Αφηρημένο

Οι όγκοι περιέχουν ένα μικρό πληθυσμό καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) προτείνεται να είναι υπεύθυνος για τη συντήρηση και την υποτροπή του όγκου. αλδεϋδικής αφυδρογονάσης 1 (ΑΙ_ϋΗ1) δραστηριότητα έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα λειτουργικό δείκτη βλαστικών κυττάρων για την απομόνωση CSCs σε διάφορους τύπους καρκίνου. Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε την δοκιμασία Aldefluor® και ανάλυση ενεργοποιημένης με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) για την απομόνωση ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα από πέντε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές σαρκώματος και μία κυτταρική σειρά πρωτογενών χόρδωμα. ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα κυμαίνεται από 0,3% (ΚΟΥΠΑ-Chor1) έως 4,1% (SW-1353) της περιφραγμένο κυττάρων. Ανοσοϊστοχημική χρώση, ανάλυση της αποτελεσματικότητας σχηματισμού κλώνου, καθώς και xCELLigence τεχνολογίας μικροηλεκτρονικής αισθητήρα αποκάλυψε ότι ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα από όλες τις κυτταρικές σειρές σαρκώματος έχουν αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα. Με τη διερεύνηση των σημαντικοί ρυθμιστές της βιολογίας των βλαστικών κυττάρων, σε πραγματικό χρόνο δεδομένα RT-PCR έδειξαν αυξημένη έκφραση του c-myc, β-κατενίνης, και SOX-2 στην υψηλή πληθυσμό ΑΙ_ϋΗ1

και ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο του ABCG2. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα SW-982 και SW-1353 έδειξαν μεγαλύτερη αντοχή στην χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες όπως η δοξορουβικίνη, επιρουβικίνη και σισπλατίνη από ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές σάρκωμα, δραστηριότητα υψηλής ΑΙ_ϋΗ1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση ενός υποπληθυσμού κυττάρων χαρακτηρίζονται από σημαντικά υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, αυξημένη σχηματισμού αποικιών, η αυξημένη έκφραση των γονιδίων μεταφορέα ABC και βλαστική ικανότητα σημειωτές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, αυξημένη αντοχή στα φάρμακα αποδείχθηκε

Παράθεση:. Lohberger Β, Rinner Β, Stuendl Ν, Absenger Μ, Liegl-Atzwanger Β, Walzer SM, et al. (2012) Αλδεΰδη αφυδρογονάσης 1, μια πιθανή δείκτης για τον καρκίνο Βλαστικών Κυττάρων Ανθρώπων σάρκωμα. PLoS ONE 7 (8): e43664. doi: 10.1371 /journal.pone.0043664

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 19 Απρ του 2012? Αποδεκτές: 23 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 23 Αυγ 2012

Copyright: © Lohberger et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Graz (επιχορήγηση START), OeNB επιχορήγησης (# 14356) και επιχορήγηση «EccoCell» αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο πληθυσμός των κυττάρων των περισσότερων όγκων είναι ετερογενής όσον αφορά την ικανότητα πολλαπλασιασμού του και την ικανότητα να ξεκινήσει ο σχηματισμός όγκου σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια. Ένας καρκίνος βλαστοκυττάρων (CSC) ορίζεται ως ένα κύτταρο εντός ενός όγκου που διαθέτει την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και για τη δημιουργία των ετερογενών καταγωγές των καρκινικών κυττάρων που περιλαμβάνουν τον όγκο [1], [2]. Πολυάριθμες έρευνες απέδειξαν ότι υπάρχουν ΚΕΠ σε μια ποικιλία ανθρώπινων όγκων όπως αιματοποιητικές κακοήθειες, οι όγκοι του εγκεφάλου, καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος και γαστρεντερικές [3], [4], [5], [6].

κυτοσολίου αφυδρογονάσες αλδεΰδης (ALDHS) είναι μια ομάδα ενζύμων που εμπλέκονται στην οξείδωση μίας ευρείας ποικιλίας ενδοκυτταρικών αλδεϋδών στα αντίστοιχα καρβοξυλικά οξέα τους [7]. Μεταξύ διατριβές ένζυμα, ΑΙ_ϋΗ1 είναι σκέψης για να έχουν ένα σημαντικό ρόλο στην οξείδωση του αλκοόλ και της βιταμίνης Α και κυκλοφωσφαμίδη χημειοαντίσταση. Ginestier et al. [8] έδειξε ότι ΑΙ_ϋΗ1 ήταν ένας δείκτης κανονικών και κακοηθών ανθρώπινα μαστικά βλαστικών κυττάρων και ένα προγνωστικό δείκτη κακής κλινικής έκβασης των ασθενών με καρκίνο του μαστού. δραστηριότητα High ΑΙ_ϋΗ1 έχει χρησιμοποιηθεί για να καθορίσει βλαστικών κυτταρικών πληθυσμών σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου πολλαπλό μυέλωμα, οξεία μυελοειδή λευχαιμία [8], παγκρεατικό καρκίνο [9], και του καρκίνου του μαστού [10]. Ως εκ τούτου, η δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1 ενδέχεται να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ένα κοινό δείκτη για πληθυσμούς κακοήθων βλαστικών κυττάρων [11]. Η αποτυχία της χημειοθεραπείας του καρκίνου μπορεί να συμβεί μέσω της αυξημένης εκροή των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, οδηγεί στην μείωση των ενδοκυτταρικών επιπέδων του φαρμάκου και της επακόλουθης αναισθησία φαρμάκου. ABC μεταφορείς έχουν την ικανότητα να εξάγουν πολλά κυτταροτοξικά φάρμακα και τα τελευταία στοιχεία δείχνουν ότι ο φαινότυπος του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων σχετίζεται με την έκφραση υψηλού επιπέδου του μεταφορέα ABCG2 [12], [13], [14].

αυτή η μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία Aldefluor® και ανάλυση ενεργοποιημένης με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) για την απομόνωση ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα από πέντε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές σαρκώματος και ένας πρόσφατα εγκατεστημένος χόρδωμα κυτταρική γραμμή. Αναλύσαμε ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα

in vitro

για την ικανότητά τους την αύξηση του πληθυσμού, κλωνογενοποιήσεως, τις ιδιότητες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων και μεταφορείς ABC, και τις δυνατότητές τους αντοχή σε πολλά φάρμακα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Όλες οι κυτταρικές σειρές σαρκώματος του ανθρώπου (SW-684, SW-872, SW-982, SW-1353, και ΤΕ-671 λήφθηκαν από την CLS ( Eppelheim, Γερμανία) και καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco’s-τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM-F12) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1% Ε-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 0.25 μg αμφοτερικίνη Β κύτταρα MUG-Chor1 καλλιεργήθηκαν σε IMDM /RPMI 1649 (4:01) (ΡΑΑ, Pasching, Αυστρία) συμπληρωμένο με 1% Ε-γλουταμίνη και 1% ITS (ΡΑΑ). Όλες οι κυτταρικές επώαση διεξήχθη στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 και καλλιέργειες ελέγχονται περιοδικά για μυκοπλάσματος. Το μέσο καλλιέργειας και τα συμπληρώματα αγοράσθηκαν από την GIBCO®, Invitrogen (Darmstadt, Germany).

φθορισμού έναντι πρόσθιας σκέδασης δείχθηκε σε μια κηλίδα πυκνότητα από το (Α ) ϋΕΑΒ κύτταρα ελέγχου και (Β) κύτταρα ΑΙ_ϋΗ1 εκφράζουν (που ονομάζεται ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή). (C) έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε% των οριοθετημένα κυττάρων. Το υψηλότερο ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα αντιπροσωπεύεται από SW-684 κύτταρα (1,77 ± 0,9%? N = 12), SW-982 κύτταρα (2,23 ± 1,0%? N = 11), και SW-1353 κύτταρα (2,69 ± 1,3%? n = 8). (Δ) Μετά από δύο εβδομάδες καλλιεργηθεί η ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή πληθυσμιακή δημιουργείται ένα σημαντικά υψηλότερο υπόψη ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα. (Ε) Η αυξημένη δραστηριότητα ALDH επίσης αποδεικνύεται από κηλίδα western.

Η

Δοκιμασία Aldefluor® και διαχωρισμός του ΑΙ_ϋΗ1

+ πληθυσμό κυττάρων με FACS ανάλυση

Αλδεΰδη αφυδρογονάση (ALDH) ενζυμική δραστηριότητα σε βιώσιμα κύτταρα προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας φθορογόνου χρωστικής ουσίας με βάση Aldefluor® δοκιμασίας (Stem Technologies Cell, Grenoble, Γαλλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 × 10

6 /ml κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας Aldefluor® περιέχει υπόστρωμα ALDH (Bodipy-αμινοακεταλδεΰδης) και επωάστηκαν για 45 λεπτά στους 37 ° C. Ως έλεγχος αναφοράς, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει Aldefluor® υπόστρωμα παρουσία diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ), ένας ειδικός αναστολέας του ενζύμου ΑΙ_ϋΗ1. Τα φωτεινά φθορισμού ΑΙ_ϋΗ1-κύτταρα που εκφράζουν (ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή) ανιχνεύτηκαν στο πράσινο κανάλι φθορισμού (520-540 nm) της FACSAria (BD Biosciences, San Diego, CA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό DIVA FACS (BD Biosciences ). Για την εξαίρεση μη βιώσιμα κύτταρα ιωδιούχο προπίδιο. (ΡΙ? Sigma Aldrich, Βιέννη, Αυστρία) προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 2 μg /ml

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιώντας αντι-Ki-67 δείκτης πολλαπλασιασμού αποκάλυψε ένα μειωμένο επίπεδο πολλαπλασιασμού (Α) SW-1353 ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα και σε σύγκριση με το (Β) SW-1353 ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα. (Γ-Ε) Δυναμική καμπύλες πολλαπλασιασμού για ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα εμβολιάστηκαν στα 10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο μετριέται με το σύστημα xCELLigence.

Η

Ανασύσταση Δοκιμασία

Για να συγκρίνουμε την ικανότητα του σμήνους των σαρκώματος ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κυττάρων

in vitro

, πρόσφατα ταξινομημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωριστά υπό τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας. Μετά από 2 εβδομάδες, τα κύτταρα βάφεται εκ νέου με τον προσδιορισμό Aldefluor® και να αναλύονται μέσω FACSAria (BD Biosciences).

(Α) Η ποσοτικοποίηση της αποτελεσματικότητας σχηματισμού κλώνος από SW-684, SW-982, και ΝΔ -1353 κύτταρα. Δεδομένα από πέντε ανεξάρτητα πειράματα αντιπροσωπεύουν μέσο αριθμό αποικιών /και μετά από 14 ημέρες. (Β) Αντιπροσωπευτική αποικία μονάδες σχηματισμού από όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές.

Η

Ανάλυση Western Blot

Για ανάλυση ολικής πρωτεΐνης, τα κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCL ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 10% ΝΡ-40, 1% Triton-X και αναστολείς πρωτεάσης), επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στις 15.000 rpm για 15 λεπτά. Κλάσματα των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης (20μg) διαχωρίστηκαν σε 12% SDS-PAGE και ηλεκτρο-στυπώθηκε σε 0,45 μm Hybond ECL μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 3% ρυθμιστικό μπλοκαρίσματος γάλα για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Δεδομένου ότι το πρωτογενές αντίσωμα, πολυκλωνικό κουνελιού /αντισώματος ΑΙ_ϋΗ1 2 (# sc50385? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκε. Η κύρια συκώτι ισομορφή ΑΙ_ϋΗ1 εντοπίζεται στο κυτοσολικό χώρο, ενώ ALDH2 εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα (Dako, Βιέννη, Αυστρία) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και ο Supersignal® Δύση Pico χημικο-ακτινοβόλα Υπόστρωμα (Thermo Scientific, Rockford, IL), σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών.

το επίπεδο έκφρασης ομαλοποιήθηκε (ΔΟ

t) στην έκφραση του mRNA για GAPDH, ACTB και HPRT-n ως εσωτερικός έλεγχος και σε σύγκριση με το αντίστοιχο ΔΟ

t (ΔΔC

t) στους μάρτυρες. Οι κανονικοποιημένες επίπεδα έκφρασης από το (Α) c-Myc, (Β) β-κατενίνης, και (Γ) SOX-2 δείχθηκαν. (D) ABCG2 ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή σε σχέση με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα, ενώ οι τιμές ρ για το (Ε) ABCA2 δεν ήταν σημαντικές. (F) ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής SW-1353 κύτταρα παρουσίασαν επίσης σημαντική υψηλότερη έκφραση της ABCB1.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

Κάθε 1 × 10

4 ΑΙ_ϋΗ

υψηλής και ALDH

χαμηλή κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας πολυστυρενίου (BD Biosciences), μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλίνη /διάλυμα PBS, και να αφυδατωθεί σε μία σειρά αύξουσα του αλκοόλ. Ανοσοϊστοχημική (IHC) μελέτες χρησιμοποιώντας την στρεπταβιδίνης-βιοτίνης υπεροξειδάσης μέθοδος διεξήχθησαν χρησιμοποίηση αντισωμάτων έναντι του αντι- Ki-67 (κλώνος 30-9) κουνελιού μονοκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα (Ventana Medical Systems, Tucson, ΑΖ) χρησιμοποιώντας το σημείο αναφοράς Ultra όργανο ( Ventana Medical Systems). Τα κύτταρα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus BX51 με την Olympus DP71 μικροσκόπιο ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Οι χρωματισμένες πλάκες ψηφιακά σαρωθεί και θετικά και αρνητικά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageScope (ImageScope εικονική διαφάνεια, έκδοση 6.25, Aperio Technol., Vista, CA). Η θετικότητα = Ν θετικά κύτταρα /Ν συνολικών κυττάρων.

Και οι δύο subopulations υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0-5,0 μΜ δοξορουβικίνη, 0-5,0 μΜ επιρουβικίνη, 1-100 μΜ σισπλατίνη, και μετρήθηκαν μετά από 48 ώρες. Μέση τιμή ± SD όλων των μετρήσεων που είχε τοποθετηθεί σύμφωνα με την εξίσωση Hill. Σημαντικές διαφορές στις επιμέρους συγκεντρώσεις ενσωματώθηκαν στις καμπύλες.

Η

Σύστημα xCELLigence

Η συσκευή xCELLigence DP από την Roche Diagnostics (Mannheim, Γερμανία) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτική και δυναμικά την παρακολούθηση των κυττάρων πολλαπλασιασμός σε πραγματικό χρόνο [15]. Αντίστοιχα 1 × 10

4 προσφάτως ταξινομημένο ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες των ηλεκτρονικών μικροτίτλου (E-Plate ™? Roche Diagnostic) και μετρήθηκαν για 72 ώρες με το σύστημα xCELLigence σύμφωνα με τις οδηγίες στο εγχειρίδιο του χρήστη. Η εφαρμογή ενός χαμηλής τάσης (λιγότερο από 20 mV) AC σήμα οδηγεί στην παραγωγή ενός ηλεκτρικού πεδίου που αλληλεπιδρά με το ιοντικό περιβάλλον στο εσωτερικό των φρεατίων των E-πλάκες και διαφορικά διαμορφώνεται από τον αριθμό των κυττάρων στο φρεάτιο, ο μορφολογία των κυττάρων, και η δύναμη της προσκόλλησης των κυττάρων. μετρήσεις πυκνότητας κυττάρων πραγματοποιήθηκαν εις τετραπλούν με μια προγραμματισμένη ανίχνευση σήματος κάθε 20 λεπτά και κανονικοποιήθηκαν προς τη χρονική στιγμή 6 ώρες. απόκτηση και ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό RTCA (έκδοση 1.2, Roche Diagnostics).

Colony Δοκιμασία Σχηματισμού

Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα σχηματισμό κλώνος (CFE) των ταξινομημένων κυττάρων

in vitro

, ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή, ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα και μη χρωματισμένα κύτταρα (ελέγχου) μετρήθηκαν και 200 ​​κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε έξι φρεατίων. Τριπλά φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ομάδα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 με συμπληρώματα για 14 ημέρες, στερεώθηκαν σε μεθανόλη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (Sigma Aldrich, Αμβούργο, Γερμανία). αριθμός ο κλώνος, η οποία αποτελείτο από περισσότερο από 50 κύτταρα μετρήθηκε. Η CFE υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο:. (Ο αριθμός κλώνου /ο αριθμός επιστρώνονται κύτταρο) × 100

Real-Time ΚΤ-ΡΟΚ

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR διεξήχθη σύμφωνα με κριτήρια MIQE [16] για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση του ABC μεταφορέα γονιδίων ABCG2 /BCRP1, ABCA2, και ABCB1 /MDR1 και οι δείκτες βλαστική ικανότητα c-myc, β-κατενίνης, και SOX-2. Ολικό RNA απομονώθηκε με RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. DNA υποβλήθηκε σε πέψη με 1 U DNase (Fermentas, St.Leon-Rot, Γερμανία) ανά μα RNA. 1 μg RNA ήταν αντίστροφη σε μεταγραφή χρησιμοποιώντας RevertAid cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Real-time PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το Platinum SYBR Green Σούπερ Mix με ROX (Invitrogen) επί AB7900HT (Applied Biosystems, Invitrogen). Τα γονίδια housekeeping γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH), β-ακτίνη (ACTB) και φωσφοριβοσυλτρανσφεράση της υποξανθίνης (HPRT-n) χρησίμευσε ως εσωτερικός μάρτυρας λόγω της σταθερής έκφρασης τους σε διαφορετικούς ιστούς. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα αρχικά τεμάχια που χρησιμοποιούνται για PCR πραγματικού χρόνου. Τα επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν με βάση το 2

-ΔΔCT μέθοδο [17].

Drug Ευαισθησία Δοκιμασία

Ταξινόμηση κύτταρα ρυθμίζεται σε πυκνότητα 5 × 10

3 κύτταρα /100 μΐ και επωάστηκαν σε 96 φρεατίων μικροπλάκες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων (υδροχλωρική δοξορουβικίνη, υδροχλωρική επιρουβικίνη, και

cis

-diammineplatinum (II) χλωρίδιο (σισπλατίνη)? Sigma Aldrich) για 48 ώρες. Χημειοθεραπευτικοί ευαισθησία φαρμάκου προσδιορίστηκε με την MTS δοκιμασία (Promega, Mannheim, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες των κατασκευαστών σε quatruplicates χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (Spektramax?. BMG Labtech, Offenburg, Γερμανία) στο μήκος κύματος των 490 nm. IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν από τα δεδομένα αναστολής της ανάπτυξης.

Στατιστική Ανάλυση

Οι μεταβλητές έκβασης εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. το αταίριαστο φοιτητής

t-test

και δοκιμή του ακριβούς Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ των ομάδων με τα στατιστικά στοιχεία PASW 18 λογισμικό (IBM Corporation, Somers, Νέα Υόρκη). Δύο όψεων

P

-τιμές κάτω του 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. IC

50 καμπύλες προσαρμόστηκαν σύμφωνα με την εξίσωση Χιλ (σιγμοειδές, 3 παραμέτρους). Γραφικών στοιχείων παρασκευάστηκαν με SigmaPlot® (Systat Software Inc., San Jose, CA).

Αποτελέσματα

σάρκωμα κυττάρων Γραμμές Εμφανίζει ένα διακριτικό κλάσμα του ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα

το σύστημα δοκιμασίας Aldefluor® έχει αναπτυχθεί για την ανίχνευση της δραστικότητας της ισομορφής ΑΙ_ϋΗ1. Χρησιμοποιήσαμε αυτή την δοκιμασία που ακολουθείται από ανάλυση FACS για την αξιολόγηση της παρουσίας και της ποσότητας των ΑΙ_ϋΗ1

κυτταρικών πληθυσμών με υψηλή περιεκτικότητα σε πέντε ανθρώπινων κυττάρων του σαρκώματος γραμμές και ένα χόρδωμα κυτταρική σειρά [18].

Για να ορίσετε ένα δείκτη για ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα ϋΕΑΒ κύτταρα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια της ανάλυσης. Οι αντιπροσωπευτικές SW-1353 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την παρουσία του αναστολέα ϋΕΑΒ ΑΙ_ϋΗ1 (Σχήμα 1Α) ή βάφτηκαν με αντιδραστήριο Aldefluor®, οι οποίες ορίζονται ως ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα (Εικόνα 1Β). Οι διαλογή πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί τουλάχιστον πέντε φορές σε κάθε κυτταρική σειρά. Η ποσότητα του ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα παρέχονται στο μέσο ± SD ήταν 1,77 ± 0,9% για το ινοσαρκώματος κυτταρική γραμμή SW-684 (n = 12), 0.77 ± 0.4% για το λιποσάρκωμα κυτταρική γραμμή SW-872 (η = 5) , 2,23 ± 1,0% για το σάρκωμα αρθρικού γραμμή SW-982 (n = 11), και 2.69 ± 1.3% για την κυτταρική γραμμή χονδροσαρκώματος SW-1353 (n = 8), αντίστοιχα. Η χόρδωμα κυτταρική σειρά ΚΟΥΠΑ-Chor 1 έδειξε μόνο ένα μικρό ποσοστό των 1,11 ± 0,5% ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα (n = 9) (Σχήμα 1C). Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε στις τρεις κυτταρικές σειρές σαρκώματος SW-684, SW-982, και SW-1353 στα παρακάτω πειράματα. Στον προσδιορισμό ανανέωση του πληθυσμού η ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή πληθυσμιακή δημιουργείται μια στατιστική σημαντικά υψηλότερο υπόψη 41.73 ± 18,5% (* p = 0,0039) ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα στα SW-684 κύτταρα, 52,5 ± 8,75% (* p = 4,39 E-07) στην κυτταρική σειρά SW-982, και 31,7 ± 11,1% (* ρ = 0,0025) (n = 5) σε SW-1353 κύτταρα χονδροσαρκώματος (Εικόνα 1D). Πρόσθετες παρατηρήσεις μας για ενισχυμένη έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 θα μπορούσε να είναι περαιτέρω να τεκμηριώνεται με ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 1 Ε? Πίνακας 2).

ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα δείχνουν Ανώτατης διάδοση των πυρηνικών όπλων και κλωνογενοποιήσεως

Χρησιμοποιώντας το ImageScope λογισμικό Ki-67 θετικά και αρνητικά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετά ανοσοϊστοχημική χρώση. ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα από τις τρεις κυτταρικές σειρές έχουν ένα αυξημένο επίπεδο του πολλαπλασιασμού σε σχέση με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα. Εκπρόσωπος χρώση SW-982 ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή (Εικόνα 2Α) και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα (Εικόνα 2Β) παρουσιάζονται και συνοψίζονται στον Πίνακα 2 (n = 5). Επιπλέον, ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα διέφεραν σημαντικά σε λογαριθμική ταχύτητα ανάπτυξης μετριέται με το xCELLigence-System (Σχήμα 2C-Ε).

Σχήμα 3Α δείχνει την κλωνογόνο δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα. Δεδομένα από πέντε ανεξάρτητα πειράματα αντιπροσωπεύουν μέσο αριθμό αποικιών /και μετά από 14 ημέρες και όλες οι τιμές που αναφέρονται στον πίνακα 2. Η απόδοση σχηματισμού κλώνος ήταν σημαντικά υψηλότερη σε SW-1353 ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα σε σύγκριση με το αντίστοιχο ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα ( * ρ = 0,0005). Για τις άλλες δύο κυτταρικές σειρές θα μπορούσαν επίσης να αποδειχθεί αυτά επίδραση, ωστόσο σε μικρότερο βαθμό. Η αύξηση του αριθμού των αποικιών στο SW-684, SW-982, και SW-1353 ΑΙ_ϋΗ

υψηλής κύτταρα παρουσιάζεται (Σχήμα 3Β).

Η έκφραση του mRNA της ABCG2, c-myc, β- κατενίνης και SOX-2 αυξορυθμίζονται στα ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα

Ερευνήσαμε αν ΑΙ_ϋΗ1

τα υψηλά κύτταρα εμπλουτίζονται για την έκφραση των γονιδίων που έχουν προταθεί για να παίζουν σημαντικό ρόλο στον τομέα της βιολογίας των βλαστικών κυττάρων, όπως ως c-myc, β-κατενίνης, και SOX-2 [19]. Ποσοτική RT-PCR έδειξαν αυξημένη έκφραση του c-myc στην υψηλή πληθυσμό ΑΙ_ϋΗ1

, ενώ η μη ταξινομημένα κύτταρα ελέγχου (Ctrl) και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα είχε μόνο ελάχιστη έκφραση (Εικόνα 4Α). Ομοίως, μια μικρή αλλά όχι σημαντική αύξηση στην έκφραση του β-κατενίνης, και SOX-2 στο ΑΙ_ϋΗ1

υψηλό κλάσμα θα μπορούσε να παρατηρηθεί (η = 6) (Σχήμα 4Β-C).

Η σχετική έκφραση των τριών μεγάλων μεταφορείς ναρκωτικών ABCG2 /BCRP1, ABCA2, και ABCB1 /MDR1 προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (n = 5). Είναι ενδιαφέρον ότι ο ΑΙ_ϋΗ1

υψηλό πληθυσμό όλων των κυτταρικών σαρκώματος γραμμές καταδεικνύεται, με στατιστική σημασία, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ABCG2 σε σύγκριση με τον έλεγχο ή την ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα (Σχήμα 4D), ενώ η τιμή ρ για ABCA2 δεν ήταν σημαντική (Σχήμα 4Ε). Επιπλέον, σε ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής SW-1353 κύτταρα μια στατιστική σημαντική υψηλότερη έκφραση του ABCB1 (p = 0,0302) θα μπορούσε να παρατηρηθεί (Εικόνα 4F). Η 2

-ΔΔCT αξίες και τις αντίστοιχες τιμές ρ παρατίθενται στον Πίνακα 2.

ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα δείχνουν Ενισχυμένη Drug Resistance

Ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων υπόθεση προτείνει ότι η ασυμφωνία μεταξύ ανταπόκριση στη θεραπεία και την επιβίωση του ασθενούς σημειώνεται στους περισσότερους τύπους καρκίνου του αντικατοπτρίζει την εγγενή αντίσταση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία. Για να διερευνήσουν πιθανές διαφορές στην αντίσταση στο φάρμακο ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή ταξινομημένο SW-982 και SW-1353 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις των τριών που χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικών παραγόντων μετά από μια φάση ανάκαμψης δύο εβδομάδες. ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής SW-982 κύτταρα σε αγωγή για 48 ώρες με 1,0 μΜ (ρ = 0,016) και 5,0 μΜ (ρ = 0,001) δοξορουβικίνη ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα (Σχήμα 5Α). Η θεραπεία με 1.0 μΜ epirubicin (p = 0.045) προκάλεσε μια ενισχυμένη αντοχή φαρμάκου (Σχήμα 5Β). SW-1353 ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα έδειξαν παρόμοια σημαντική επίδραση μετά από την επεξεργασία με 5,0 μΜ δοξορουβικίνη (ρ = 2.77E-05) (Εικόνα 5D) και 0.5 μΜ epirubicin (p = 0.039) και 1.0 μΜ epirubicin (p = 0.021 ) (Σχήμα 5Ε). Η θεραπεία με σισπλατίνη προκάλεσε μόνο μικρές διαφορές μεταξύ ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή SW-982 και SW-1353 κύτταρα (Σχήμα 5C και 5F). Στην κυτταρική σειρά ινοσαρκώματος μπορούσαν να ανιχνευθούν SW-684 δεν σημαντικές διαφορές. Μέση τιμή ± SD όλων των πειραμάτων ήταν εξοπλισμένο σύμφωνα με την εξίσωση Hill. Το αντίστοιχο υπολογίζεται IC

Οι 50 τιμές που αναγράφονται στον Πίνακα 2.

Συζήτηση

Με βάση την τρέχουσα βλαστικών κυττάρων καρκίνου (CSC) υπόθεση, μόνο ένα μικρό υποπληθυσμό εντός του πληθυσμού ετερογενή όγκος είναι την ικανότητα έναρξης και την εκ νέου έναρξη των όγκων. Η έννοια της ΚΕΠ βασίστηκε στην παρατήρηση ότι όταν τα καρκινικά κύτταρα πολλών διαφορετικών τύπων προσδιορίστηκαν για πολλαπλασιαστικού δυναμικού τους σε διάφορους προσδιορισμούς

in vitro

και

in vivo

, μόνο μια μειοψηφία των κυττάρων έδειξε εκτεταμένο πολλαπλασιασμό [20]. Οι CSCs έχουν ταυτοποιηθεί σε μια ποικιλία κακοηθειών [21], [22], [23]. Μία widly αποδεκτή μέθοδος για την αναγνώριση ΚΕΠ βασίζεται στην ενζυματική δράση της αφυδρογονάσης αλδεΰδης 1 (ΑΙ_ϋΗ1), μια αποτοξίνωση ενζύμου που ευθύνεται για την οξείδωση της ενδοκυτταρικής αλδεϋδών [8], [21]. Υπάρχουν διαφορετικές ισομορφές της ALDH. Το σύστημα δοκιμασίας Aldefluor® έχει αναπτυχθεί για την ανίχνευση της δραστικότητας της ισομορφής ΑΙ_ϋΗ1. δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1 έδειξε να αυξηθεί σε ΚΕΠ και έχει χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση CSCs σε διαφορετικές μορφές καρκίνου [24], [25], [26]. Ως εκ τούτου, ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα εμφανίζουν αρκετά χαρακτηριστικά που παρατηρούνται συνήθως σε ΚΕΠ, συμπεριλαμβανομένης της δυνατότητας για την αυτο-ανανέωση, παραγωγή διαφοροποιημένων απογόνων και αυξημένη έκφραση γονιδίων δεικτών βλαστικών κυττάρων. Η μελέτη της CSC βιολογία στηρίζεται στην ικανότητα να αξιολογούν με ακρίβεια CSC εκπροσώπησης στο πλαίσιο των καρκινικών κυττάρων πληθυσμούς. Όπως προτείνεται από πιο πρόσφατα ευρήματα CSC αντιπροσώπευση μπορεί να είναι συνάρτηση του τύπου κυττάρου προέλευσης, στρωματικά μικροπεριβάλλον, συσσωρευμένη σωματικές μεταλλάξεις και το στάδιο των κακοήθων πρόοδο που επιτεύχθηκε από έναν όγκο [27], [28].

Μέχρι σήμερα , η ύπαρξη ενός τέτοιου πληθυσμού αρχέγονων κυττάρων που μοιάζουν σε ανθρώπινο οστεοσάρκωμα και κυτταρικές σειρές σάρκωμα Ewing έχει με βάση την έκφραση γονιδίων δεικτών βλαστικών κυττάρων καθώς και την ικανότητά τους να σχηματίζουν σφαιροειδή

in vitro

[29], [30], [31]. Έχει προταθεί ότι ο προσδιορισμός της CSC δεν μπορεί να στηριχθεί αποκλειστικά και μόνο από την πλευρά του πληθυσμού (SP) διαλογή χρησιμοποιώντας εκροή της Hoechst 33342 βαφής. Ωστόσο ο φαινότυπος SP δεν παρουσιάζονται σε όλα τα ΚΕΠ και μπορεί εκεί να υπάρχουν άλλοι αμυντικοί μηχανισμοί για να αποφύγουν ΚΕΠ φαρμακευτικές θεραπείες που δεν μπορεί να προσδιοριστεί από την Hoechst χρώση χρωστική [32]. Ως εκ τούτου, εμείς επιλέξαμε το δείκτη ΑΙ_ϋΗ1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι πέντε κυτταρικές σειρές σαρκώματος περιείχε διαφορετικό ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή κυττάρων, με το υψηλότερο ποσοστό στην ινοσάρκωμα, αρθρικό σάρκωμα, και κυτταρικές σειρές χονδροσαρκώματος. Το μικρό ΑΙ_ϋΗ1 έκφραση των χαμηλών κυττάρων ALDH

στην ανάλυση της κηλίδος western μπορεί να εξηγηθεί από τη χρήση του πρωτογενούς αντισώματος ΑΙ_ϋΗ1 /2. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού και κλωνογενοποιήσεως της SW-684, SW-982, και SW-1353 ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα

in vitro

ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο των ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα, σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά του η υψηλή φαινότυπος ΑΙ_ϋΗ1 δραστηριότητα σε άλλα καρκινικά κύτταρα [33], [34], η οποία μπορεί να υποδεικνύει ότι ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κυττάρων από σάρκωμα είναι εν μέρει υπεύθυνη για τη μετάσταση των όγκων και στην επανάληψη και θα πρέπει να επικεντρωθεί κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου. Όπως c-Myc έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής βιολογίας βλαστικών, μπορεί να χρησιμεύσει ως σύνδεσμος που συνδέει κακοήθεια και «βλαστική ικανότητα» [35]. Εισαγωγή του c-myc με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες (συμπεριλαμβανομένων των SOX-2) παράγει επάγεται βλαστοκυττάρων πολυδύναμων από διαφοροποιημένα κύτταρα [36]. Σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης παίζει σημαντικό ρόλο όχι μόνο στον καρκίνο, αλλά επίσης και σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου [37]. ποσοτικά δεδομένα μας RT-PCR έδειξαν αυξημένη έκφραση του c-myc, β-κατενίνης και SOX-2 στην υψηλή πληθυσμό ΑΙ_ϋΗ1

, ενώ η μη ταξινομημένα κύτταρα ελέγχου (Ctrl) και ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα είχαν μόνο ελάχιστη έκφραση.

Ένας προτεινόμενος μηχανισμός αντίστασης χημειοθεραπεία των βλαστοκυττάρων του καρκίνου βασίζεται στην ενισχυμένη έκφραση πρωτεϊνών μεταφοράς ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτας (ABC), οι οποίες είναι υπεύθυνες για την εκροή του φαρμάκου. Υψηλότερες έκφραση πρωτεϊνών μεταφοράς ABC σε βλαστικά κύτταρα σε σύγκριση με μη-βλαστικών κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα σχετική αντίσταση των βλαστικών κυττάρων στις τοξικές επιδράσεις των φαρμάκων χημειοθεραπείας [12], [13]. Αναλύσαμε την έκφραση του mRNA των τριών μεγάλων μεταφορέων ναρκωτικών (ABCG2 /BCRP1, ABCA2, ABCB1 /MDR1) της ABC οικογένειας μεταφορέα. Στην παρούσα μελέτη, ABCG2 ρυθμίζεται αυξητικά σε ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα από τις τρεις σάρκωμα γραμμές. Επιπλέον, ένα άλλο ABC μεταφορέα ABCB1 /MDR1 βρέθηκε επίσης με υψηλότερο επίπεδο έκφρασης mRNA σε SW-1353 ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή κυττάρων σε σύγκριση με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα. Αυτά τα γονίδια μπορεί να είναι υπεύθυνη για αντοχή πολυ-φαρμάκου των καρκινικών κυττάρων και θα πρέπει να είναι ιδανικοί στόχοι για τη θεραπεία κλινικών καρκίνου.

Πρόσθετες, ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα έδειξαν αυξημένη αντίσταση σε χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικά φάρμακα. ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα SW-982 και SW-1353 έδειξαν σημαντικά μικρότερη ευαισθησία τόσο δοξορουβικίνη και επιρουβικίνη σε σύγκριση με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα. Η θεραπεία σισπλατίνη έδειξε μόνο μικρές διαφορές. Μαζί, απομονωμένες επιτυχία ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα από διάφορες κυτταρικές σειρές σαρκώματος χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Aldefluor®. ΑΙ_ϋΗ1

υψηλής κύτταρα εκτίθενται

in vitro

ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό πολλαπλασιασμού, την αύξηση της αποτελεσματικότητας κλώνος σχηματισμό, αυξημένη έκφραση των μεταφορέων ABC και βλαστική ικανότητα δείκτη, καθώς και η αυξημένη χημειοαντοχή σε σύγκριση με ΑΙ_ϋΗ1

χαμηλή κύτταρα .

εν κατακλείδι, η παρουσία των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με αυξημένη έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 θα μπορούσε να είναι μία από τις πιθανές συνεισφέροντες στην ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου σε σαρκώματα. Η περαιτέρω μελέτη θα πρέπει να καθορίσουν τα βλαστικά κύτταρα σαρκώματος και τους μηχανισμούς της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, αλλά ΑΙ_ϋΗ1

υψηλή πληθυσμιακή μπορεί να χρησιμεύσει ως

in vitro

μοντέλο για να αναζητήσετε νέες επιλογές θεραπευτικής αγωγής.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω Heike Kaltenegger και Αλεξάνδρα Νόβακ για την άριστη τεχνική βοήθεια.