC ή οχημάτων, και επεξεργασία με θρυψίνη, και αναμειγνύεται με Comet LM-αγαρόζης (CometAssay, Trevigen) και μεταφέρθηκαν σε διαφάνειες. Ηλεκτροφόρηση και SYBR-Πράσινο χρώση διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ποντίκια ξενομοσχεύματος Μελέτες όγκων

2 × 10

6 C81 κυττάρων σε 50 μι μέσου ανάπτυξης αναμίχθηκαν με 50 μL Matrigel (BD Biosciences) και εγχύεται σε αμφότερες τις πλευρές 4-6 εβδομάδων SCID αρσενικά ποντίκια. Όταν τα μεγέθη του όγκου έφθασε 200 mm

3, 50 μι Πεπτιδίου Α-8R (40 mg πεπτιδίου Α-8R /Kg του ζώου) ή φορέα (DMSO) απευθείας εγχέεται όγκους κάθε δεύτερη μέρα. Οι ενέσεις σταμάτησαν μετά από 5 φορές και οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε 3 ημέρες. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία μετά από 3 εβδομάδες και οι όγκοι αποκόπηκαν. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Τολέδο Διεύθυνσης Lab Animal Πόρων (DLAR). εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάζονται με βρασμό του ιστού του όγκου σε 3 × SDS ρυθμιστικού, και αξιολογήθηκαν με SDS-PAGE γέλη.

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση του Εργαστηρίου τα ζώα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου του Τολέδο (Αριθμός Πρωτοκόλλου: 106418). Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, όλα τα ζώα παρακολουθούνταν καθημερινά για νοσηρότητα και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Στο τέλος της μελέτης όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με χρήση εισπνοής διοξειδίου του άνθρακα, μετά την οποία η χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε σε όγκους φόρου κατανάλωσης από όλα τα ζώα.

Αποτελέσματα

Τα πεπτίδια στόχευσης sGCα1 είναι κυτταροτοξικά για κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Τα στοιχεία μας καταδεικνύουν ότι sGCα1 απαιτείται για την επιβίωση [10] και τον πολλαπλασιασμό [7] του προστάτη καρκινικών κυττάρων υποδηλώνουν ότι αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να είναι ένας καλός στόχος για θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Για να ξεκινήσετε να αντιμετωπίσει αυτό το ενδεχόμενο, θα χρησιμοποιηθούν αυτά τα προηγούμενα δεδομένα δείχνουν ότι sGCα1 λειτουργίες προ-καρκίνου είναι ανεξάρτητη από NO σηματοδότησης και sGCβ1 [7], [10] και ότι sGCβ1 μπορεί να ανακουφίσει sGCα1 μεσολάβηση καταστολή της δραστηριότητας της μεταγραφής p53 [10], γεγονός που υποδηλώνει ότι sGCβ1 διμερισμό με sGCα1 μπορεί να διαταράξει sGCα1 λειτουργίες προ-καρκίνου. Αυτό μας οδήγησε να εξετάσει μια προσέγγιση με βάση πεπτίδιο για διατάραξη των λειτουργιών sGCα1, χρησιμοποιώντας πεπτίδια που μιμούνται τις τέσσερις γνωστές περιοχές sGCβ1 ετεροδιμερισμό [13]. Αυτά τα πεπτίδια, που ονομάζονται Πεπτίδιο Α, Β, C, και D, μεταβάλλονται σε μήκος στις 11 έως 19 αμινοξέα. Κάθε πεπτίδιο περιείχε 8 αργινίνες στο καρβοξυ άκρο (Εικ. 1Α), μία αλληλουχία που είναι γνωστό ότι μεσολαβούν μετατόπισης μεμβράνης πλάσματος και την κυτταρική ενσωμάτωση [14]. Τα πεπτίδια δοκιμάστηκαν για δραστικότητα σε κύτταρα LNCaP, μία κυτταρική σειρά που εκφράζει τόσο AR και sGCα1 [7]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, Πεπτίδιο Α-8R είχε μια ισχυρή, εξαρτώμενη από τη δόση, κυτταροτοξική δραστικότητα, σκοτώνοντας σχεδόν όλα τα κύτταρα κατά την ημέρα 4. Πεπτίδιο Β-8R είχε επίσης αρνητική επίδραση, καταστέλλοντας την ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά όχι τη μείωση του αριθμού των κυττάρων όπως έκανε Πεπτίδιο Α-8R ( Εικ. 1Β). Από την άλλη πλευρά, πεπτίδια C-8R και D-8R είχε μικρή επίδραση (Εικ. 1Β). Εν όψει της ισχυρής κυτταροτοξική δράση της, επελέγη Πεπτίδιο Α-8R για περαιτέρω μελέτη.

(Α) Τέσσερα πεπτίδια σχεδιάστηκαν στόχευσης sGCα1, με κάθε πεπτίδιο που περιέχει οκτώ αργινίνες στο Ο-άκρο για μετατόπιση της μεμβράνης. (Β) LNCaP κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 10% ορό κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων πεπτιδίων, όπως φαίνεται. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε μετά από 0-4 ημέρες επώασης. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν μέσους όρους τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν τυπικές αποκλίσεις. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστική σημασία (Ρ & lt? 0,0002). Πεπτιδίου Α δραστηριότητα, ως προς το όχημα

Η

Peptide ένα Associates με ενδογενή sGCα1 σε κύτταρα προστάτη Cancer

Πεπτίδιο Α-8R σχεδιάστηκε για να αλληλεπιδρούν με sGCα1, η οποία έχει επιβεβαιωθεί χρησιμοποιώντας τρεις μεθόδους. Πεπτίδιο Α-8R συντέθηκε με μια ετικέτα Βιοτίνη στο C-τελικό άκρο, δίνοντας Πεπτίδιο Α-8R-βιοτίνη. Στην πρώτη δοκιμασία, τα κύτταρα LNCaP υπέστησαν αγωγή με Πεπτίδιο Α-8R-βιοτίνη και υποβλήθηκε σε ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον Βιοτίνη για να ανιχνεύσει την ετικέτα Πεπτίδιο Α-8R και ένα άλλο κατά sGCα1 να ανιχνεύσει αυτή την πρωτεΐνη (Εικ. 2Α). Όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως, η ενδογενής sGCα1 βρέθηκε αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων LNCaP, που περιβάλλει τον πυρήνα [7]. Σημαντικά, Πεπτίδιο Α-8R-Βιοτίνη βρέθηκε επίσης στο κυτταρόπλασμα και συνεντοπίζεται με sGCα1, όπως φαίνεται από τις εικόνες συγχωνευθείσα. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι το πεπτίδιο Α-8R-Βιοτίνη αλληλεπιδρά με ενδογενή sGCα1, η οποία επαληθεύεται από ένα πείραμα pull-down. Σε αυτό το δεύτερο προσδιορισμό (Σχ. 2Β), εκχύλισμα ολικού κυττάρου LNCaP επωάστηκε με Πεπτίδιο Α-8R-Βιοτίνης και υποβλήθηκε σε στρεπταβιδίνη-αγαρόζη καθαρισμού, οδηγώντας σε συν-καθαρισμός της sGCα1. Αντίθετα, τα σφαιρίδια αγαρόζης δεν ήταν σε θέση να τραβήξει προς τα κάτω sGCα1 σε απουσία πεπτιδίου Α-8R-βιοτίνη. Για να μετρηθεί η ειδικότητα της δέσμευσης, το πείραμα pull-down επαναλήφθηκε υπό συνθήκες στις οποίες υπερβολική ποσότητα μη επισημασμένου Πεπτιδίου Α-8R ή ​​πεπτιδίου C-8R προστέθηκε στην αντίδραση με βιοτίνη-επισημασμένου πεπτιδίου A-8R. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, Πεπτίδιο Α-8R ανέστειλαν σημαντικά Πεπτίδιο Α-8R-Βιοτίνη αλληλεπίδραση με sGCα1, ενώ το Πεπτίδιο C-8R δεν είχε κανένα αποτέλεσμα, που δείχνει μία ειδική αλληλεπίδραση του πεπτιδίου Α-8R με sGCα1. Χρησιμοποιήσαμε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) του sGCα1 να προσδιοριστεί συγγένεια σύνδεσης του για το Πεπτίδιο A-8R. Πεπτίδιο Α-8R επισημασμένο με FITC χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ότι η συγγένεια δέσμευσης πεπτιδίου (Κ

D) για sGCα1 ήταν 11,6 μΜ (Σχ. 2C), η οποία εμπίπτει στο ενεργό εύρος συγκέντρωσης για Πεπτίδιο Α-8R-διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα . Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν μια συγκεκριμένη φυσική σχέση μεταξύ πεπτιδίων Α-8R και sGCα1. Σύκο. 2D δείχνει ότι η προσθήκη μιας ετικέτας βιοτίνης με Πεπτίδιο Α-8R δεν επηρέασε κυτταροτοξική αποτελεσματικότητα του.

(Α) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ βιοτίνη-επισημασμένου πεπτιδίου A-8R για 2 ώρες και υποβλήθηκε σε ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιώντας αντι-sGCα1 ή αντι-βιοτίνης αντίσωμα για να μετρηθεί υποκυτταρικό συν-εντοπισμό της ενδογενούς sGCα1 και Πεπτίδιο Α-8R. DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. (Β) LNCaP κυτοσολίου εκχυλίσματα επωάστηκαν με Πεπτίδιο Α-8R-Βιοτίνης και υποβλήθηκε σε καθαρισμό χρησιμοποιώντας στρεπταβιδίνη-αγαρόζη. Αυτό το πείραμα pull-down επαναλήφθηκε με ανταγωνιστικές περίσσεια ποσότητα του μη-επισημασμένου πεπτιδίου C-8R ή ​​το πεπτίδιο Α-8R. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η συν-καθαρισμός της sGCα1. (Γ) εκχύλισμα LNCaP κυττάρων επωάστηκε με διαφορετικές συγκεντρώσεις του Πεπτιδίου Α-8R-FITC και ενδογενών sGCα1 ανοσοκατακρημνίστηκε. Co-καθαρισμένο πεπτίδιο Α-8R-FITC προσδιορίστηκε ποσοτικά με μέτρηση εκπομπής σήμα φθορισμού. μη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό μια συγγένεια για σύνδεση Πεπτιδίου Α-8R να sGCα1. (D) κύτταρα LNCaP αναπτύχθηκαν σε 10% ορό κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις πεπτιδίου Α-8R ή ​​A-8R-Βιοτίνη, όπως φαίνεται. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε μετά από 0-48 ώρες επώασης. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν μέσους όρους τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν τυπικές αποκλίσεις. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0,02). Πεπτιδίου Μια δραστηριότητα, σε σχέση με το όχημα

Η

Το πεπτίδιο Α δεν επηρεάζει sGC δραστικότητα του ενζύμου

Από Peptide Μια σχεδιάστηκε για να μιμηθεί ένα sGCβ1 τομέας ετεροδιμερισμού, είναι πιθανό ότι αυτό το πεπτίδιο μπορεί να επηρεάσει sGCα1-sGCβ1 ετεροδιμερισμό και έτσι ενζυμική δραστηριότητα. Για την αντιμετώπιση της πρώτης δυνατότητας, θα μετρηθεί άμεσα την αλληλεπίδραση του sGCα1 με sGCβ1 από IP χρησιμοποιώντας αντισώματα εναντίον sGCα1 και sGCβ1. Πεπτίδιο Α-8R δεν είχε καμία επίδραση ούτε sGCα1 συν-IP με sGCβ1 ή sGCβ1 συν-IP με sGCα1 (Εικ. S1 Α), καταδεικνύοντας σαφώς ότι το πεπτίδιο Α δεν διαταράσσει sGCα1-sGCβ1 ετεροδιμερισμό. Επιβεβαίωση για αυτό ελήφθη από ένα πείραμα ELISA μέτρηση σύνθεση cGMP. Όπως φαίνεται στο Σχ. S1B, θεραπεία R1881 αξιοσημείωτα αυξημένα επίπεδα cGMP, συνεπής με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα μας δείχνουν επαγωγή της έκφρασης ανδρογόνων sGCα1 και σύνθεση cGMP [7]. Σημαντικά, Πεπτίδιο Α-8R δεν ήταν σε θέση να καταστείλει σημαντικά τα επίπεδα cGMP, είτε στην απουσία ή την παρουσία ανδρογόνων (Σχ. S1B). Αυτά τα δεδομένα συλλογικά δείχνουν ότι το Πεπτίδιο Α δεν διαταράσσει δραστικότητα του ενζύμου sGC και έτσι δείχνουν ότι το ΝΟ σηματοδότηση δεν εμπλέκεται σε κυτταροτοξικότητα της. Για να ελεγχθεί απ ‘ευθείας αυτό, προσθέσαμε 8-Br-cGMP στα κατεργασμένα κύτταρα. 8-Br-cGMP είχε καμία επίδραση στη με φορέα ή πεπτίδιο Α-8R-επεξεργασμένα κύτταρα, ενώ ήταν σε θέση να μερικώς κύτταρα διάσωση κατεργασία με το sGC αναστολέα ενζύμου ΟϋΟ (Εικ. S1c). Μια δεύτερη προσέγγιση ήταν να προσθέσετε το NO παράγοντα απομόνωσης C-ΡΤΙΟ, η οποία ενισχύεται αντί να απαλλαγεί την κυτταροτοξικότητα των πεπτιδίων Α-8R στα 10 και 25 μΜ, αλλά έχει ενδιαφέρον όχι 50 μΜ (Εικ. S1D). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το Πεπτίδιο συλλογικά Α-8R δεν παρεμβαίνει ούτε εξαρτάται από ΝΟ σηματοδότηση.

Πεπτίδιο Α Blocks η ανάπτυξη τόσο ορμονο-εξαρτώμενων και ευνουχισμός ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα προστάτη, αλλά όχι sGCα1-ελλειμματικών κυττάρων

Για να προσδιοριστεί εάν ανδρογόνων επηρέασε την κυτταροτοξική δράση του πεπτιδίου Α-8R, το πείραμα στο Σχ. 1Β επαναλήφθηκε σε παρουσία ορμόνης. Όπως δεικνύει η Εικ. 3Α δείχνει, Πεπτίδιο Α-8R είχε την ίδια ισχυρή κυτταροτοξική δραστικότητα με ή χωρίς ανδρογόνων, προκαλώντας όλα τα κύτταρα να χαθούν κατά την ημέρα 6, όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με 50 μΜ πεπτίδιο. Ένα ανενεργό πεπτίδιο, πεπτίδιο C-8R, δεν είχε σημαντική επίδραση στην ίδια συγκέντρωση (Σχ. 3Α), αποδεικνύοντας ότι η αλληλουχία αμινοξέων του πεπτιδίου Α που απαιτείται για την κυτταροτοξική επίδραση και εξαιρουμένων δυναμικό κυτταροτοξικότητα που επάγεται από την αλληλουχία 8-αργινίνη .

όχημα ή διαφορετικές συγκεντρώσεις του πεπτιδίου Α-8R ή ​​C-8R, όπως φαίνεται, προστέθηκε σε (Α) που εξαρτώνται από ορμόνες κύτταρα LNCaP αναπτύχθηκαν σε 2% ορό χωρίς ή με 1 ηΜ R1881, (Γ) ευνουχισμός ανθεκτικά C81 ή CWR-22Rv1 κύτταρα, ή (Ε) sGCα1 ανεπάρκεια PC-3 ή Cos κύτταρα. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε μετά από διάφορες ημέρες επώασης. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν μέσους όρους τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν τυπικές αποκλίσεις. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστική σημασία (Ρ & lt? 0,03) από πεπτιδίου Α δραστηριότητα, σε σχέση με τα οχήματα. Κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να παρακολουθηθεί η έκφραση του ενδογενούς sGCα1 σε κύτταρα (Β) C81 και CWR-22Rv1, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 1 ηΜ R1881, ή (Ε) κύτταρα Cos PC-3 και, σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP. Σημειώστε ότι β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο για την πρωτεΐνη φόρτωση.

Η

Για να διερευνηθεί αν το σήμα μετατοπίσεως μεμβράνης που απαιτείται για την κυτταροτοξικότητα του πεπτιδίου Α-8R, αναλύσαμε την δραστικότητα Πεπτιδίου Α λείπει 8 αργινίνες . Όπως φαίνεται στο Σχ. S2, Πεπτίδιο Α χωρίς τις αργινίνες είχε μικρή αρνητική επίδραση, σε αντίθεση με την ισχυρή κυτταροτοξική δράση του πεπτιδίου Α-8R. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι η κυτταρική εσωτερίκευση απαιτείται για το πεπτίδιο κυτταροτοξική δράση.

προηγουμένως έχουν δείξει ότι sGCα1 προάγει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του προστάτη, και αυξάνει την έκφρασή του σε υψηλότερο στάδιο του καρκίνου του προστάτη [7]. Όπως παρουσιάζεται προηγουμένως, η έκφραση sGCα1 πρωτεΐνη είναι up-ρυθμίζεται από ανδρογόνο σε ανδρογόνο-εξαρτώμενη κύτταρα και συστατική σε ανδρογόνα ανεξάρτητο C81 και CWR-22Rv1 κύτταρα, με κύτταρα CWR-22Rv1 εκφράζουν χαμηλότερα επίπεδα από ό, τι τα κύτταρα C81 (Σχ. 3Β). Έτσι, ενδιαφερθήκαμε να μελετήσουμε την επίδραση του πεπτιδίου σε αυτές τις ορμόνες πυρίμαχων καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Πεπτίδιο Α-8R ήταν πολύ αποτελεσματική στην καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων C81 (Εικ. 3C), που ταιριάζουν στην επίδραση επί των κυττάρων LNCaP που εξαρτώνται από ορμόνη. Πεπτίδιο Α-8R ήταν επίσης αποτελεσματικό σε ένα άλλο ορμονοάντοχου κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη, κύτταρα CWR-22Rv1, οι οποίες είναι διαφορετικές από LNCaP κύτταρα (Σχ. 3C). Σημαντικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η ορμόνη καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού κύτταρα είναι ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση του πεπτιδίου Α-8R καθώς εξαρτώνται από τις ορμόνες κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το πεπτίδιο αυτό μπορεί να είναι αποτελεσματικό έναντι CRPC, τη θανατηφόρο μορφή της νόσου.

η ενδογενής sGCα1 εκφράζεται σε LNCaP, C81, και τα κύτταρα CWR-22Rv1 (βλέπε Σχ. 3Β), τα οποία είναι ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση του πεπτιδίου Α-8R. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η επίδραση του πεπτιδίου απαιτεί ενδογενή έκφραση sGCα1, μία αναμενόμενη εύρημα επειδή sGCα1 ήταν η σχεδιασμένη στόχος του πεπτιδίου Α-8R. Για να αποκτήσετε περισσότερα στοιχεία για την υπόθεση αυτή, δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου μελετήθηκαν τα οποία δεν εκφράζουν ενδογενείς sGCα1 (Σχ. 3D). Πεπτίδιο Α-8R είχε μικρή ή καθόλου επίδραση στην PC-3 (καρκίνος του προστάτη) ή COS (καρκίνος νεφρού ποντικού) κύτταρα (Σχ. 3Ε). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν σθεναρά την άποψη ότι η κυτταροτοξική δράση των πεπτιδίων Α-8R εξαρτάται από την ενδογενή πρωτεΐνη sGCα1.

Το πεπτίδιο Α Down-ρυθμίζει ΑΚΤ σε κύτταρα του προστάτη Καρκίνος

Για να καταλάβουμε πώς sGCα1 μεσολαβεί κυττάρων πολλαπλασιασμού, χρησιμοποιήσαμε έναν αναστολέα της είτε ΜΑΡΚ ή PI3K-AKT σηματοδότησης, δύο σημαντικών οδών σηματοδότησης που ρυθμίζουν την κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο αναστολέας ΡΙ3Κ-ΑΚΤ LY294002 δραματικά κατασταλεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων LNCaP (Εικ. S3A). Αυτό μας οδήγησε να διερευνήσει την πιθανότητα ότι sGCα1 μπορεί να προκαλέσει πολλαπλασιασμό μέσω αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης. Χρησιμοποιώντας σταθερή LNCaP κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν sGCα1 (Εικ. S3b), που εμφανίζουν αυξημένη ανδρογόνο επαγόμενο πολλαπλασιασμό (Εικ. S3C), βρήκαμε με κηλίδωση Western ότι τα επίπεδα της ολικής ΑΚΤ και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ αυξημένα σημαντικά σε αυτά τα LNα1-6 και κύτταρα LNα1-4 (Εικ. S3b)? Αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν επίσης υψηλότερα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ΡϋΚ1, μια κινάση που ενεργεί για ΑΚΤ, και GSK-3β, ένας στόχος της ΑΚΤ [15]. Για να επιβεβαιωθεί ότι τα αυξημένα επίπεδα ΑΚΤ οφείλονταν σε sGCα1 υπερέκφραση, siRNA χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση του knockdown sGCα1 σε κύτταρα LNα1-6, οδηγώντας σε σημαντικά μειωμένα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ (Εικ. S3D). Σημαντικά, sGCα1 δεν επηρέασε τα επίπεδα του mRNA ΑΚΤ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι sGCα1 δρα επί της πρωτεΐνης ΑΚΤ, ίσως επηρεάζει τη σταθερότητα του. Είναι ενδιαφέρον, siRNA knockdown του sGCα1 (Εικ. S3F) ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP (Εικ. S3E), καταδεικνύοντας σαφώς ότι η ενδογενής sGCα1 παρέχει τα κύτταρα μια λειτουργία επιβίωσης και υπέρ της ανάπτυξης.

Λόγω μας δεδομένα παραπάνω (βλέπε Σχ. S3b, S3D) υποδηλώνοντας ότι sGCα1 δρα επί της πρωτεΐνης ΑΚΤ, Peptide σύνδεση προς sGCα1 Α-8R θα μπορούσε να αναμένεται να επηρεάσει ΑΚΤ. Πράγματι, η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με Πεπτίδιο Α-8R είχε μια ισχυρή, εξαρτώμενη από τον χρόνο αρνητική επίδραση επί της πρωτεΐνης ΑΚΤ, έτσι ώστε με 50 λεπτά το μεγαλύτερο μέρος της μετρήσιμης ΑΚΤ έχει φύγει (Εικ. S4A). Όπως θα αναμενόταν, φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ επηρεάστηκε παρομοίως (Εικ. S4A). Η ανενεργή έλεγχος Peptide C-8R δεν είχε καμία επίδραση ούτε ολική Akt ή φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ επίπεδα (Σχ. S4A). Είναι ενδιαφέρον ότι η ίδια αρνητική επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης ΑΚΤ (Εικ. S4B) παρατηρήθηκε σε όγκους ξενομοσχεύματος ποντικού (βλέπε κατωτέρω) που έλαβαν θεραπεία με Πεπτίδιο Α-8R, όπως παρατηρήθηκε σε LNCaP κύτταρα (Σχ. S4A).

Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την υπόθεση ότι το πεπτίδιο Α-8R διαταράσσει τις λειτουργίες προ-καρκίνο του sGCα1 και προτείνουν ότι τουλάχιστον ένας μηχανισμός κυτταροτοξικών δράσης της είναι μέσω διάσπαση της πρωτεΐνης ΑΚΤ. Για να εξεταστεί άμεσα αυτή η υπόθεση, έχουμε υπερεκφράζεται ΑΚΤ χρησιμοποιώντας ένα σύστημα αδενοϊού, η οποία οδήγησε σε σημαντικά αυξημένα επίπεδα της ΑΚΤ σε κύτταρα επεξεργασμένα με 10 και 25 μΜ του πεπτιδίου Α-8R (Εικ. S4C). Παραδόξως, αδενοϊό-εκφράζεται ΑΚΤ ήταν σε θέση να διασώσει τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 10- 50 μΜ πεπτιδίου Α-8R (Εικ. S4D), υποδηλώνοντας ότι η ΑΚΤ κάτω ρύθμιση δεν εμπλέκεται σε Πεπτίδιο Α-8R-διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα.

Πεπτίδιο Α Καρκίνος σκοτώνει κύτταρα του προστάτη από παραγωγή ROS

Δεδομένου ότι η ΑΚΤ υπερέκφραση απέτυχαν να διασώσουν Πεπτίδιο Α-κατεργασμένα κύτταρα (βλέπε Εικ. S4D), ψάξαμε για ένα διαφορετικό μηχανισμό κυτταροτοξικότητας. Είναι ενδιαφέρον ότι, πρόσφατα δεδομένα έχουν δείξει ότι τα πιο αποτελεσματικά φάρμακα του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της σισπλατίνης και δοξορουβικίνη, επάγουν κυττάρου όγκου θάνατο με την ανύψωση των επιπέδων των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) [16], [17]. Εν όψει της ταχείας κυτταροτοξικότητα που επάγεται από το Πεπτίδιο Α (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), εξετάσαμε την πιθανότητα ότι εμπλέκεται ROS. Πράγματι, η αγωγή με Πεπτίδιο Α 8R οδήγησε σε σημαντική επαγωγή ROS στα κύτταρα LNCaP μέσα σε 30 λεπτά (Σχ. 4Α), ενώ οι sGCα1-αρνητικά κύτταρα PC-3 δεν αποκρίνονται (Εικ. S5A). Είναι σημαντικό ότι, το ανενεργό πεπτίδιο, C-8R, αποτυγχάνει να επάγει την παραγωγή ROS (Εικ. S5B). Όπως ήταν αναμενόμενο, η παραγωγή ROS στα κύτταρα LNCaP αυξήθηκε όταν η συγκέντρωση πεπτιδίου Α-8R αυξήθηκε από 10 έως 25 μm, αλλά, απροσδόκητα, μειωμένη με 50 μΜ (Σχ. 4Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η παραγωγή ROS μπορεί να είναι υπεύθυνη για την κυτταροτοξικότητα Πεπτίδιο Α-8R στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις των 10 και 25 μΜ, αλλά όχι στα 50 μΜ.

(Α) κύτταρα C81 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή διαφορετικά μιποΙθΓ Οι συγκεντρώσεις του πεπτιδίου Α-8R και χωρίς ή με 0-5 mM NAC και παρακολουθήθηκαν για την παραγωγή ROS μετά 0-30 λεπτά όπως μετράται με ένταση φθορισμού (FI). ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν μέσους όρους των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν τυπικές αποκλίσεις. Σημειώστε ότι οι αστερίσκους στη γραμμή διαγράμματα που βρέθηκαν με NAC σε σύγκριση με ισοδύναμα δεδομένα χωρίς NAC. κύτταρα (Β) C81 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή διάφορες συγκεντρώσεις του Πεπτιδίου Α-8R, όπως φαίνεται, και 0-5 mM NAC, όπως φαίνεται, και παρακολουθήθηκαν για τον αριθμό των κυττάρων μετά από 0-6 ημέρες επώασης, όπως μετράται με ΜΤΤ δοκιμασία. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν μέσους όρους τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν τυπικές αποκλίσεις. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0,04). κύτταρα (C) C81 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή διάφορες συγκεντρώσεις του Πεπτιδίου Α-8R, όπως φαίνεται, και με ή χωρίς 5 mM NAC, όπως φαίνεται, και παρακολουθήθηκε βλάβη DNA μετά από επώαση 1 ώρας, όπως μετράται με Comet δοκιμασίας.

Για να αντιμετωπιστεί αυτό το ενδεχόμενο, χρησιμοποιήσαμε την οδοκαθαριστής ROS NAC (N-ακετυλο κυστεΐνη) [18]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, NAC ήταν σε θέση να διασώσουν εντελώς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε επεξεργασία με 10 μΜ πεπτιδίου Α-8R ή ​​σχεδόν εντελώς με 25 μΜ. Αυτές NAC επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό αντιστοιχούν στις NAC συνέπειες για πεπτιδίων Α-8R μεσολάβηση γενιάς ROS (Σχ. 4Α), γεγονός που δείχνει ότι η παραγωγή ROS είναι υπεύθυνη για Peptide Α κυτταροτοξικότητα. Είναι ενδιαφέρον, NAC απέτυχε να διασώσει σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε επεξεργασία με 50 μΜ πεπτιδίου Α-8R (Εικ. 4Β). Αυτό το εύρημα, μαζί με τις προηγούμενες αποτέλεσμα μας δείχνει ελάχιστη επαγωγή ROS με 50 μΜ πεπτιδίου Α-8R (βλέπε Σχ. 4Α), υποστηρίζουν ότι αυτή η υψηλή συγκέντρωση του πεπτιδίου Α-8R σκοτώνει κύτταρα μέσω μηχανισμού ανεξάρτητου της γενιάς ROS.

(Α) LNCaP, (Β) PC-3, ή (Γ) Cos κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, Πεπτίδιο Α-8R (10 μΜ), ή ετοποσίδη (20 μΜ) για 0-24 ώρες και υποβάλλεται σε μία δοκιμασία Caspase για τη μέτρηση της απόπτωσης. ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν μέσους όρους των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συν τυπικές αποκλίσεις. Όλες οι δραστηριότητες είναι σε σχέση με την πρώτη προϋπόθεση, και αυτή η δραστηριότητα ορίστηκε να 1. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0.005). (D) κύτταρα LNCaP υπέστησαν αγωγή με όχημα, Peptide C-8R, Πεπτίδιο Α-8R, ή ετοποσίδη (κάθε φάρμακο στα 50 μΜ) για 8 ώρες και παρακολουθούνται για την απόπτωση με μέτρηση διάσπαση PARP χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Σημειώστε ότι β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο για την πρωτεΐνη φόρτωση.

Η

ROS-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σχετίζεται με βλάβη του DNA [19], το οποίο επάγεται ασθενώς από 10 μΜ Πεπτιδίου Α-8R και πολύ πιο έντονα από 25 μΜ, όπως μετράται με Comet δοκιμασίας (Σχήμα 4C).? σημαντικό, αυτή η επαγωγή είναι εντελώς αποκλεισμένη από την NAC, καταδεικνύοντας σαφώς το πεπτίδιο-Α-8R-επαγόμενης βλάβης του DNA απαιτεί την παραγωγή ROS. Είναι ενδιαφέρον, 50 μΜ πεπτιδίου Α-8R, η οποία σκοτώνει τα περισσότερα κύτταρα, δεν προκαλούν μια Comet σήματος (Εικ. 4C). Όπως φαίνεται στο Σχ. S6, αυτή η συγκέντρωση του πεπτιδίου σκοτώνει τα κύτταρα και διαταράσσει πυρήνων και το DNA τους, έτσι ώστε ϋΑΡΙ βαφή αποδόσεις κανένα σήμα και NAC δεν είχε καμία επίδραση.

Πεπτίδιο Α επάγει την απόπτωση των κυττάρων του προστάτη Cancer

Αυξημένα επίπεδα Όπως φαίνεται στο Σχ.