Αφηρημένο

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από κακοήθη νοσήματα σε όλο τον κόσμο, με το μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του ( NSCLC) υποτύπου αντιπροσωπεύουν την πλειοψηφία των περιπτώσεων. NSCLC χαρακτηρίζεται από συχνές γονιδιωματική ανισορροπίες και παραλλαγές αριθμού αντιγράφων (CNVs), αλλά οι επιγενετικές εκτροπές που σχετίζονται με την κλινική πρόγνωση και θεραπευτική αποτυχία δεν παραμένουν πλήρη προσδιορισμό. Στην παρούσα μελέτη, συνολικά 55 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα είχαν συμπεριληφθεί και πραγματοποιήσαμε γονιδιωματικές αναλύσεις και γενετική έκφραση, ανοσοϊστοχημική ανίχνευση πρωτεϊνών, DNA μεθυλίωση και προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης χρωματίνης για την απόκτηση γενετικών και επιγενετικών προφίλ που σχετίζονται με την πρόγνωση και chemoresponse των ασθενών με NSCLC. Τέλος, siRNA επιμόλυνση με τη μεσολάβηση της γενετικής αποσιώπησης και σισπλατίνη δοκιμασίες κυτταροτοξικότητα σε κυτταρικές σειρές NSCLC Α-427 και ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ-37 αξιολογήθηκαν για να περιγράψει τους μηχανισμούς που εμπλέκονται χημειοαντίσταση. Τα αποτελέσματά μας εντοπίστηκαν υψηλές συχνότητες των CNVs (66-51% των περιπτώσεων) στις 7ρ22.3-p21.1 και 7p15.3-p15.2 κυτταρογενετική περιοχές. Ωστόσο, η υπερέκφραση των γονιδίων, όπως

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

και

AhR

, σε 7p21.2-p21.1 συνέβη τόπο παρά την απουσία CNVs και μικρές αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA. Σε αντίθεση, οι αλληλουχίες υποκινητή του

MEOX2

και

TWIST1

εμφανίζεται σημαντικά χαμηλότερη /μείωση στην κατασταλτική σήμα της ιστόνης H3K27me3 και την αύξηση του ενεργού σήματος της ιστόνης επίπεδα H3K4me3. Τέλος τα αποτελέσματα αυτά συσχετίζονται με κακή επιβίωση σε ασθενείς με NSCLC και κυτταρική χημειοαντίσταση να ογκολογικών φαρμάκων σε κυτταρικές σειρές NSCLC σε

MEOX2

και

TWIST1

υπερέκφραση εξαρτώμενο-τρόπο. Εν κατακλείδι, αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι

MEOX2

συμμετέχει σε χημειοαντίσταση ανεξάρτητα από το υψηλό CNV, αλλά εξαρτάται σημαντικά από H3K27me3 εμπλουτισμό πιθανώς σχετίζεται με την επιθετικότητα και την αποτυχία χημειοθεραπείας σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, ωστόσο πρόσθετες κλινικές μελέτες πρέπει να είναι για να επιβεβαιώσει τα ευρήματά μας ως νέα πιθανή κλινική δεικτών σε ασθενείς με ΜΜΚΠ

Παράθεση:. Άβιλα-Moreno F, Armas-López L, Álvarez-Moran AM, López-Bujanda Ζ, Ortiz-Quintero Β, Hidalgo-Μιράντα Α, et al. (2014) Η υπερέκφραση του

MEOX2

και

TWIST1

συνδέεται με H3K27me3 επίπεδα και καθορίζει τον Καρκίνο του Πνεύμονα χημειοαντίσταση και πρόγνωση. PLoS ONE 9 (12): e114104. doi: 10.1371 /journal.pone.0114104

Επιμέλεια: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12, Αυγ 2014? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 2 Δεκ, 2014

Copyright: © 2014 Άβιλα-Moreno et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί και Υποστήριξη στοιχεία πληροφοριών και αρχείων. έχουν δεδομένων Array υποβληθεί στη βάση δεδομένων GEO (GSE62407)

Χρηματοδότηση:. FAM συγγραφέας υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (CONACYT), κονδύλια για την έρευνα στις βασικές επιστήμες, Έργο 0.053.643? Έρευνα Διεύθυνση του Εθνικού Ινστιτούτου Αναπνευστικών Νοσημάτων (ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ)? και το Εθνικό Αυτόνομο Πανεπιστήμιο του Μεξικού, UNAM, Έργα IACOD-PAPIIT IA201611, PAPIIT IB202512 και PAPIIT RR282512. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο

πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο, τόσο οι ΗΠΑ [1] και σε όλο τον κόσμο, με το μη-μικροκυτταρικού καρκίνου (NSCLC) υποτύπου που αντιπροσωπεύουν την πλειοψηφία των περιπτώσεων σε καπνιστές και μη tobacco- συναφείς ασθενείς [2]. Αργά διαγνώσεις και αναποτελεσματική θεραπευτική συμβάλλουν στην κακή πρόγνωση και με το μέσο όρο ποσοστά 5ετούς επιβίωσης λιγότερο από 15% [1], [3], [4], [5].

NSCLC χαρακτηρίζεται από γονιδιωματική ανωμαλίες, τα οποία περιλαμβάνουν κοινές σωματικές παραλλαγές αριθμού αντιγράφων του DNA (CNVs). Συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμός (CGH) από φασματική καρυότυπο [6] ή προσδιορισμούς μικροσυστοιχιών γονιδιακού DNA χαμηλής ανάλυσης [7], [8], [9] κατέδειξαν απώλειες /διαγραφές στο 2q36-37, 3ρ21, 8ρ22, 9p21-22, 9q22 , 13q22 και 17p12-13, και τα κέρδη /ενισχύσεις σε θέση 1q23, 1q31, 3q25-27, 5p13-14, 6ρ, 7q και 8q23-24? Ωστόσο, μερικές από αυτές τις μεταβολές έχουν δειχθεί να εμπλέκονται σε επιθετικότητα του όγκου [9] ή την κλινική πρόοδο του NSCLC.

Πρόσφατα, διεθνείς κοινοπραξίες για τη μελέτη του καρκίνου του πνεύμονα έχουν χρησιμοποιήσει συστοιχίες SNP υψηλής πυκνότητας (250 K) για να περιγράψει CNVs, όπως 5p15.33, 7p11.2, 14q13.3 και 17q12, καθώς και μικροελλείψεις στο 5q11.2, 7q11.22 και 9p23 [10]. Μερικά από αυτά τα CNVs, όπως τα κέρδη στο 14q13.3 που περιέχει το

NKX2-8

[11] και

NKX2-1

γονίδια [10], έχει αποδειχθεί ότι είναι λειτουργικά εμπλέκονται στην ανάπτυξη , την επιβίωση και ογκογόνο δραστηριότητα σε NSCLC [10], [11]. Αυξήσεις στην CNV στα 5p13.2 τόπο έχουν προταθεί ως μια νέα μοριακού δείκτη της πρώιμης προ-διεισδυτικότητα [12]. Επιπλέον, μια γενετική υπογραφή του mRNA υπερέκφρασης από 7q11.23, 14q23.2 και 17q21.2 (

STX1A

,

HIF1A

και

CCR7

, αντίστοιχα) ήταν προσδιορίζονται ως προγνωστική εξέλιξη πρόγνωση υπογραφή κατά τα πρώτα κλινικά στάδια των ασθενών με NSCLC [13].

έχουν κακή πρόγνωση έχουν συνδεθεί με την 7ρ τόπο, η οποία μπορεί να οφείλεται, εν μέρει, στην αυξημένη CNV και την υπερέκφραση πιθανών ογκογονιδίων σε 7p15.3-11.2, οι οποίες έχουν περιγραφεί σε 56% των κυτταρικών σειρών NSCLC [14]. Επίσης, τα κέρδη σε 7p12-21 έχουν εντοπιστεί σε σχεδόν 50% των ασθενών με NSCLC με μεταστατική νόσο [15], το οποίο μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα από τα μοντέλα εξέλιξης καρυοτυπικής του NSCLC με βάση τα κέρδη του χρωμοσώματος 7 [16]. Επιπλέον, επιγενετικές εκτροπές, όπως DNA υπερμεθυλίωση στο 7p15.2 [17], μπορεί να αντιπροσωπεύουν σχετικές ρυθμιστικές μηχανισμούς ή /και δείκτες, όχι μόνο για τη βιολογία του καρκίνου του πνεύμονα [16], αλλά και για την εξέλιξη της NSCLC, λόγω της παρουσίας τους κατά την πρώιμη [ ,,,0],17] και αργά κλινικά στάδια [10], [11], [15]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, οι μοριακές σχέσεις μεταξύ CNVs υψηλής συχνότητας, επιγενετικές αλλοιώσεις, οι προγνώσεις των ασθενών και ογκολογικές αποτυχία στην NSCLC δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί πλήρως.

Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να συσχετίζονται δυναμικό επιγενετικές τροποποιήσεις με το μοτίβο της DNA αριθμού αντιγράφων αλλαγές στο NSCLC μέσω της χρήσης των συστοιχιών πλακάκια SNP υψηλής ανάλυσης (500 Κ). Εντοπίσαμε ενισχύσεις στο 7ρ22.3-p22.1, 7p21.3-p21.1 και 7p15.3-p15.2 κυτταρογενετική περιοχές σε εύρος 66 – 51% των περιπτώσεων μας. Αυτές οι ενισχύσεις είχαν ως αποτέλεσμα υπερέκφραση

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

και

AhR

παρά τα ελάχιστα αυξημένα επίπεδα της μεθυλίωσης του DNA. Ωστόσο, η σημαντικά χαμηλότερη εμπλουτισμό του καταπιεστικού δείκτη ιστονών H3K27me3 και η σημαντικά αυξημένη ενεργοποίηση των H3K4me3 τόσο η

MEOX2

και

TWIST1

περιοχές προαγωγού συσχετίζονται με κακή κλινική πρόγνωση. Ως εκ τούτου, όπως δείξαμε στο NSCLC μοντέλα κυτταρική γραμμή, σισπλατίνη χημειοαντίσταση συσχετίζεται με μια υπερ-έκφραση του

MEOX2

και

TWIST1

γονίδια, κυρίως λόγω της απώλειας των ιστονών κατασταλτικά σήματα H3K27me3. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι επιγενετικές μηχανισμοί υπερβαίνει γενετική (CNV) ανωμαλιών σε 7p21 και συμπληρώνουν τους, συμβάλλοντας έτσι στην επιθετικότητα και την αποτυχία της ογκολογικής θεραπείας σε ασθενείς με NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγμα επιλογής

Ένα σύνολο 55 όγκων του πνεύμονα (LT), 15 γειτονικά μη συμμετέχουν πνεύμονα συμφωνημένα ιστούς (LNAT) και 20 πρόδρομος πνευμονικών βλαβών (LP) από νωπά κατεψυγμένα (FF) και φορμόλη-Σταθερή και ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) ιστούς μεθόδους επεξεργασίας, συλλέχθηκαν από το χειρουργικό Υπηρεσία θώρακος και Παθολογίας Υπηρεσία στο Εθνικό Ινστιτούτο των αναπνευστικών παθήσεων (ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ). Επιπροσθέτως, οι κυτταρικές σειρές NSCLC SK-MES-1, Α-549, Α-427, αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) και ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ-37, ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ-51 ελήφθησαν από την μεξικανική Mestizo ασθενών, όπως έχει ήδη αναφερθεί [18], [19].

Ηθική Δήλωση

το Διοικητικό κριτική Θεσμική (IRB) του Εθνικού Ινστιτούτου Αναπνευστικών Νοσημάτων (ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ) ενέκρινε τα πρωτόκολλα με την B17 μητρώο -07 και B09-08, και από το Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), FES-Iztacala, Βιοϊατρική Ερευνητική Μονάδα ελεγχθεί και εγκριθεί τα πρωτόκολλα για τις μελέτες της γενετικής και της μοριακής βιολογίας. Πληροφορημένη συναίνεση ελήφθη από τους ασθενείς με διάγνωση LT και υποβάλλονται σε χειρουργικές διαδικασίες. Όλα τα άτομα υπέγραψαν την τεκμηριωμένη επιστολή συγκατάθεσης για αυτές τις έρευνες στο θώρακα υπηρεσία χειρουργική επέμβαση, ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ, και εξουσιοδότησε την αποθήκευση των βιολογικών δειγμάτων τους στο ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ και UNAM αποθετήρια για αυτό και μελλοντικές μελέτες. Σε αυτή τη μελέτη δεν συλλέγονται δείγματα από ανηλίκους /παιδιών, μόνο νεαρούς ενήλικες περιλήφθηκαν ηλικίας άνω των 18 ετών.

SNP Χαρτογράφηση Array 500 K υβριδισμός και Βιοπληροφορικής Αναλύσεις

Ένα σύνολο των 30 LNAT, LT, τα δείγματα LP και NSCLC κυτταρική σειρά DNA συμπεριλήφθηκαν στην πλατφόρμα υβριδισμό συστοιχίας (SNP 500 K) και σε ορισμένες περιπτώσεις για SNP 6,0 συστοιχίες, σύμφωνα με τη συνιστώμενη τις οδηγίες του κατασκευαστή (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας η προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [20] με τη σύγκριση 300 ανθρώπινα υγιείς δότες από τον πληθυσμό του Μεξικού Mestizo απλότυπου Χάρτης βάση δεδομένων που περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Affymetrix SNP δεδομένων συστοιχίες (Affymetrix Console έκδοση 4.1.3), εισήχθησαν, ομαλοποιημένη και οι αυξήσεις των CNV ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας προεπιλογών Partek Γονιδιωματική Σουίτα Πρόγραμμα και Partek Γονιδιώματος Δείτε Εργαλεία (Partek, Saint Louis, ΜΙ, USA), όταν ο μέσος όρος των 20 SNP υπερβεί μια αναλογία αριθμού αντιγράφων του 2,5 ή ήταν μικρότερη από 1,5 (

FDR

≤0.02). πρόβλεψη Pathway αναλύσεις από τα γονίδια με αριθμό αντιγράφων αλλαγές στα δείγματα NSCLC μας (S1 File) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την εφευρετικότητα προγράμματος συστήματος λογισμικού (Έκδοση 7.0). Ο κατάλογος των παρεκκλίνουσα γονιδίων που περιλαμβάνονται στην πρόβλεψη κυτταρικό μονοπάτι μας αναλύσεις, επιλέχθηκαν με βάση την διαθεσιμότητα των προφίλ έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς των πνευμόνων και των ιστών του καρκινώματος των πνευμόνων, χρησιμοποιώντας δεδομένα στην περιήγηση EntrezGene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /γονίδιο) και web browser GeneCards Human Gene Database (https://www.genecards.org/). SNP δεδομένων πίνακα που περιλαμβάνεται στην παρούσα μελέτη υποβλήθηκαν και εγκρίθηκαν από την Gene Expression Omnibus (GEO) της βάσης δεδομένων με τον επίσημο αριθμό GEO:. GSE62407

Ανοσοϊστοχημική Αναλύσεις σε ιστολογικά δείγματα

πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις επί LNAT, δείγματα ιστού LT και LP σταθεροποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη 10% ή Hope I /II αντιδραστική Μέθοδος (Innovative Diagnostik-System, Γερμανία), και στη συνέχεια χρησιμοποιώντας 1-2 μικρογραμμάρια ειδικών αντισωμάτων αντι-MEOX2, αντι-TWIST1, αντι-HDAC9 και αντι-EVX1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), με επώαση σε θάλαμο υγρασίας και επιπλέον της αντίδρασης αντιγόνου-ειδικών με αβιδίνη-βιοτίνη υπεροξειδάσης σύστημα /διαμινο-βενζιδίνη (Dako, Carpinteria, CA, USA ). Μια συσκευή Ventana System (Roche, Tucson, Αριζόνα, USA) και μια μελέτη που μεταδίδεται οπτικό μικροσκόπιο (Leica, Bannockburn, IL, USA), χρησιμοποιήθηκαν για την απόκτηση μικροφωτογραφίες σε 40Χ και 80X μεγέθυνση.

Real-Time PCR για έκφραση mRNA και DNA Ποσοτικοποίηση Δοκιμασίες

για τις αναλύσεις έκφρασης mRNA, cDNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA με τη χρήση της υψηλής χωρητικότητας Kit (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA και γενωμικό DNA ενισχύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς SYBR Green qPCR και σύνολα ολιγονουκλεοτιδίων σχεδιάστηκε από Primer Design ή /και τα προγράμματα λογισμικού Vector NT, και συντίθεται από την Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA), που περιγράφεται για το mRNA δοκιμασίες έκφρασης στον πίνακα S1, και για ακολουθίες υποκινητή DNA ανάλυση στον πίνακα S2.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR) εκτελέστηκε σε ένα βήμα One Plus και 7500 Διάταξη (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City , CA, USA), και σε ένα σύστημα LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germany), με τη χρήση δύναμης SYBR Green (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific , Fermentas, Life Science, Foster City, CA,).

Προϋποθέσεις για τη σχετική ποσοτική αντίδραση PCR χρησιμοποιώντας Fermentas SYBR Green ήταν ως ακολούθως, ένας κύκλος 50 ° C για 2 λεπτά, ένας κύκλος 95 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 30 s, και επιπλέον το βήμα επέκτασης στους 60 ° C για 30 s. Ενώ για Applied Biosystems Ισχύς SYBR Green είχαν ως εξής: ένας κύκλος 50 ° C για 2 λεπτά, ένας κύκλος 95 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 30 s. Στο τέλος της αντίδρασης PCR, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μία ανάλυση τήξης για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του amplicon, και γονίδιο β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως οικοκυρική για ανάλυση ομαλοποίηση.

Περιορισμός Enzyme ευαίσθητα σε μεθυλίωση Δοκιμασίες

κατάσταση μεθυλίωσης του γενωμικού DNA (200 ng), που προήλθε από LNAT, LT και LP ιστών και οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας 0,5 μονάδες η κάθε μία από ένα συνδυασμό ευαίσθητων σε μεθυλίωση ενζύμων περιορισμού

ΗραΙΙ

,

ΗργΟΗ4ΐν

και /ή

AciI

(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) και επώαση στους 37 ° C, για 4 ώρες. Ακολουθούμενη από προσδιορισμούς PCR ενίσχυση ευαίσθητων σε μεθυλίωση χρησιμοποιώντας σύνολα ολιγονουκλεοτιδίων (Πίνακας S2), σχεδιασμένο εσωτερικό των προβλεπόμενων CpG νησίδων των γονιδίων στόχων του Διοργανωτή (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, και

AhR

), τα ακόλουθα κριτήρια όπως το μέγεθος νησί & gt? 100, και το ποσοστό GC & gt?. 50.0, χρησιμοποιώντας MethPrimer να επισυνάψουν όσες θέσεις περιορισμού για την επίτευξη των ενζύμων ευαίσθητα σε κατάσταση μεθυλίωσης, μέσα στο αμπλικόνιο και αναφέρεται σε πίνακα S3

η μεθυλίωση Ευαίσθητα PCR αναλύσεις

κατάσταση μεθυλίωσης (%) υπολογίστηκε με βάση την μεθυλίωση δοκιμασίες Ευαίσθητες PCR, με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδίων σετ περιέχει θέσεις CpG μέσα στο αμπλικόνιο σε γονίδια-στόχους υποστηρικτής μελέτησε (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, και

AhR

) που περιγράφονται στον πίνακα S3. Εν συντομία, 50 ng χωνευμένο DNA χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος στις 25 μΙ συνολικού αντίδρασης PCR, και τα μεγέθη των προϊόντων αναλύθηκαν, σύμφωνα με τον πίνακα S3, ακολουθεί τα επόμενα συνθήκες PCR: ένας κύκλος στους 95 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 s, 55 ° C για 30 s και 72 ° C 45 s.

Επιπλέον, ανθρώπινο πνεύμονα (NSCLC) γραμμές Α-427 και ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ-37 χρησιμοποιήθηκαν για την τυποποίηση των συνθηκών ενζυματικές περιορισμού, ανάπτυξη

in vitro δοκιμασίες

μεθυλίωση χρησιμοποιώντας CpG μεθυλ-τρανσφεράσης (M.SssI) και μεθειονίνη S-αδενοσυλ (SAM), με επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες. Πρότυπο μεθυλιωμένο DNA και ανθρώπινο DNA σπέρματος εξάγεται από υγιείς δότες χρησιμοποιήθηκαν ως υπερ-μεθυλιώνεται και υπο-μεθυλιώνεται ελέγχους DNA για ενζυματικές αναλύσεις περιορισμού.

In Vitro

μεθυλίωσης του DNA και ιστόνης Τροποποίηση Δοκιμασίες Αναστολής

το ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ-37 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC (αδενοκαρκίνωμα) (5 × 10

5 κύτταρα) υποβλήθηκαν σε θεραπεία

in vitro

με 5′-αζα-δεοξυκυτιδίνη [4 μΜ A-427 και ], ότι αναστέλλει

de novo

μεθυλίωσης του DNA στο υποκινητές αλληλουχία, ή /και με TSA [300 nm], να αναστέλλουν τη δράση της αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) κατά τη διάρκεια 48 h.

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης (μάρκας)

Φρέσκα κατεψυγμένα LT (3 mm

3) κονιοποιήθηκαν κάτω από υγρό άζωτο κατάψυξη και σταθεροποιήθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη κατά την διάρκεια 10 λεπτών, και αμέσως εξουδετερώθηκε με 0,125 Μ γλυκίνη κατά την διάρκεια 5 λεπτών. Τα προκύπτοντα κύτταρα πλύθηκαν με 1% PBS και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM HEPES-ΚΟΗ ρΗ 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA ρΗ 8, Triton Χ-100 1%, 0,1% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS) που περιέχει αναστολέα πρωτεάσης

πλήρης μίνι

1 δισκίο σε 10 ml (Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA).

χρωματίνης από δείγματα LT υποβλήθηκε σε υπερήχους χρησιμοποιώντας 10 παλμούς των 20 δευτερολέπτων w /u 60 watts. 10 μg από χρωματίνη ανοσοκατακρημνίστηκε (μάρκας) με τη χρήση του εμπορικού σετ EZ-Magna ChIP G (Millipore, Temecula, CA, USA), και χρησιμοποιώντας 2,5 μα αντι-H3K27Ac, ​​αντι-H3K4me3, αντι-H3K27me3, αντι-H3K9me3 και αντι ΚΝΑ Pol II ενεργοποιείται αντισώματα (Abcam, Cambridge Science Park, Cambridge, UK). 1 μg IgG αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκε σαν ένας αρνητικός έλεγχος για πλινθίου (Millipore, Temecula, CA, USA). Ακεραιότητα και την ποιότητα των ακολουθιών υποκινητή της Immuno-καθιζάνει DNA (ΙΡ-DNA) αξιολογήθηκαν από προϊόν PCR ενίσχυση των 166 bp για την αλληλουχία υποκινητή του γονιδίου GADPH όπως συνιστάται από τον προμηθευτή (Millipore, Temecula, CA, USA).

IP-DNA ενίσχυσης και το chip Ποσοτικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας qPCR αναλύσεις

ανοσοκαταβυθίζονται DNA (IP-DNA) 20 ng γραμμικά ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ολόκληρο το γονιδίωμα Amplification (WGA1) Kit (Sigma, St. Louis, MO , USA), και μετά από αυτό καθαρίστηκε με στήλες MiniElute (QIAGEN, Hilden Renania-Westfalia, Germany).

Η ΙΡ-DNA που λαμβάνεται από τα δύο δείγματα LT και κυτταρικές γραμμές LT αναλύθηκαν με qPCR απόλυτη ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας LightCycler 480 Σύστημα (Roche, Mannheim, Γερμανία), και SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Fermentas Life Science, Foster City, CA, USA) και σύνολα ολιγονουκλεοτιδίων για τους στόχους και τους ελέγχους (Πίνακας S2).

ΙΡ-DNA 20 ng χρησιμοποιήθηκαν ανά αντίδραση, αναπτύχθηκαν παρομοίως ενίσχυση των πρότυπων καμπυλών, μέσω διαδοχικών αραιώσεων του φυσικού DNA από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς δότες (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, και 0.01 ng), και χρησιμοποιώντας αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων στόχων (Πίνακας S2), και τους ελέγχους αλληλουχία ολιγονουκλεοτιδίων ως c-fos προαγωγέα έχουν ληφθεί από το κιτ χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση Magnify System (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

κυτταροτοξικότητα Δοκιμασίες

Κινητή αναλύσεις βιωσιμότητας διεξήχθησαν σε πλάκες 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS ) (Promega, Madison, WI, USA) υπό την απουσία ή παρουσία του ογκολογικές cisplatinum φαρμάκου. Για να γίνει αυτό, πλάκες 96-φρεατίων εμβολιάστηκαν με 3.000 έως 5.000 κύτταρα σε 200 μΙ RPMI-1640 για 48 ώρες και, στη συνέχεια, επωάζονται με 10 μΙ MTS [5 mg /ml] για 3 ώρες, για μεταγενέστερη ανάγνωση στο 550 nm και /ή 570 nm, χρησιμοποιώντας τον τύπο: βιωσιμότητα των κυττάρων = (απορροφητικότητας του δείγματος /Ελέγχου OD) × 100. Ομοίως, οι καμπύλες αντίστασης στα φάρμακα αναπτύχθηκαν σε ένα δόσης-απόκρισης εξαρτώμενο τρόπο χρησιμοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις του σισπλατίνη φάρμακο για τον καρκίνο.

Γενετική κατασιγάσει (siRNA Επιμόλυνση Αναλύσεις)

Εμείς χρησιμοποιούνται μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA που) στρέφεται κατά

MEOX2

(SC-106233),

TWIST1

(SC-38604) και μη ανθρώπινα σχετίζονται mRNA ως αρνητικός μάρτυρας (SC-37007 και SC-44230), όλα προέρχονται από Σάντα Cruz Biotechnology (Ντάλας, Τέξας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Συνοπτικά, κυτταρικές καλλιέργειες με 3% FCS χωρίς αντιβιοτικά επωάστηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων κατά τη διάρκεια 12 ωρών και στη συνέχεια επιμολύνονται με το αντιδραστήριο RNAi, Lipofectamine (Life Technologies Corporation, Invitrogen, Foster City, CA, USA) και siRNAs στα 50 ηΜ, σε ένα συνολικό όγκο 100 μΙ.

Western Blot

οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και καθαρίστηκαν με τη μέθοδο του ΤΡΙΖΟΙ (Invitrogen), αιωρήθηκε σε SDS 5% με αναστολείς πρωτεάσης (πλήρες mini, Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA), και ποσοτικοποιηθεί με τη μέθοδο Lowry. Σύνολο πρωτεΐνες (30 μg) υποβλήθηκαν σε κατακόρυφο ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα ακρυλαμιδίου 12% και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας εξοπλισμό Trans-Blot-Turbo /Συστήματος Μεταφοράς (BioRad, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα στους 4 ° C, μπλοκάροντας με χαμηλά λιπαρά γάλα 5% σε PBS 1Χ /Tween20 0,1%, και επωάζονται 2 ώρες με αντισώματα (MEOX2) 1:1500, (TWIST1) 1:1500, (β-ακτίνη) 1 :3000, ή (GAPDH) 1:3000 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). Οι μεμβράνες επωάστηκαν επί 1 ώρα με ένα δευτερεύον αντίσωμα (αντι HRP ποντικού /αντι-κουνελιού HRP) 1:10000, σε θερμοκρασία δωματίου και αποκάλυψε με λουμινόλη 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας σαρωτή C-ψηφίο (Li-cor, Lincon, Nebraska, USA ) και Hypercassette και Ταινίες (Amersham, Chalfont, Buckinghamshire, Αγγλία).

Στατιστικές αναλύσεις

ακριβές τεστ του Fisher,

t-test

και Mann Whitney-U στατιστικές δοκιμές ήταν χρησιμοποιείται για να αναλύσει τις διαφορές μεταξύ των ομάδων των ασθενών,

σ

τιμές ≤0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Χρησιμοποιήσαμε επίσης Log-Rank (Mantel Cox) και Gehan-Breslow-Wilcoxon τεστ καμπύλης επιβίωσης. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS στατιστικού λογισμικού για Mac-OS X (έκδοση 11.0) και GraphPad (έκδοση 5.0).

Αποτελέσματα

Η χρωμοσωμική Microaberrations και αυξημένη Παραλλαγές Αριθμός Copy (CNVs) με την Ύπατη συχνότητες σε 7p22-21 και 7p15 στον καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς

για να εντοπίσει τις πιο συχνές γενετικές microaberrations με πιθανή προφίλ γενετική έκφραση και επιγενετικές αλλοιώσεις σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, LNAT-, LP-, ΕΤ και NSCLC κυτταρική γραμμή που προέρχεται από δείγματα DNA (η = 30) υποβλήθηκαν σε δοκιμασίες γενωμικού υβριδισμού για SNP 500 K μικροσυστοιχίες. Η ανάλυση βιοπληροφορικής τμηματική επέτρεψε την ταυτοποίηση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών και αυξημένη CNVs στις LT προερχόμενα δείγματα, τα οποία δεν παρατηρήθηκαν στις LNAT προερχόμενα συμφωνημένα ιστούς. Τυπικά χρωμοσωμικές ανωμαλίες στον καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων 3ρ διαγραφές? ενίσχυση πολλαπλών περιοχών στα χρωμοσώματα 5, 12, 14, 16, 18, 19 και 20? και ενίσχυση /ταυτοποιήθηκαν διαγραφή αρκετές περιοχές του χρωμοσώματος 8 (Σχήμα 1Α).

Focal ανάλυση του συνόλου του γονιδιώματος και χρωμόσωμα 7. (α) μια ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος και την ανάλυση βιοπληροφορικής τμηματική τριών καρκίνου του πνεύμονα ασθενείς διεξήχθη με τη χρήση συμφωνημένα, ιστολογικά γειτονικό ιστό μη συμμετέχουν πνεύμονα (LNAT) και καρκινώματα πνεύμονα (LT). (Β) Ολόκληρο-γονιδιώματος και εστιακό αναλύσεις του φυσιολογικού πνεύμονα, πρόδρομος του πνεύμονα βλάβες και καρκινώματα του πνεύμονα (18-14 των 27 βλάβες στους πνεύμονες με υψηλή CNV). (Γ) Ένα εστιακό ανάλυση του χρωμοσώματος 7 αποκάλυψε μια υψηλή συχνότητα CNV στην περιοχή 7p21 (βέλος) σε προκαρκινικές βλάβες του πνεύμονα και καρκινώματα του πνεύμονα.

Η

Μια υψηλή συχνότητα CNV χρησιμοποιώντας εστιακό γονιδιωματικής ανάλυσης στη 7p22. 3-p22.1, 7p21.3-p21.1 και 7p15.3-p15.2 (Εικόνα 1Β) ανιχνεύθηκαν. Ειδικότερα, παρατηρήσαμε επιμηκύνσεις DNA στην 7p21.1 τόπο στο ΕΤ και LP που προέρχονται από τα δείγματα σε σχεδόν το 55% των περιπτώσεων (15/27 πνευμονικών βλαβών), συμπεριλαμβανομένων 3 από 4 πρόδρομες βλάβες (Σχήμα 1Γ και στο Σχήμα S1), που δεν παρατηρήθηκαν στις LNAT προερχόμενα δείγματα (Σχήμα 1 C).

Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε αυξήσεις CNV στην 7ρ τόπο τόσο στα δείγματα LP- και LT που προέρχεται χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα SNP 6.0 (Σχήμα S2 ). Τα 39 γονίδια με τα υψηλότερα ποσοστά μεταβολής των CNV παρουσιάζονται στον Πίνακα S4. Οι αλλαγές αυτές βρίσκονται στην 7ρ22.3-p22.1 και 7p21.3-p21.1 κυτταρογενετική περιοχές, και περιλαμβάνεται

ZNF12

,

RPA3

,

MEOX2

,

BZW2

,

TSPAN13

,

AGR2

,

AGR3

,

AhR

,

TWIST1

και

HDAC9

. Αλλαγές στο

TWISTN

,

HNRNPA2

,

CBX3

, η

Hoxa

συμπλέγματος και

EVX1

, τα οποία βρίσκονται σε 7p15. 3-p15.2, εντοπίστηκαν επίσης (Πίνακας S4).

Εντοπίσαμε ένα σύνολο 1.376 γονιδίων με αριθμό αντιγράφων αλλάζει σε ανθρώπινο πνεύμονα δείγματα καρκίνου μας (S1 αρχείου). Από αυτά τα γονίδια, 809 γονίδια ενισχύθηκαν με συχνότητα 37-66% σε χρωμόσωμα 7.

Με βάση αυτή την ανάλυση βρήκαμε έναν εμπλουτισμό των γονιδίων που εμπλέκονται σε αρκετές οδούς κυτταρικής σηματοδότησης, ιδίως έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική κίνηση , ο θάνατος των κυττάρων και τα δίκτυα εμβρυϊκή ανάπτυξη (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ορισμένα από αυτά που απαριθμούνται στον πίνακα S4, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι γενετικές ή /και επιγενετικές εκτροπές παίζει ένα λειτουργικό σημαντικό ρόλο στη βιολογία του καρκίνου του πνεύμονα.

Αυξήσεις στα CNV σε 7p21 και 7p15 συσχετίζεται με mRNA και πρωτεΐνης υπερέκφραση και όχι μεθυλίωσης του DNA σε καρκίνο του πνεύμονα

Η συσχέτιση μεταξύ της αύξησης των CNV και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA, καθώς και τον αντίκτυπο της μεθυλίωσης του DNA στα προφίλ έκφρασης του mRNA αναλύθηκαν σε καρκινώματα του πνεύμονα. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες qRT-PCR, βρήκαμε ότι μόνο

MEOX2

,

HDAC9

και

TWIST1

(Εικόνα 2Α), καθώς και

AhR

και

EVX1

γονίδια (Σχήμα S3A-Β) ήταν υπερ-εκφράζεται και συσχετίζεται θετικά με CNV-υψηλή πλαίσιο (Εικόνα 1Β και Γ και σχήμα S1), σε σύγκριση με άλλα γονίδια στο 7p21 (δεν φαίνεται). Η έκφραση αυτών των γονιδίων ήταν σημαντικά υψηλότερη στα δείγματα LT προερχόμενων από ότι στα LNAT προερχόμενα δείγματα (

σ

≤0.05). Επιπλέον, τα επίπεδα της πυρηνικής πρωτεΐνης του

MEOX2

,

HDAC9

και

TWIST1

αυξήθηκαν σταθερά στις LT προερχόμενα δείγματα (Σχήμα 2Β), καθώς και

MEOX2

και

TWIST1

πρωτεΐνη επίπεδα /αφθονία σε κυτταρικές σειρές NSCLC (Σχήμα S4A-C), ενώ η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών στην παρακείμενη πνευμονικό παρέγχυμα και τα LNAT προερχόμενα δείγματα δεν αυξήθηκαν (Εικόνα 2Β ), όπως ανιχνεύεται με χρήση ανοσοϊστοχημείας. Μία αύξηση στην

EVX1

έκφραση ανιχνεύθηκε σε μεμβράνες στα LP- και LT που προέρχονται από τα δείγματα και τις κυτταρικές γραμμές NSCLC (Σχήμα S5A-Β).

(Α)

MEOX2

,

HDAC9

και

TWIST1

έκφραση του mRNA. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης του μέσου. (Β) Η έκφραση της πρωτεΐνης σε παρακείμενες μη συμμετέχουν πνευμονικός ιστός (LNAT), πρόδρομος πνευμονικών βλαβών (LP) και καρκινώματα πνεύμονα (LT) (μικροφωτογραφίες στα 200Χ και 400Χ), καθώς επίσης και σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) και κατεψυγμένα (FF) ιστούς, συγκρίθηκαν. (C) Ανάδοχος ανάλυση μεθυλίωσης αλληλουχίας. Οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές σε σχέση με την LNAT και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher, ένα αταίριαστο

t-test

και Mann-Whitney U, *

σ

≤0.05? **

σ

≤0.005? ***

σ

≤0.001. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν λεπτό στο μέγιστο βαθμό με διάστημα εμπιστοσύνης 95%, και οικόπεδα κουτί αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις από τη μέση τιμή.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η επίδραση στη γονιδιακή έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με CNV, τη συμμετοχή των επιγενετικών αξιολογήθηκε μεταβολές, ιδίως μεθυλίωσης του DNA. ενζυματικές δοκιμασίες περιορισμός ευαίσθητα σε μεθυλίωση αποκάλυψε μικρές διαφορές στο ποσοστό μεθυλίωσης του DNA μεταξύ των LNAT- και LT που προέρχονται από δείγματα στις αλληλουχίες υποκινητή του

MEOX2

,

HDAC9

και

TWIST1

(Σχήμα 2C), γεγονός που υποδηλώνει έλλειψη συσχετισμού μεταξύ της έκφρασης του mRNA και μεθυλίωσης του DNA (Σχήμα 2Α και 2C). Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει μια μείωση της μεθυλίωσης του DNA για

MEOX2

,

HDAC9

και

TWIST1

(

σ

≤0.005 και

p

≤0.001, αντίστοιχα), στο LP που προέρχονται από δείγματα που δεν παρατηρήθηκαν στις LNAT- και LT που προέρχονται από τα δείγματα (Σχήμα 2C).

Ως συμπλήρωμα, μια αξιόπιστη ανάλυση μεταξύ του LNAT- και LT προερχόμενο από δείγματα σε ορισμένες CNV χωρίς ασθενών αποκάλυψε επίσης μια υπερέκφραση του mRNA της

MEOX2

,

HDAC9

, και

TWIST1

, γεγονός που υποδηλώνει μια έλλειψη γενετικής (CNV) και επιγενετικές (μεθυλίωση του DNA) συσχέτιση (Σχήμα S6a-C), καθώς και η έλλειψη γενετικής-επιγενετικών αντιστοιχίας του CNV-υψηλής ασθενείς (Σχήμα S7A-C)? με εξαίρεση για το

AhR

γονιδίων μεταξύ LNAT- και LT-δείγματα (Σχήμα S3A, S3C), καθώς και μεταξύ CNV-free και CNV-υψηλής ασθενείς (S6D, και S7D). Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η μεθυλίωση του DNA δεν είναι ο κύριος υπεύθυνος για τις παρατηρούμενες μορφές έκφρασης στην κυτταρογενετική περιοχή 7p21 σε καρκινώματα του πνεύμονα, όπως NSCLC.

Μειώσεις του κώδικα ιστόνης της H3K27me3 και Αυξήσεις H3K4me3 είναι που συνδέονται με το

MEOX2

και

TWIST1

υπερέκφραση και συσχετίζεται με κακή κλινική πρόγνωση σε NSCLC

Ως εκ τούτου, ρωτήσαμε αν άλλες επιγενετικές τροποποιήσεις θα μπορούσαν να συμμετάσχουν στη ρύθμιση των πληγεισών γονιδίων, εστιάζοντας στην κυτταρογενετική περιοχή 7p21 στον NSCLC.

σε αυτό, ως μια εντελώς ανεξάρτητη μελέτη επικύρωσης, το ρόλο των τροποποιήσεων ιστονών στην υπερέκφραση του

MEOX2

και

TWIST1

στην NSCLC ασθενείς αξιολογήθηκε. Για την ανάλυση αυτή μια πρόσθετη ομάδα των ασθενών που είχαν υποβληθεί σε κλινική παρακολούθηση, μελετήθηκε για να προσδιοριστεί εάν

MEOX2

και

TWIST1

υπερέκφραση στον καρκινικό ιστό συσχετίστηκε με τα επίπεδα του H3K27me3

vs.

H3K27Ac και H3K4me3 και θα μπορούσε να καθορίσει την πρόγνωση ή /και την ανταπόκριση σε ογκολογικές θεραπεία σε ασθενείς με NSCLC.

Μια ζεύγη ανάλυση μεταξύ των LNAT- και LT που προέρχονται από τα δείγματα, σε συνεργασία με το

MEOX2

και

TWIST1

υπερέκφραση (Σχήμα 3Α-Β), αποκάλυψε μια μείωση στην H3K27me3 (Σχήμα 3C-D). Αυτοί οι ασθενείς με χαμηλότερα επίπεδα εμπλουτισμού του καταπιεστικού ιστόνης H3K27me3 και υψηλή

MEOX2

και

TWIST1

έκφραση του mRNA (Σχήμα 3Α-D) εμφανίζεται χαμηλά ποσοστά επιβίωσης, με μέσο όρο 6,2 μήνες (ΔΣΕ, RSCL, MGGR, GOMJ και GCH ασθενείς) ενώ οι ασθενείς με υψηλότερα επίπεδα εμπλουτισμού H3K27me3 και χαμηλή

MEOX2

και

TWIST1

έκφραση του mRNA (Σχήμα 3Α-D) εμφανίζονται καλύτερα ποσοστά επιβίωσης, με μέσο όρο 53,4 μήνες (ΥΔΚΑΣ, ΑΕΕ, SPN, το ΕΠΣΕ και PMA ασθενείς, με

σ

≤0.0027) (Σχήμα 3Ε, Πίνακας 1).

(Α)

MEOX2

έκφρασης στον NSCLC και τα LNAT που προέρχονται από τα δείγματα, και (Β)

TWIST1

έκφραση σε NSCLC και τα LNAT που προέρχονται από τα δείγματα. Οι ράβδοι σφάλματος παριστάνουν τυπικά σφάλματα του μέσου όρου των τριών επαναλήψεων. προφίλ εμπλουτισμού (C) την τροποποίηση των ιστονών του

MEOX2

αλληλουχία του υποκινητή. προφίλ εμπλουτισμού (Δ) την τροποποίηση της ιστόνης του

TWIST1

αλληλουχία του υποκινητή. οικόπεδα Box αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών επαναλήψεων. Η ανάλυση αποκάλυψε μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης χαμηλή mRNA και τον εμπλουτισμό H3K27me3. καμπύλη (Ε) Επιβίωση αναλύσεις βασίζονται σε log-rank (Mantel Cox) και Gehan-Breslow-Wilcoxon τεστ της σχετικής δείκτη έκφραση

MEOX2

συν

TWIST1

(

p

≤0.0027).

η

Επίσης, σημαντικά αυξημένα επίπεδα (

σ

≤0.008) του καταπιεστικού δείκτη της ιστόνης H3K27me3 τόσο η

MEOX2

και

TWIST1

αλληλουχίες υποκινητή επιβεβαιώθηκαν για τους ασθενείς με υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης (Εικόνα 4Α-Β). Ωστόσο, δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα H3K27Ac παρατηρήθηκαν (Σχήμα 4C-D). Αντίθετα, μειώνονται τα επίπεδα των H3K4me3 δείκτη ενεργοποίησης ανιχνεύτηκαν τόσο η

MEOX2

(

σ

≤0.028) και

TWIST1

(

p

≤ 0,0006) αλληλουχίες προαγωγού στην ομάδα του υψηλού επιβίωση των ασθενών (Σχήμα 4Ε-F) και συσχετίστηκαν με μερική ανταπόκριση σε ένα επίκουρο σισπλατίνη ή καρβοπλατίνη, ως η πρώτη γραμμή χημειοθεραπείας σε ασθενείς με NSCLC (Πίνακας 1).

(Α ) H3K27me3 εμπλουτισμός του

MEOX2

αλληλουχία του υποκινητή (** Mann-Whitney U test,

σ

≤0.01, και F test,

σ

≤0.0003) και (Β ) H3K27me3 εμπλουτισμό με το

TWIST1

αλληλουχία του υποκινητή σε ασθενείς υψηλού επιβίωση σε σύγκριση με ασθενείς με κακή πρόγνωση (*** Mann-Whitney U test,

σ

≤0.01, και αταίριαστα t-test ,

σ

≤0.02). (Γ) H3K27ac εμπλουτισμού στην αλληλουχία προαγωγέα του

MEOX2

(καμία σημαντική αλλαγή) και (Δ) H3K27ac εμπλουτισμού στην αλληλουχία προαγωγέα του

TWIST1

σε ασθενείς υψηλού επιβίωση σε σύγκριση με ασθενείς με κακή πρόγνωση (δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές). (Ε) H3K4me3 εμπλουτισμού στο

MEOX2

αλληλουχία του υποκινητή (* F τεστ,

σ

≤0.02) και (F) το

TWIST1

αλληλουχία του υποκινητή σε ασθενείς υψηλού επιβίωση σε σύγκριση