Αφηρημένο

Τα επίπεδα έκφρασης των anoctamin 1 (ANO1, TMEM16A), ένα κανάλι χλωριούχο ασβέστιο ενεργοποιείται (CACC) , είναι σημαντικά αυξημένα σε διάφορους όγκους, και η αναστολή της ANO1 είναι γνωστό ότι μειώνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Εδώ, πραγματοποιήσαμε διαλογή με βάση κύτταρα από μια συλλογή των φυσικών προϊόντων και φαρμακευτικών ενώσεων που μοιάζουν να πιστοποιηθούν αναστολείς της ANO1. Ως αποτέλεσμα του ελέγχου, ιδεβενόνη, μικοναζόλη και πλουμπαγκίνη ταυτοποιήθηκαν ως νέων αναστολέων ANO1. Ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες έδειξαν ότι η ιδεβενόνη, ένα συνθετικό ανάλογο του συνενζύμου Q10, εντελώς αποκλεισμένη δραστηριότητα ANO1 σε κύτταρα που εκφράζουν FRT ANO1 χωρίς καμία επίδραση στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση ασβεστίου και CFTR, ένα κανάλι χλωριούχο cAMP ρυθμίζονται. Οι δραστηριότητες CACC σε PC-3 και τα κύτταρα CFPAC-1 που εκφράζει άφθονα ενδογενή ANO1 έντονα μπλοκαριστεί από ιδεβενόνη. Η ιδεβενόνη ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που επάγεται σε PC-3 και τα κύτταρα CFPAC-1, αλλά όχι σε κύτταρα Α549, τα οποία δεν εκφράζουν ANO1. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ιδεβενόνη, ένα μυθιστόρημα αναστολέας ANO1, έχει τη δυνατότητα για χρήση στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Seo Υ, το Park J, Kim M, Λι Χονγκ Κονγκ, Kim J-Η, Jeong J-H, et al. (2015) Αναστολή της ANO1 /TMEM16A Chloride Κανάλι από ιδεβενόνη και κυτταροτοξικότητα του να Lines Cancer Cell. PLoS ONE 10 (7): e0133656. doi: 10.1371 /journal.pone.0133656

Επιμέλεια: Johannes Reisert, Monell Κέντρο Χημικών Αισθήσεων, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15 Απριλίου 2015? Αποδεκτές: 29, Ιουνίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιούλη, 2015

Copyright: © 2015 Seo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο Yonsei Παγκόσμια Ειδίκευση έργο του 2014, μια επιχορήγηση της Κορέας Υγείας τεχνολογία R & amp? D έργου, Υπουργείο Υγείας & amp? . Πρόνοιας Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (HI08C2149) και Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας [NRF-2012R1A1A1040142]

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Η συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ασβέστιο που ενεργοποιείται Cl

-. κανάλια (CaCCs) εκφράζονται ευρέως σε διάφορους τύπους κυττάρων και ιστών, και εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές δραστηριότητες όπως τα επιθηλιακά έκκριση υγρών, συστολή λείου μυός, αισθητήρια και μεταγωγή σήματος [1-3]. CaCCs περιγράφηκαν για πρώτη φορά πριν από πάνω από 3 δεκαετίες, αλλά η μοριακή ταυτότητα του CaCCs έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί [4]. Το 2008, τρεις ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες ανέφεραν ότι anoctamin-1 γονιδίου (ANO1, TMEM16A) κωδικοποιεί μια CACC, δείχνοντας ασβέστιο ενεργοποιείται Cl

– ρευμάτων όταν εκφράζεται σε ωοκύτταρα και κύτταρα θηλαστικών [5-7]. ANO1 εκφράζεται σε διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων της τραχείας, εντερική, και αδενικά επιθήλια, κύτταρα λείου μυός, εντερικά κύτταρα βηματοδότη, αισθητήριων νευρώνων, και αρκετοί όγκοι [5, 7-9].

ANO1 ήταν επίσης γνωστή ως ανακαλυφθεί επί GIST-1 (DOG1), όγκου ενισχύονται και υπερεκφράζονται αλληλουχία 2 (TAOS2), και καρκίνο του στόματος υπερεκφράζεται 2 (ORAOV2) [10, 11]. DOG1, TAOS2 και ORAOV2 ονομάζονται έτσι επειδή ANO1 έντονα υπερεκφράζεται σε γαστρεντερικών στρωματικών όγκων (GIST) και από του στόματος καρκινώματα πλακωδών κυττάρων. ANO1 χαρτογραφείται στο χρωμοσωμικό ζώνη 11q13 που συχνά ενισχύεται σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκινωμάτων συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος κεφαλής και του λαιμού πλακωδών κυττάρων (HNSCC), GIST, του μαστού και του καρκίνου του προστάτη. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν σημαντική συμμετοχή ANO1 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, κυτταρική μετανάστευση, ογκογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου [12, 13]. Για παράδειγμα, η αναστολή της έκφρασης ANO1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC-3 μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, τη μετάσταση και εισβολή, και μπλοκάρει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού [14]. Η φαρμακολογική αναστολή της ANO1 με Τ16Α

inh-A01, ένας εκλεκτικός αναστολέας ANO1, μειωμένη πολλαπλασιασμό κύτταρα Cajal (ICC) και CFPAC-1 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα που εκφράζουν ενδογενή ANO1 [15]. Σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης γονιδίου ANO1 μειωμένη πολλαπλασιασμό, προκάλεσε την απόπτωση, και ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Επιπλέον, η φαρμακολογική αναστολή της δραστηριότητας CACC του ANO1 μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα σε HNSCC, κύτταρα οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) και του καρκίνου του μαστού μέσω αναστολής του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και εξαρτώμενη από καλμοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση II (ΟΑΜΚΙΙ) σηματοδότησης [16 ].

Οι περισσότερες ενδείξεις δείχνουν ότι η φαρμακολογική αναστολή της δραστηριότητας του καναλιού ANO1 μπορεί να έχει τη δυνατότητα να παρέχει θεραπευτικά οφέλη σε HNSCC, ESCC, GIST, του μαστού και ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Δεδομένου ότι έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί ANO1, μόνο λίγες ενώσεις ταυτοποιήθηκαν ως ισχυροί αναστολείς ANO1 όπως CACC

inh-A01, ταννικό οξύ, Τ16Α

inh-A01, διγαλλικού οξύ, διχλωρoφαίνη, βενζοβρωμαρόνη, και Ν – ((4 -μεθοξυ) -2-ναφθυλ) -5-νιτροανθρανιλικό οξύ (Monna). Επιπλέον, φαρμακολογικές ιδιοκτησίας και οι μηχανισμοί δράσης των αναστολέων είναι ακόμα ασαφής [17-21].

Για την ταυτοποίηση νέων αναστολέων ANO1, πραγματοποιήσαμε μια διαλογή με βάση κύτταρα με μια συλλογή φυσικών προϊόντων και φαρμάκων -όπως ενώσεις χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία διαλογής υψηλής απόδοσης που βασίζονται σε κύτταρα που καθορίστηκε για την ταυτοποίηση των αναστολέων ANO1 σε προηγούμενη μελέτη [19]. Βρήκαμε μερικά φάρμακα όπως οι ενώσεις και τα φυσικά προϊόντα που δείχνει ισχυρή ανασταλτική δράση ANO1, και διερευνήθηκε η επίδραση των ενώσεων χτύπημα στην αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυτταρικών γραμμών, τα οποία εκφράζουν ενδογενώς ANO1.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά και διαλύματα

ιδεβενόνη, συνένζυμο Q10, plumbagin, μικοναζόλη, και άλλες χημικές ουσίες, εκτός αν υποδεικνύεται διαφορετικά, αγοράστηκαν από την Sigma. Ποντίκι ANO2 αγοράστηκε από ΟηΟεηε Technologies Inc. (Rockville, MD, USA, Κατάλογος Νο MC205812). Η συλλογή ένωση που χρησιμοποιείται για τον έλεγχο (Spectrum Collection, 2320 ενώσεις) αγοράστηκε από Microsource Discovery Inc. (Gaylordsville, CT). Αυτή η βιβλιοθήκη αποτελείται από ανθρώπινα θεραπευτικά φάρμακα ή ενώσεις φαρμάκων που μοιάζουν και φυσικά προϊόντα. Οι ενώσεις αραιώθηκαν με DMSO για να επιτευχθεί μια συγκέντρωση 2,5 mM. Αυτό χρησιμοποιήθηκε ως το 100χ συγκεντρωμένο διάλυμα αποθέματος το οποίο υποβλήθηκε σε επεξεργασία επί των κυττάρων.

Κυτταροκαλλιέργεια

Fisher θυρεοειδούς κύτταρα αρουραίου (FRT) διαμολύνθηκαν σταθερά με ανθρώπινο ANO1 (ABC) ή ανθρώπινο άγριου Τύπος CFTR χωριστά, και τα δύο από τα κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με τον αισθητήρα αλογονίδιο YFP-H148Q /I152L /F46L ή YFP-H148Q, όπως περιγράφεται στο προηγούμενο μελέτη [20, 22]. κύτταρα FRT διαμολύνθηκαν σταθερά με το ποντίκι ANO2 (ΟηΟεηε Technologies Inc.) και ο αισθητήρας αλογονίδιο YFP-F46L /H148Q /I152L. κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε FRT Coon`s τροποποιημένο μέσο F12 συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. PC3 και ΗΤ-29 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) που περιέχει 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. κύτταρα CFPAC-1 αναπτύχθηκαν σε Τροποποιημένο κατά Iscove το Dulbecco Μέσο (IMDM) συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη.

Κυττάρων προσυμπτωματικό έλεγχο

ANO1 /TMEM16A και YFP κύτταρα που εκφράζουν FRT απλώθηκαν σε 96-φρεατίων με μαύρα τοιχώματα μικροπλάκες (Corning Inc., Corning, ΝΥ) σε πυκνότητα 20.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μέσο Ρ12 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /mL πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Προσδιορισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας Fluostar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Γερμανία) και MARS Λογισμικό Data Analysis (BMG Labtech). Κάθε φρεάτιο της πλάκας 96-φρεατίων πλύθηκε 3 φορές σε PBS (200 μί /πλύση), αφήνοντας 100 μL PBS. Οι ενώσεις δοκιμής (1 μί) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε 25 μΜ τελική συγκέντρωση. Μετά από 10 λεπτά, οι πλάκες 96 φρεατίων μεταφέρθηκαν σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας για προσδιορισμό φθορισμού. Κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε ξεχωριστά για TMEM16A μεσολάβηση I

– εισροή καταγράφοντας φθορισμό συνεχώς (400 ms ανά σημείο) για 2 s (βασική γραμμή), στη συνέχεια 100 μL 140 mM I

– προστέθηκε διάλυμα που περιέχει 200 ​​μΜ ΑΤΡ σε 2 s και στη συνέχεια YFP φθορισμός καταγράφηκε για 6 s. Αρχικές ρυθμός εισροής ιωδιούχο προσδιορίστηκε από την αρχική κλίση της μείωσης φθορισμού, με μη γραμμική παλινδρόμηση, μετά την έγχυση ιωδιούχου με ΑΤΡ.

Ussing τμήμα μελέτη

ένθετα δηβρννβΙΙ περιέχουν ANO1- ή CFTR εκφράζουν FRT κύτταρα τοποθετούνται σε θαλάμους Ussing (φυσιολογικός Instruments, San Diego, CA). Το βασεοπλευρικό λουτρό πληρώθηκε με την ΕΤ

3

– ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει (σε ​​mM): 120 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl

2, 1 CaCl

2, 10 D-γλυκόζη, 2,5 HEPES, και 25 NaHCO

3 (ρΗ 7.4), και το ακραίο λουτρό πληρώθηκε με ένα μισό-Cl

– λύση. Στο μισό-Cl

– διάλυμα 65 mM NaCI στο ΕΤ

3

– ρυθμιστικό διάλυμα αντικαταστάθηκε από Na-γλυκονικό. Το βασεοπλευρικό μεμβράνη διαπερατά με 250 μg /mL αμφοτερικίνη Β κύτταρα λούζονται για μία περίοδο σταθεροποίησης 20 λεπτών και αερίζεται με 95% O

2/5% CO

2 στους 37 ° C. ΑΤΡ εφαρμόστηκε στην κορυφαία διάλυμα του λουτρού για να επάγει ενδοκυτταρική αύξηση ασβεστίου? ιδεβενόνη, φορσκολίνη και CFTR

inh-172 προστέθηκαν στην κορυφαία και βασεοπλευρικό διάλυμα λουτρού. Ακραίο ρεύματα μεμβράνης μετρήθηκαν με EVC4000 Multi-Channel V /I Clamp (World Precision Instruments, Sarasota, FL) και καταγράφονται χρησιμοποιώντας PowerLab 4/35 (Όργανα μ.Χ., Castle Hill, Αυστραλία). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με λογισμικό απόκτησης ADInstruments Labchart Pro 7 λογισμικού. Ο ρυθμός δειγματοληψίας ήταν 4 Hz.

Patch-clamp

ολόκληρου κυττάρου καταγραφές patch-clamp έγιναν σε ANO1-κύτταρα που εκφράζουν FRT και τα κύτταρα PC3. Το διάλυμα λουτρού περιείχε (σε mM): 140 NMDG-Cl, 1 CaCl

2, 1 MgCl

2, 10 γλυκόζη και 10 HEPES (ρΗ 7,4). Το διάλυμα της πιπέτας περιείχε (σε mM): 130 ΟδΟΙ, 0,5 EGTA, 1 MgCl

2, 1 Τρις-ΑΤΡ, και 10 HEPES (ρΗ 7,2). Σιφώνια τραβήχτηκαν από βοριοπυριτικό γυαλί και είχαν αντιστάσεις 3-5 ΜΩ μετά στίλβωση φωτιά. Μετά τον καθορισμό της διαμόρφωσης ολόκληρου κυττάρου, ANO1 ενεργοποιήθηκε με ΑΤΡ (100 μΜ). Ολόκληρων κυττάρων ρεύματα που προκαλούνται από την εφαρμογή υπερπόλωσης και αποπόλωσης παλμοί τάσης από ένα δυναμικό κράτησης 0 mV σε δυναμικά μεταξύ -80 mV και +80 mV σε βήματα των 20 mV. Ηχογραφήσεις έγιναν σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας ένα Axopatch-200B (Αχοη Instruments, Union City, CA). Ρεύματα ψηφιοποιήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μετατροπέα Digidata 1440A (Αχοη Instruments), και pCLAMP 10.2 λογισμικού (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Τα ρεύματα φιλτράρεται κατωπερατά σε 1 kHz και δείγματα στα 5 kHz.

Ανοσοστύπωμα

Εκχυλίσματα κυττάρων και ανοσοστύπωμα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 και Α549 κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 1% Nonidet Ρ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM na

3νο

4, και αναστολέα πρωτεάσης μείγμα). Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 15,000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθεί το απόρριμμα κυττάρου, και ίσες ποσότητες (80 μg πρωτεΐνης /λωρίδα) του υπερκειμένου πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 4-12% Τπδ-γλυκίνη γέλη προκατασκευασμένα (KOMA BIOTECH, Σεούλ, Κορέα) και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF (Millipore, Billerica, ΜΑ). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (50 mM Tris-Cl, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl), συμπεριλαμβανομένων 0,1% Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτή η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε για μία νύχτα με αντίσωμα πρωτογενούς ANO1 (μία γενναιόδωρη προσφορά των Νέων Duk Yang, Πανεπιστήμιο CHA). Μετά από πλύση με 0.1% Tween 20 σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα (TBST), η κηλίδα επωάστηκε περαιτέρω για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ένα δευτερεύον αντίσωμα αντι-κουνελιού (Cell Signaling). Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε τρεις φορές με TBST για 5 λεπτά και στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το ECL Plus δυτικό σύστημα κηλίδωση ανίχνευσης (GE Healthcare Amersham? Piscataway, NJ).

ενδοκυτταρικό ασβέστιο μέτρηση

FRT και ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων με μαύρα τοιχώματα μικροπλακών και φορτώθηκαν με Fluo-4 NW σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος ανιχνεύσεως (ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hanks 1Χ »με 2.5 mM προβενεσίδη και 20 mM HEPES), συμπεριλαμβανομένων Fluo-4 NW. Μετά από 1 ώρα επώασης, οι πλάκες 96 φρεατίων μεταφέρθηκε σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας για προσδιορισμό φθορισμού. Fluo-4 φθορισμός μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας Fluostar Omega (BMG Labtech) εφοδιασμένο με αντλίες σύριγγας και προσαρμοσμένες Fluo-4 διέγερσης /εκπομπής φίλτρα (485/538 nm,). Ενδοκυτταρικό ασβέστιο ήταν αύξηση με εφαρμογή 100 μΜ ΑΤΡ.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

PC3, CFPAC-1 και τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων. Μετά από επώαση 24 ωρών, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του idebenone (3, 10, 30 μΜ), το συνένζυμο Q10 (100 μΜ) και Τ16Α

inh-A01 (10 μΜ), και στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ημέρες. Μία ίση ποσότητα DMSO προστέθηκε στο κάθε έλεγχο. Το μέσο καλλιέργειας και οι ενώσεις αλλάζονται κάθε 12 ώρες. Για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, μετά από 48 ώρες επώασης με τις ενώσεις, BrdU (τελική συγκέντρωση: 10 μΜ) προστέθηκε και τα κύτταρα επωάζονται εκ νέου για επιπλέον 2 ώρες. ενσωμάτωσης BrdU προσδιορίζεται με ELISA κυτταρικού πολλαπλασιασμού, BrdU (χρωματομετρική) κιτ (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Για τη δοκιμασία MTS, μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα επωάζονται εκ νέου με MTS για 1 ώρα. Το διαλυτό φορμαζάνης που παράγεται από την κυτταρική μείωση του MTS ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm με άπειρη M200 (Tecan, Grödig, Αυστρία) αναγνώστη μικροπλακός. δοκιμασία MTS έγινε χρησιμοποιώντας CellTiter 96 Υδατικό One Solution κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega, Madison, WI, USA).

πληγών επούλωσης δοκιμασία

κινητικότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία γρατσουνιά πληγή. PC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων έως ότου ήταν συρρέοντα. Η κυτταρική στιβάδα τραυματίστηκε χρησιμοποιώντας ένα 96-Well WoundMaker (Essen BioScience, Michigan, USA) και πλύθηκαν δύο φορές με μέσο ελεύθερο φρέσκο ​​ορό. Τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσο χωρίς ορό, και οι εικόνες των τραυμάτων ελήφθησαν αυτόματα κάθε 2 ώρες για 48 ώρες με τη χρήση του IncuCyte ZOOM (Essen BioScience). Οι εικόνες αναλύθηκαν από το πακέτο λογισμικού IncuCyte (Έσσεν BioScience).

δοκιμασίες ΤΟΥΝΕΛ

PC3, CFPAC-1 και Α549 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων με μαύρα τοιχώματα μικροπλάκες. Μετά από επώαση 24 ωρών, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ιδεβενόνη (30 μΜ) και στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με TUNEL (τερματική τρανσφεράση δεσοξυνουκλεοτιδίων μεσολάβηση dUTP nick-τελική σήμανση, πράσινο) χρησιμοποιώντας το ApopTag Φλουορεσκεΐνη Direct In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), και στη συνέχεια πυρήνας βάφτηκαν με DAPI ( 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, μπλε).

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα πολλαπλών πειραμάτων παρουσιάζεται ως το μέσο ± SE Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με t-test του Student ή με ανάλυση της διακύμανσης ανάλογα με την περίπτωση. Η τιμή του

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση ANO1 /TMEM16A αναστολείς

Ένα κύτταρο προσυμπτωματικό έλεγχο της συλλογής των φυσικών προϊόντων και φαρμάκων όπως ενώσεις έγινε για η ταυτοποίηση των αναστολέων ANO1. δραστηριότητα του καναλιού χλωριούχο ANO1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Fischer θυρεοειδούς αρουραίου (FRT) κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την ανθρώπινη ANO1 και το γενετικά κωδικοποιημένα ιωδιούχο-αισθητήρια φθορίζουσα πρωτεΐνη, YFP-F46L /H148Q /I152L. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, για την διαλογή για να πιστοποιηθούν αναστολείς ANO1, τα κύτταρα FRT προ-επωάστηκαν με τις ενώσεις δοκιμής σε PBS πριν από την προσθήκη ενός ιωδιούχου και ΑΤΡ, έναν αγωνιστή του υποδοχέα πουρινεργικών Ρ2 η οποία προκαλεί μια αύξηση στην ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου, που περιέχουν διάλυμα. Με την παρουσία του αναστολέα ANO1, YFP απόσβεση φθορισμού από ιωδιούχο πρόσληψη μέσω ANO1 θα ανασταλεί.

(Α) Αρχή της, προσδιορισμού διαλογής υψηλής απόδοσης με βάση τα κύτταρα φθορισμός. (Β) Χημικές δομές των αναστολέων ANO1. (Γ) YFP φθορισμός μετράται σε μεμονωμένες κοιλότητες των πλακών 96-φρεατίων, που δείχνει ανασταλτική επίδραση της ιδεβενόνης, μικοναζόλη και πλουμπαγκίνη για δράση διαύλου ANO1. Ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του idebenone, μικοναζόλη και πλουμπαγκίνη προστέθηκαν 20 λεπτά πριν από την ενεργοποίηση ANO1 από 100 μΜ ΑΤΡ

Η

Η διαλογή των 2320 ενώσεων απέδωσε 24 ενώσεις που μπλοκάρει ιωδιούχου εισροή από & gt.? 70% στα 25 μΜ. Βρήκαμε τρεις νέους αναστολείς ΑΝΩ, ιδεβενόνη, πλουμπαγκίνη και μικοναζόλη, από τις πρωτογενείς ενώσεις χτύπημα. Η ιδεβενόνη, πλουμπαγκίνη και μικοναζόλη ανέστειλαν σημαντικά τη δραστηριότητα του καναλιού χλωριούχο ANO1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και πλήρως ανέστειλε ANO1 στους 30 μΜ (Σχήμα 1 C).

Χαρακτηρισμός του idebenone

ιδεβενόνη μελετήθηκε περαιτέρω επειδή ιδεβενόνη , ένα συνθετικό ανάλογο του συνενζύμου Q10 (CoQ10), εμφανίζει ισχυρή και εκλεκτική αναστολή της ANO1, και χρησιμοποιείται ευρέως ως ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό. Apical μέτρηση ρεύματα μεμβράνης σε ANO1 κύτταρα που εκφράζουν FRT έδωσε ένα IC

50 9,2 μΜ για ιδεβενόνη και δείχνουν σχεδόν πλήρη αναστολή των ρευμάτων χλωριούχου ANO1 από 30 μΜ idebenone (σχήμα 2Α και 2Β). Για να διερευνηθεί η επίδραση της ιδεβενόνης στην ενδοκυτταρικής σηματοδότησης ασβέστιο, ΗΤ-29 και FRT κύτταρα φορτώθηκαν με Fluo-4 NW, μία φθορίζουσα αισθητήρα ασβεστίου. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 30 μΜ ιδεβενόνη και στη συνέχεια ΑΤΡ εφαρμόζεται σε μια συγκέντρωση 100 μΜ επάγεται παροδική αύξηση του κυτοσολικού συγκέντρωση ασβεστίου. Η ΑΤΡ-επαγόμενη αύξηση κυτοσολικού ασβεστίου δεν επηρεάστηκε σημαντικά από idebenone (Σχήμα 2C). Για να διαλευκανθεί αν idebenone μεταβάλλει τα άλλα κανάλια χλωριούχο, κυστική ίνωση διαμεμβρανικής αγωγιμότητας ρυθμιστή (CFTR) και ANO2 (TMEM16B), το οποίο μοιράζεται μια υψηλή ομολογία αμινοξέων με ANO1, μετρήσαμε ακραία ρεύματα μεμβράνης σε κύτταρα FRT που εκφράζουν ανθρώπινο CFTR και ποντικού άγριου τύπου ANO2 (mANO2). δραστηριότητα του καναλιού CFTR επηρεάστηκε μόνο λίγο από ιδεβενόνη. Είναι ανέστειλε CFTR κατά 8,2 ± 0,2% στα 30 μΜ, μία συγκέντρωση που αναστέλλει πλήρως ANO1 (Σχήμα 2D), αλλά, όπως ήταν αναμενόμενο, η ιδεβενόνη παρεμποδίζει ισχυρά 100 μΜ ενεργοποίηση ΑΤΡ που προκαλείται από mANO2 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα FTR-mANO2 ( Σχήμα 2Ε). Μετρήσαμε ακραία ρεύματα μεμβράνης να παρατηρηθεί η επίδραση του CoQ10 στην δραστικότητα διαύλου ANO1 σε κύτταρα FTR-ANO1 επειδή idebenone είναι ένα ανάλογο μικρής αλυσίδας του CoQ10. Όπως φαίνεται στο Σχ 2F, 100 μΜ CoQ10 δεν αναστέλλει ΑΤΡ-επαγόμενων ρευμάτων χλωριούχο ANO1. Για να διερευνηθεί κατά πόσο ιδεβενόνη αναστέλλει αντιστρεπτά ANO1, μετρήσαμε ακραία ρεύματα μεμβράνης σε FTR-ANO1 κελί με E

πράξη, ένα συγκεκριμένο ενεργοποιητή του ANO1. Προεπεξεργασία 100 μΜ idebenone ανέστειλε πλήρως E

πράξη επαγόμενη ενεργοποίηση ANO1 (Σχήμα 2G). Όπως φαίνεται στο Σχ 2Η, προεπεξεργασία των 100 μΜ idebenone παρεμπόδισε πλήρως την ενεργοποίηση ANO1 ΑΤΡ-επαγόμενη. Ωστόσο, μετά έκπλυση, το μεγαλύτερο μέρος της ανασταλτικής δράσης της ιδεβενόνης στην ενεργοποίηση ANO1 από Ε

πράξη απομακρύνθηκε. Ιδεβενόνη αναστέλλει έτσι αναστρέψιμα ANO1 χωρίς μεταβολές στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση ασβεστίου.

(Α) Apical ρεύματα μεμβράνης μετρήθηκαν σε κύτταρα FRT-ANO1. Η ιδεβενόνη προστέθηκαν 10 λεπτά πριν από την ενεργοποίηση ANO1 με 100 μΜ ΑΤΡ. (Β) Περίληψη της δόσης-απόκρισης (μέση ± S.E., η = 3-4). (Γ) Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Fluo-4 σε ΗΤ-29 και τα κύτταρα FRT. 30 μΜ ιδεβενόνη (IDE), μικοναζόλη (MCZ) και πλουμπαγκίνη (PLB) προκατεργάστηκαν για 20 λεπτά και στη συνέχεια εφαρμόστηκε 100 μΜ ΑΤΡ. (D) Επίδραση της ιδεβενόνης στην δραστικότητα διαύλου χλωριούχου CFTR μετρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν ανθρώπινο FRT φυσικού τύπου CFTR. CFTR ενεργοποιήθηκε με 20 μΜ φορσκολίνη και αναστέλλεται από 10 μΜ CFTR

INH-172. (Ε) Επίδραση της ιδεβενόνης στο ποντίκι ANO2 (mANO2) μετρήθηκε σε κύτταρα FRT-mANO2. (F) Επίδραση συνένζυμο Q10 (CoQ10) για τη δραστηριότητα του καναλιού ANO1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα FRT-ANO1. 100 μΜ CoQ10 προκατεργάστηκε για 20 λεπτά και στη συνέχεια εφαρμόστηκε 100 μΜ ΑΤΡ. (Δεξιά) Περίληψη του ρεύματος κορυφής (μέσος όρος ± Τ.Α., n = 3-4). (G) Επίδραση της ιδεβενόνης στην ενεργοποίηση ANO1 από Ε

πράξη ANO1-κύτταρα που εκφράζουν FRT. 100 μΜ ιδεβενόνη (γκρι γραμμή) ήταν προεπεξεργασία για 20 λεπτά και ANO1 ενεργοποιήθηκε με 10 μΜ Ε

πράξης. Τα υπόλοιπα ρεύματα ANO1 ανεστάλησαν από Τ16Α

ΙΝΗ-A01. (Δεξιά) Σύνοψη των ρεύματος αιχμής (μέση ± S.E., η = 3). (H) αναστρεψιμότητα ιδεβενόνη. Μετά vanishment 100 μΜ ΑΤΡ που προκαλείται ANO1 ρεύμα, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές για 5 λεπτά η κάθε μία και κατόπιν ANO1 ενεργοποιήθηκε με 10 μΜ Ε

πράξη. (Δεξιά) Σύνοψη των ρεύματος αιχμής (μέση ± S.E., η = 3). ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, unpaired t-test μαθητές ».

Η

ολόκληρου κυττάρου patch clamp σε FRT-ANO1 και PC-3 κύτταρα

Στο Σχήμα 3, ολόκληρων κυττάρων ανάλυση καθήλωσης έγινε να καθορίσει τους μηχανισμούς αναστολής της ιδεβενόνης. Σε κύτταρα που εκφράζουν FRT ANO1, εφαρμογή των 10 μΜ ανέστειλε idebenone ΑΤΡ-επαγόμενων ρευμάτων χλωριούχο ANO1 σε όλες τις τάσεις, υποδεικνύοντας ότι έχει την ανασταλτική δράση μέσω μιας τάσης-ανεξάρτητο μηχανισμό (Σχήμα 3Α). μέτρηση Patch clamp ολικού κυττάρου ρεύματα στο PC-3 (αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου προστάτη προερχόμενα) κύτταρα που εκφράζουν υψηλό επίπεδο ANO1 έδειξε ότι ιδεβενόνη στα 10 μΜ και 30 μΜ αναστέλλει ΑΤΡ-επαγόμενα ρεύματα CaCCs χλωρίδιο με ~ 54% και ~ 90%, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β).

(Α) (αριστερά) ολόκληρου κυττάρου ANO1 ρεύμα καταγράφονται σε ένα δυναμικό κράτημα σε 0 mV και πάλλεται σε τάσεις μεταξύ ± 80 mV (σε βήματα των 20 mV) υπό την απουσία και παρουσία 10 μΜ idebenone. ANO1 ενεργοποιήθηκε με 100 μΜ ΑΤΡ. (Κέντρο) ρεύματος /τάσης (Ι /V) διάγραμμα της μέσης ρευμάτων στο μέσον του κάθε παλμού τάσης. (Δεξιά) Τα ιστογράμματα συνοψίζουν τα δεδομένα πυκνότητα ρεύματος που μετράται στο + 80 mV (μέσος όρος ± Τ.Α., n = 4). (Β) (αριστερά) ηχογραφήσεις ολόκληρου κυττάρου patch clamp των κυττάρων PC3. CACC ρεύματα καταγραμμένα υπό την απουσία και παρουσία της idebenone. CACC διεγέρθηκε με 100 μΜ ΑΤΡ. (Κέντρο) ρεύματος /τάσης (Ι /V) διάγραμμα της μέσης ρευμάτων στο μέσον του κάθε παλμού τάσης. (Δεξιά) Τα ιστογράμματα συνοψίζουν τα δεδομένα πυκνότητα ρεύματος που μετράται στο + 80 mV (μέσος όρος ± Τ.Α., n = 4). ** P & lt? 0,01, unpaired t-test φοιτητών.

Η

αναστολείς ANO1 μειώνουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος

Τρεις τύποι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος ελέγχθηκαν για να προσδιοριστεί η επίδραση της ιδεβενόνης στην η δραστικότητα ενδογενούς CaCCs και την κυτταρική ανάπτυξη και τη μετανάστευση. Κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι η ενδογενής ANO1 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε PC3 και CFPAC-1 (αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου ανθρώπινα προερχόμενα) κύτταρα αλλά όχι σε Α549 (πνεύμονας αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου προέρχονται) κύτταρα (Σχ 4Α). Ο φθορισμός YFP δοκιμασία σβέση με κύτταρα CFPAC-1 που εκφράζει το αλογονίδιο ανιχνεύσεως μεταλλάκτη YFP αποκάλυψε ότι ιδεβενόνη μπλοκάρει ισχυρά ενεργοποίηση χλωριούχου διαύλου CACC ΑΤΡ που προκαλείται σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β). Για να διερευνηθεί αν οι αναστολείς ANO1 επηρεάζουν την κυτταρική ανάπτυξη, ιδεβενόνη, μικοναζόλη και πλουμπαγκίνη εφαρμόστηκαν σε κύτταρα PC3 που εκφράζουν υψηλά επίπεδα ANO1 και κυττάρων Α549 που δεν εκφράζουν ANO1. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 4C, και αποκαλύπτουν ότι η ιδεβενόνη ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα PC3, αλλά όχι σε κύτταρα Α549. Miconazole και πλουμπαγκίνη έδειξαν ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και στα δύο κύτταρα PC3 και Α549, αλλά δεν ήταν έκπληξη, διότι σε αρκετές προηγούμενες έρευνες, δείχθηκε ότι η μικοναζόλη και πλουμπαγκίνη ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων μέσω διαφορετικών μηχανισμών [24-29] . Η επίδραση της αναστολής ANO1 με ιδεβενόνης στην κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια πληγή δοκιμασία επούλωσης σε κύτταρα PC3. Στη δοκιμασία, τα κύτταρα PC3 ελέγχου καλύπτονται 63.6 ± 2.5% (η = 5) του τραύματος, ενώ Τ16Α

inh-A01 (30 μΜ) και ιδεβενόνη (10 και 30 μΜ) επεξεργασμένων κυττάρων καλύπτεται 39,6 ± 2,5, 26,1 ± 1,8 και 13,8 ± 0,8% (η = 5) του τραύματος κατά 48 ώρες μετά την πληγή, αντίστοιχα (Εικόνα 4D).

(Α) Ανοσοστύπωμα ANO1 πρωτεΐνης σε FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 και Α549 κύτταρα. Οι εκπρόσωποι των τριών σετ των μελετών φαίνεται. (Β) Επίδραση της ιδεβενόνης στην CaCCs μετρήθηκε σε κύτταρα CFPAC-1 που εκφράζει αλογονιδίων ευαίσθητο μεταλλαγμένο YFP. CaCCs ενεργοποιήθηκαν με 100 μΜ ΑΤΡ. (Γ) PC3 και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ιδεβενόνη (30 μΜ), μικοναζόλη (30 μΜ) και πλουμπαγκίνη (30 μΜ), και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε μετά από 2 ημέρες χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς MTS (μέση ± S.E., η = 6). (D) Τραύματος δοκιμασία επούλωσης σε κύτταρα PC3. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Τ16Α

inh-A01 (30 μΜ) και ιδεβενόνη. (Αριστερά) Το κλείσιμο της πληγής προσδιορίστηκε ποσοτικά σε κάθε 2 ώρες μετά την πληγή (μέση ± S.E., η = 5). (Δεξιά) Εκπρόσωπος εικόνες που λαμβάνονται σε 0 ώρες και 48 ώρες μετά τον τραυματισμό (× 10). ** P & lt? 0,01, unpaired t-test φοιτητών.

Η

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η επίδραση της ιδεβενόνης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, παρατηρήσαμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε απόκριση προς το idebenone χρησιμοποιώντας MTS δοκιμασία και δοκιμασία BrdU σε PC3, CFPAC-1 και Τα κύτταρα Α549 (Εικόνα 5). Σε αυτή τη μελέτη, το συνένζυμο Q10 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, διότι δεν αναστέλλει ANO1 /CaCCs παρόλο idebenone είναι ένα συνθετικό ανάλογο του συνενζύμου Q10 (Σχήμα 2F). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ιδεβενόνη (3, 10 και 30 μΜ), το συνένζυμο Q10 (100 μΜ) και Τ16Α

inh-A01 (10 μΜ), και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε ποσοτικά μετά από 2 ημέρες. Σε PC3 και τα κύτταρα CFPAC-1, ιδεβενόνη ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ενσωμάτωση BrdU σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά ιδεβενόνη και Τ16Α

inh-A01did δεν επηρεάζουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων και η ενσωμάτωση BrdU σε κύτταρα Α549 (Σχήμα 5Α-5C). Το συνένζυμο Q10 δεν μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Προς τα κάτω ρύθμιση του ANO1 προκαλεί απόπτωση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές που υπερεκφράζουν ANO1 [14, 16, 30]. Για να διερευνηθεί αν idebenone επάγει απόπτωση σε κύτταρα που εκφράζουν ANO1, χρώση TUNEL διεξήχθη στις κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος. PC3, CFPAC-1 και Α549 κύτταρα επωάστηκαν με 30 μΜ ιδεβενόνη για 48 ώρες, και στη συνέχεια, βλάβης του DNA παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL. TUNEL θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε PC3 και CFPAC-1 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα Α549 (Σχήμα 5D-5F).

(AC) PC3, CFPAC-1 και Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων, και μετά 24 h επώαση, αυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις idebenone (IDE), 100 μΜ συνένζυμο Q10 (Q10) και 10 μΜ Τ16Α

inh-A01 (A01) σε δοκιμασία MTS. IDE (30 μΜ), το συνένζυμο Q10 (100 μΜ) και Τ16Α

inh-A01 (10 μΜ) εφαρμόστηκαν στα κύτταρα σε δοκιμασία BrdU. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από 2 ημέρες μέσω MTS (αριστερά) ή δοκιμασία BrdU (δεξιά) (μέση τιμή ± S.E., η = 6). (D-F) PC3, CFPAC-1 και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 30 μΜ ιδεβενόνη. Τα κύτταρα βάφτηκαν με TUNEL (τερματική τρανσφεράση δεσοξυνουκλεοτιδίων μεσολάβηση dUTP nick-τελική σήμανση, πράσινο) και ϋΑΡΙ (4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, μπλε). Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 20 μm. * P & lt? 0.05, αταίριαστα t-test μαθητές ».

Η

Συζήτηση

ANO1, ένα πρόσφατα εντοπίστηκαν CACC, έντονα υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων HNSCC, GIST, του μαστού και του καρκίνου του προστάτη. Αξιοσημείωτα, Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν έντονα τη συμμετοχή ANO1 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, κυτταρική μετανάστευση, ογκογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου [12, 13, 16, 31]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ANO1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτικός στόχος των όγκων, επειδή τα κάτω ρύθμιση του ANO1 έδειξε δυνητικών θεραπευτικά οφέλη επί HNSCC, ESCC, GIST, του μαστού και του καρκίνου του προστάτη [14, 16, 30, 32, 33]. Χάρη στην πρόσφατη ταυτοποίηση των ANO1, λίγες μικρό μόριο αναστολείς ANO1 είναι διαθέσιμες, όπως CACC

ΙΝΗ-A01, ταννικό οξύ, Τ16Α

ΙΝΗ-A01, και Monna [17, 19-21], αλλά η φαρμακολογική ιδιοκτησίας και οι μηχανισμοί δράσης των αναστολέων είναι ακόμη ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια διαλογή με βάση κύτταρα για την ταυτοποίηση νέων αναστολέων ANO1 με μια συλλογή από τα ναρκωτικά, όπως ενώσεων και φυσικών προϊόντων. Είναι ενδιαφέρον, ανακαλύψαμε ότι η ιδεβενόνη παρεμποδίζει ισχυρά ANO1.

ιδεβενόνη [2,3-διμεθοξυ-5-μεθυλ-6- (10-υδροξυδεκυλ) -21,4-βενζοκινόνη] είναι ένα συνθετικό βενζοκινόνη βραχείας αλυσίδας ως ανάλογο της ουβικινόνη (συνένζυμο Q10). Η ιδεβενόνη επί του παρόντος διερευνάται για τη θεραπεία ενός αριθμού των μιτοχονδρίων και νευρομυϊκές παθήσεις, όπως η αταξία του Friedreich (FRDA), μιτοχονδριακή εγκεφαλοπάθεια με γαλακτική οξέωση και το εγκεφαλικό επεισόδιο-όπως επεισόδιο (ΜΕΛΑΣ) και μυϊκή δυστροφία Duchenne (DMD), χάρη στην ικανότητά του να χρησιμεύσει ως φορέας ηλεκτρονίων στη μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και ισχυρό αντιοξειδωτική δράση της. Οι Ευεργετικές κλινικές επιδράσεις της idebenone έχουν αναφερθεί σε ασθενείς υπό θεραπεία με ιδεβενόνη FRDA (300-2250 mg /ημέρα? 0,5-5 χρόνια), ΜΕΛΑΣ (90-270 mg /ημέρα? 163 ημέρες) και DMD (450 mg /ημέρα? 12 μήνες) [34-36]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των μεγάλων κλινικών μελετών έδειξαν ότι η ιδεβενόνη ήταν ασφαλής και καλά ανεκτή [37, 38].

Δείξαμε ότι ιδεβενόνη ανέστειλε ισχυρά την δραστικότητα ANO1 σε προσδιορισμό φθορισμού YFP απόσβεση (Σχήμα 1 C) και ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες ( Τα Σχήματα 2Α και 3Α). Για να διαπιστωθεί αν δραστηριότητα αντιοξειδωτικό και ηλεκτρονίων φορέας του idebenone να επηρεάσει τη λειτουργία του καναλιού ANO1, παρατηρήσαμε την επίδραση του CoQ10 στην δραστικότητα διαύλου ANO1 επειδή ιδεβενόνη και CoQ10 μοιράζονται το ίδιο μοτίβο υποκατάσταση της μονάδας κινόνης και διαφέρουν μόνο στην ουρά αλκύλιο συνδέεται με το C6 α-άτομο άνθρακα του δακτυλίου κινόνης τους. Όπως φαίνεται στο Σχ 2F, προεπεξεργασία των 100 μΜ CoQ10 ελαφρά (αλλά όχι σημαντικά) αυξήθηκε ANO1 ρεύματα αντί της αναστολής ΑΤΡ-επαγόμενα ρεύματα ANO1 σε ANO1 κύτταρα που εκφράζουν FRT. Επιπλέον, CoQ10 δεν μπλοκάρει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό σε αρκετούς ANO1 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν (Σχήμα 5), και ιδεβενόνη δεν επηρέασε CFTR και ενδοκυτταρική σηματοδότηση ασβέστιο (Σχ 2C και 2D). Μαζί, τα ανωτέρω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο μηχανισμός δράσης της ιδεβενόνης στην αναστολή ANO1 μπορεί να είναι άμεση και όχι μέσω της αντιοξειδωτικής και ο φορέας ηλεκτρονίων ικανότητά του. Υπάρχει ακόμα η πιθανότητα ότι το idebenone επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση μέσω των άλλων οδών. Ωστόσο, η ιδεβενόνη έδειξαν ισχυρή αναστολή της ANO1 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα που εκφράζουν ANO1, και ένα ειδικός αναστολέας ANO1 Τ16Α

inh-A01 έδειξε παρόμοια απόκριση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (σχήμα 5). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι η επαγόμενη ιδεβενόνη αναστολή ANO1 είναι τουλάχιστον εν μέρει εμπλέκονται στην κυτταροτοξική επίδραση της ιδεβενόνης. Στο Σχήμα 4D, δείξαμε ότι η ισχυρή αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης σε μια περιοχή της πληγής με ιδεβενόνη. Σε επούλωσης πληγών δοκιμασία χρησιμοποιήσαμε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας χωρίς ορό για να μειωθεί η κυτταρική ανάπτυξη, διότι τόσο κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης επηρεάζουν τον ρυθμό της επούλωσης του τραύματος. στέρηση ορού οδήγησε σε ~ 54% αναστολή της ανάπτυξης (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και η ανασταλτική επίδραση της ιδεβενόνης στην επούλωση τραυμάτων ήταν ισχυρότερη από εκείνη του idebenone στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήματα 4Δ και 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ιδεβενόνη αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση, ακόμη και αν η αναστολή της ανάπτυξης από το idebenone μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα.

Σε κλινική δοκιμή, οι ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε θεραπεία με ιδεβενόνη έως 2250 mg /ημέρα.