Αφηρημένο

TIG3 είναι μια πρωτεΐνη καταστολέας των όγκων που περιορίζει την επιβίωση των κερατινοκυττάρων κατά την κανονική διαφοροποίηση. Είναι επίσης σημαντικό στον καρκίνο, καθώς επίπεδο TIG3 μειώνεται σε όγκους και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του δέρματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να απαιτείται απώλεια της έκφρασης για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Ένας σημαντικός στόχος είναι η αναγνώριση πως TIG3 περιορίζει την επιβίωση των κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η έκφραση TIG3 στην επιδερμική πλακώδες καρκίνωμα SCC-13 κύτταρα ανάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προάγει μορφολογικές και βιοχημικές απόπτωση. Να προσδιορίσει τον μηχανισμό που οδηγεί αυτές τις αλλαγές, καταδεικνύουν ότι TIG3 εντοπίζεται κοντά στο κεντρόσωμα και ότι η συσσώρευση pericentrosomal της TIG3 αλλάζει μικροσωληνίσκων και μικρονηματίων οργάνωσης και διανομής οργανιδίων. συσσώρευση οργανίδιο στο κεντρόσωμα είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης και αποδεικνύουν ότι TIG3 προάγει τη συσσώρευση pericentrosomal οργανίδιο. Οι αλλαγές αυτές συνδέονται με μειωμένη κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε και κυκλίνη Α και αυξημένο επίπεδο ρ21. Επιπλέον, το επίπεδο Bax αυξάνεται και το επίπεδο Bcl-XL είναι μειωμένη, και η αποκοπή procaspase 3, 9 και προκασπάσης PARP ενισχύεται. Προτείνουμε ότι pericentrosomal εντοπισμός του TIG3 είναι ένα σημαντικό γεγονός που οδηγεί σε μικροσωληνίσκων και μικρονηματίων αναδιανομή και pericentrosomal ομαδοποίηση οργανίδιο και ότι οδηγεί σε καρκίνο κυτταρικής απόπτωσης

Παράθεση:. Scharadin TM, Jiang Η Jans R, Rorke ΕΑ, Eckert RL (2011) TIG3 Ογκοκατασταλτικής-εξαρτημένων Organelle Η αναδιανομή και η απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του δέρματος. PLoS ONE 6 (8): e23230. doi: 10.1371 /journal.pone.0023230

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Μαρ 2011? Αποδεκτές: 12 του Ιούλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 του Αυγ 2011

Copyright: © 2011 Scharadin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί στους RE (ΝΙΗ R01 AR094713 και ΝΙΗ R01 AR04694). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

TIG3 (Ταζαροτένη επαγόμενη γονίδιο 3), η οποία καλείται επίσης ρετινοϊκού αποκριτής υποδοχέα οξύ 3 (RARRES3) και ρητινοειδή επαγώγιμο γονίδιο 1 (RIG1) [1] – [5], είναι εκατό εξήντα τέσσερα πρωτεΐνη αμινοξύ [6]. TIG3 αρχικά αναγνωρίστηκε ως αυξημένη μετά από θεραπεία των καλλιεργημένων επιδερμικών κερατινοκυττάρων ή ψωριασική επιδερμίδα με το συνθετικό ρητινοειδές, Tazarotene [6]. Εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε υπερπολλαπλασιαστικές επιδερμίδας (π.χ., καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και ψωρίαση) και η έκφραση αποκαθίσταται με ρετινοειδές θεραπεία [7] – [9]. Σε ρετινοειδές αγωγή επιδερμίδα ψωριασικών, αυξημένη έκφραση TIG3 σχετίζεται με την αποκατάσταση της φυσιολογικής διαφοροποίησης [6], [10]. Η ένωση των αυξημένη έκφραση TIG3 με φυσιολογικό φαινότυπο επιδερμική υποδεικνύει ότι TIG3 μπορεί να δρα ως ρυθμιστής προ-διαφοροποίηση. Για να εξεταστεί ο μηχανισμός δράσης, μελετήσαμε λειτουργία TIG3 σε φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα [10] – [12]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι TIG3 είναι παρούσα σε vanishingly χαμηλά επίπεδα σε κερατινοκύτταρα σε μονοστρωματική καλλιέργεια, αλλά αυξάνεται σε διαφοροποιημένα καλλιέργειες σχεδία [12]. Vector μεσολάβηση έκφραση TIG3 σε κερατινοκύτταρα προκαλεί μειωμένη πολλαπλασιασμού και αυξημένο σχηματισμό κερατινοποιημένου φακέλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι TIG3 ρυθμίζει κερατινοκυττάρων διαφοροποίηση [10] – [12]. Τρέχουσες μελέτες δείχνουν ότι TIG3 λειτουργεί μέσω διαφόρων μηχανισμών, αλλά ένας εξέχων μηχανισμός δράσης είναι η ρύθμιση της δραστηριότητας τρανσγλουταμινάσης [10], [11]. Τύπου Ι τρανσγλουταμινάσης (TG1) είναι ένα ένζυμο κλειδί στην κερατινοκύτταρα και άλλη επιφάνεια επιθηλίων που εκφράζεται σε υπερβασικά διαφοροποιημένων κυττάρων [13] – [20]. Η τρανσγλουταμινάση καταλύει το σχηματισμό του ∈- (γ-γλουταμυλ) διασταυρωμένων συνδέσεων μεταξύ πρωτεϊνών λυσίνη για τη συναρμολόγηση του κερατινοποιημένο φάκελλο, ένα βασικό συστατικό του επιδερμικού φραγμού [21], [22]. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι TIG3 συνεντοπίζεται με TG1 που οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα τρανσγλουταμινάσης [10], [11]. Πρόσθετες μελέτες δείχνουν ότι TIG3 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων, αλλά δεν προκαλεί απόπτωση [10], [11]. TIG3 αποτελείται από μία αμινοτερματική υδρόφιλο τμήμα και ένα c-τερματικό τομέα αγκίστρωσης μεμβράνης [6], [23]. Μελέτες δείχνουν ότι Mutagenesis μεταλλάγματα που στερούνται την περιοχή της μεμβράνης αγκύρωσης c-τερματικό δεν είναι ενεργά [10], [11], [23]. Σε αντίθεση, η Ν-τερματική κολόβωση μετατρέπει TIG3 σε μία πρωτεΐνη που προκαλεί απόπτωση σε κερατινοκύτταρα [12].

TIG3 εκφράζεται σε μειωμένα επίπεδα σε όγκους του δέρματος [7]. Έτσι, ένας σημαντικός στόχος της παρούσας μελέτης είναι να χαρακτηριστεί η επίδραση της έκφρασης TIG3 σε καρκινικά κύτταρα του δέρματος. Δείχνουμε ότι η αποκατάσταση της έκφρασης TIG3 μειώνει την επιβίωση των κυττάρων επιδερμικού πλακώδες καρκίνωμα μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει pericentrosomal εντοπισμό TIG3 οδηγούν σε μεταβολή της οργάνωσης μικροσωληνίσκων και τη διανομή οργανιδίων. Αυτό συνδέεται με τις αλλαγές στο επίπεδο του κύκλου και της απόπτωσης των ρυθμιστικών αρχών των κυττάρων.

Αποτελέσματα

έκφραση TIG3 μειώνει τον αριθμό των κυττάρων

Αρχίσαμε από την εξέταση των επιπτώσεων της TIG3 για SCC- 13 κυτταρική επιβίωση. TIG3 παραδόθηκε από τον αδενοϊό μόλυνση. Σύκο. 1Α δείχνει ότι άδειο φορέα-μολυσμένα κύτταρα αυξάνονται σε αριθμό πάνω από 72 ώρες, αλλά ο αριθμός των κυττάρων μειώνεται σημαντικά στις 48 και 72 ώρες σε TIG3-εκφράζοντα κύτταρα. Σύκο. 1Β δείχνει ότι το επίπεδο TIG3 είναι μέγιστη στα μολυσμένα κύτταρα με 24 και 48 ώρες μετά τη μόλυνση και μειώνεται κατά 72 ώρες. Εκτός από το μονομερές TIG3, παρατηρούμε συσσώρευση μορφών υψηλού μοριακού βάρους, που πιστεύεται ότι είναι ομοιοπολικά διασυνδεδεμένη TIG3 [10] – [12]. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, TIG3 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στα περισσότερα μετασχηματισμένα κύτταρα [10], [11] και ως εκ τούτου δεν ανιχνεύεται σε χρόνο μηδέν.

Υποσυρρέουσες καλλιέργειες SCC-13 κύτταρα, που αναπτύσσονται σε 3,8 cm

2 πηγάδια, μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ tAd5-EV ή tAd5-TIG3. Σε 0, 24, 48, και 72 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα μετρήθηκαν και τα προϊόντα λύσης που παρασκευάζονται. Μια έκφραση TIG3 μειώνει τον αριθμό των κυττάρων. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM, η = 3. Αυτές οι συγκρίσεις που σημειώνονται με αστερίσκο είναι σημαντικά διαφορετικές όπως προσδιορίζεται με t-test του Student (ρ & lt? 0.001). Β TIG3 ανιχνεύεται με ανοσοστύπωμα σε tAd5-TIG3 μολυσμένα SCC-13 κύτταρα. Το μονομερές είναι ορατό στο 18 kDa και ο βραχίονας δείχνει υψηλότερο μοριακό βάρος διασταυρωμένες TIG3 [10], [11]. Τα μοριακά βάρη υποδεικνύονται στα αριστερά του στυπώματος σε kDa.

Η

TIG3 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αναστολής της προόδου του κυτταρικού κύκλου

επόμενο παρακολουθείται εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Αρχίσαμε με την εκτίμηση του ποσοστού των κυττάρων σε φάση S με χρήση σήμανσης BrdU. SCC-13 κύτταρα μολύνθηκαν με τον ιό TIG3 εκφράζουν και μετά από 24 ώρες επισημασμένο με BrdU για 2 ώρες πριν από την ανίχνευση του BrdU και TIG3. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, 54 ± 2,8% (μέσος όρος ± SEM) του EV-μολυσμένων κυττάρων ήταν θετικά για BrdU σε σύγκριση με 23% ± 4% του TIG3-εκφράζοντα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, τα πιο γνωστά μεταβολές του κυτταρικού κύκλου είναι η μείωση των G1 και να αυξήσει σε εκδηλώσεις subG1. Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός που ευθύνεται για αυτές τις αλλαγές, μετρήσαμε τα επίπεδα των βασικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου. Σύκο. 2C δείχνει ότι (, cdk2, CDK6, cdk4 cdk1) επίπεδα εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση δεν μεταβάλλονται από TIG3, αλλά τα επίπεδα κυκλίνης D1 και κυκλίνη Ε μειώνεται και το επίπεδο ρ21 είναι αυξημένη. Οι αλλαγές αυτές είναι συνεπείς με μειωμένη εξέλιξη στη φάση G1 και το G1 /S μετάβαση. Σύκο. 2D δείχνει ότι οι αυξήσεις επίπεδο του mRNA p21 παράλληλα με την αύξηση της πρωτεΐνης ρ21.

SCC-13 κύτταρα που αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ EV ή ιό TIG3 κωδικοποίησης και μετά από 24 ώρες επεξεργασία με 10 μΜ BrdU για 2 ώρες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-BrdU (κόκκινο) και αντι-TIG3 (πράσινο). ενσωμάτωσης BrdU είναι ένας δείκτης της φάσης σύνθεσης του κυτταρικού κύκλου. Ο αριθμός των BrdU θετικών κυττάρων ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων παρουσιάζεται κάτω από κάθε πίνακα. Οι τιμές είναι μέσες ± SEM (n = 3) και οι τιμές που είναι σημαντικά διαφορετικές όπως προσδιορίζεται με t-test του Student (ρ & lt? 0.001). Γραμμές = 10 μm. Β SCC-13 κύτταρα συλλέχθηκαν για κυτταρομετρία ροής στις 24 ώρες μετά τη μόλυνση με τον ιό EV ή TIG3-κωδικοποίηση. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 50 μg ml ιωδιούχου προπιδίου /πριν την ανάλυση. TIG3 μειώνει γεγονότα στην G1 και αυξάνει τα γεγονότα subG1. C Στις 24 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα εκχυλίσματα παρασκευάζονται για την ανίχνευση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου. Τα μοριακά βάρη υποδεικνύονται στα αριστερά του στυπώματος σε kDa. D Τα κύτταρα κατεργάστηκαν όπως παραπάνω και στη συνέχεια συλλέγονται για την ανίχνευση του mRNA p21 κωδικοποιεί με πραγματικού χρόνου PCR. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε κάθε ένα από τρία πειράματα.

Η

TIG3 επάγει απόπτωση

Η παρουσία του περιεχομένου subG1 DNA μπορεί να συνδέεται με την κυτταρική απόπτωση. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε τον αντίκτυπο της TIG3 στην απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η έκφραση TIG3 ενεργοποιεί τη διάσπαση των προκασπάσης 9 και procaspase 3 και δημιουργεί διασπασμένης PARP. Επιπλέον, η προ-αποπτωτικά ρυθμιστής, Bax, αυξάνεται και ο ρυθμιστής prosurvival, Bcl-XL, μειώνεται. Αυξημένη απόπτωση μπορεί επίσης να παρατηρηθεί

in situ

. Σύκο. 3Β δείχνει ότι πολύ λίγοι διασπασμένη PARP-θετικών κυττάρων που παρατηρείται σε καλλιέργειες ελέγχου (1 ± 1%, μέσος όρος ± SD), αλλά ότι ο αριθμός είναι σημαντικά αυξημένη σε TIG3-θετικό (23 ± 8%) καλλιέργειες. Αυτά τα ευρήματα, μαζί με την αύξηση της περιεκτικότητας σε subG1 DNA (Σχ. 2Β), υποδεικνύουν ότι TIG3 επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

SCC-13 κύτταρα μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ EV ή ιό TIG3-κωδικοποίηση και μετά 24 h προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν για την ανίχνευση των δεικτών απόπτωσης. Ο βραχίονας δείχνει υψηλό μοριακό βάρος διασταυρωμένες TIG3 [10], [11]. Τα μοριακά βάρη υποδεικνύονται στα αριστερά του στυπώματος σε kDa. Β Στις 24 ώρες μετά την μόλυνση SCC-13 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-διασπασμένη PARP (κόκκινο). TIG3 αυξήσεις διασπαστεί χρώση PARP. Το ποσοστό των διασπασμένη PARP θετικών κυττάρων παρουσιάζεται σε κάθε πάνελ (μέση τιμή ± SD). Τα βέλη δείχνουν διασπασμένη PARP-θετικά κύτταρα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κάθε ένα από τρία πειράματα.

Η

TIG3 εντοπίζεται στην περιοχή pericentrosomal και προκαλεί οργανίδιο αναδιανομή

Για να αποκτήσουν εικόνα για το μηχανισμό TIG3 της δράσης θα παρακολουθείται TIG3 υποκυτταρική τοποθεσία στο tAd5-TIG3 μολυσμένα με ιό κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, TIG3 (πράσινο) συσσωρεύεται κατά μήκος περιφέρεια του κυττάρου κοντά στην μεμβράνη πλάσματος (κεφαλές βελών) και σε μια περιπυρηνική τοποθεσία (βέλη), και οι πυρήνες σε TIG3-κύτταρα που εκφράζουν μειωθεί σε μέγεθος. Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η θέση TIG3, τα κύτταρα χρωματίζονται για την ανίχνευση περικεντρίνη, ένα κεντρόσωμα δείκτη. Οι εικόνες στο Σχ. 4Β αποκαλύπτουν TIG3 χρώση αντιπαρατίθεται με περικεντρίνη χρώσης (λευκό βέλος) που πρόσκειται στον πυρήνα (n). TIG3 (πράσινο) εντοπίζεται στη γενική γειτονία του περικεντρίνη (κόκκινο) προτείνοντας συσσώρευση στην περιοχή του κεντροσώματος.

SCC-13 κύτταρα μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ tAd5-EV ή tAd5-TIG3 και στις 24 ώρες μετά την μόλυνση σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-TIG3 (πράσινο). Τα βέλη δείχνουν pericentrosomal και αιχμές βελών δείχνουν εντοπισμό μεμβράνης. Δεν TIG3 ανιχνεύεται σε κενά κελιά φορέα μολυσμένα. Β κύτταρα, μολύνθηκαν όπως ανωτέρω, σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με TIG3 (πράσινο) και περικεντρίνη (κόκκινο). Τα βέλη υποδεικνύουν περικεντρίνη χρώση του κεντρόσωμα και η δείχνει τους πυρήνες. Μπαρ = 10 μm.

Η

Το κεντρόσωμα είναι ένα σημείο ελέγχου για ένα ευρύ φάσμα λειτουργιών των κυττάρων. Λειτουργεί ως κέντρου οργάνωσης των μικροσωληνίσκων (MTOC), η οποία είναι η περιοχή της συγκρότησης μικροσωληνίσκων [24], [25]. Επιπλέον, αναπαράγει κατά την κυτταρική διαίρεση και η κόρη κεντροσωμάτια χρησιμεύουν για να οργανώσουν τις μιτωτικής ατράκτου που καθοδηγούν χρωμόσωμα διαχωρισμού [24], [26]. Είναι σημαντικό ότι η MTOC χρησιμεύει ως σημείο ελέγχου για την κίνηση του μοριακού κινητήρα-μεταφέρονται φορτία, συμπεριλαμβανομένων των οργανιδίων, κατά μήκος των μικροσωληνίσκων [27]. Επιπλέον, κεντροσωμάτων δυσλειτουργία σχετίζεται με την κυτταρική απόπτωση [28]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν η συσσώρευση pericentrosomal TIG3 μεταβάλλει τη διανομή των μικροσωληνίσκων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, οι μικροσωληνίσκοι σε TIG3-αρνητικά κύτταρα απλώνονται σε όλο το κύτταρο σε ένα τυπικό δίκτυο τύπου πλέγματος που ακτινοβολεί έξω από το κεντρόσωμα (λευκό βέλος). Αντίθετα, σε TIG3-κύτταρα που εκφράζουν (μαύρο βέλος δείχνει pericentrosomal TIG3), οι μικροσωληνίσκοι εντοπίζεται ως μία ζώνη (κόκκινα βέλη) στο κύτταρο περιφέρεια και δεν ακτινοβολεί έξω από το κεντρόσωμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τοποθεσία επιπτώσεις TIG3 μικροσωληνίσκων και αγκυροβόλιο. Αυτό παρατηρείται καλύτερα στο Σχ. 5Α (κάτω πάνελ), η οποία δείχνει μόνο τη χρώση β-τουμπουλίνης. Οι μικροσωληνίσκοι στην TIG3-θετικού κυττάρου (αριστερά) δεν κεντροσωμάτων που βασίζεται ομαδοποίηση, ενώ ο TIG3 αρνητικό κύτταρο (δεξιά) έχει κεντροσωμάτων σταθεροποιημένες των μικροσωληναρίων (λευκό βέλος). Για να εκτιμηθεί η επίπτωση της TIG3 στο δίκτυο των μικροσωληνίσκων, μετρήθηκε ο αριθμός των κυττάρων που εμφανίζουν μικροσωληνίσκων ακτινοβολεί από το κεντρόσωμα. Όπως φαίνεται στο διάγραμμα, το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν κεντροσωμάτων κατευθυνόμενη δίκτυα μειώνεται σημαντικά σε TIG3-εκφράζοντα κύτταρα.

SCC-13 κύτταρα μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ tAd5-EV ή tAd5-TIG3 και στους 24 h μετά τη μόλυνση τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-TIG3 (πράσινο λεκέ) και αντι-β-τουμπουλίνης (κόκκινο λεκέδων). TIG3 συσσωρεύεται κατά την αναμενόμενη περιπυρηνικού θέση (μαύρο βέλος). β-τουμπουλίνης συσσωρεύεται σε ένα άτυπο δαχτυλίδι στο κύτταρο περιφέρεια (κόκκινα βέλη). Η κανονική δίκτυο β-τουμπουλίνης στον TIG3-αρνητική κυτταρική υποδεικνύεται από ένα λευκό βέλος κατευθυνόμενο προς τα κεντρόσωμα. Πυρήνες ήταν Hoechst χρωματισμένο (μπλε). Το κάτω πάνελ είναι ταυτόσημη με την κορυφή, εκτός από το ότι μόνο το σήμα β-τουμπουλίνης (κόκκινο) υποδεικνύεται. Μπαρ = 10 μΜ. Το γράφημα δείχνει τον αριθμό των TAD-EV και tAd5-TIG3 κύτταρα μολυσμένα με συστοιχίες μικροσωληνίσκων κεντροσωμάτων-προήλθε. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε είκοσι ανεξάρτητα πεδία μικροσκοπίου και τουλάχιστον εκατό κύτταρα μετρήθηκαν ανά ομάδα θεραπείας. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM. ανάλυση t-test Paired Student αποκαλύπτει ότι τα μέσα είναι σημαντικά διαφορετικές (p & lt? 0.001). Για να εκτιμηθεί η επίπτωση της TIG3 στη διαλυτότητα της τουμπουλίνης, τα κύτταρα μολύνθηκαν με tAd5-EV ή tAd5-TIG3 και μετά από 24 ώρες συνολικό εκχύλισμα, διαλυτά και σφαιρίδιο κλάσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και ακολουθεί ανοσοχρώση για την ανίχνευση β-τουμπουλίνης και β-ακτίνης. Η παρουσία της πλειοψηφίας των β-ακτίνης στο διαλυτό κλάσμα υποδεικνύει ότι η κλασμάτωση ήταν επιτυχής. έκφραση Β TIG3 προκαλεί κατάρρευση ακτίνης γύρω από τον πυρήνα. SCC-13 κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊό ως ανωτέρω και μετά από 24 ώρες χρώση με αντι-β-ακτίνης (κόκκινο λεκέ) και αντι-TIG3 (πράσινη κηλίδα). Πυρήνες ήταν Hoechst χρωματισμένο (μπλε). Για τους TIG3-θετικών κυττάρων, το αριστερό πλαίσιο δείχνει το TIG3 και τα σήματα β-ακτίνης (κόκκινο και πράσινο), ενώ ο δεξιός πίνακας δείχνει μόνο το κανάλι β-ακτίνης (κόκκινο). Το μαύρο βέλος δείχνει τη συσσώρευση TIG3 στο κεντρόσωμα και το κόκκινο βέλος δείχνει το β-ακτίνης μικρονηματίων πυρηνική δαχτυλίδι. Γραμμές = 10 μm. Το διάγραμμα δείχνει τον αριθμό των TAD-EV και tAd5-TIG3 κύτταρα που έχουν μολυνθεί εμφανίζουν μικρονηματίων ακτίνης δαχτυλίδια γύρω από τον πυρήνα. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε δεκαοκτώ ανεξάρτητα πεδία μικροσκοπίου και τουλάχιστον εκατό κύτταρα μετρήθηκαν ανά ομάδα θεραπείας. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM. ανάλυση t-test κατά ζεύγη Student αποκαλύπτει ότι τα μέσα είναι σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0.001).

Η

Η ανακατανομή της τουμπουλίνης στην κυτταρική μεμβράνη σε TIG3-θετικά κύτταρα υποδεικνύει ότι μπορεί να είναι αδιάλυτο. Για την εκτίμηση αυτή, έχουμε ετοιμάσει συνολικό εκχύλισμα κυττάρων από TIG3-αρνητικών και θετικών κυττάρων και παρασκευάζεται διαλυτές και ειδικότερα (pellet) κλάσματα. Στη συνέχεια αναλύθηκαν για β-τουβουλίνης σε κάθε κλάσμα με ανοσοστύπωμα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η μεμβράνη-εντοπισμένο β-τουμπουλίνης δεν εμφανίζεται στο κλάσμα σφαιριδίου, υποδεικνύοντας ότι αν και εντοπίζεται στη περιφέρεια του κυττάρου σε ή κοντά στην μεμβράνη, παραμένει διαλυτή.

Τα δίκτυα τουμπουλίνης και ακτίνης αλληλεπιδρούν εκτεταμένα και γι ‘αυτό παρακολουθείται ο αντίκτυπος της TIG3 στη διανομή ακτίνη νήματος (Εικ. 5Β). Σε TIG3-αρνητικά κύτταρα (EV), β-ακτίνη (κόκκινο) διανέμει σε όλο το κυτταρόπλασμα. Αντίθετα, σε TIG3-θετικά κύτταρα (πράσινο λεκέ) ένα διακριτές μορφές δακτύλιος ακτίνης στον πυρηνικό περιφέρεια (κόκκινο βέλος). Αυτό φαίνεται τόσο σε συγχωνευμένη εικόνα και β-ακτίνης χρώση μόνο (Σχ. 5Β). μετρήθηκε ο αριθμός των κυττάρων που εμφανίζουν ένα δαχτυλίδι πυρηνική ακτίνης. Η καμπύλη δείχνει ότι το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν ένα δακτύλιο πυρηνικής ακτίνης είναι σημαντικά αυξημένη σε TIG3-εκφράζοντα κύτταρα.

Επειδή κίνηση οργανιδίων και αγκύρωσης εξαρτάται από τα τουμπουλίνης και ακτίνης δικτύων [29], αναμέναμε ότι TIG3 μπορεί να επηρεάσει διανομής οργανίδιο. Για να εκτιμηθεί η επίπτωση της TIG3 με την τοποθεσία οργανίδιο, τα κύτταρα βάφτηκαν για να ανιχνεύσει GM130 (cis-Golgi), υποδοχέα μαννόζης 6-φωσφορικής (M6PR, trans-Golgi και αργά ενδόσωμα) [30], rab11 (ανακύκλωση ενδοσώματα), καλνεξίνη ( ενδοπλασματικό δίκτυο), και clathrin βαριά αλυσίδα (CHC, ενδοκυτταρικά κυστίδια μεταφοράς). Σύκο. 6Α δείχνει ότι GM130 (κόκκινο) εντοπίζεται σε μία περιπυρηνική τοποθεσία στο TIG3-αρνητικά και θετικά κύτταρα? Ωστόσο, φαίνεται περισσότερο συμπιέζεται στο TIG3-θετικά κύτταρα (πράσινο λεκέ). M6PR, rab11 και καλνεξίνης επίσης εμφανίζονται συμπιέζεται στο pericentrosomal τοποθεσία στο TIG3-θετικά κύτταρα (λευκά βέλη). Αυτό επιτυγχάνεται εύκολα οπτικοποιείται για καλνεξίνη, συγκρίνοντας την κατανομή που φαίνεται στο κόκκινο μονόχρωμο εικόνα (ένθετο) με αυτή που παρατηρήθηκε σε κύτταρα EV-μολύνθηκαν (Εικ. 6Α), ως μια έντονη pericentrosomal συγκέντρωση καλνεξίνη παρατηρείται σε TIG3-θετικά κύτταρα . Επιπλέον, clathrin βαριάς αλυσίδας είναι ένα ιδιαίτερα δραματικό παράδειγμα, από το ότι η χρώση φαίνεται κατανεμημένα σε όλο το κυτταρόπλασμα στα κύτταρα που έχουν μολυνθεί EV-αλλά ουσιαστικά όλο το CHC συσσωρεύεται στην περιοχή του κεντροσώματος σε TIG3-θετικά κύτταρα. Έτσι, φαίνεται ότι μεταβάλλει TIG3 ενδοκυτταρική διανομή οργανίδιο κατά τρόπο που να συγκεντρώνει και συμπιέζει πολλά οργανίδια στην περιοχή του κεντροσώματος. Αυτή συμπίεση ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της δισδιάστατη επιφάνεια που καλύπτεται από μεμονωμένες οργανίδια σε τετραγωνικά microns χρησιμοποιώντας ImageJ Software (Εικ. 6Β). Αυτή η ανάλυση αποκαλύπτει μια σημαντική και στατιστικά σημαντική μείωση στην περιοχή για GM130, M6PR και rab11. Καλνεξίνη και διανομή CHC δεν αναλύθηκε με αυτόν τον τρόπο, δεδομένου ότι η συμπύκνωση ήταν προφανής. Εξετάσαμε επίσης τον αντίκτυπο της TIG3 σε επίπεδο πρωτεΐνης οργανίδιο. Σύκο. 7 δείχνει ότι η έκφραση TIG3 προκαλεί μια μέτρια μείωση στο επίπεδο ορισμένων πρωτεϊνών οργανιδίων, συμπεριλαμβανομένων καλνεξίνη, rab11, GM130 και EEA1? Ωστόσο, το επίπεδο των άλλων πρωτεϊνών δεικτών δεν μεταβάλλεται.

SCC-13 κύτταρα μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ tAd5-EV ή tAd5-TIG3 και μετά από 24 ώρες μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για την ανίχνευση TIG3 (πράσινο) και διάφορες οργανίδιο δείκτες (κόκκινο). Οι δείκτες περιλαμβάνουν GM130 (cis-Golgi), M6PR (υποδοχέας μαννόζης-6-φωσφορικής, trans-Golgi και αργά ενδοσώματος), rab11 (ανακύκλωση ενδοσώματος), καλνεξίνη (ER), και CHC (βαριά αλυσίδα κλαθρίνη, ενδοκυτταρική κυστιδίων μεταφοράς). Λευκά βέλη δείχνουν pericentrosomal εντοπισμό των TIG3. Πυρήνες βάφονται μπλε. Για GM130, M6PR, και rab11, όλα τα πάνελ είναι κόκκινο /πράσινο /μπλε συγχωνευθείσας εικόνες. Τα EV και TIG3 φωτογραφίες της χρώσης καλνεξίνης είναι κόκκινο /πράσινο /μπλε συγχωνευθείσας εικόνες. Τα ένθετα στο TIG3 /εικόνα καλνεξίνης είναι μονόχρωμο εικόνες. Για το λεκέ CHC, μόνο το κόκκινο (CHC) εικόνα εμφανίζεται. Γραμμές = 10 μm. αντίκτυπο Β TIG3 στην υποκυτταρική κατανομή οργανίδιο. Για τη μέτρηση οργανίδιο εξάπλωση, το μικροσκόπιο επικεντρώθηκε στην z-plane εμφανίζοντας τη μέγιστη εξάπλωση οργανίδιο και την περιοχή που καλύπτεται από το οργανίδιο παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ και παρουσιάζονται ως περιοχή οργανίδιο σε μm

2. Οι τιμές είναι μέσες ± SEM (n = 30 πεδία) συμπεριλαμβανομένης της μέτρησης του τουλάχιστον τριάντα κυττάρων ανά ομάδα θεραπείας. Αξιόπιστες ανάλυση έλεγχος τ προσδιορίζει τα μέσα που διαφέρουν σημαντικά (p & lt? 0.001).

Η

SCC-13 κύτταρα μολύνθηκαν κατά 10 ΜΟΙ tAd5-EV ή tAd5-TIG3 και μετά από λύματα κυττάρων 24 ώρες ήταν παρασκευάζονται για την ανίχνευση ανοσοκηλίδος των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. έκφραση TIG3 μειώνει το επίπεδο της rab11, GM130 και EEA1, αλλά δεν μεταβάλλει το επίπεδο LAMP1. Τα μοριακά βάρη υποδεικνύονται στα αριστερά του στυπώματος σε kDa.

Η

Συζήτηση

TIG3 (Ταζαροτένη επαγόμενη γονιδίου 3) ταυτοποιήθηκε αρχικά ως αυξημένη μετά από θεραπεία των καλλιεργημένων επιδερμικών κερατινοκυττάρων ή ψωριασική επιδερμίδα με το συνθετικό ρετινοειδή, Tazarotene [6], και αργότερα εντοπίστηκαν στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και ονομάζεται RIG1 [5]. Μεταγενέστερες μελέτες αποκαλύπτουν TIG3 mRNA σε ένα φάσμα ιστών και κυττάρων σε καλλιέργεια [1], [5], [31] – [33]. επίπεδο TIG3 αυξάνεται με κατεργασία ρητινοειδούς [4], [34] και σε μερικούς τύπους κυττάρων TIG3 γονιδιακή έκφραση καταστέλλεται από ΜΑΡΚ σηματοδότηση [35].

TIG3 είναι μέλος της NiPc /P60 υπεροικογένειας πρωτεϊνών [ ,,,0],36]. Το Ν-τερματικό πεδίο (aa1-134) κωδικοποιεί τις περιοχές που είναι συντηρημένες μεταξύ των μελών της lecithin:retinol ακυλτρανσφεράσης (LRAT) και Η-rev οικογένειες ογκοκατασταλτικό [37] – [39]. Λειτουργική ανάλυση της δομής TIG3 υποδεικνύει ότι το Ο-τερματικό υδρόφοβο τομέα (aa135-164) λειτουργεί ως άγκυρα μεμβράνης [6], [23] και ότι η Ν-τερματική περιοχή κωδικοποιεί 2 δραστικότητα ασβέστιο-ανεξάρτητη φωσφολιπάσης Α1 /[31] , [32], [40]. Επιπλέον, φωσφολιπάση δραστηριότητα A1 /2 δεν απαιτεί την c-τερματικό υδρόφοβο τομέα [40]. TIG3 έχει αποδειχθεί ότι μειώνει την επιβίωση των κυττάρων σε έναν αριθμό κυτταρικών τύπων [6], [10], [11], [34], [41], [42], αλλά ο μηχανισμός υπεύθυνος για την καταστολή δεν είναι καλά κατανοητός. Σε ορισμένους τύπους κυττάρων, TIG3 μπορεί να δράσει μέσω ρύθμισης των ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση [1], [3], [41].

TIG3 σε επιδερμίδα

TIG3 εκφράζεται στο άνωθεν της βασικής διαφοροποιημένες στρώσεις καλλιέργειες κερατινοκυττάρων σχεδία [12] και σε επιδερμίδα υπερβασικά [7], [8], και η έκφραση TIG3 μειώνεται υπερπολλαπλασιαστικής δερματικής πάθησης και σε καρκινικά κύτταρα του δέρματος [6] – [9]. Ρητινοειδούς θεραπεία αυξάνει επίπεδο TIG3 και αυτό συνδέεται με μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό [6] – [9]. TIG3 δεν εκφράζεται σε φυσιολογικά κερατινοκύτταρα διατηρήθηκαν σε μονοστρωματική καλλιέργεια και έκφραση TIG3 φορέα μεσολάβηση συσχετίζεται με μειωμένο αριθμό κυττάρων [8], [10] – [12]. Μηχανιστικές μελέτες σε κερατινοκύτταρα δείχνουν ότι η C-τελική περιοχή αγκίστρωσης μεμβράνης είναι απαραίτητη για δραστηριότητα [10], [11], [23], και ότι η έκφραση της TIG3 σε φυσιολογικά ανθρώπινα καλλιεργημένα κερατινοκύτταρα ενεργοποιεί επιλεγμένες εκδηλώσεις διαφοροποίησης που σχετίζονται με [10] – [ ,,,0],12]. Ειδικότερα, TIG3 αλληλεπιδρά με τον τύπο Ι τρανσγλουταμινάσης (TG1) για την αύξηση της καταλυτικής δραστηριότητας TG1 [10], [11]. TG1 είναι ένα ένζυμο κλειδί στη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων που καταλύει το σχηματισμό της πρωτεΐνης-πρωτεΐνης διασταυρωμένες συνδέσεις που οδηγούν στην συναρμολόγηση του κερατινοποιημένο φάκελλο, ένα σημαντικό συστατικό του φραγμού διαπερατότητας του δέρματος [43]. πρωτεΐνη TIG3 πλήρους μήκους διεγείρει τη δραστηριότητα τρανσγλουταμινάσης διαφοροποίηση που σχετίζεται με κερατινοκύτταρα. Σε αντίθεση, αμινο-τερματικό κολοβωμένες μορφές προκαλέσει απόπτωση και το επίπεδο της απόπτωσης είναι πιο έντονη, όπως το Ν-άκρο βραχύνεται [12]. Άλλες μελέτες δείχνουν μοναδικό επιπτώσεις των διαφόρων TIG3 υποτομείς [40], [42], [44]. Το μοτίβο υπερβασικά έκφρασης TIG3 στην επιδερμίδα είναι συνεπής με το ρόλο των TIG3 ως ελεγκτής των κερατινοκυττάρων γεγονότων διαφοροποίησης που σχετίζονται.

έκφραση TIG3 σε καρκινικά κύτταρα του δέρματος μειώνει τον πολλαπλασιασμό και αυξάνει την απόπτωση

Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι TIG3 mRNA είναι παρόν σε μειωμένα επίπεδα σε καρκίνο του δέρματος και καρκίνο του δέρματος σε κυτταρικές σειρές [8]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το αν TIG3 ρυθμίζει την επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου του δέρματος και την εξέλιξη του όγκου. Δείχνουμε ότι η έκφραση του TIG3 προκαλεί σημαντική μείωση στον αριθμό κυττάρων SCC-13 που σχετίζεται με μειωμένη G1 και εκδηλώσεις φάση S και αυξημένη περιεκτικότητα σε υπο-G1 DNA. Αυτές οι αλλαγές του κυτταρικού κύκλου που συνδέονται με TIG3 μεταβολές που εξαρτώνται από τον κυτταρικό κύκλο επίπεδο ρυθμιστικής πρωτεΐνης. έκφραση TIG3 μειώνει κυκλίνης D1 και τα επίπεδα κυκλίνης Ε και αυξάνει το επίπεδο του αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη ρ21. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με μια μείωση στην πρόοδο του κυτταρικού μέσω του G1 /S μετάβαση. Επιπλέον, δείχνουμε ότι TIG3 αυξάνει SCC-13 απόπτωση των κυττάρων όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη παραγωγή του ενεργοποιημένου κασπάσης 9 και 3 και αυξημένη διασπασμένη PARP. Επιπλέον, ανοσοχρώσης μελέτες αποκαλύπτουν διασπασμένης ΡΑΚΡ συσσωρεύεται στο TIG3-θετικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα είναι ιδιαίτερα ενδιαφέροντα ως TIG3 δεν προκαλεί απόπτωση σε φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα. Αντ ‘αυτού, TIG3 προκαλεί τα κύτταρα να υποστούν διαφοροποίηση [10] – [12]. Σε αντίθεση, μεταλλαγμένες μορφές της TIG3 προκαλούν απόπτωση σε φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα [12]. Το γεγονός ότι TIG3 προκαλεί απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα υποδηλώνει ένα διαφορετικό μηχανισμό δράσης σε κανονικά έναντι μετασχηματισμένων κυττάρων. Επιπλέον, ορισμένες από αυτές τις αλλαγές συνδέονται με αλλαγές στο επίπεδο του mRNA του γονιδίου-στόχου. Για παράδειγμα, η TIG3-εξαρτώμενη αύξηση στην πρωτεΐνη ρ21 συνδέεται με μια παράλληλη αύξηση στο mRNA p21 κωδικοποιεί, υποδεικνύοντας ότι TIG3 ρυθμίζει την μεταγραφή του γονιδίου p21 ή σταθερότητα του RNA. Δεν το παρόν γνωρίζω αν αυτή η δράση είναι άμεση ή έμμεση.

TIG3 έκφραση συνδέεται με pericentrosomal οργανίδιο clustering

Ένα σημαντικό ερώτημα είναι πού TIG3 εντοπίζεται στο κύτταρο. Μια ενδιαφέρουσα προηγούμενη μελέτη σε HeLa κύτταρα καρκίνου του τραχήλου υποδηλώνει ότι TIG3 εντοπίζεται στην cis και trans-Golgi και ότι αυτό εντοπισμός απαιτείται να διεγείρει απόπτωση [2]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, αντίσωμα συν-χρώση SCC-13 κύτταρα υποδηλώνει ότι TIG3 εντοπίζεται στην cis και trans-Golgi (GM130, M6RP), η καθυστερημένη ενδόσωμα (M6PR), το ενδόσωμα ανακύκλωση (rab11), το ενδοπλασματικό δίκτυο (καλνεξίνη) και τα ενδοκυτταρικά κυστίδια μεταφοράς (CHC). Ωστόσο, πιστεύουμε ότι είναι απίθανο ότι TIG3 κύριο λόγο εντοπισμένη σε αυτές τις δομές για πολλούς λόγους. Πρώτον, TIG3 εμφανίζεται μόνο για τον εντοπισμό με το οργανίδιο μόνο στο άμεσο περιβάλλον του κεντροσώματος και όχι περισσότερο περιφερικά. Δεύτερον, δείχνουμε ότι TIG3 μεταβάλλει μικροσωληνίσκων και διανομή μικρονημάτια και αυτό συνδέεται με τη συσσώρευση pericentrosomal οργανίδιο. Τρίτον, σε άλλη έκθεση μελετούμε την κατανομή των TIG3 σε φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα και οι μελέτες αυτές υποδεικνύουν έντονα μια pericentrosomal τοποθεσία TIG3 (δεν φαίνεται). Με βάση αυτά τα ευρήματα, που υποστηρίζουν ότι η κύρια επίδραση της TIG3 βρίσκεται στο κεντρόσωμα και ότι η εμφάνιση της colocalization της TIG3 με μαρκαδόρους οργανίδιο είναι ένα τεχνούργημα λόγω pericentrosomal οργανίδιο ομαδοποίηση.

Organelle μετεγκατάσταση είναι μια πολύ γνωστή φαινόμενο που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [45]. Θεωρείται για την ενίσχυση της μεμβράνης οργανίδιο ανάμειξης για τη διευκόλυνση της διάδοσης των προ-αποπτωτικών δραστών [45] – [50]. Ωστόσο, πώς αυτά τα οργανίδια και οργανιδίων θραύσματα έρχονται μαζί κατά τη διάρκεια της απόπτωσης δεν είναι πλήρως κατανοητή, αλλά πιστεύεται ότι περιλαμβάνει τη κεντροσωμάτων και μικροσωληνίσκους. Το κεντρόσωμα χρησιμεύει ως κέντρου οργάνωσης των μικροσωληνίσκων (MTOC) σε κύτταρα μεσόφαση και ως οργανωτής της μιτωτικής συσκευής μιτωτικά κύτταρα. Ως κέντρο φύτρων μικροσωληνίσκων, κεντροσωμάτων λειτουργία απαιτείται για ενδοκυτταρική διακίνηση οργανίδιο [24], [51]. Οργανίδια κινούνται κατά μήκος των μικροσωληνίσκων που συνδέονται με ειδικές πρωτεΐνες κινητήρα [27], [51]. Προηγούμενες εκθέσεις εμπλέκουν κινητήρων μικροσωληνίσκων σε φέρνοντας θραύσματα οργανίδιο και οργανίδιο στο οργάνωσης μικροσωληνίσκων κέντρο (κεντροσωμάτων) κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [45], [52]. Αυτές περιλαμβάνουν την συσκευή Golgi, ενδοσώματα, ενδοπλασματικό δίκτυο, μιτοχόνδρια και άλλα οργανίδια [45], [47], [53], [54]. Το καλύτερα χαρακτηρισμένο παράδειγμα είναι ανακατανομή των μιτοχονδρίων στο Golgi εγγύς οργάνωσης μικροσωληνίσκων κέντρο σε κύτταρα που εκτίθενται σε TNFa, το οξειδωτικό στρες ή ιογενή λοίμωξη [45]. Αρκετές αναφορές δείχνουν ότι η διαδικασία αυτή ενεργοποιεί ΜΑΡΚ σηματοδότησης να φωσφορυλιώνει κινεσίνη ελαφριά αλυσίδα για να σταματήσει μιτοχόνδρια προχωρητική διασποράς που οδηγούν σε συσσώρευση αυτών των οργανιδίων κοντά στο κεντρόσωμα [45].

Οι προηγούμενες αναφορές περιγράφουν pericentrosomal ομαδοποίηση οργανίδιο σε απόκριση σε θεραπεία με αυξητικούς παράγοντες, το οξειδωτικό στρες ή άλλα ερεθίσματα [45]. παρούσες μελέτες μας είναι μοναδικό στο ότι η ομαδοποίηση οργανιδίου ενεργοποιείται από την έκφραση μίας πρωτεΐνης καταστολής όγκου. Επιπλέον, το γεγονός ότι TIG3 συσσωρεύεται κοντά στο κεντρόσωμα δείχνει ότι μπορεί να έχει άμεσο ρόλο στη ρύθμιση της κυκλοφορίας οργανίδιο κατά την απόπτωση. Οι μελέτες μας αποκαλύπτουν ότι TIG3 παρουσία μεταβάλλει την κανονική υποκυτταρική τοποθεσία των μικροσωληνίσκων και μικρονηματίων, τα οποία μπορεί να είναι ένας μηχανισμός με τον οποίο μεταβάλλει τοποθεσία οργανίδιο. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να αντιμετωπίσουν το αν TIG3 αλλάζει επίσης μικροσωληνίσκων κινητήρα που εξαρτώνται από τη μεταφορά των οργανιδίων. υπόθεση εργασίας μας είναι ότι TIG3 μπορεί να μεταβάλει τόσο τη διανομή των μικροσωληνίσκων και κινητική λειτουργία των μικροσωληνίσκων που βασίζεται για να προκαλέσει pericentrosomal ομαδοποίηση οργανίδιο. Με βάση την ανάλυσή μας, TIG3 προάγει τη συσσώρευση των οργανιδίων στο κεντρόσωμα συμπεριλαμβανομένων ενδοπλασματικό δίκτυο, σύμπλεγμα Golgi, endosomes ανακύκλωσης, αργά ενδοσώματος, και κυστίδια μεταφοράς. Ωστόσο, δεν είναι όλα τα οργανίδια μεταφέρονται στο κεντρόσωμα. Για παράδειγμα, λυσοσώματα, όπως μετράται από την ανίχνευση του LAMP1, διανέμουν σε συστοιχίες κατά μήκος μικροσωληνίσκων και, σε TIG3-θετικά κύτταρα, αυτό το μοτίβο εντείνεται (δεν φαίνεται). Έτσι, πρόσθετες μελέτες θα πρέπει να κατανοήσουν το ρόλο της TIG3 στη ρύθμιση της λειτουργίας των μικροσωληνίσκων και τη μεταφορά οργανιδίων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αδενοϊό λοίμωξη

SCC-13 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD) και διατηρήθηκαν σε υψηλά γλυκόζης ϋΜΕΜ (Gibco, 11960-044) συμπληρωμένο με 2 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 5% ορό εμβρύου βοός (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Οι αδενοϊοί παρήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. tAd5-TIG3

1-164 είναι ένα που επάγεται από τετρακυκλίνη ιού που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη πλήρους μήκους TIG3 και ένα στοιχείο ενισχυτή τετρακυκλίνη αποκρίνονται [10], [11]. Ο ιός Ad5-TA κωδικοποιεί την διενεργοποιητή τετρακυκλίνης (TA). tAd5-EV είναι ένα άδειο ιός χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Για τη μόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν με 10 ΜΟΙ TIG3 κωδικοποίησης ή κενό ιό σε παρουσία 5 ΜΟΙ Ad5-TA σε ϋΜΕΜ που περιέχει 6 μg πολυβρένιο /ml (Sigma, H9268). Μετά από 5 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς ιούς και η επώαση συνεχίστηκε για επιπλέον 24-72 ώρες πριν από την προετοιμασία των κυττάρων και εκχυλίσματα για ανοσοϊστολογία και ανοσοστύπωμα.

ανοσολογικές μέθοδοι

Για ανοσοστυπώματος, εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, που περιέχει 150 mM NaCl, 1 mM αιθυλενογλυκόλη-δις (αμινοαιθυλαιθέρας) τετραοξικού οξέος, 1 mM EDTA, 1% Triton Χ-100, 2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM γλυκεροφωσφορικό, 1 mM βαναδικό νάτριο, 1 μg /ml λευπεπτίνη (Cell Signaling, 9803, Danvers, μΑ) και 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο. η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford Bio-Rad (Bio-Rad,