Αφηρημένο

Η ανώμαλη ακετυλίωση των ιστονών διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στη νεοπλασματική διαδικασία μέσω της επιγενετικής αποσιώπηση του όγκου γονίδια καταστολής (ΕΠΠΕ)? Ως εκ τούτου, η αναστολή της αποακετυλασών ιστόνης (HDAC) έχει γίνει ένα υποσχόμενο στόχο σε θεραπευτικά του καρκίνου. Για να διερευνηθεί η συσχέτιση της ακετυλίωσης ιστόνης με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και έκφραση TSG, εξετάσαμε την έκφραση του ακετυλιωμένης Η3 (AcH3), RARβ2, Ε-καδερίνης, και β-κατενίνη με ανοσοϊστοχημεία σε 65 ασθενείς τραχηλικού πλακώδους καρκινώματος. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η απουσία AcH3 άμεσα σχετίζονται με την κακή ιστολογική διαφοροποίηση και κομβικά μετάστασης καθώς και μείωση /αρνητική έκφραση του RARβ2, Ε-καδερίνης, και β-κατενίνη σε κλινικά δείγματα όγκων. Δείξαμε επίσης ότι η κλινικά διαθέσιμο HDAC αναστολείς βαλπροϊκό οξύ (VPA) και το σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA), σε συνδυασμό με all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA), μπορεί να ξεπεράσει τα εμπόδια στην επιγενετικών μεταγραφή του RARβ2 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Χρωματίνης ανάλυση ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η θεραπεία συνδυασμού αύξησε τον εμπλουτισμό των ακετυλιωμένων ιστονών στην περιοχή RARβ2-RARE υποκινητή. Ενόψει αυτών των ευρημάτων, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα κατά των όγκων που προκαλούνται από συνδυασμένη αγωγή VPA και ATRA σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος εμφυτεύθηκαν με πτωχά διαφοροποιημένο ανθρώπινο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, VPA αποκατασταθεί η έκφραση RARβ2 μέσω επιγενετικής διαφοροποίησης. Πρόσθετη αντινεοπλασματική δράση παρήχθησαν σε ξενομοσχεύματα όγκου συνδυάζοντας VPA με τη θεραπεία ATRA. Μηχανιστικά, η θεραπεία συνδυασμού επανενεργοποιηθεί την έκφραση των ΕΠΠΕ RARβ2, E-cadherin, P21

Cip1

, και Ρ53 και μείωσε το επίπεδο της p-Stat3. Διαδοχικά, προς τα πάνω ρύθμιση ινβολουκρίνη και loricrin, που δείχνουν την τελική διαφοροποίηση, συνέβαλε σε μεγάλο βαθμό στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου μαζί με μερική απόπτωση. Εν κατακλείδι, στοχευμένη θεραπεία με αναστολείς HDAC και αγωνιστές RARβ2 μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας πλακωδών κυττάρων

Παράθεση:. Feng D, Wu J, Tian Υ, Zhou Η, Zhou Υ, Χου W , et al. (2013) Στόχευση της ιστόνης Αποακετυλάσες να επανενεργοποιήσει όγκου κατασταλτικά γονίδια και θεραπευτικών δυνατοτήτων τους σε μια ανθρώπινη καρκίνο του τραχήλου μοντέλο ξενομοσχεύματος. PLoS ONE 8 (11): e80657. doi: 10.1371 /journal.pone.0080657

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 25 Απρίλη 2013? Αποδεκτές: 6, Οκτωβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 19, Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30901606, 81001168,81072127, 81372779 και 81372777) και το Ίδρυμα Anhui Provincial Φυσικών Επιστημών (110406M176 και 110406M178). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η μεταβολή της δομής της χρωματίνης που προκύπτει από ακετυλίωση ιστονών μπορεί να είναι σημαντική για τη νεοπλαστική διαδικασία [1] – [3]. Η κατάσταση ακετυλίωσης των ιστονών καθορίζεται από αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) και ιστόνης ακετυλο-τρανσφεράσης (ΗΑΤ). την ανάπτυξη του καρκίνου οδηγείται από γενετικές και επιγενετικές μεταβολές στο κυτταρικό επίπεδο που ενεργοποιούν και απενεργοποιούν ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΟΚΓ), αντίστοιχα [4]. Μεταγραφική σίγηση με απακετυλίωση ιστόνης είναι μία από τις καθιερωμένες μηχανισμούς TSG αδρανοποίησης [1], [5] – [7]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αποακετυλιωμένη ιστονών στην περιοχή του υποκινητή καταστέλλει την έκφραση των ΕΠΠΕ, όπως

ρετινοβλάστωμα

[8], το ρετινοϊκό οξύ β υποδοχέα (

RARβ

) [9],

p21

[10],

p53

[6],

p16

[11],

E-cadherin

[5], και πολλοί άλλοι. Έτσι, η αναστολή των ενζύμων HDAC έχει γίνει ευρέως αποδεκτή ως μια στρατηγική για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω της επαγωγής της ιστόνης υπερακετυλιώσεως και την εκ νέου έκφραση σιγήσει ΕΠΠΕ.

Από όλα τα εγγυημένα παραδοσιακά ιδιότυπα προϊόντα, RARβ2, και E-cadherin διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης και στους υγιείς και κακοηθών κυττάρων [9]. Η ικανότητα του ρετινοϊκού οξέος να δρα ως παράγων χημειοπροληπτική διευκολύνεται κυρίως από την αλληλεπίδρασή του με RARβ2 [9], [12]. E-cadherin είναι ένα μόριο ενδοκυτταρικής προσκόλλησης στα επιθηλιακά κύτταρα, η οποία συνδέεται με β-κατενίνης για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο που παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της μορφολογικής ακεραιότητας της κανονικής επιθήλιο [13], [14]. Μελέτες των επιθηλιακών όγκων έχουν δείξει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση του RARβ2 είναι ένα κρίσιμο γεγονός στην κακοήθεια και ότι η μετέπειτα παρεκκλίνουσα έκφραση των συμπλοκών E-cadherin /β-κατενίνης συσχετίζεται με την μετατροπή των όγκων σε πρώιμο στάδιο σε επεμβατική κακοήθειες [15], [ ,,,0],16]. Η απώλεια της έκφρασης RARβ2 σε κύτταρα όγκου έχει αποδοθεί στην αποσιώπηση της περιοχής του υποκινητή του γονιδίου μέσω απακετυλίωση ιστόνης και υπερμεθυλίωση. Επομένως, η χρήση των αναστολέων HDAC, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με DNA μεθυλοτρανσφεράση (DNMT) αναστολείς, έχει δειχθεί να αποκαταστήσει την μεταγραφή και την ανάπτυξη ρυθμιστικές επιδράσεις της RARβ2 [9], [17], [18]. προηγούμενες εργασίες μας αποκάλυψε επίσης ότι ο συνδυασμός του βαλπροϊκού οξέος (VPA), μια κλινικά διαθέσιμη αναστολέα HDAC, και all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) προωθεί συνεργιστικές επιδράσεις στην επανενεργοποίηση αδρανής RARβ2 και έντονα την αναστολή του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

με την προώθηση της διαφοροποίησης μέσω του PI3K /Akt μονοπατιού [19]. Ωστόσο, με τις γνώσεις μας, ο συσχετισμός μεταξύ ακετυλίωση των ιστονών και της έκφρασης ΕΠΠΕ σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ιστού και την ενδεχόμενη εκμετάλλευση των ακετυλίωση των ιστονών στη στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου δεν έχουν αξιολογηθεί πλήρως. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε της ιστόνης Η3 ακετυλίωση και έκφραση TSG στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και τη σύνδεσή της με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Επιπλέον, αξιολογήσαμε το θεραπευτικό δυναμικό του αναστολέα HDAC VPA σε συνδυασμό με ATRA σε θεραπεία ενός μοντέλου ξενομοσχεύματος όγκου που προέρχονται από ανθρώπινο τραχηλικό καρκίνωμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτό το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Anhui Medical University. Τα δείγματα ασθενών ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ελήφθησαν όπως περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεση μας [20]. Οι καρκινικούς ιστούς για εμφύτευση σε ποντικούς ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή. Έγκριση για

in vivo

πειράματα με ζώα χορηγήθηκε από την Επιτροπή σχετικά με τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων της Anhui Medical University.

Ασθενείς και δείγματα

φορμόλη-σταθερό παραφινώδη ενσωματωμένα δείγματα προέρχονται από τραχηλικών βλαβών σε 65 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας πλακωδών κυττάρων που προέρχονται από τα αρχεία του Τμήματος Παθολογίας του Anhui Επαρχιακό Νοσοκομείο συνδεδεμένες με Anhui Medical University κατά την περίοδο 2002 έως 2008. τα κλινικά στάδια προσδιορίστηκαν από δύο πιστοποιημένα γυναικολόγοι σύμφωνα με την τροποποιημένη Διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας Μαιευτικής (FIGO) σύστημα για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας που δημοσιεύθηκε το 2000. οι όγκοι ταξινομούνται ως καλά – μέτρια, ή κακώς διαφοροποιημένο – από τουλάχιστον δύο παθολόγους, σύμφωνα με τα κριτήρια που προτείνει ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας. Λεπτομερείς κλινικοπαθολογοανατομικές πληροφορίες εμφανίζονται στον Πίνακα 1. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υστερεκτομή. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει καμία θεραπεία όγκου-ειδικά πριν από την χειρουργική εκτομή.

Η

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

Ανθρώπινο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa, SiHa, CaSki και C33A αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, USA) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco). VPA (Sigma-Aldrich, USA) διαλύθηκε σε PBS και χρησιμοποιήθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 3 mmol /L. SAHA και ATRA αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, διαλύθηκε σε DMSO, και χρησιμοποιήθηκαν σε τελικές συγκεντρώσεις των 10 μmol /L και 1 mmol /L, αντίστοιχα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με VPA ή SAHA μόνα τους ή σε συνδυασμό με ΑΤΡΑ για 48 ώρες. Τα κύτταρα μάρτυρες υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με το όχημα.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση και η ανοσολογική αξιολόγηση

μπλοκ παραφίνης των όγκων κόπηκαν σε 5

μ

m φέτες και στη συνέχεια σε επεξεργασία με τη χρήση τυποποιημένων deparaffinisation και ενυδάτωσης τεχνικές. Ενδογενών υπεροξειδασών αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας 3% υπεροξειδίου του υδρογόνου. Για ανάκτηση αντιγόνου, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θέρμανση μικροκυμάτων σε 0,01 Μ κιτρικό νάτριο (ρΗ 6.0). Οι πλάκες προ-επωάσθηκαν σε 5% ορό κατσίκας σε TBS (ρΗ 7,6) πριν από προστέθηκαν πρωτεύοντα αντισώματα. Τα ακόλουθα πρωτογενή αραιώσεις αντισώματος χρησιμοποιήθηκαν: 1:100 για ακετυλιωμένο ιστόνης Η3 (Santa Cruz, USA), 1:100 για RARβ2 (Santa Cruz), 1:50 για το E-cadherin (Abcam, UK), 1:100 για το β κατενίνης (Abcam), 1:100 για ινβολουκρίνη (Santa Cruz), 1:500 για loricrin (Abcam), και 1:200 για Ki67 (Boster, Κίνα). Η σύνδεση του πρωτογενούς αντισωμάτων έγινε ορατή χρησιμοποιώντας την ChemMate Detection Kit (Boster). Οι πλάκες ελαφρά με αιματοξυλίνη Mayer για 30 δευτερόλεπτα

Η ανοσοαντιδραστικότητα ημιποσοτικά αξιολογούνται βάσει της χρώσης ένταση και διανομής χρησιμοποιώντας βαθμολογίας ανοσολογική ως εξής:. Βαθμολογίας ένταση × βαθμολογίας ποσοστό [16], [21]. Η βαθμολογία ένταση ορίζεται ως 0, αρνητικά? 1, αδύναμη? 2, μέτρια? ή 3, ισχυρή, και η βαθμολογία αναλογία ορίζεται ως 0, αρνητικά? 1, & lt? 10%? 2, 11-50%? 3, 51-80%? ή 4, & gt? 80% θετικά κύτταρα. Η συνολική βαθμολογία κυμαίνεται από 0 έως 12. Η ανοσοαντιδραστικότητα ήταν χωρισμένη σε τρία επίπεδα επί τη βάσει της τελικής βαθμολογίας: αρνητική ανοσοαντιδραστικότητα ορίστηκε ως συνολική βαθμολογία 0? χαμηλή ανοσοδραστικότητα ορίστηκε ως συνολική βαθμολογία από 1 έως 4? και υψηλή ανοσολογική ορίστηκε ως η συνολική βαθμολογία μεγαλύτερη από 4. Οι βάφονται ιστούς όγκων βαθμολογήθηκαν από δύο ερευνητές, οι οποίοι δεν γνώριζαν τα κλινικά δεδομένα.

απομόνωση RNA και PCR πραγματικού χρόνου ποσοτικοποίηση

Ένα μικρογραμμάριο ολικού RNA, το οποίο εξήχθη από τους ιστούς, μετατρέπεται σε cDNA χρησιμοποιώντας Superscript III ανάστροφης μεταγραφάσης (Takara, Ιαπωνία). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου δοκιμασίες (qRT-PCR) διεξήχθησαν με τη χρήση cDNA 50 ng, ειδικούς εκκινητές (Πίνακας 2), ο SYBR®

Προμίγματα Ex Taq

™ Kit (Takara) και ένα Opticon® 2 πραγματικό time PCR όργανο (MJ Research, ΗΠΑ). τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο καμπύλη και εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση GAPDH.

Η

Αντισώματα και ανοσοαποτύπωση

Το ακετυλιωμένο ιστόνης Η3 (AcH3, 1:500), RARβ2 (1 :500), και ινβολουκρίνη (1:500) αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Η Stat3 (1:1000), ρ-Stat3 (1:2000), P21 (1:1000), και GAPDH (1:2000) αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. Το E-cadherin (1:500), β-κατενίνης (1:5000), και loricrin (1:2000) αντισώματα αγοράστηκαν από Abcam. Η Ρ53 (1:500), κασπάσης-3 (1:1000), και Bcl-2 (1:200) αντισώματα ελήφθησαν από Boster Technology. Η πρωτεΐνη παρασκευάστηκε από τους ιστούς σύμφωνα με το κιτ (# 89900, Θέρμο, USA) εγχειρίδιο εκτός από την προσθήκη ενός σταδίου εκχύλισης οξέος για ιστόνες [19]. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες και ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα. Η επώαση με δευτερογενή αντισώματα συγκεκριμένα είδη (Cell Signaling) πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με υπόστρωμα χημιφωταύγειας (Thermo), και αυτοραδιογραφία διεξήχθη με φιλμ Χ-ΟΜΑΤ (Kodak, Rochester, ΝΥ).

χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) διεξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ ΕΖ-chip Δοκιμασία (Millipore, USA) με ένα τσιπ βαθμού αντίσωμα για ακετυλιωμένο ιστόνης Η3 (H3K9ac, Abcam). Εν συντομία, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 150 mm πιάτα καλλιέργειας. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με VPA (3 mmol /L) ή SAHA (10 μmol /L) μόνες ή σε συνδυασμό με ΑΤΡΑ (1 mmol /L) για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια με σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και η αντίδραση σβήστηκε με 0,125 Μ γλυκίνη. Τα κύτταρα αποξέστηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1% SDS, 10 mM EDTA, και 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.1) συμπληρωμένο με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης επί πάγου και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους για να ληφθούν τμήματα DNA των 200-1000 bp σε μήκος , όπως επιβεβαιώνεται με ηλεκτροφόρηση επί πηκτωμάτων αγαρόζης 1%. Το διασπασμένο DNA φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 χ

g

στους 4 ° C για 10 λεπτά, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Δέκα τοις εκατό του υπερκείμενου που προορίζεται για χρήση ως DNA εισόδου και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την περαιτέρω χρήση ως θετικός έλεγχος. Διαλυτό χρωματίνη ανοσοκαταβυθίστηκε όλη τη νύκτα με ένα αντίσωμα αντι-H3K9ac. Το ανοσοκαταβυθισμένο σύμπλοκο χρωματίνη συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας G-αγαρόζης πρωτεΐνης, και το διασταυρώσεων αντιστράφηκε με την προσθήκη NaCl σε τελική συγκέντρωση 200 mM στους 65 ° C για 5 ώρες. Το DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας τις στήλες σπιν που παρέχεται με το κιτ. Τα δείγματα DNA, καθώς και το υλικό εισαγωγής και τις εικονικές δείγματα ανοσοκαθίζηση, χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα για ημι-ποσοτική και σε πραγματικό χρόνο PCR για να προσδιοριστεί η σχετική εμπλουτισμός του RARβ2-RARE υποκινητή. Οι εκκινητές για την RARβ2-RARE υποκινητή φαίνονται στον Πίνακα 2.

Εμφύτευση του αρχικού ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου όγκου σε ποντικούς και θεραπεία φαρμάκου

Four-εβδομάδων θηλυκά BALB /c ελήφθησαν γυμνών ποντικών από το Εργαστήριο Κέντρο ζώων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και διατηρήθηκαν σε εγκατάσταση ζώων άνευ παθογόνου για 1 εβδομάδα πριν από τη χρήση. Ένα δείγμα του τραχήλου της μήτρας καρκίνος του πτωχά διαφοροποιημένο καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου, η οποία επιβεβαιώθηκε με ιστολογία, ελήφθη με ενημερωμένη συγκατάθεση από έναν ασθενή που υφίσταται χειρουργείο μέσα σε 1 ώρα μετά την υστερεκτομή. Το δείγμα πλύθηκε με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 7.4) που περιέχει 10.000 U /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη και στη συνέχεια τεμαχίστηκε σε μικρά κομμάτια περίπου 2-4 mm

3 για την εμφύτευση. Αυτά τα μικρά κομμάτια ιστού εμφυτεύθηκαν στον υποδόριο ιστό του τρία γυμνά ποντίκια κατά τη ράχη με χρήση τροκάρ.

Μετά 6-8 εβδομάδες, ένα τμήμα των οζιδίων του όγκου που αναπτύχθηκαν αποκόπηκε υπό στείρες συνθήκες. Αυτό το δείγμα αμέσως υποδιαιρείται σε μικρά τεμάχια και ενίεται σε άλλες γυμνούς ποντικούς. Μόλις καθιερώθηκαν ψηλαφητών όγκων, 20 ποντίκια τοποθετήθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες: ελέγχου, VPA, ATRA, και συνδυασμό. VPA αραιώθηκε σε 0,9% χλωριούχο νάτριο, ενώ ATRA διαλύθηκε σε καθαρό σησαμέλαιο. Οι ποντικοί χορηγήθηκαν VPA (300 mg /kg /d) και /ή ATRA (15 mg /kg /d) ημερησίως μέσω ενδοπεριτοναϊκής (ε.π.) ένεση και ενδογαστρική (ε.γ.) βελόνα καθετηριασμού, αντίστοιχα. Η ομάδα ελέγχου έλαβε το έκδοχο μόνο ακολουθώντας το ίδιο χρονοδιάγραμμα. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο δύο φορές την εβδομάδα και υπολογίζεται σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 4 εβδομάδες και στη συνέχεια θυσιάστηκαν. Οι όγκοι συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για παθολογική αξιολόγηση ή καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για PCR, Chip, και ανάλυση ανοσοκηλίδωσης ακριβώς όπως οι όγκοι μάζα καταγράφηκαν. αναστολή της ανάπτυξης του όγκου (TGI) υπολογίστηκε αφαιρώντας από το 100% το επεξεργασμένο μέση μάζα του όγκου /μέση μάζα του όγκου ελέγχου × 100%.

ΤΟΥΝΕΛ δοκιμασία

Κατά την παραλαβή του κάθε δείγματος όγκου, η μικρό τμήμα του όγκου ορίστηκε σε 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Μετά αποπαραφίνωση, οι τομές πλύθηκαν και κατέστησαν διαπερατά επί 5 λεπτά σε πάγο με 0.1% Triton Χ-100 και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ (Sigma-Aldrich) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. χρώση TUNEL εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα

in situ

κιτ απόπτωσης-ανίχνευση (Keygene Technology, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τομές καλύφθηκαν με TUNEL μείγμα αντίδρασης σήμανσης (ρυθμιστικό εξισορρόπησης, βιοτίνη-11-dUTP, TdT ένζυμο) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα σε θάλαμο υγρασίας. Οι τομές περαιτέρω σημάνθηκαν με στρεπταβιδίνη-ΡΙΤΟ στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Μετά από αντίθετη χρώση με ϋΑΡΙ (2 μg /ml), TUNEL θετικά κύτταρα μετρήθηκαν από τις εικόνες φθορισμού ελήφθησαν από 10 τυχαία πεδία στα 200 × μεγέθυνση.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση το πακέτο SPSS λογισμικού (έκδοση 13? SPSS Inc., USA). Η συσχέτιση μεταξύ των παραμέτρων κλινικοπαθολογοανατομικών και ανοσοϊστοχημικές δεδομένα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή chi-τετράγωνο ή ακριβούς δοκιμασίας του Fisher. Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του AcH3, RARβ2, Ε-καδερίνης, και β-κατενίνη αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ chi-τετράγωνο για μια γραμμική τάση. Η συμφωνία μεταξύ του παρατηρητή στο σκορ ανοσολογική αντίδραση μεταξύ δύο ερευνητές αξιολογήθηκαν από κ-στατιστικά στοιχεία. Σύμφωνα με Fleskens [22], κ-τιμών & lt? 0,20 ένδειξη κακής συμφωνίας? 0,21 – 0,40 δίκαιη συμφωνία? 0,41 – 0,60 μέτρια συμφωνίας? 0,61 – 0,80 καλή συμφωνία? και 0,81 έως 1,00 εξαιρετική συμφωνία. ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η στατιστική σημαντικότητα για τη σχετική εμπλουτισμό RARβ2 προαγωγό σε δοκιμασία τσιπ και της

in vivo

μοντέλα ξενομοσχεύματος. Ένα

P

-τιμή του & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά

Ένα σύνολο 65 περιπτώσεων πρωτοπαθούς του τραχήλου της μήτρας πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα αναλύθηκαν. κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά τους, όπως η διαφοροποίηση του όγκου, πραγματοποίηση ενημερωτικών και κομβικά μετάσταση, επανεξετάστηκαν και συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Σύλλογος των κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητών με τα επίπεδα έκφρασης της AcH3, RARβ2, E-cadherin, και β- κατενίνης

Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της ανάλυσης ανοσοϊστοχημείας μας για AcH3, RARβ2, Ε-καδερίνης, και β-κατενίνη που φαίνεται στο Σχήμα 1. στο φυσιολογικό τραχηλικό επιθήλιο, και τα τέσσερα παράμετροι θετικά χρωματισμένων στα κύτταρα του άνωθεν της βασικής με την βασική στοιβάδα, με διακριτή έκφραση των AcH3 στους πυρήνες, RARβ2 στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες, και Ε-καδερίνη και β-κατενίνη κυρίως στην μεμβράνη (Σχήμα 1). Στο καρκινικού ιστού, η ένταση ανοσολογική αντίδραση αυτών των τεσσάρων παραμέτρων ήταν ισχυρή σε καλά διαφοροποιημένο όγκων και μείωσε σε μέτρια διαφοροποιημένο καρκίνωμα, με αδύναμη ή αρνητική σήμανση σε φτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα (Εικόνα 1Α).

(Α) Η αριστερό πάνελ δείχνουν τις τομές από φυσιολογικό τραχηλικό ιστό. χρώση AcH3 ήταν ισχυρή στα κύτταρα του όγκου σε καλά διαφοροποιημένο καρκίνωμα. έκφραση AcH3 ήταν μειωμένη ή απούσα σε μέτρια και φτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα, αντίστοιχα. Παρόμοια πρότυπα έκφρασης παρατηρήθηκαν για την χρώση των RARβ2, Ε-καδερίνης, και β-κατενίνης. (Β) Υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις βαθμολογίες ανοσολογική αντίδραση για AcH3, RARβ2, E-cadherin, και β-κατενίνης μεταξύ καλά, μέτρια και φτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων.

Η

Η ανοσοϊστοχημική χρώση Ο δύο ερευνητές. Ο Πίνακας 3 δείχνει τη συμφωνία μεταξύ των δύο ερευνητές για τα τρία επίπεδα ανοσοδραστικότητας για AcH3, RARβ2, Ε-καδερίνης, και β-κατενίνης. Μια σύγκριση των αποτελεσμάτων με τη χρήση κ-στατιστικές έδειξαν εξαιρετική συμφωνία για RARβ2 και E-cadherin βαθμολόγησης (κ = 0.840, 0.876) και καλή συμφωνία για AcH3 και β-κατενίνης βαθμολόγησης (κ = 0,710, 0,657). Η συνολική κ τιμή ήταν 0.778 (καλή συμφωνία), υποδεικνύοντας συμφωνία μεταξύ των βαθμολογιών ανοσολογική αντίδραση που παρέχονται από τους δύο ερευνητές.

Η

Οι σχέσεις μεταξύ των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και τις βαθμολογίες ανοσολογική αντίδραση για AcH3, RARβ2, Ε- cadherin, και β-κατενίνη φαίνονται στον πίνακα 1. Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σχέση με την ηλικία ή το κλινικό στάδιο μεταξύ αυτών των τεσσάρων παραμέτρων. Ωστόσο, η έκφραση αυτών των τεσσάρων παραμέτρων έδειξε σημαντική συσχέτιση με ιστολογική διαφοροποίηση (

P

& lt? 0,01) και με κομβικά μετάσταση (

P

& lt? 0,01) (Πίνακας 1). Οι κατανομές των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων όγκου συναρτήσει βαθμολογίες ανοσοαντιδραστικότητα τους στα δείγματα ασθενών που φαίνεται στο Σχήμα 1Β. AcH3, RARβ2, Ε-καδερίνης, και η έκφραση β-κατενίνης συσχετίζεται θετικά με ιστολογική διαφοροποίηση (r = 0.737, 0.531, 0.574, και 0.549, αντίστοιχα,

P

& lt? 0,01) (Πίνακας 1). Για Η3 ακετυλίωση, 94,4% (17/18) από τα καλά διαφοροποιημένα περιπτώσεις έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης, ενώ το 37% (10/27) των μετρίως διαφοροποιημένων περιπτώσεις έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης. Ισχυρή έκφραση δεν παρατηρήθηκε σε ασθενώς διαφοροποιημένες περιπτώσεις (0/20). Το ποσοστό των όγκων με υψηλή ανοσοαντιδραστικότητα για Ε-καδερίνη και η έκφραση β-κατενίνης ήταν πάνω από 72% σε ασθενείς με καλά διαφοροποιημένο όγκους. Ωστόσο, για την έκφραση RARβ2, μόνο το 39% (7/18) των ασθενών είχαν συνολική βαθμολογία & gt? 4, ενώ το 61% (11/18) των ασθενών παρουσίασαν χαμηλή ανοσολογική αντίδραση. Παρομοίως, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ Η3 ακετυλίωση και την έκφραση του RARβ2, Ε-καδερίνης, και β-κατενίνη (r = 0,560, r = 0,731 και r = 0,733, αντίστοιχα,

P

& lt? 0.01) (Εικόνα 1Β).

HDAC αναστολείς σε συνδυασμό με ATRA αποκατάσταση της έκφρασης RARβ2 μέσω RARβ2-ΣΠΑΝΙΟ

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, τον αναστολέα HDAC SAHA (σύμφωνα με την προηγούμενη εργασία μας για VPA [19]) μόνη ή σε συνδυασμό με ATRA έντονα επαγόμενη υπερακετυλίωση ιστόνης Η3 και αποκατέστησε την έκφραση RARβ2 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. Για να κατανοηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός για ακετυλίωσης ιστόνης επαγόμενη επανέκφραση του RARβ2, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία ChIP χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-H3K9ac για να προσδιοριστεί η σύνδεση του ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 στην περιοχή RARβ2 υποκινητή (-168 /+ 22), η οποία περιλαμβάνει η κεντρική περιοχή του RARE (-55 /-35) και το κουτί ΤΑΤΑ (Εικόνα 2Β). Η υπερακετυλίωση της λυσίνης 9 για ιστόνης Η3 (H3K9ac) συνδέεται συνήθως με ενεργά μεταγράφονται τα γονίδια [23]. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τα κύτταρα SiHa θεραπεία με αναστολείς HDAC (10 μmol /L SAHA ή 3 mmol /L VPA) μόνο για 48 ώρες έδειξαν μια σημαντική αύξηση στον εμπλουτισμό της RARβ2-RARE βασίζονται σε ημι-ποσοτική (Σχήμα 2C) και PCR πραγματικού χρόνου (Σχήμα 2D). Το αποτέλεσμα ήταν η μεγαλύτερη όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία τόσο με αναστολείς HDAC και ATRA (1 μmol /L). Αυτή η συνδυασμένη θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική στην επαγωγή ακετυλίωση των ιστονών στην περιοχή RARβ2-RARE από κάθε μεμονωμένο φάρμακο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σπάνια στον υποκινητή RARβ2 είναι λειτουργική και ότι η ακετυλίωση ιστόνης στην περιοχή RARβ2-RARE συσχετίζεται στενά με RARβ2 επανέκφραση σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας.

(Α) SAHA (10 μmol /L ) θεραπεία για 48 ώρες, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με ΑΤΡΑ (1 mmol /L), που προκαλείται από έντονα την υπερακετυλίωση ιστόνης Η3 και αποκατέστησε την έκφραση RARβ2 σε HeLa, SiHa, CaSki και κύτταρα C33A. (Β) Σχηματική απεικόνιση της περιοχής RARβ2-υποκινητή. Τα εξώνια του RARβ2 αντιπροσωπεύεται από μαύρα κουτιά. Το βέλος δείχνει την τοποθεσία της μεταγραφής έναρξη της διαδικασίας. Η περιοχή της PCR (-168 να +22) για την δοκιμασία ChIP περιλάμβανε την περιοχή πυρήνα της RARE, το κουτί ΤΑΤΑ, και 22 bp του εξωνίου 1. (C) Αντιπροσωπευτικά δεδομένα ChIP-PCR. PCR προϊόντα οπτικοποιήθηκαν μέσω ενός πηκτώματος αγαρόζης 1% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο. δείγματα (D) DNA από το αντι-H3K9ac IP καθώς και το υλικό εισροής και τις εικονικές δείγματα ανοσοκαταβύθισης ποσοτικοποιείται με PCR πραγματικού χρόνου. Η θεραπεία είτε με 10 μmol /L SAHA ή 3 mmol /L VPA οδήγησε σε σημαντική αύξηση των RARβ2-RARE εμπλουτισμού. Η μεγαλύτερη αύξηση στην RARβ2-RARE εμπλουτισμός παρατηρήθηκε με τη θεραπεία συνδυασμού. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

συνδυασμένη θεραπεία VPA και ATRA αναστέλλει την εξέλιξη των ξενομοσχευμάτων όγκων που προέρχονται από ανθρώπινους δότες

Τέσσερις εβδομάδες μετά την αρχική εμφύτευση του καρκινώματος του τραχήλου που προέρχεται από ένα ανθρώπινο δότη, ο όγκος έγινε αναγνωρίσιμη στο σημείο της μεταμόσχευσης και συνέχισε να αυξάνεται αργά. Ένας ταχύς ρυθμός αύξησης παρατηρήθηκε στη δεύτερη γενιά? χρειάστηκαν μόνο 2 εβδομάδες για μια αξιοσημείωτη ξενομόσχευμα να σχηματίσουν. Η ιστολογική εξέταση έδειξε χαρακτηριστικά γνωρίσματα που ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα του καρκινώματος του τραχήλου του αρχικού ασθενούς (Σχήμα 3D)

Αφού οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες:. Έλεγχος (όχημα), VPA (300 mg /kg VPA), ATRA (ATRA 15 mg /kg), και συνδυασμό. Οι διάφορες αγωγές χορηγήθηκαν ημερησίως για 28 ημέρες. Οι όγκοι νεοπλασίας και τα βάρη των ποντικών υπολογίστηκαν κάθε δύο ημέρες. Ο συνδυασμός του VPA και ATRA ανέστειλε σημαντικά την αύξηση ξενομοσχευμάτων όγκου σε σύγκριση με είτε μονό φάρμακο ή την θεραπεία του οχήματος (

P

& lt? 0,05) (Α). Την ημέρα 28, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και ξενομοσχεύματα όγκων συλλέχθηκαν (Β). δεδομένα μάζα όγκου ήταν συνεπή με όγκους του όγκου. Μεγαλύτερη υποχώρηση του ρυθμού αύξησης του όγκου παρατηρήθηκε για τη συνδυασμένη θεραπεία από ό, τι για τις διοικήσεις ενός μόνο φαρμάκου (

P

& lt? 0,05) (C). VPA και η θεραπεία συνδυασμού κυρίως βελτίωσε το βαθμό της ιστολογικής διαφοροποίησης. Μεμονωμένα καρκινικά κύτταρα είχαν άφθονο ηωσινοφιλική keratinized κυτταρόπλασμα (κεφαλές βέλους), και μιτωτική στοιχεία απουσίαζαν. Τα ξενομοσχεύματα όγκου σε επεξεργασία με το όχημα ή ATRA παρέμεινε ελάχιστα διαφοροποιημένη, παρόμοια με τα αρχικά ανθρώπινους όγκους. Μιτωτικά σχήματα (βέλη) είναι κοινά σε αυτά τα δείγματα και το κυτταρόπλασμα είναι ηωσινοφιλική να αμφιφιλικά, με ελάχιστη ή ανύπαρκτη κερατινοποίησης (D). *

P

& lt?. 0.05, έναντι της ομάδας αγωγή ενός μόνο φαρμάκου

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση του VPA και ATRA στην αύξηση του όγκου ξενομοσχεύματος, τα ζώα έλαβαν φορέα ως έλεγχο, VPA (300 mg /kg /d ip), ATRA (/kg /d ig 15 mg), ή η θεραπεία συνδυασμού για 28 ημέρες, όπως καθορίστηκαν οι όγκοι. Η θεραπεία δεν είχε εμφανή τοξικότητα σε ποντικούς. Μετά από 28 ημέρες, ο μέσος όγκος του όγκου για την ομάδα θεραπείας συνδυασμού ήταν 66,84 ± 19,10 mm

3, ενώ οι όγκοι του όγκου για ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με έκδοχο, VPA, και ATRA ήταν 316,65 ± 94,58 mm

3, 119.83 ± 7.74 mm

3, και 208.64 ± 76,61 mm

3, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α και Β). Σε συμφωνία με τα δεδομένα όγκου του όγκου, το μέσο βάρος όγκου της ομάδας ελέγχου ήταν 0.99 ± 0.09 g, ενώ τα βάρη του όγκου για την VPA, ATRA, και οι ομάδες θεραπείας συνδυασμού ήταν 0,402 ± 0,02 g, 0,618 ± 0,16 g, και 0.264 ± 0,09 g, αντίστοιχα (Σχήμα 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα ξενομοσχεύματα κατασταλεί από 59,39%, 37,58% και 73,33% (ποσοστό αναστολής ανάπτυξης όγκου,% TGI) για το VPA, ATRA, και σε συνδυασμό θεραπειών, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Τα δεδομένα δείχνουν ότι η θεραπεία συνδυασμού οδήγησε σε μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου από ξενομοσχεύματα είτε θεραπεία μονού φαρμάκου.

Είναι σημαντικό ότι, η ιστολογική εμφάνιση έδειξε ότι το VPA και η θεραπεία συνδυασμού βελτίωσε την έκταση της ιστολογικής διαφοροποίησης στα ξενομοσχεύματα όγκου . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, τα καρκινικά κύτταρα από ξενομοσχεύματα με VPA μόνο του ή σε συνδυασμό με ATRA έχουν άφθονη ηωσινοφιλική κερατινοποιημένο κυτταρόπλασμα, ενώ μιτωτικά σχήματα απουσιάζουν ή σημειώνεται μόνο περιστασιακά. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα στους ιστούς τόσο από τον έλεγχο και την ATRA αγωγή ομάδες ήταν κακώς διαφοροποιημένα. Μιτωτικά σχήματα ήταν κοινές (πεδίο υψηλής ισχύος 2-4 ανά στην ομάδα ελέγχου, αλλά ≤2 ανά πεδίο υψηλής ισχύος σε ομάδα ΑΤΡΑ-αγωγή) και το κυτταρόπλασμα ήταν ηωσινοφιλική να αμφιφιλικά, ενώ κερατινοποίησης ήταν ελάχιστη ή απούσα, παρόμοια με η αρχική καρκίνωμα. Οι παρατηρήσεις αυτές περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση για ινβολουκρίνη και loricrin (δείκτες τελικής διαφοροποίησης επιθήλιο) σε ιστούς από ξενομοσχεύματα όγκου (Σχήμα 4). Η έκφραση του ινβολουκρίνη και loricrin προκλήθηκε σημαντικά σε όγκους από ποντικούς που έλαβαν μόνο VPA, σε σύγκριση με τους όγκους από ποντικούς ελέγχου και ATRA αγωγή ποντικούς. Οι μεγαλύτερες επίπεδα ινβολουκρίνη και έκφραση loricrin βρέθηκαν σε όγκους από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το συνδυασμό των φαρμάκων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με χρώση Κί67. Η θεραπεία με VPA σε συνδυασμό με ATRA οδήγησε σε σημαντική μείωση της Ki67-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με το VPA, ATRA, ή θεραπεία οχήματος (13,0%

vs

39.4, 71.2, και 78.6, αντίστοιχα?.

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 5Β). Εκτός από την επαγωγή διαφοροποίησης, VPA προωθεί επίσης την απόπτωση [24]. Για να διερευνηθεί αυτό το αποτέλεσμα, πραγματοποιήσαμε χρώση TUNEL για την αξιολόγηση απόπτωσης σε ξενομοσχεύματα όγκου (Σχήμα 5Α). Σε όγκους από ποντικούς αναφοράς, ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ήταν ελάχιστη (3.6 ± 1.14). Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων σε όγκους από ΑΤΡΑ-ποντίκια με αγωγή δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές από εκείνες στα ποντίκια που έλαβαν μόνο VPA ή το όχημα. Υπήρξε μια σημαντική αύξηση σε αποπτωτικά κύτταρα (20,60 ± 4,16) στους όγκους συνδυασμό φάρμακο.

Η θεραπεία με VPA αύξησε μόνος σημαντικά το επίπεδο της ιστόνης Η3 ακετυλίωση, αποκαταστάθηκε έκφραση RARβ2, και επάγεται η έκφραση του τερματικού δείκτες διαφοροποίησης ινβολουκρίνη και loricrin, ενώ η θεραπεία με το συνδυασμό του VPA και ATRA οδήγησε σε μεγαλύτερη επίδραση στην επανενεργοποίηση αυτών έκφραση γονιδίων σε σύγκριση με είτε ενιαία φαρμακευτική αγωγή. Μικρή θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε ιστούς από την ομάδα ATRA φάρμακο.

Η

(Α) Cell απόπτωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL. Αποπτωτικών κυττάρων (πράσινο) μετρήθηκαν από τις εικόνες φθορισμού που λαμβάνονται από 10 τυχαία πεδία στα 200 × μεγέθυνση. Η θεραπεία με το συνδυασμό του VPA και ATRA σημαντικά αυξημένη απόπτωση σε σύγκριση με το όχημα ή τη θεραπεία μονού φαρμάκου. πολλαπλασιασμό (Β) των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση Κί67. Η κατανομή του Κί67-θετικών κυττάρων βαθμολογήθηκε από δύο ερευνητές. Μια σημαντική μείωση του αριθμού των Κί67-θετικών κυττάρων παρατηρήθηκε σε όγκους που έλαβαν το συνδυασμό των φαρμάκων σε σύγκριση με τη θεραπεία VPA μόνο του. Υπήρχε μόνο ελαφρά μείωση του αριθμού των Κί67-θετικών κυττάρων σε ομάδα που έλαβε αγωγή ATRA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, έναντι της ομάδας ελέγχου

Η

VPA και ATRA αποκατάσταση της έκφρασης RARβ2 μέσω επιγενετικών τροποποιήσεων και διαδοχικά. αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου κατά την επανενεργοποίηση έκφραση ΕΠΠΕ

Το ιστόνης Η3 κατάσταση ακετυλιώσεως των ξενομοσχευμάτων όγκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και ανάλυση Western blot. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 4 και 6, η θεραπεία VPA αύξησε σημαντικά το επίπεδο της ακετυλιωμένης Η3 σε σύγκριση με τον έλεγχο και την ομάδα ATRA. Όταν συνδυάζεται με ATRA, VPA παρουσίασαν εμφανή επίδραση πρόσθετο στο ιστονών επιγενετικής τροποποίησης.