Αφηρημένο

Εισαγωγή

In vitro

ενεργοποίηση και ανάπτυξη της αρχέγονης αδρανείς θυλάκια για την παραγωγή γονιμοποιήσιμων ωοκύτταρα θα αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη διατήρηση της γονιμότητας. Η απασχόληση των φωσφατάση και tensin ομόλογο αναστολείς (PTEN), σε συνδυασμό με πρωτεΐνη κινάση Β (Akt) τόνωση μόρια, έχει προηγουμένως χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της ενεργοποίησης των ωοθυλακίων μέσω της διέγερσης του PTEN-Akt μονοπατιού.

Μέθοδοι

Στόχος μας είναι να θεσπίσει καλύτερη

in vitro

ενεργοποίηση και για ασθενείς με καρκίνο των οποίων ωοθηκικού ιστού έχει ήδη κρυοσυντηρηθεί. Φρέσκα και προηγουμένως κρυοσυντηρημένα φλοιό του ανθρώπου ωοθηκών εκτέθηκαν σε βραχυπρόθεσμη, χαμηλή συγκέντρωση και ωοθηκών-ειδική θεραπεία μόνο με έναν αναστολέα της PTEN.

Αποτελέσματα

μας

in vitro

πρωτόκολλο ενεργοποίηση ενισχύει τους μηχανισμούς ενεργοποίησης των αρχέγονων ωοθυλακίων σε τόσο φρέσκα και κρυοσυντηρημένα δείγματα, και μεγεθύνει την αύξηση του πληθυσμού, χωρίς να επάγει απόπτωση είτε σε θύλακες ή τον περιβάλλοντα στρώμα. Η θεραπεία αυξάνει την έκκριση της οιστραδιόλης και αποκαθιστά τα επίπεδα έκφρασης του προηγουμένως μειωμένη Αντιμυλλέριος ορμόνη μέσω διαδικασιών κρυοσυντήρησης. Γενωμική διαμόρφωση της σχετικής έκφρασης του

PTEN

γονίδια οδού βρέθηκε σε δείγματα αντιμετωπίζονται.

Συμπέρασμα

Το

in vitro

πρωτόκολλο ενεργοποίηση προσφέρει νέες εναλλακτικές λύσεις για την ασθενείς με κρυοσυντηρημένα ιστό, καθώς αυξάνει την πισίνα βιώσιμων ενεργοποιηθεί θυλάκια διαθέσιμα για

in vitro

διαδικασίες ανάπτυξης. Ο συνδυασμός της κρυοσυντήρησης ωοθηκικού ιστού και

in vitro

ενεργοποίηση των αρχέγονων ωοθυλακίων, το κύριο συστατικό αποθεματικό των ωοθηκών, θα είναι μια σημαντική εξέλιξη στην διατήρηση της γονιμότητας

Παράθεση:. Novella-Maestre E, Herraiz S , Rodríguez Iglesias-Β, Díaz García-C, Pellicer Α (2015) Short-Term PTEN Αναστολή Βελτιώνει

In Vitro

ενεργοποίηση της Αρχέγονα θυλάκια, Διατηρεί Θυλακιώδες Βιωσιμότητα και Επαναφέρει ΑΜΗ επίπεδα σε κρυοσυντηρημένα ωοθηκών ιστού από ασθενείς με καρκίνο . PLoS ONE 10 (5): e0127786. doi: 10.1371 /journal.pone.0127786

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Wei Shen, Qingdao Γεωπονικό Πανεπιστήμιο, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 12 Ιαν του 2015? Αποδεκτές: 19 Απριλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 29, 2015

Copyright: © 2015 Novella-Maestre et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή έχει υποστηριχθεί από επιχορηγήσεις SAF 2011 – 30031-CO2-01 και FIS PI13 /02353 από το ισπανικό Υπουργείο Οικονομίας και Ανταγωνιστικότητας, από το Dexeus Ίδρυμα Υγεία των γυναικών Grant το 2011 και από PROMETEOII /2014/045 και GV /2014/115 από το Περιφερειακό Υπουργείο Παιδείας Βαλένθια. συμμετοχή SH έχει υποστηριχθεί από μια επιχορήγηση CD11 /00292 από το ισπανικό Υπουργείο Οικονομίας και Ανταγωνιστικότητας και BRI από AP-2010 έως 0675 επιχορήγηση από το ισπανικό Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού και Αθλητισμού. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιβίωσης μετά τον καρκίνο στην εφηβεία και της παιδικής ηλικίας έχει βελτιωθεί [1]. Έτσι, ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού των νεαρών γυναικών, οι οποίοι δεν έχουν εκπληρώσει την αναπαραγωγική του έργου τους, θα υποστούν δευτερογενή αποτελέσματα της θεραπείας του καρκίνου, όπως gonadotoxicity. Αυτό το γεγονός, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η κοινωνία μας καθυστερεί σε αναπαραγωγική ηλικία [2], που σημαίνει ότι η διατήρηση της γονιμότητας (FP) γίνεται ολοένα και πιο ζητηθεί, ιδιαίτερα σε νεαρούς ασθενείς με καρκίνο.

Αρκετές επιλογές είναι διαθέσιμες σήμερα για τις γυναίκες FP, όπως η κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων [3], έμβρυα [4], ή ωοθηκικό ιστό [5-7].

Η ωοθηκών φλοιός περιέχει ηρεμίας αρχέγονη θυλάκια που χαρακτηρίζονται από την αντοχή τους σε διεργασίες κατάψυξη και απόψυξη. Δεδομένων αυτών των ιδιοτήτων, η κρυοσυντήρηση του ωοθηκικού φλοιού για επακόλουθη αυτόλογη orthotransplantation είναι η πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για τη διατήρηση της γονιμότητας σε ασθενείς με καρκίνο [8]. Επιπλέον, είναι η μόνη επιλογή σε παιδιατρικούς ασθενείς χωρίς ώριμα ωοκύτταρα να είναι κρυοσυντηρημένα, και για τις περιπτώσεις ασθενειών εξαρτώμενων από ορμόνες [9, 10].

Ο συνολικός αριθμός των διαθέσιμων αρχέγονου θυλάκια είναι, μεταξύ άλλων σημαντικών ερωτήσεις, ο κύριος καθοριστικός παράγοντας για τη διασφάλιση FP επιτυχία. Αυτό μπορεί να τεθεί σε κίνδυνο από διάφορους παράγοντες, όπως το μέγεθος των ωοθηκών φλοιό, την ηλικία, προηγούμενες χημειοθεραπεία, και άλλες πιθανές επιδράσεις του καρκίνου στη γυναικεία γονάδων. Έχει ήδη δημοσιευθεί ότι κακοήθειες, όπως ο καρκίνος του μαστού, μπορεί επίσης να επηρεάσει την αναπαραγωγική αποτέλεσμα ως αποθεματικό των ωοθηκών είναι μειωμένη σε νεαρές γυναίκες με βλαστική γραμμή

BCRA1

μεταλλάξεις [11]. Ωοθηκική απόκριση σε ελεγχόμενη κύκλους διέγερσης μειώνεται σε ασθενείς με καρκίνο, ακόμη και πριν λάβετε οποιαδήποτε θεραπεία [12]. Παρ ‘όλα αυτά, ο κίνδυνος επανεισαγωγής των κακοήθων κυττάρων σε μεταμοσχευμένος ιστός είναι το κύριο μέλημα των ωοθηκών κρυοσυντήρησης. Αυτή η ανεπιθύμητη ενέργεια είναι σε αυξημένο κίνδυνο [13-15] σε ασθενείς με καρκίνους αιματολογικές, όπως η λευχαιμία, η συχνότερη κακοήθεια της παιδικής ηλικίας [16]. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να αναπτυχθούν νέες ασφαλείς εναλλακτικές λύσεις για τη βελτιστοποίηση αποθεματικό των ωοθηκών σε αυτούς τους ασθενείς, όπου κρυοσυντήρηση και μεταμόσχευση των ωοθηκών φλοιού αντενδείκνυνται [17], ή σε παιδιατρικούς ασθενείς που δεν έχουν ώριμα ωάρια να κρυοσυντηρηθούν [18].

ως προηγούμενο βήμα για την ανάπτυξη, την αρχέγονη αδρανείς θύλακες, το κύριο συστατικό των ωοθηκών αποθεματικών [19, 20], θα πρέπει να ενεργοποιηθεί για αναπτυξιακό τους πρόγραμμα για να ξεκινήσει. Οι ποικίλες οδών που εμπλέκονται στην καθοδήγηση ενεργοποίηση θύλακα μέσω του ελέγχου της έναρξης της ανάπτυξης των ωοκυττάρων και συντήρησης, όπως το ομόλογο φωσφατάσης και tensin διαγράφονται στο χρωμόσωμα 10 (PTEN), φωσφατιδυλινοσιτόλη 3 κινάσης (PI3K), forkhead κουτί Ο3 (FOXO3), και την θηλαστικών στόχος των πολύπλοκων ραπαμυκίνης 1 (mTORC1) [21-26]. Παρ ‘όλα αυτά, οι υποκείμενοι μηχανισμοί ενεργοποίησης παραμένουν άγνωστα.

Έχει αναφερθεί ότι η ανάπτυξη όλων των αρχέγονων ωοθυλακίων σε νεογέννητα και ενήλικα ζώα προωθείται από το ωοκύτταρο ειδικές διαγραφή του

PTEN

γονίδιο [21, 24-26]. Αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί ένα ένζυμο φωσφατάση που ρυθμίζει αρνητικά την ΡΙ3Κ-Protein κινάση Β (Akt) μονοπατιού σηματοδότησης.

PTEN

διαγραφή αυξάνει τη φωσφορυλίωση της Akt και την πυρηνική εξαγωγή των κατάντη πρωτεϊνών FOXO3 [24]. Πράγματι

FOXO3

γονίδιο διαγραφή ενεργοποιεί επίσης όλες οι αδρανείς θύλακες σε ποντίκια. Πρόσφατα, Li et al. 2010 [26] ανέπτυξε μια βραχυπρόθεσμη, ωοθήκη-ειδική θεραπεία των τρωκτικών και ανθρώπου ωοθήκες με έναν αναστολέα ΡΤΕΝ και /ή ένας ενεργοποιητής ΡΙ3Κ. Θεραπεία αυξημένη FOXO3 πυρηνικής εξώθηση σε αρχέγονες ωοκύτταρα, η οποία οδήγησε σε ενεργοποίηση τους.

Με βάση αυτά τα ευρήματα, μια κλινική δοκιμή διεξήχθη με Kawamura [27] για να διερευνήσει την αποτελεσματικότητα των αναστολέων ΡΤΕΝ και των μορίων διεγέρτης Akt χρησιμοποιείται για το

in vitro

ενεργοποίηση (IVA) διαδικασία σε γυναίκες με πρόωρη ωοθηκική ανεπάρκεια. Αυτή η μελέτη απέδειξε ότι οι υπόλοιπες ηρεμίας θυλάκια των αποθεματικών των ωοθηκών μπορεί να διασωθεί από την επαγωγή των μηχανισμών ενεργοποίησης για την παραγωγή γονιμοποιήσιμων ωοκύτταρα.

Η ενθάρρυνση από αυτά τα αποτελέσματα, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να επιτευχθεί η ενεργοποίηση του ανθρώπινου λανθάνουσα αρχέγονη θυλάκια βυθισμένο στο φλοιό των ωοθηκών από ασθενείς με καρκίνο μέσω επώασης με έναν αναστολέα ΡΤΕΝ να αποφευχθεί η υποβάθμιση των ωαρίων με, ως εκ τούτου, να αυξήσει την «πισίνα» των βιώσιμων αρχέγονης ωοθυλακίων που διατίθενται για

in vitro

διαδικασίες ανάπτυξης.

Υλικό και Μέθοδοι

χημικά

Όλες οι χημικές ουσίες, μέσα καλλιέργειας και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είχαν αγοραστεί από την Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

σχεδιασμός

μελέτη

δήλωση Ηθική και συλλογή ιστών.

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Νοσοκομείου Universitario y Politecnico La Fe, Βαλένθια, Ισπανία (2011/0018) και διεξάγονται σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Μετά την απόκτηση γραπτή συγκατάθεση, 18 ανθρώπινη βιοψίες ωοθηκών φλοιό από τις γυναίκες που προσλαμβάνονται σε γονιμότητας Διατήρηση Πρόγραμμα μας ελήφθησαν. Ωοθηκών βιοψίες φλοιό συμπεριλήφθηκαν μόνο αν ο υπόλοιπος ιστός ήταν διαθέσιμες μετά τη συλλογή των ωοθηκών φλοιό για σκοπούς διαφύλαξης της γονιμότητας. Οι ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του μαστού (η = 8), ραβδομύωμα (n = 1), οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (n = 1), λέμφωμα Hodgkin (η = 4), αντι-συνθετάση σύνδρομο (n = 1), σάρκωμα Ewing’s (n = 1), μυελοβλάστωμα (n = 1) και μη Hodgkin λεμφώματος (n = 1). Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 27,8 (εύρος 14-37) έτη. Κανένας ασθενής δεν είχε υποβληθεί σε χημειοθεραπεία /ακτινοθεραπεία πριν από την εκχύλιση του φλοιού των ωοθηκών. Ωοθηκών βιοψίες (κατά προσέγγιση πάχος του 10x10x1 mm) πλύθηκαν αμέσως με μέσο Μ199 χωρίς ορό στους 37 ° C, αποσυντίθενται με την αφαίρεση μυελού και κόβεται σε δύο τεμάχια: το ένα να δοκιμάσει το πρωτόκολλο IVA σε φρέσκο ​​ιστό και το άλλο για να το δοκιμάσει σε κρυοσυντηρημένα /απόψυξη του ιστού. Λόγω του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος, μόνο 14 από τα 18 που λαμβάνονται βιοψίες που περιλαμβάνονται στην ομάδα κρυοσυντηρημένου

Πειραματικές ομάδες

Φρέσκα τεμάχια ωοθηκών (n = 18) διαιρέθηκαν σε λωρίδες..? ο ένας ήταν αμέσως σταθερό για να ενεργήσει ως αρχική ιστού κατάσταση φρέσκα έλεγχο και διατέθηκε για την Ομάδα 1 (S1 σχήμα)? η άλλη είχε διατεθεί στην Ομάδα 2 και ήταν

in vitro

ενεργοποιηθεί και καλλιεργήθηκαν για 25 ώρες με τον αναστολέα PTEN.

Για να εκτιμηθεί αν υπήρχαν οποιεσδήποτε δυσμενείς επιπτώσεις από τις συνθήκες καλλιέργειας, πρόσθετες φρέσκα ταινίες των ωοθηκών (n = 9) διατέθηκαν για την Ομάδα 3 και επωάστηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες όπως τα ενεργοποιημένα αυτά, αλλά χωρίς τον αναστολέα ΡΤΕΝ να ενεργεί ως μια νέα καλλιεργημένα ελέγχου.

κρυοσυντηρημένα /αποψυγμένα κομμάτια των ωοθηκών ( n = 14) ήταν επίσης χωρίζεται σε λωρίδες? ένα ορίστηκε αμέσως μετά την απόψυξη να ενεργεί ως αρχική ιστού κατάσταση κρυοσυντηρημένα ελέγχου και ονομάστηκε ως Ομάδα 4? άλλος διατέθηκε στην Ομάδα 5 να επωάζονται και να καλλιεργηθούν με τον αναστολέα ΡΤΕΝ για 25 ώρες? ένα τρίτο καλλιεργήθηκε για 25 ώρες χωρίς τον αναστολέα ΡΤΕΝ και θεωρήθηκε το κρυοδιατηρημένων καλλιεργημένων ελέγχου, που ονομάζεται Ομάδα 6.

Τα δείγματα από τα φρέσκα και κρυοσυντηρημένα καλλιεργημένα ομάδες ελέγχου (Ομάδες 3 και 6) χρησιμοποιήθηκαν για την TUNEL προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση παραγωγή ορμονών με ELISA, όπως περιγράφεται παρακάτω.

ωοθηκών Κρυοσυντήρηση ιστών και απόψυξη.

Μια αργή κατάψυξη τεχνική αυτή χρησιμοποιήθηκε για την κρυοσυντήρηση λωρίδες των ωοθηκών. Μ199 μέσο καλλιέργειας, που περιέχει 5% ανθρώπινο ορό αλβουμίνης (HSA) και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), χρησιμοποιήθηκε ως κρυοπροστατευτικό διάλυμα. DMSO προστέθηκε διαδοχικά σε μία διαδικασία 2 σταδίων και θραύσματα διανεμήθηκαν σε σάκους οξικό αιθυλεστέρα βινύλιο (Cryocyte, Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Σφραγισμένες σακούλες τοποθετήθηκαν σε θάλαμο κατάψυξης της συσκευής ψύξης ελεγχόμενο ρυθμό (Πλάνη). Ένα πρωτόκολλο βραδεία κατάψυξη εφαρμόστηκε ακολουθώντας την ίδια διαδικασία που χρησιμοποιείται επί του παρόντος για κλινικούς σκοπούς σε πρόγραμμα διατήρησης της γονιμότητας μας. Σακούλες αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο (-196 ° C), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28, 29]. Απόψυξη πραγματοποιήθηκε μετά από 24 ώρες. Σακούλες αποψύχθηκαν και κρυοπροστατευτικό εκλούεται χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο 3 βημάτων, όπως περιγράφεται αλλού [28, 29].

πρωτόκολλο IVA

Βραχυπρόθεσμη επωάσεις με δικάλιο Bisperoxo (picolinato) οξοβαναδικό V, PTP Αναστολέας XV (bpV (pic)), εκτελέστηκαν ως πρωτόκολλο IVA. Εν συντομία, τα ενεργοποιημένα δείγματα επωάστηκαν πρώτα για 1 ώρα με 100 μΜ του BPV (pic) (Calbiochem, Merck KGaA, Germany) σε μέσο α-ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% HSA και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητικό διάλυμα (ΑΤΒ). Στη συνέχεια τα δείγματα επωάστηκαν για 24 ώρες με το ίδιο μέσο (100 μΜ bpV (pic) + 10% HSA, 1% ATB- α-ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 0,3 Ι.υ. FSH. Όλες οι επωάσεις διεξήχθησαν υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας στους 37 ° C, 5% CO

2.

Στα καλλιεργημένα ομάδες ελέγχου (G3 και G6), τα δείγματα επωάστηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες, αλλά bpV ( pic) δεν προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Μετά τη διαδικασία IVA και την καλλιέργεια, τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη και το μέσο καλλιέργειας αμέσως αποθηκεύεται στους -80 ° C για ορμόνη ποσοτικοποίηση.

Ιστολογική αξιολόγηση και θυλακιώδη μετράει

μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη δείγματα εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) και κομμένο σε 4-μm πάχους τομές. Κάθε 10

ου τομή χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η & amp? Ε) για να εκτελέσει την ιστολογική ανάλυση και θυλακιώδη μετράει. Τα υπόλοιπα τμήματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοϊστολογική ανάλυση

Στα H & amp? E-βάφονται τα δείγματα, τα θυλάκια ταξινομήθηκαν ως εξής:. Αρχέγονο στάδιο: το ωοκύτταρο περιβάλλεται από ένα στρώμα ισοπεδωμένα κοκκιώδη κύτταρα (GC)? Αρχικό στάδιο: το ωοκύτταρο περιβάλλεται από ένα πλήρες στρώμα cuboidal GC? Δευτερογενής στάδιο: το ωοκύτταρο περιβαλλόταν από δύο στρώματα, ή περισσότερο, από κυβοειδές GC [19]. Θυλάκια μετρήθηκαν μόνο όταν ο πυρήνας ωάριο ήταν παρόντες για να αποφευχθεί η διπλή καταμέτρηση. Μόνο τα υγιή θυλάκια [30] μετρήθηκαν για τον προσδιορισμό των πυκνοτήτων και τα ποσοστά της ηρεμίας (αρχέγονο) και αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων (πρωτοβάθμια, δευτεροβάθμια). Όλα τα H & amp? E-τομές εξετάστηκαν από δύο διαφορετικούς παρατηρητές (ENM, SH)

Η ανοσοϊστοχημεία

Για τη δημιουργία των ωοθυλακίων ενεργοποίηση, πολλαπλασιαστική κατάσταση και την ανάπτυξη μέσω της δευτεροβάθμιας στάδια, ανοσοχρώση με FOXO3a,. Ki-67 και Αντιμυλλέριος ορμόνη (AMH) έγινε. Ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα FOXO3a μονοκλωνικό κουνελιού (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, ΜΑ, USA), μετά από αραίωση 1: 150, επωάστηκε για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για την ανίχνευση της ενεργοποίησης ωοθυλακίου. Ένα μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινο Ki-67 αντίσωμα (ΜΙΒ-1, Dako Denmark A /S, Glostrup, Denmark), σε αραίωση 1: 100, επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά, και χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ειδικά κύτταρα του ωοθυλακίου πολλαπλασιαζόμενα . Ένα αντίσωμα κατσίκας πολυκλωνικό αντι-ανθρώπινο-MIS (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Χαϊδελβέργη, Γερμανία), κατόπιν αραίωση 1: 200, χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της ΑΜΗ (60 min και RT). Για όλα τα αντισώματα, μία αντίδραση βιοτίνης /στρεπταβιδίνης χρησιμοποιήθηκε για την επώαση δευτερεύον αντίσωμα (μέθοδος LSAB Dako Denmark A /S, Glostrup, Denmark), που ακολουθείται από ανίχνευση με 3,30-διαμινοβενζιδίνη (DAB). Για τους αρνητικούς μάρτυρες, το πρωτογενές αντίσωμα παραλείφθηκε? για τους θετικούς μάρτυρες μια πρόσθετη διαφάνεια, που περιέχει πνεύμονα, αυξανόμενο ενδομήτριο και των όρχεων, είχε συμπεριληφθεί.

Τα ωοθυλάκια θεωρήθηκαν ενεργοποιείται όταν ανιχνεύθηκε η πυρηνική εξώθηση FoxO3 στο ωάριο. Ki-67 και AMH ήταν θετικά όταν ανιχνεύεται σε GC και στους πυρήνες των ωαρίων /GC, αντίστοιχα.

ΑΜΗ και της οιστραδιόλης (Ε2)

παραγωγής

Για τον προσδιορισμό ΑΜΗ, τα δείγματα μέσα καλλιέργειας αναλύθηκαν με AMH-Gen-ΙΙ ELISA (Beckman Coulter, Immunotech, Texas, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, καθώς. Εν συντομία, τα δείγματα και οι έλεγχοι διανεμήθηκαν στα φρεάτια μικρο-τιτλοδοτήθηκε επικαλυμμένες με το αντι-AMH αντίσωμα. Μετά από επώαση και πλύση, προστέθηκε το αντι-AMH αντίσωμα ανίχνευσης επισημασμένο με βιοτίνη. Μετά την πλύση, στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση αρμορακίας προστέθηκε στα φρεάτια και αναπτύχθηκε. Στη συνέχεια η απορρόφηση μετρήθηκε σε μία αυτόματη συσκευή ανάγνωσης ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Το όριο ανίχνευσης (LOD) του προσδιορισμού AMH ήταν 0,08 ng /ml? Αυτή η δοκιμασία δεν ανιχνεύει ινχιμπίνη Α, ακτιβίνη Α, FSH και LH. Οι ενδο- και δια-δοκιμασίας παραλλαγές ήταν 3,7% και 4,4%, αντίστοιχα.

Ε2 μετρήθηκε με το κιτ οιστραδιόλη ΕΙΑ (Cayman Chemical Company, Michigan, USA). Η δοκιμασία διεξήχθη ακολουθώντας την του κατασκευαστή, καθώς πρωτόκολλο σε μη αραιωμένα δείγματα. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405-420 nm. Το LOD της δοκιμασίας Ε2 ήταν 20 pg /ml, και παρεμβολή με άλλες στεροειδείς ορμόνες ήταν & lt? 0,01%. Για 102,4 pg /ml, οι ενδο- και δια-δοκιμασίας παραλλαγές ήταν 13,0% και 8,2%, αντίστοιχα.

Σε αμφότερες τις δοκιμασίες, η απορρόφηση ήταν αντιστρόφως ανάλογη με τις συγκεντρώσεις της ΑΜΗ και Ε2 στα δείγματα, η οποία ήταν υπολογίζεται από την καμπύλη βαθμονόμησης. Τα δείγματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε ng /ml και pg /ml, αντίστοιχα, και επίσης σύμφωνα με την καθιερωμένη πρότυπη καμπύλη.

Η απόπτωση ποσοτικός προσδιορισμός με TUNEL

κατάτμηση DNA ανιχνεύθηκε με την TdT (τερματικό δεοξυριβονουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης) μεσολάβηση δοκιμασία dUTP nick-άκρο επισήμανση (TUNEL) με τη χρήση του κόκκινου TMR

in situ

κιτ ανίχνευσης θανάτου κυττάρου (Roche Diagnostics, Germany). Τρεις ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές ανά δείγμα εκκαθαρίστηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν (αιθανόλη, απεσταγμένο νερό) πριν από την δοκιμάστηκαν. Μετά την πλύση με PBS, ανάκτηση αντιγόνου με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό πραγματοποιήθηκε σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 5 λεπτά. Στη συνέχεια τα πλακίδια επωάστηκαν για 60 λεπτά στους 37 ° C μέσα σε ένα σκοτεινό θάλαμο υγροποιημένο με 50 μΙ του μίγματος της αντίδρασης TUNEL? το μίγμα αυτό παραλείφθηκε στον αρνητικό έλεγχο. Τα δείγματα τοποθετούνται με Αντιδραστήριο παρατείνει Χρυσό αντιξεθωριάσματος με DAPI (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) και εξετάζεται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού με συμβατικά. Το αποπτωτικό σήμα καταγράφεται ως θετική όταν dUTP βάφονται τον πυρήνα κόκκινο.

Ζημιά

Η κυτταρική ποσοτικά αρχέγονη θυλάκια, το κύριο συστατικό των ωοθηκών αποθεματικό, και στο στρώμα των ωοθηκών. Θυλάκια θεωρήθηκαν καταστραφεί όταν ο πυρήνας ωάριο, ή περισσότερο από το 50% του GC, βάφτηκε κόκκινη από dUTP. Στο στρώμα των ωοθηκών, ο κυτταρικός θάνατος ερευνηθεί από TUNEL εκφράστηκε ως ποσοστό του θανάτου των κυττάρων [(TUNEL + κύτταρα /σύνολο κυττάρων) * 100]. Η αποπτωτική ποσοστό των ομάδων IVA (G2 και G5) συγκρίθηκε με τις αντίστοιχες καλλιεργημένα τους ελέγχους τους (G3 και G6). Η επιλογή των καλλιεργημένων ελέγχων μας επέτρεψε να φωτιστούν, αν η βλάβη των κυττάρων, όταν παρατηρείται, μπορεί να οφείλεται στην αναστολή ΡΤΕΝ ή απλά για να τις συνθήκες καλλιέργειας. Επιπλέον, η αποπτωτική βαθμό ανιχνεύθηκε σε φρέσκο ​​φλοιό των ωοθηκών ή έμμεσα με τεχνικές κρυοσυντήρησης, έχει καθιερωθεί στο παρελθόν [28, 31-34].

Για να ποσοτικοποιηθεί η δοκιμασία TUNEL, εικόνες υψηλής ανάλυσης ελήφθησαν με οπτικό μικροσκόπιο ( LEICA DM4000B, Leica Microsystems GmbH, Γερμανία) με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή που επισυνάπτεται (LEICADFC450C, Leica Microsystems GmbH, Γερμανία). Η ποσοτικοποίηση προσδιορίστηκε με την Εικόνα ProPlus 6,3 λογισμικό (Media Cybernetics Inc. Rockville, MD, USA).

Σχετική έκφραση γονιδίου του μονοπατιού ΡΤΕΝ

mRNA ελήφθη από 7-9 FFPE δείγματα ωοθήκης της κάθε ομάδας με τον Ανάκτηση κιτ απομόνωσης Όλα Σύνολο Nucleic Acid (Ambion, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, καθώς. Για κάθε δείγμα, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα 15-μm διαφάνειες. Στη συνέχεια cDNA συντέθηκε με MultiScribe ανάστροφης μεταγραφάσης από το High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Ειδικούς ανιχνευτές Taqman αναλύθηκαν από την Real-Time PCR για την ποσοτικοποίηση της σχετικής έκφραση των ακόλουθων γονιδίων:

PTEN

,

PI3KCB

,

ΑΚΤ1

και

FOXO3

. μίγματα αντίδρασης PCR παρασκευάστηκαν με 100 ng του cDNA ως πρότυπο στο Expression 1xTaqman Gene Master Mix μετά την του κατασκευαστή, καθώς πρωτόκολλο. Στη συνέχεια, τα δείγματα ενισχύθηκαν στο σύστημα 7900HT Fast PCR (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Οι συνθήκες PCR συνίστατο σε μια αρχική ενεργοποίηση του uracyl-

N

-glycosylase στους 50 ° C για 2 λεπτά., που ακολουθείται από AmpliTaq Gold ενεργοποίησης στους 95 ° C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα δείγματα ανακυκλώνονται 40 φορές με μετουσίωση στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και επέκταση ανόπτηση στους 60 ° C για 1 λεπτό ανά κύκλο. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

Μετά τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της ενίσχυσης των γονιδίων στόχων, η σχετική έκφραση λήφθηκε με τη συγκριτική μέθοδο Ct (DDCt) [35]. Η έκφραση του mRNA του γονιδίου-στόχου, ομαλοποιήθηκε με την έκφραση του γονιδίου αναφοράς 18S.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η δοκιμή Friedman, που ακολουθείται από ένα Wilconox ζεύγη

post hoc

δοκιμής, διεξήχθη για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα μεταξύ των ομάδων. p & lt? 0,05 τιμές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS 19.0 (IBM, Somers, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ)

Αποτελέσματα

Θυλακιώδες πυκνότητες και οι πληθυσμοί

Μεταξύ των H & amp?. Ε-τομές των ωοθηκών , 597 θυλάκια μετρήθηκαν και εξετάστηκαν. Όταν αρχέγονη, πρωτογενή και δευτερογενή πυκνότητες συγκρίθηκαν μεταξύ των ενεργοποιημένων δειγμάτων και των αντίστοιχων αρχικών ελέγχων κατάστασή τους (G1 και G4), σημαντικές διαφορές ανιχνεύθηκαν στα νωπά ή κρυοσυντηρημένων δειγμάτων (p = NS), ούτε όταν συγκρίθηκαν με το καλλιεργημένο ομάδες ελέγχου (G3 και G6) (Πίνακας 1).

η

οι πειραματικές παρεμβάσεις που εκτελούνται στο ωοθηκικού ιστού δειγμάτων που περιλαμβάνονται σε κάθε πειραματική ομάδα μελέτης μας παρατίθενται στον πίνακα 1. Θυλακιώδες πυκνότητες και τα ποσοστά των κάθε πληθυσμός υπολογίστηκαν. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Η κρυοσυντηρημένα ενεργοποιημένη (G5) ομάδα έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές για το ποσοστό της ηρεμίας και αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων σε σύγκριση με την αρχική κατάσταση.

Ωστόσο, μετά την ενεργοποίηση, τα ποσοστά των αρχέγονων ωοθυλακίων μείωσε τόσο τα φρέσκα και κρυοσυντηρημένα ομάδων IVA, όταν σε σύγκριση με τις αρχικές ελέγχους κατάσταση του ιστού (Ομάδα 1: 62.3 ± 8.3%? G2: 47,9 ± 8,2%? G4: 55,0 ± 6,1%? G5: 38,2 ± 7,1%), αλλά τα ποσοστά των αυξανόμενων αυτές αυξήθηκαν (G1: 37,7 ± 8,3%? G2: 52.03 ± 8.2%? G4: 46,9 ± 6,1%? G5: 61,9 ± 7,1%) σε σύγκριση με τους ελέγχους τους, ή, σε σύγκριση με τα καλλιεργημένα ελέγχους (G3 και G6). Αυτό το φαινόμενο ήταν στατιστικά σημαντική μόνο στην ομάδα G5 (p = 0,02 και p = 0,03, αντίστοιχα).

Για να διαλευκανθεί αν υπήρχε οποιαδήποτε διαφορά μεταξύ αμέσως σταθερό έλεγχο μας και καλλιεργημένα ελέγχους, μια διερευνητική μελέτη διεξήχθη (S1 πίνακα). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των φρέσκα και κρυοσυντηρημένα αρχική ιστούς ελέγχου κατάσταση όταν αρχέγονη, πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας πυκνότητες των ωοθυλακίων συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες καλλιεργημένων ιστών τον έλεγχό τους, ούτε όταν συγκρίθηκαν οι ηρεμίας και αυξανόμενο πληθυσμό.

Θυλακιώδες ενεργοποίηση

FOXO3 πυρηνική εξαγωγή, ένας δείκτης της ενεργοποίησης του ωοθυλακίου, παρακολουθήθηκε (Σχήμα 1Α και 1Β) και ποσοτικοποιούνται (Σχ 1C και 1D) στα ενεργοποιημένα δείγματα, καθώς επίσης και στις αντίστοιχες τους ελέγχους τους. Μία αύξηση κατά 3 φορές του ποσοστού των ενεργοποιημένων αρχέγονου ωοθυλακίων παρατηρήθηκε στα φρέσκα ενεργοποιημένα δείγματα (G2: 59,55 ± 9,88%) σε σύγκριση με την αρχική τους ελέγχου (G1: 23,69 ± 5,71%? P = 0.03). Όταν πρωτογενή ενεργοποίηση θυλάκιο αναλύθηκε, δεν ήταν στατιστικά σημαντική, παρά την αύξηση κατά 15% παρατηρήθηκε στην ενεργοποιημένη ομάδα (G2: 80,44 ± 4,8%, G1: 66.4 ± 8.9%, ρ = NS). Στα κρυοσυντηρημένα ενεργοποιημένο δείγματα (G5), το πρωτόκολλο IVA παρήγαγε μια σημαντική αύξηση κατά 2-φορές στην αρχέγονη και της πρωτογενούς ενεργοποίηση ωοθυλάκιο (Σχήμα 1D), σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Αρχέγονο: G5: 63,7 ± 8,9%? G4: 36,8 ± 7,2 %, p = 0,04 και πρωτοβάθμια: G5: 93,80 ± 2,4%? G4: 47,5 ± 8,9%? p = 0.03)

(Α) και (Β)?. ανίχνευση FOXO3 και εντοπισμού για την παρακολούθηση της ενεργοποίησης των ωοθυλακίων. Τα ωοθυλάκια από τα δείγματα G2 και G5 δείχνεται, αντίστοιχα. Σημειώστε ότι τα ενεργοποιημένα τα θυλάκια των ομάδων G2 και G5 παρουσιάσει μια πυρηνική εξώθησης FOXO3 (βέλος) και ένα θετικό σήμα στο GC? (Γ) το ποσοστό των αρχέγονων ωοθυλακίων ενεργοποίησης εκτιμήθηκε σε φρέσκο ​​ιστούς των ωοθηκών, και μια σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε στο G2, σε σύγκριση με το G1 (* p = 0,03)? (Δ) όταν ο ενεργοποιηθεί αρχέγονη ποσοστό των ωοθυλακίων συγκρίθηκε στο παρελθόν κρυοσυντηρημένα-απόψυξη ομάδα, η ενεργοποίηση θύλακα ενισχύθηκε σε G5 εναντίον G4 (** p = 0,03)? (Ε) φρέσκο ​​ενεργοποιημένο δείγμα (G2), αρχέγονη θύλακα δείχνει Ki-67 χρώση σε GC και ωαρίων πυρήνες? ΣΤ) το Ki-67-θετικό σήμα στα ωοκύτταρα των αρχέγονων ωοθυλακίων από του κρυοσυντηρημένου-ενεργοποιημένο δείγμα (G5)? (G) ποσοτικοποίηση της έκφρασης ΑΜΗ σε GC. Μια αύξηση στην έκφραση ΑΜΗ παρατηρήθηκε στο GC από τα θυλάκια στις δύο G2 (§ p = 0,006) και G5 (§§ p = 0,008), ως αποτέλεσμα της

in vitro

διαδικασία ενεργοποίησης με 100 μΜ του BPV (pic)? (Η) οιστραδιόλη έκκριση στο μέσο καλλιέργειας. Όπως το γράφημα απεικονίζει,

vitro διαδικασίες ενεργοποίησης

αυξημένη έκκριση Ε2 στο

in vitro

ενεργοποιηθεί φρέσκο ​​(G2

vs

. G3 * p = 0,036) και κρυοσυντηρημένα (G5

vs

. G6 ** p = 0.001) δείγματα, σε σύγκριση με τους δικούς τους ελέγχους.

Η

διάδοσης και ανάπτυξης σε δευτερεύουσα στάδια

Το Ki-67 θετικών κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε ωοκύτταρα και GC από όλα τα ενεργοποιημένα δείγματα (Σχ 1Ε και 1Ρ). Αυτό το εύρημα αποκάλυψε ότι BPV (pic) έκθεσης, ακόμη και μετά τις διαδικασίες κρυοσυντήρηση, δεν επηρεάζει την πολλαπλασιαστική ικανότητα των αρχέγονη και της πρωτογενούς θυλάκια.

ΑΜΗ ανοσοχρώση αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση, της τάξης του 23-30%, με το ΑΜΗ θετική ωοθυλάκια μετά τη θεραπεία IVA στα ενεργοποιημένα δείγματα από τις ομάδες G2 και G5 σε σύγκριση με τις αρχικές τους ελέγχους κατάσταση του ιστού (G1: 53,3 ± 8,7%

vs

.G2: 76,3 ± 9,4%? p = 0,006 και G4: 25,7 ± 8,2%

vs

G5: 54,5 ± 10,2%? p = 0,008) (Σχήμα 1G)

AMH και οιστραδιόλη παραγωγής

Η ποσοτικοποίηση της ΑΜΗ.. σε μέσο καλλιέργειας έδειξαν ότι το πρωτόκολλο IVA αύξησε σημαντικά τη συγκέντρωση της ΑΜΗ σε φρέσκα ενεργοποιημένα δείγματα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου καλλιεργήθηκαν (G2: 0.34 ± 0.1 ng /ml

vs

G3:. 0.47 ± 0.1 ng /ml ? p = 0,017). Ωστόσο, αυτή η αύξηση δεν ανιχνεύθηκε στα προηγουμένως κρυοσυντηρημένων δειγμάτων, όπου τα επίπεδα της ΑΜΗ παρέμεινε κάτω από το χαμηλό όριο ανίχνευσης σε όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν.

Μία σημαντική αύξηση στη συγκέντρωση της Ε2 που εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας ανιχνεύθηκε σε αμφότερα το φρέσκο ​​(G3: 84,9 ± 17,7 pg /ml

vs

G2: 98,6 ± 22,9 pg /ml? p = 0.036). και κρυοσυντηρημένα ομάδων IVA (G6: 33,6 ± 6,3 pg /ml

vs

G5:. 40.8 ± 6.8 pg /ml? p = 0,001) σε σύγκριση με τις αντίστοιχες καλλιεργημένα τους ελέγχους τους (Σχήμα 1)

η απόπτωση από ΤΟΥΝΕΛ

για να διαλευκανθεί αν το πρωτόκολλο IVA που προκαλείται οποιαδήποτε επιβλαβή επίδραση στη ωοθηκών στρώμα ή θυλάκια, κυτταρική βλάβη διερευνήθηκε και ποσοτικά με TUNEL στα ενεργοποιημένα και ελέγχου-καλλιεργημένα δείγματα. TUNEL θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε όλες τις πειραματικές ομάδες, ακόμη και σε αμφότερες τις ομάδες ελέγχου καλλιεργημένα, λόγω των συνθηκών καλλιέργειας (Σχήμα 2Α έως 2D). Όσον αφορά τις βλάβες των κυττάρων των ωοθυλακίων (σχήμα 2Ε), η μελέτη έδειξε ότι δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς το βαθμό των κατεστραμμένων θυλάκων μεταξύ των ενεργοποιημένων ομάδων και των αντίστοιχων δειγμάτων ελέγχου πολιτισμό τους στον καθαρό (G2: 7,7 ± 4,0%

vs

G3: 13,0 ± 7,6%? p = NS) και κρυοσυντηρημένα ιστούς (G5: 6,25 ± 6,0%

vs

G6:. 28 ± 18,4%? p = NS), αν και μια ευρεία διακύμανση μεταξύ των δειγμάτων ήταν ανιχνεύεται (S2 σχήμα). Όταν βλάβη των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε στο στρώμα, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές που οφείλονται στις διαδικασίες ενεργοποίησης βρέθηκαν (Σχήμα 2F).

(Α) πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε) για την εκτέλεση της δοκιμασία TUNEL. Το δείγμα από την ομάδα G3. Το + σήμα ΤϋΝΕΕ βρέθηκε στα κύτταρα στόμιο (κόκκινο) από το G3? (Β) σημειώνει την αρχέγονη θύλακα στο δείγμα G2. Το + σήμα TUNEL βρέθηκε στο στρώμα, αλλά σημειώνουν ότι ήταν απούσα στο ωοκύτταρο και GC από τα θυλάκια της ομάδας G2? (C) το δείγμα G6. Αρχέγονα θυλάκια που περιβάλλεται από πεπλατυσμένο σχήμα GC και στρώμα πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (μπλε). TUNEL-θετικά κύτταρα χρωματίζονται με κόκκινο χρώμα στο στρώμα. Ωοθυλάκια ήταν αρνητικά για βλάβες του DNA στο δείγμα G6? (D) το δείγμα G5 που περιείχε δύο αρχέγονα ωοθυλάκια, πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με DAPI. Αριθ TUNEL + ανιχνεύθηκε σήμα σε ωοκύτταρο και GC, αλλά ήταν θετική στο στρώμα των ωοθηκών? (Ε) του δείκτη κυτταρικού θανάτου. Ποσοτικοποίηση των ωοθυλακίων με θετικό σήμα ΤϋΝΕΕ στα ωοκύτταρα ή GC. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ ενεργοποιηθεί και μη ενεργοποιημένο δείγματα? (F) TUNEL θετικών ποσοτικοποίηση περιοχή του στρώματος. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ανιχνεύθηκαν για ωοθυλακίων όταν η περιοχή TUNEL + συγκρίθηκε μεταξύ των ενεργοποιημένων και μη ενεργοποιημένων ομάδων. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η κυτταρική βλάβη που βρέθηκαν στο στρώμα από όλες τις ομάδες ήταν λόγω της διαδικασίας πολιτισμό.

Η

Σχετική γονιδιακή έκφραση του

PTEN

οδού

για την επικύρωση του αποτελέσματος της bpV (pic) επωάσεις στην έκφραση γονιδίων του

PTEN

οδός, η σχετική έκφραση των κύριων γονιδίων ποσοτικά.

στο φρέσκο ​​ιστούς, το πρωτόκολλο IVA προκαλείται από διάφορους σημαντικές τροποποιήσεις, όπως η μειωμένη φορές αλλαγή (fc) του

PTEN

(fc = -1,21, p = 0.03) και (-2,43 fc =) γονίδια

PI3K

, και μια υπερέκφραση του

ΑΚΤ

(fc = 7.65, p = 0.015) και

FOXO3

(fc = 6,78, p = 0,01) σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 3Α και 3Β). Όταν το Δέλτα του Κύκλου Threshold (ΔΟΙ) ήταν στατιστικά σύγκριση μεταξύ των ενεργοποιηθεί και δείγματα ελέγχου (Πίνακας 2), σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν επίσης μεταξύ των

PTEN

,

PI3K

και

FOXO3

προφίλ γονιδιακής έκφρασης. (p = 0,01? p = 0,03 και p = 0,015, αντίστοιχα)

(Α) φορές αλλαγή της

PTEN

γονίδιο. Σημαντικές διαφορές προέκυψαν όταν ΔΟΙ αναλύθηκαν και έδειξε την αναστολή ΡΤΕΝ που παράγονται από BPV (pic) στα 100 μΜ σε φρέσκο ​​(G1

vs

. G2 p = 0.01) και στο παρελθόν κρυοσυντηρημένα ιστούς των ωοθηκών (G4

vs

G5 p = 0,04)? (Β) φορές αλλαγή της

FOXO3

γονίδιο. Μια σημαντική μείωση ανιχνεύθηκε μόνο στα φρέσκα ιστούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία IVA όταν ΔΟΙ αναλύθηκαν (G1

vs

. G2 p = 0,015).

Η

Για την κρυοσυντηρημένα δείγματα, η σχετική έκφραση ή fold αλλαγή των

PTEN

γονίδια οδού τροποποιήθηκε επίσης από IVA

(PTEN

fc = -1,29,

PI3K

fc = 0.59,

Akt

fc = 2,27, p = 0,007? και

FOXO3

fc = 1,94, p = 0,008) σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 3Α και 3Β). Παρόλο που παρατηρήθηκε το ίδιο μοτίβο έκφρασης, ανιχνεύθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μόνο για το

PTEN

γονίδιο κατά τη σύγκριση ΔΟΙ (p = 0.04).

Επιπλέον, μια διερευνητική μελέτη για την έκφραση των γονιδίων πραγματοποιήθηκε μεταξύ αρχική δείγματα κατάσταση και τις αντίστοιχες καλλιεργούνται τον έλεγχό τους. Όπως φαίνεται S2 Πίνακα, δεν ανιχνεύθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων ελέγχου σε σύγκριση με μια αντιστοιχισμένη δοκιμή.

Συζήτηση

Η χρήση ενός πρωτοκόλλου IVA με έναν αναστολέα ΡΤΕΝ σε ανθρώπινο κρυοσυντηρημένα φλοιό των ωοθηκών από ασθενείς με καρκίνο αύξησε την πισίνα βιώσιμων ενεργοποιούνται αρχέγονα ωοθυλάκια χωρίς να προκαλεί επιβλαβή αποτελέσματα, όπως τα αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν. Η προσέγγιση αυτή αντιπροσωπεύει μια σημαντική βελτίωση στα πρώτα βήματα του

in vitro

τεχνικές ανάπτυξης. Αποδίδει ιδιαίτερη σημασία στην: εκείνους τους ασθενείς με καρκίνο στους οποίους ωοθηκών φλοιός είναι κρυοσυντηρημένα ως τη μόνη επιλογή για την FP, αλλά για τους οποίους άμεση επαναφορά των ιστών αντενδείκνυται [9, 10, 18]?