Abstract

Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Wnt εμπλέκεται σε πολυάριθμες ανθρώπινους καρκίνους, και την κατανόηση των επιπτώσεων της διαφοροποίησης των μελών οδού μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων. Η έκφραση της εκκρινόμενης κατσαρωμένα σχετίζονται πρωτεΐνη 4 (SFRP4), ένα εξωκυτταρικό ρυθμιστής του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt, σταδιακά χάνεται σε πιο επιθετικά φαινοτύπους καρκίνου των ωοθηκών. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ανασυνδυασμένη SFRP4 (rSFRP4) επεξεργασία μίας ορώδες κυτταρική σειρά καρκίνου αποτελέσματα των ωοθηκών σε αναστολή της β-κατενίνης που εξαρτώνται από σηματοδότηση Wnt, όπως μετράται με τη δοκιμασία ανταποκριτή TOP /FOP Wnt και μειωμένη μεταγραφή των γονιδίων στόχων Wnt, Axin2, CyclinD1 και Myc. Επιπλέον, η θεραπεία rSFRP4 αύξησε σημαντικά την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών να προσκολληθούν στο κολλαγόνο και ινονεκτίνη, και μειωμένη ικανότητα τους να μεταναστεύουν κατά μήκος ενός προκλήθηκε τραύμα. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι αυτές οι αλλαγές στη συμπεριφορά των κυττάρων μπορεί να προκαλείται μέσω μεσεγχυματικών σε επιθηλιακό μετάβαση (ΚΟΑ), ως θεραπεία rSFRP4 είχε επίσης ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης, και μειωμένη έκφραση της βιμεντίνης και Twist. Σε συνδυασμό, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η διαμόρφωση μιας ενιαίας ανάντη gatekeeper του σηματοδότηση Wnt μπορεί να έχει επιπτώσεις στην κατάντη Wnt σηματοδότηση και τη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, όπως τη μεσολάβηση των επιθηλιακών σε μεσεγχυματικά πλαστικότητα (EMP). Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι SFRP4 μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο διαγνωστικά και θεραπευτικά σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Ford CE, Jary Ε, Ma SSQ, Nixdorf S, Heinzelmann-Schwarz VA, Ward RL (2013) Η Wnt gatekeeper SFRP4 διαμορφώνει EMT, μετανάστευση των κυττάρων και μεταγενέστεροι Wnt σηματοδότηση σε κύτταρα υδαρής καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (1): e54362. doi: 10.1371 /journal.pone.0054362

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Ιουλ, 2012? Αποδεκτές: 11 Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Ford et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από την θεραπεία του καρκίνου Αυστραλία Ίδρυμα (# 1008633, CEF), Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας Συμβούλιο CJ Martin Fellowship (# 466005, CEF), Cancer Institute NSW (# 09 /CRF /2-02, VHS) ο William Maxwell Εμπιστοσύνη (VHS) και η Βασιλική της Αυστραλίας και της Νέας Ζηλανδίας Κολέγιο Μαιευτήρων και Γυναικολόγων (VHS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών έχει την υψηλότερη θνησιμότητα όλων των γυναικολογικών καρκίνων [1], [2]. Παρά τις πρόσφατες γνώσεις σχετικά με την ετερογένεια της ασθένειας αυτής [3] – [6], και μια συζήτηση επί της κυτταρικής προέλευσης [7], [8], οι περισσότεροι ασθενείς επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών λαμβάνουν την ίδια συστημική θεραπεία (καρβοπλατίνη, Paclitaxel [5] . η περαιτέρω έρευνα για τις μοριακές διαδρομές που στηρίζουν αυτή την ασθένεια είναι απαραίτητη προκειμένου για την ταυτοποίηση νέων όγκων-δείκτες και στόχους για θεραπευτική παρέμβαση Μία οδός η οποία έχει ταυτοποιηθεί ως δυνητικών σημασία στον καρκίνο των ωοθηκών είναι η οδός σηματοδότησης Wnt [9] -. [11 ].

το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt είναι ένα κρίσιμο αναπτυξιακό μονοπάτι που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση, πολικότητα, τη μετανάστευση, εισβολή, προσκόλληση και την επιβίωση [12]. οι ίδιες κυτταρικές διεργασίες αποτελούν βασικά συστατικά της ογκογένεσης και της μετάστασης, και ως εκ τούτου ο ρόλος του σηματοδότηση Wnt σε ανθρώπινο καρκίνο ολοένα και διερευνάται μαζί με θεραπευτικές στρατηγικές για τη στόχευση συστατικά οδό. Δυσλειτουργία του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt έχει ενοχοποιηθεί σε πολυάριθμες καρκίνους συμπεριλαμβανομένων εκείνων με υψηλό επιπολασμό και /ή κακή έκβαση, όπως του ορθοκολικού, μαστού, των ωοθηκών, και καρκίνο του προστάτη (αναθεωρούνται στο [13]).

Αυτό το πολύπλευρο δίκτυο σηματοδότησης παραδοσιακά απλοποιηθεί με τη διαίρεση του δικτύου σε κανονική (β-κατενίνης εξαρτώμενο) και μη κανονικών (ανεξάρτητη β-κατενίνης) μονοπάτια. Κανονικού σηματοδότηση Wnt περιλαμβάνει την πρόσδεση του συνδέτη Wnt με μία από τις δέκα Frizzled υποδοχέων (Fzd) παρουσία μιας πρωτεΐνης που σχετίζονται με υποδοχέα χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνης (LRP) συν-υποδοχέα. Αυτό δημιουργεί έναν καταρράκτη των γεγονότων που οδήγησαν στην αποσυναρμολόγηση του συγκροτήματος καταστροφής Axin /APC /ΟδΚ3β και τη σταθεροποίηση της β-κατενίνης. Συσσώρευση β-κατενίνης στα αποτελέσματα κυτταρόπλασμα σε μετατόπιση προς τον πυρήνα και TCF /LEF διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στην κυτταρική διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό. Βασικά κατάντη στόχοι του ενεργού κανονικού σηματοδότησης Wnt περιλαμβάνουν C-myc (

MYC

), CyclinD1 (

CCND1

) και Axin2 (

AXIN2

) [12].

Το μονοπάτι Wnt ρυθμίζεται σε πολλαπλά επίπεδα, με τους ανταγωνιστές Wnt ή «πρωτεΐνες φύλακα» λαμβάνει προσοχή τα τελευταία χρόνια, λόγω των συχνών αδρανοποίησή τους στον καρκίνο. Αυτή η ομάδα των Wnt διαμορφωτών περιλαμβάνει την οικογένεια Dickkopf (DKK1-4), WIF-1 και την οικογένεια εκκρινομένων πρωτεϊνών υποδοχέα frizzled (SFRP1-5). SFRPs είναι διαλυτές εξωκυτταρικές πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από κατσαρωμένα-σαν τους πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή (CRD), η οποία πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την ικανότητά τους να διαμορφώνουν σηματοδότηση Wnt μέσω σύνδεσης απευθείας σε Wnt συνδετήρες ή Frizzled υποδοχείς. SFRPs έχουν δείξει να λειτουργούν ως καταστολείς όγκων σε άλλους τύπους καρκίνου του [14] – [17]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι μία από αυτές φύλακες, SFRP4, εκκρίνεται στη ροή του αίματος και προοδευτικά χάνονται σε πιο επιθετικά φαινοτύπους καρκίνου των ωοθηκών, όπως οι καρκίνοι Τύπου II [18]. Επιπλέον, ασθενείς με έλλειψη έκφρασης SFRP4 είχαν χειρότερη πρόγνωση από εκείνους που εκφράζουν SFRP4 [18].

Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι μια βασική αναπτυξιακή διαδικασία που τα καρκινικά κύτταρα αεροπειρατείας να αυξήσει την επιθετικότητα τους και επεμβατική δυναμικό [19] . Αν και ο τύπος συγκροτήματος, και κυττάρου ειδικά, κύτταρα που υφίστανται EMT μπορεί γενικά να χαρακτηρίζεται από την απώλεια της Ε-καδερίνης και κέρδος βιμεντίνης, Twist και σαλιγκάρι. Η μεταβατική διαδικασία μπορεί επίσης να συμβεί στην αντίθετη κατεύθυνση (μεσεγχυματικά σε επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ).) Είναι πλέον κατανοητό ότι το ΚΟΑ είναι ίσης σημασίας στην οργανογένεση και την μετάσταση, και ότι υπάρχουν πολλά ενδιάμεσα ή «μετασταθής» των κυττάρων κράτη όπως κύτταρα μετάβαση μεταξύ τα δύο άκρα [20], [21]. Αυτή η δυναμική διαδικασία έχει ονομαστεί επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά πλαστικότητα, ή EMP. Πολλά μονοπάτια σηματοδότησης έχουν συνδεθεί με EMP, κυρίως του TGF-β, Notch και μονοπατιών Wnt.

Στην παρούσα μελέτη διερευνούμε τις λειτουργικές επιδράσεις της διαμόρφωσης ενός κλειδιού Wnt μονοπάτι φύλακα, SFRP4 για σηματοδότηση Wnt, κελί συμπεριφορά και EMT. Αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι εκ νέου έκφραση του SFRP4 σε ένα επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών κυτταρική γραμμή αναστέλλει σηματοδότηση Wnt, αυξάνει την πρόσφυση, αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και αναστέλλει EMT. Δεδομένου ότι η έκφραση SFRP4 έχει αποδειχθεί για να χαθεί σε μια μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [18], αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι η διαφοροποίηση των Wnt σηματοδότηση μέσω SFRP4 ή άλλων ανάντη Wnt μέλη οδός μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα λεωφόρο για στοχευμένη θεραπεία κατά του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο ορώδες καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα OVCAR3, που λαμβάνεται από την ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) καλλιεργήθηκαν σε RPMI που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Το μέσο συμπληρώθηκε με πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (90 μονάδες /ml πενικιλλίνη? 90 μg /ml στρεπτομυκίνη) και 1,8 mM GlutaMAX (Life Technologies). Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2, στους 37 ° C και αποδείχθηκε ότι είναι απαλλαγμένα από μόλυνση μυκοπλάσματος.

δοκιμασίες ρεπόρτερ Wnt

κύτταρα OVCAR3 απλώθηκαν σε συγκέντρωση 5.000 κύτταρα /φρεάτιο σε λευκό πυθμένα πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα στερήθηκαν ορό επί μία νύκτα και συν-επιμολύνθηκαν με 0.2 μα είτε TOPflash (3 θέσεις σύνδεσης × TCF4) ή FOPflash (3 χ μεταλλαγμένες TCF4 θέσεις σύνδεσης) πλασμίδια έκφρασης (Millipore, Temecula, CA, USA), και 0,1 μg ρΡΙ_-ΤΚ (φορέας Renilla-ΤΚ-λουσιφεράσης, Promega) ως έλεγχο, με τη χρήση Lipofectamine2000. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με αυξανόμενες δόσεις rSFRP4 ή /και ανασυνδυασμένου Wnt3 ένα (rWnt3 ένα 0.1 μg /ml) για 48 ώρες πριν από την λουσιφεράση δραστηριότητες που μετριέται χρησιμοποιώντας ένα Glomax 96 Microplate Luminometer (Turner Biosystems Instrument, Sunnyvale, CA, USA). δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly ομαλοποιήθηκε για αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης διαιρώντας με τη δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. Ο λόγος TOP /FOP χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της β-κατενίνης με γνώμονα τη μεταγραφή. τυπικές αποκλίσεις μέση δραστηριότητα και προήλθαν από octopulate επιμολυσμένα δείγματα.

Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφάσης (qPCR)

Μετά την αγωγή DNAse, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ Quantitect RT (Qiagen, Valencia, CA, USA). Έλεγχοι που περιέχει RNA αλλά χωρίς ανάστροφης μεταγραφάσης συμπεριλήφθηκαν για όλα τα δείγματα. qPCR διεξήχθη εις τριπλούν σε ένα Stratagene MxPro μηχανή 3005 P χρησιμοποιώντας 25 ng του εκμαγείου cDNA και SYBR πράσινο /Rox κύριο μείγμα (Qiagen). Έκφραση ομαλοποιήθηκε σε τρία διαφορετικά γονίδια καθαριότητα (SDHA, HSPCB, YWHZA) με τη μέθοδο της κανονικοποίησης Vandesompele [22]

Primer ακολουθίες που χρησιμοποιούνται για qPCR ήταν SFRP4:. Προς τα εμπρός (F) 5 ‘TGTGTTACGAGTGGCG 3’, αντίστροφη ( R) 5 ‘GGGGGATTACTACGACTG 3’, Cdh1: F 5 ‘AGGCCAAGCAGCAGTACATT 3’ R 5 ‘ATTCACATCCAGCACATCCA 3’, VIM F 5 ‘CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC 3’ R 5 ‘GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA 3’, TWIST F 5 ‘GCCAATCAGCCACTGAAAGG 3’ R 5 ‘TGTTCTTATAGTTCCTCTGATTGTTACCA 3’ , AXIN2 F 5 ‘TCAAGTGCAAACTTTCGCCAACC 3’ ‘TAGCCAGAACCTATGTGATAAGG 3’ R5, MYC F 5 ‘CGTCTCCACACATCAGCACAA 3’, R 5 ‘CACTGTCCAACTTGACCCTCTTG 3’, CCND1 F 5 ‘GGCGGAGGAGAACAAACAGA 3’ R 5 ‘TGGCACAAGAGGCAACGA 3’, JNK F 5’TCTGGTATGATCCTTCTGAAGCA 3 «R 5 ‘TCCTCCAAGTCCATAACTTCCTT, RhoA F 5’ GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT 3 ‘R 5’ GGCTGTCGATGGAAAAACACAT 3 ‘, RAC1 F 5’ TGTAGTCGCTTTGCCTATTGATG 3 ‘R 5’ CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3 ‘, PRKCA F 5’ GCTTCCAGTGCCAAGTTTGC 3 ‘R 5’ CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3 ‘, SDHA F 5 ‘CTTGAATGAGGCTGACTGTG 3’ R 5 ‘ATCACATAAGCTGGTCCTGT 3’, HSPCB F 5 ‘TCTGGGTATCGGAAAGCAAGCC 3’ R 5 ‘GTGCACTTCCTCAGGCATCTTG 3’, YWHZA F 5 ‘ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 3’ R 5 ‘CCGCCAGGACAAACCAGTAT 3’.

Δυτική κηλίδες

τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με λύση κυττάρων σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 0.27 Μ σακχαρόζη, 1 χ πλήρης αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία)). Τα κυτταρολύματα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για ανάλυση συγκέντρωση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας το κιτ BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). λύματα πυρηνική πρωτεΐνη παρασκευάστηκαν με λύση κυττάρων σε παγωμένο Πυρήνες Buffer (10 mM Tris, ρΗ 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA και 0,5% ΝΡ-40, αναστολείς πρωτεάσης) και επώαση σε πάγο για 10 λεπτά . Οι πυρήνες ανακτήθηκαν με φυγοκέντρηση στα 900g επί 3 λεπτά, πλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Πυρήνων πλύσης (10 mM Tris, ρΗ 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 και 0,1 mM EDTA που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Για κηλίδωση Western, αντισώματα έναντι SFRP4 (ab32784, Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA), Ε-καδερίνης (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), βιμεντίνη (# 5741, Cell Signaling Technology), Twist (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), β-κατενίνης (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), της ιστόνης Η3 (# 9715s, Cell σηματοδότηση) και α-τουμπουλίνης (# 3873, Cell Signaling Technology) χρησιμοποιήθηκαν. ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν και ποσοτικά με τη χρήση του Image Quant LAS 4000 (GE Healthcare).

δοκιμασίες Μετανάστευση

κύτταρα OVCAR3 σπάρθηκαν σε IBIDI Πολιτισμού-Ενθέματα (IBIDI GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried , Γερμανία) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με rSFRP4 (5 μg /ml). IBIDI ένθετα απομακρύνονται και το κλείσιμο του προκύπτοντος πληγή παρακολουθήθηκε για τις επόμενες 48 ώρες. Εικόνες του τραύματος συλλήφθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία με τη χρήση του συστήματος Leica DMIL μικροσκόπιο (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

προσδιορισμούς πρόσφυσης

πλάκες καλλιέργειας ιστών επικαλύφθηκαν με διαλύματα 10 μg /ml κολλαγόνου τύπου Ι (Sigma, Castle Hill, Australia), 5 μg /ml ινωδονεκτίνης (Millipore, Bedford, μΑ, ΗΠΑ) ή 3% BSA σε PBS και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Οι πλάκες ξεπλύθηκαν με 80% αιθανόλη, επωάστηκαν σε 3% BSA σε μέσο ελεύθερο ορού για 30 λεπτά στους 37 ° C και ξεπλένονται πάλι με PBS. εναιωρήματα κυττάρων προστέθηκαν στις επικαλυμμένες πλάκες και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 4 ώρες στους 37 ° C. Οι πλάκες πλύθηκαν ήπια με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 96% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Η περίσσεια της βαφής απομακρύνθηκε με εκτεταμένα πλένοντας πιάτα με αποστειρωμένο νερό. Μετά πλάκες είχαν αποξηραμένα, τα κύτταρα λύθηκαν με 50% οξικό οξύ και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm χρησιμοποιώντας ένα SpectraMax Plus384 απορρόφηση Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Στατιστική ανάλυση

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Στατιστικά πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του τεστ t του two-tailed σπουδαστή. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001

Αποτελέσματα και Συζήτηση

SFRP4 αναστέλλει σηματοδότηση Wnt σε ένα ορώδες καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών

Μετά από προηγούμενη εργασία μας δείχνει ότι η απώλεια SFRP4 ήταν ένα συχνό συμβάν σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών [18] προσδιορίσαμε αν η προσθήκη ανθρώπινης ανασυνδυασμένης SFRP4 (rSFRP4)

in vitro

θα μπορούσε να αναστείλει εξαρτάται β-κατενίνης σηματοδότηση Wnt. Έχουμε επιλέξει το ορώδες ωοθηκικό καρκίνο κυτταρική σειρά OVCAR3 για αυτά τα πειράματα δεδομένου ότι στερείται ανιχνεύσιμη έκφραση SFRP4 και προηγουμένως αναφερθεί ότι εμφανίζουν συστατική σηματοδότηση Wnt (όπως αποδεικνύεται από την συσσώρευση /παρουσία πυρηνικών β-κατενίνης, [23]). Η διέγερση των κυττάρων με ανασυνδυασμένη OVCAR3 Wnt3A (rWnt3a) είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στην β-κατενίνης που εξαρτώνται από σηματοδότηση Wnt όπως μετράται μέσω TOP /FOP FLASH λουσιφεράσης δοκιμασία Wnt ανταποκριτή (Σχήμα 1Α), επιβεβαιώνοντας ότι ήταν πράγματι ένα Wnt ανταποκρίνεται κυτταρική γραμμή. Στη συνέχεια δοκιμάστηκε αυξανόμενες συγκεντρώσεις rSFRP4, και βρήκαν ότι 5 μg /ml του rSFRP4 όφειλε να αναστέλλει σημαντικά β-κατενίνης εξαρτώμενη σηματοδότηση Wnt (Σχήμα 1Α). Αυτή η συγκέντρωση rSFRP4 επίσης δείχθηκε να αναστέλλει τα επίπεδα της πρωτεΐνης του β-κατενίνης στον πυρήνα (Εικόνα 1Β). Αυτή η συγκέντρωση στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για όλα τα επόμενα πειράματα.

(Α) κύτταρα OVCAR3 συν-επιμολύνθηκαν με ρΡΙ_-ΤΚ (Renilla) και είτε TOPflash ή FOPflash πλασμίδια έκφρασης. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με αυξανόμενες δόσεις rSFRP4 ή /και ανασυνδυασμένου Wnt3 α (rWnt3a 0,1 μg /ml) για 48 ώρες πριν από την λουσιφεράση δραστηριότητες που μετριέται χρησιμοποιώντας ένα Glomax 96 Microplate φωτόμετρο. Μέση δραστηριότητα και οι τυπικές αποκλίσεις προήλθαν από octopulate επιμολυσμένα δείγματα. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των 3 πειραμάτων και ράβδοι αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (Τ.Α) του μέσου όρου. *

P

& lt? 0,05. (Β) Αντιπροσωπευτική ανοσοστυπώματα που δείχνουν αυξημένη SFRP4 και μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης πυρηνικής β-κατενίνης σε κύτταρα OVCAR3 ακόλουθες 72 ώρες επίδρασης rSFRP4 (5 μg /ml). έκφραση SFRP4 κορυφή του πίνακα (SFRP4, ab32784, Abcam, Cambridge, UK), το δεύτερο πάνελ α-τουμπουλίνης έκφραση (α-τουμπουλίνης # 3873, Cell σηματοδότηση Technologies, Danvers, ΜΑ, USA), τρίτο τμήμα πυρηνικής β-κατενίνης (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), κάτω πάνελ της ιστόνης Η3 (# 9715s, Cell σηματοδότηση). (Γ) Η πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης SFRP4 σε 3 ξεχωριστά πειράματα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το Τ.Α της μέσης. *

P

& lt? 0,05. (D) έκφραση RNA Σχετική SFRP4 αυξήθηκε σε κύτταρα OVCAR3 σε επεξεργασία με rSFRP4 (5 μg /ml) για 48 ώρες. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιούνται σε τρία διαφορετικά γονίδια καθαριότητα (SDHA, HSPCB, YWHZA). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο 6 πειραμάτων. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το Τ.Α της μέσης. *

P

& lt? 0,05. (Ε) σχετική έκφραση των εξαρτώμενων β-κατενίνης γονιδίων στόχων Wnt μειώθηκε σε κύτταρα OVCAR3 σε επεξεργασία με rSFRP4 (5 μg /ml) για 48 ώρες. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς τρία διαφορετικά γονίδια καθαριότητα (SDHA, HSPCB, YWHZA) Έκφραση AXIN2, MYC και CCND1 μειώθηκαν σε rSFP4 επεξεργασμένα κύτταρα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο 4 πειραμάτων και ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον Τ.Α της μέσης. *

P

& lt? 0,05. (F) Σχετική έκφραση του β-κατενίνης ανεξάρτητη γονιδίων στόχων Wnt ήταν αμετάβλητη σε κύτταρα OVCAR3 σε επεξεργασία με rSFRP4 (5 μg /ml) για 48 ώρες. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς τρία διαφορετικά γονίδια καθαριότητα (SDHA, HSPCB, YWHZA) Έκφραση του JNK, RhoA, RAC1 και PRK2A παρέμειναν αμετάβλητες σε rSFP4 κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο 3 πειραμάτων και ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον sd της μέσης τιμής.

Η

Σαράντα οκτώ ώρες θεραπείας με rSFRP4 (5 μg /ml) οδηγούν σε μία κατά προσέγγιση δύο φορές αύξηση στην SFRP4 mRNA και πρωτεΐνη , καθώς η προσθήκη του εξωκυτταρικού ανασυνδυασμένου Wnt πρωτεΐνες ενισχύει την ενδογενή παραγωγή πρωτεΐνης. (Σχήμα 1Β-D). Η έκφραση των τριών γονιδίων κατάντη Wnt στόχος CyclinD1 (CCND1), C-myc (MYC) και Axin2 (AXIN2) μειώθηκαν μετά από αγωγή rSFRP4 (Σχήμα 1 Ε). Ωστόσο, από αυτά τα 3 γονίδια, μόνο η έκφραση AXIN2 μειώθηκε σημαντικά (

P

= 0,03). Σε αντίθεση με CCND1 και MYC, AXIN2 είναι αποδεκτό ως ειδικό Wnt γονίδιο στόχο, και μέχρι σήμερα δεν έχει συνδεθεί με άλλες οδούς σηματοδότησης [24] – [27]. Αυξημένη έκφραση του AXIN2 αναφέρθηκε σε όλους τους ασθενείς ορώδες ωοθηκικό καρκίνο σε πρόσφατη μελέτη [10], υποδεικνύοντας ότι παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Wnt μπορεί να είναι πιο διαδεδομένη στο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών από ό, τι εθεωρείτο μέχρι σήμερα. Τόσο MYC και CCND1 είναι γνωστό ότι λειτουργούν σε άλλες οδούς σηματοδότησης κρίσιμο εμπλέκονται στην καρκινογένεση ωοθηκών [28] – [31], η οποία μπορεί να εξηγήσει γιατί εμφάνισαν ασθενέστερη αλλαγές έκφραση από AXIN2 σε απόκριση σε θεραπεία SFRP4. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η προσθήκη του SFRP4 στο σύστημά μας ήταν ικανό να μειώσει τη μεταγραφή τριών καθοδικών γονιδίων της οδού σηματοδότησης Wnt, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην κατάντη στόχοι της β-κατενίνης ανεξάρτητη σηματοδότηση Wnt (Σχήμα 1 F), ούτε σε μια ανάντη του υποδοχέα του μονοπατιού (FZD7) και τρεις μη συνδεδεμένοι υποδοχείς (EGFR, ErbB3, ΑΚΤ, τα δεδομένα δεν φαίνονται).

σε συνδυασμό, αυτά τα αρχικά πειράματα δείχνουν ότι η προσθήκη ενός μόνο Wnt μονοπάτι διαμορφωτής μπορεί να διαμορφώσει γονίδιο μεταγραφή σε ένα μοντέλο ορώδες καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών. Με βάση την δοκιμασία ανταποκριτή TOP /FOP Wnt, Western blots και Wnt αποτελέσματα γονίδιο στόχο, τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι στην περίπτωση του καρκίνου των ωοθηκών, SFRP4 όντως λειτουργία σαν ένας ανταγωνιστής της κανονικής ή β-κατενίνης που εξαρτάται μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Φαίνεται επίσης ότι SFRP4 δεν ενεργεί για την αναστολή της β-κατενίνης ανεξάρτητη σηματοδότηση Wnt, ως τέσσερα γονίδια στόχοι δεν επηρεάστηκαν από αγωγή με SFRP4. Αυτό είναι ενδιαφέρον, καθώς δεν είναι σαφές στο πεδίο της Wnt σηματοδότησης ποιες ακριβώς συνδέτες Wnt αναστέλλονται από ποια συγκεκριμένα μέλη της οικογένειας SFRP, και αν σε μερικές περιπτώσεις SFRPs μπορεί στην πραγματικότητα να αυξήσουν, αντί αναστέλλουν σηματοδότηση Wnt [32] – [34 ].

θεραπεία SFRP4 μειωμένη μετανάστευση και αυξημένη πρόσφυση των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

θεραπεία SFRP4 δεν είχε καμία επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 2Α), αλλά ανέστειλε σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν OVCAR3 μήκος ενός προκλήθηκε τραύμα (Σχήμα 2Β). Αποδείχθηκε επίσης ότι η προσθήκη SFRP4 αύξησε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών να προσκολληθούν στο κολλαγόνο και πλάκες καλλιέργειας ιστού επικαλυμμένα ινωδονεκτίνη (Σχήμα 2C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι SFRP4 έχει την ικανότητα να αναστέλλουν την μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vitro

, το οποίο ταιριάζει με την αναφορά προηγούμενα κλινικά δεδομένα μας ότι οι ασθενείς που εκφράζουν SFRP4 είχαν καλύτερη χωρίς εξέλιξη και συνολική επιβίωση συγκριτικά με αυτούς που δεν έφεραν SFRP4 έκφραση [18]. Προσθέτει στον αυξανόμενο σώμα αποδείξεων ότι το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt μπορεί πρωτίστως να διαδραματίσει ένα ρόλο στην μετάσταση καρκίνου παρά την έναρξη του καρκίνου.

(Α) 24 ώρες εφόσον rSFRP4 θεραπεία (5 μg /ml) δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική πολλαπλασιασμός, όπως μετράται μέσω trypan blue καταμέτρηση των κυττάρων χρησιμοποιώντας το σύστημα κοντέσα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των 3 πειραμάτων και ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον Τ.Α της μέσης. (Β) SFRP4 ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση. κύτταρα OVCAR3 σπάρθηκαν επάνω σε IBIDI Culture-Εισάγει και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με rSFRP4 (5 μg /ml). IBIDI ένθετα απομακρύνονται και το κλείσιμο του προκύπτοντος πληγή παρακολουθήθηκε για τις επόμενες 24 ώρες. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ποσοστό των ανοικτών τραυμάτων και ράβδοι αντιπροσωπεύουν το S.D. **

P

& lt? 0,01. (Γ) SFRP4 αυξημένη προσκόλληση στο κολλαγόνο και ινονεκτίνη. SFRP4 (5 μg /ml, 48 ώρες) επεξεργασμένα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 4 ώρες στους 37 ° C είτε 10 μg /ml κολλαγόνου τύπου Ι ή 5 μg /ml ινωδονεκτίνης, στη συνέχεια πλένονται, λύθηκαν και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm με τη χρήση η SpectraMax Plus384 Απορρόφηση Microplate Reader. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 6 πειραμάτων και ράβδοι αντιπροσωπεύουν την Τ.Α της μέσης. *

P

& lt?. 0.05

Η

SFRP4 αναστέλλει EMT στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Καθώς οι αλλαγές στην κυτταρική συμπεριφορά που συνδέονται με την EMT, μπορούμε επίσης να διερευνηθεί κατά πόσον SFRP4 θα επηρεάζουν τη μορφολογία των κυττάρων και την έκφραση των βασικών δεικτών EMT, E-cadherin (Cdh1), βιμεντίνη (VIM), και Twist1 (TWIST1). Ενώ δεν υπάρχουν προφανείς αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκαν 48 ώρες μετά την κατεργασία SFRP4 (Σχήμα 3Α), η θεραπεία με rSFRP4 αύξησε την έκφραση της Ε-καδερίνης (Εικόνα 3Β-D), και μειωμένη έκφραση βιμεντίνης και Twist (Σχήμα 3Β-ϋ) σε τόσο το μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, υποδηλώνουν την έναρξη της ΚΟΑ.

(Α) θεραπεία SFRP4 (5 μg /ml, 48 ώρες) δεν προκάλεσε εμφανείς αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία του ορώδες κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών , OVCAR3 (μεγέθυνση 10x). (Β) Ε-καδερίνης (Cdh1) έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη, και βιμεντίνης και Twist μειώθηκε σε SFRP4 (5 μg /ml, 48 ώρες) επεξεργασμένα κύτταρα OVCAR3. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιούνται σε τρία διαφορετικά γονίδια καθαριότητα (SDHA, HSPCB, YWHZA). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο 6 πειραμάτων και ράβδοι αντιπροσωπεύουν την Τ.Α της μέσης. **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001. (C) Αντιπροσωπευτική ανοσοστυπώματα που δείχνει αυξημένη Cdh1 και μειωμένη VIM και η έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα TWIST1 OVCAR3 ακόλουθες 72 ώρες επίδρασης rSFRP4 (5 μg /ml). έκφραση κορυφή του πίνακα Cdh1 (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), η έκφραση δεύτερο πάνελ VIM (# 5741, Cell Signaling Technology), η έκφραση TWIST1 τρίτο πάνελ (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ), και κάτω πάνελ α-τουμπουλίνης έκφρασης (α-τουμπουλίνης # 3873, Cell σηματοδότηση Technology). (Δ) Η πυκνομετρική ανάλυση των Cdh1, VIM και TWIST1 έκφραση της πρωτεΐνης σε 3 ξεχωριστά πειράματα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το Τ.Α της μέσης. **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt?. 0.05

Η

EMT, όπως το μονοπάτι Wnt, είναι πιο στενά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη, αλλά πρόσφατα έχει λάβει έντονο ενδιαφέρον στο δυναμικό της ως στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου. Γενικευμένη διεργασίες που συμβαίνουν σε όλα τα καρκινικά κύτταρα είναι μια ελκυστική οδός για την θεραπεία του καρκίνου, ως πιθανές θεραπείες θα έχουν ευρεία εφαρμογή. Επιπλέον, παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Wnt έχει έντονα συνδεθεί με καρκίνους με κακή πρόγνωση [12], [35], έτσι περαιτέρω αποσαφήνιση του ρόλου αυτής της οδού και των φυσικών φύλακες της θα αποδώσει σημαντικές γνώσεις για ανθρώπινη ασθένεια. Είναι γνωστό εδώ και πολλά χρόνια ότι σηματοδότηση Wnt μπορεί να επηρεάσει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την προσκόλληση, και αυτή η μελέτη παρέχει κάποια στοιχεία ότι οι επιπτώσεις αυτές μπορεί να κατευθύνεται μέσα από τη διαδικασία της ΕΜΤ. Τα αποτελέσματά μας στηρίζει με μια πρόσφατη μελέτη που συνδέει AXIN2 και EMT σε καρκίνο του παχέος εντέρου [27]. Επιπλέον, υποθέτουν ότι SFRP4 αναστέλλει την ικανότητα των ειδικών συνδετήρων Wnt να δεσμεύονται σε υποδοχείς Frizzled. Με βάση τις δύο προηγούμενες μελέτες, μία ένδειξη ότι Wnt7a υπερεκφράζεται στον καρκίνο των ωοθηκών [11], και ένα γεγονός που υποδηλώνει SFRP4 μπορεί να αναστείλει Wnt7a δέσμευση Fzd5 στον καρκίνο του ενδομητρίου [36], θα εικάζουν ότι υπό κανονικές συνθήκες δεσμεύει SFRP4 και απομονώνει μακριά Wnt7a. Ωστόσο, σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, SFRP4 έχει σιγήσει, επιτρέποντας Wnt7a να δεσμεύσει Fzd5 και ενεργοποιούν εξαρτάται β-κατενίνης σηματοδότηση Wnt, και το αυτοκίνητο TCF /LEF μεσολάβηση μεταγραφή των γονιδίων ρεπόρτερ Wnt όπως AXIN2, MYC και CCND1.

Η Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι είναι ένα εξαιρετικά πολύπλοκο και διασυνδεδεμένο μονοπάτι συνδέεται με πολλές ανθρώπινες ασθένειες. Δεδομένου ότι η οδός είναι ασχολείται κυρίως στην εμβρυογένεση και ενήλικο ιστό επισκευή, τα φάρμακα στοχεύουν σε αυτή την οδό δεν αναμένεται να προκαλέσει σημαντικές παρενέργειες ή τοξικότητα [37]. Ωστόσο, οι προσπάθειες για τη στόχευση του Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι στον καρκίνο έχουν σε μεγάλο βαθμό ανεπιτυχείς, χωρίς κλινικά εγκεκριμένα φάρμακα μέχρι σήμερα. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην επιλογή των φαρμακευτικών στόχων που κατοικούν περαιτέρω κατάντη στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt (πρόσφατα επισκοπείται στο [38]). Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει την αδρανοποίηση του ανάντη συστατικά της οδού Wnt στον καρκίνο συμπεριλαμβανομένων των μελών της SFRP και των οικογενειών DKK, υποδεικνύοντας ένα ρόλο κλειδί για αυτές τις πρωτεΐνες φύλακα στην ογκογένεση [14] – [17], [34], [39] . Αυτές οι εξωκυτταρικές πρωτεΐνες έχουν επίσης ισχυρό δυναμικό ως στόχοι φαρμάκου λόγω της ανάντη θέσης τους στην οδό. Το έγγραφο αυτό δείχνει τις δυνατότητες των ανάντη διαμόρφωση μονοπατιού, χρησιμοποιώντας ένα μόνο ανταγωνιστή Wnt. Δεδομένου ότι υπάρχουν τουλάχιστον δέκα εξωκυττάρια ανταγωνιστές του μονοπατιού Wnt προσδιορίζονται σήμερα, συνδυασμοί αυτών μπορεί να δώσει ακόμη εντονότερα φαινόμενα [40] και είναι άξιο περαιτέρω διερεύνησης.