Αφηρημένο

microRNA-30c (miR-30c) έχει αναφερθεί ότι είναι ένας καταστολέας των όγκων σε καρκίνο του ενδομητρίου (ΕΚ). Έχουμε αποδείξει ότι miR-30c ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ΕΚ ιστό και εκφράζεται έντονα σε υποδοχέα οιστρογόνου (ER) -αρνητική HEC-1-Β κύτταρα. MiR-30c αναστέλλει άμεσα ΜΤΑ-1 έκφραση και λειτουργεί ως καταστολέας όγκου μέσω της οδού σηματοδότησης miR-30γ-ΜΤΑ-1. Επιπλέον, miR-30c μειώνεται κατά E

2 θεραπεία και στις δύο Ishikawa και ER αρνητικά HEC-1-Β κύτταρα ER-θετική. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το miR-30c είναι ένα σημαντικό απορυθμισμένη miRNA στην ΕΚ και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πιθανή βιοδεικτών και νέων θεραπευτικών στόχων για την ΕΚ

Παράθεση:. Κονγκ X, Xu Χ, Yan Υ, Guo F , Li J, Χου Y, et al. (2014) Τα οιστρογόνα Ρυθμίζει την Όγκων καταστολείς miRNA-30c και γονιδίου στόχου του, ΜΤΑ-1, σε καρκίνο του ενδομητρίου. PLoS ONE 9 (3): e90810. doi: 10.1371 /journal.pone.0090810

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27, Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 4 του Φλεβάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Κονγκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από έξι Talent σύνοδο κορυφής του έργου του γραφείου επαρχία Jiangsu Προσωπικού (ΝΔ-021). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ενδομητρίου (ΕΚ) είναι η πιο συχνή κακοήθης όγκος του γεννητικού συστήματος σε όλο τον κόσμο. Καρκίνου του ενδομητρίου περιλαμβάνει δύο διαφορετικές παθογενετικών υποτύπους. όγκοι τύπου Ι είναι χαμηλής ποιότητας που σχετίζεται με οιστρογόνο ενδομητριοειδές καρκίνους (ΕΟΚ) που αναπτύσσονται γενικά από πολύπλοκες και άτυπα ενδομητρίου υπερπλασίας σε περι-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Αντίθετα, οι όγκοι τύπου II είναι επιθετικοί μη ενδομητριοειδές καρκίνους (NEEC) που δεν σχετίζονται με τη διέγερση οιστρογόνου και ότι αναπτύσσονται από την ατροφική ενδομήτριο των ηλικιωμένων γυναικών. Οι διαφορές μεταξύ των δύο υποτύπων ΕΚ να οδηγήσει σε διαφορετική αντιμετώπιση και πρόγνωση [1].

Η σημασία των microRNAs (miRNAs), ένας τύπος του μη κωδικοποιητικού RNA, έχει αποδειχθεί σε καρκίνο. Τα γονίδια που κωδικοποιούν miRNAs θηλαστικών αρχικά μεταγράφεται ως πρωταρχικό miRNAs (PRI-miRNAs), τα οποία υποβάλλονται σε επεξεργασία από τις ενζυματικές συγκροτήματα Drosha και Dicer για να γίνει πρόδρομος miRNAs (προ-miRNAs) και ώριμη miRNAs [2]. Τα ώριμα miRNAs είναι περίπου 22 νουκλεοτιδίων μήκους, μονόκλωνα μόρια RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων τους ανακριβείς συμπλήρωση στο 3′-αμετάφραστες περιοχές (UTRs), 5′-UTRs, και ακόμη και ακολουθίες κωδικοποίησης των mRNAs να καταστείλει μετάφραση στα ζώα [2] – [5]. Το οιστρογόνο (Ε

2) και του υποδοχέα οιστρογόνων (ER) έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν miRNAs όπως miR-125a [6] και miR-429 [7] στη μήτρα ποντικού, miRNA-20α και miRNA-21 σε φυσιολογικό ενδομητρίου αδενικά επιθηλιακά κύτταρα [8], ας-7 οικογένεια, miR-27a, miR320 και miR-424 [9] στα κύτταρα ΕΚ, miR-104 [10], miR-7 [11], miR-21 [12], miR -30C και miR-103 [13] σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, miR-135b σε ορθοκολικό κύτταρα [14] και miR-203 σε αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα [15]. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι E

2 και το παιχνίδι ER σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των miRNAs.

Πρόσφατα, η απορρύθμιση των miR-30c έχει αναφερθεί όχι μόνο να είναι σχετικές με την καρκινογένεση και την εξέλιξη πολλών καρκίνους, όπως ΕΚ [16], [17], τον καρκίνο των ωοθηκών [18], [19], του καρκίνου του μαστού [20] – [23], ο καρκίνος του πνεύμονα [24], καρκίνωμα σαφής κύτταρο νεφρικών κυττάρων [25], γαστρικό καρκίνο [26], καρκίνος της ουροδόχου κύστης [27] και νευροβλάστωμα [28], αλλά επίσης και να παρουσιάζουν δυνητική διαγνωστική και προγνωστική επιπτώσεις, καθώς και για να αντιπροσωπεύουν ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο της χημείο- και radiotherapies για καρκίνους [18], [29], [ ,,,0],30]. Επί του παρόντος, η μετάσταση σχετιζόμενη γονίδιο-1 (ΜΤΑ-1) [17], KRAS [20], DLL4 [31], TWF1, βιμεντίνη [21], BCL9 [19], REDD1 [32], ΡΑΙ-1 [33] και CTGF [34] έχουν αναγνωριστεί ως στόχοι του miR-30c, και SERPINE1 [28], NYH11, GPRASP2 DDR2 [16], PPARGC1B, Makorin-3, UBAC1, PTPDC1 [22] snail1 [35], p53 [36] είναι πιθανοί στόχοι που μένει να επικυρωθεί. Επειδή miR-30c παρουσιάζει μια σχετική μείωση στην έκφραση από την κανονική ενδομητρίου σε άτυπη υπερπλασία με τον καρκίνο, και επειδή ο ρόλος του miR-30c στο ΕΚ παραμένει άγνωστη, πραγματοποιήσαμε μια έρευνα του ρόλου του miR-30c στο ΕΚ. προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι οι στόχοι miR-30c ΜΤΑ-1, η οποία εκφράζεται έντονα ΕΚ [37] και λειτουργεί ως καταστολέα όγκου σε κυτταρικές σειρές ΕΚ [17]. Ωστόσο, οι ακριβείς ρόλοι του miR-30c και ΜΤΑ-1 στο ΕΚ είναι ασαφείς. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε αυτή την εκτεταμένη μελέτη.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την έκφραση του miR-30c σε ιστούς ΕΚ και διαφορετικές κυτταρικές σειρές ΕΚ, διερευνήθηκε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ των miR-30c και ΜΤΑ-1, επικυρωμένη η όγκου λειτουργία καταστολής του miR-30c και διερεύνησε τη ρύθμιση του miR-30c σε κυτταρικές σειρές ΕΚ. Έτσι, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η λειτουργία καταστολής όγκου του miR-30c, η οποία θα καθορίσει την πιθανή αξία της ως νέο θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία της ΕΚ.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς και των ιστών δείγματα

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Nanjing Drum Tower Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Πανεπιστήμιο Nanjing. Τα άτομα της μελέτης είχαν προσληφθεί από τους ασθενείς στο Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας, Nanjing Drum Tower Νοσοκομείο, Nanjing University Medical School στο Nanjing, Κίνα. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται στη μελέτη. Όλα τα δείγματα που συλλέχθηκαν με ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών και επιβεβαιώθηκε από την παθολογική εξέταση. Όλοι οι ασθενείς υπέφεραν τύπου Ι ΕΚ και κανένας από αυτούς έλαβαν προεγχειρητική θεραπεία, όπως ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία. 21 πρωτογενή δείγματα ιστών όγκου ΕΚ ελήφθησαν από τους ασθενείς ΕΚ, και 14 δείγματα φυσιολογικού ενδομήτριου ιστού ελήφθησαν από γυναίκες που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή (λαπαροσκοπική ή κοιλιακό) για τη θεραπεία άλλων ασθενειών, όπως μύωμα ή πρόπτωση της μήτρας.

κυτταρικές σειρές ΕΚ και θεραπείες

κυττάρων

Ανθρώπινο ΕΚ Ishikawa ήταν ευγενική προσφορά από τον καθηγητή LHWei (Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Λαϊκού Νοσοκομείου, Κίνα), και HEC-1-Β αγοράστηκαν από την Συλλογή των κυττάρων της Σαγκάης (Shanghai, Κίνα). Τα κύτταρα Ishikawa καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle του Dulbecco (DMEM, Gibco, USA), και τα HEC-1-Β κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α Medium (Gibco, USA), και τα δύο από τα οποία έχει συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου βοός ( FBS, Gibco). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Για τον προσδιορισμό της ρύθμισης της Ε

2, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 17β-οιστραδιόλη (Ε

2, 10

-8 Μ και 10

-10 Μ, Sigma, USA) για 6, 12, 24 και 48 ώρες σε πλάκες των 6 φρεατίων. Ishikawa και HEC-1-Β κύτταρα συν-θεραπεία με τον ανταγωνιστή ER Fulvestrant (ICI 182780, 10

-8 Μ, Sigma, USA) και 10

-8 Μ ή 10

-10 ME

2 για 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα.

επιμόλυνση κυττάρων

Οι μιμείται (miR10000244) και αναστολέα (miR20000244) του miR-30c, μικρά παρεμβαλλόμενα RNA του ΜΤΑ-1 (Si- ΜΤΑ-1, si-h-MTA1_001) και των αντίστοιχων αγωνίζομαι ολιγονουκλεοτίδια τους, μιμείται-sc (miR01101), αναστολέα-sc (miR02101), sir-sc (siN05815122147), σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Guangzhou RiboBio (Guangzhou, Κίνα). Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη

TM 2000 (Invitrogen, USA) σε μέσο Opti-ΜΕΜ χωρίς αντιβιοτικά (Invitrogen, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή σε μια τελική συγκέντρωση 50 ηΜ. Για τους συνεπιμολύνσεις, χρησιμοποιήθηκαν 25 ηΜ εκάστου ολιγονουκλεοτιδίου. Ολικό RNA και οι πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για περαιτέρω ανάλυση. Μη επιμολυσμένα κύτταρα Ishikawa σε μέσο καλλιέργειας παρασκευάσθηκαν επίσης να χρησιμεύσουν ως εικονικές μάρτυρες.

ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

Ολικό RNA ιστών και κυττάρων εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA). Το RT αρχικό τεμάχιο stem-loop του miR-30c, εκκινητές του miR-30c, U6 και ΜΤΑ-1 για qRT-ΡΟΚ που περιγράφεται στο προηγούμενη μελέτη μας [17]. Του GAPDH, pri-miR-30c, και προ-miR-30c εκκινητές σχεδιάστηκαν ως εξής: GAPDH προς τα εμπρός αστάρι: TGAACGGGAAGCTCACTGG, GAPDH ανάστροφο εκκινητή: TCCACCACCCTGTTGCTGTA? pri-miR-30c πρόσθιο εκκινητή: GCCCAAGTGGTTCTGTGTTT, προ-miR-30c πρόσθιο εκκινητή: ACCATGCTGTAGTGTGTGTAAACA, και ανάστροφο εκκινητή pri-miR-30c /προ-miR-30c: TCCATGGCAGAAGGAGTAAA. cDNA συντέθηκε από ολικό RNA με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας την PrimeScript ™ RT Kit αντιδραστήριο (Takara, Dalian, Κίνα). Στη συνέχεια, qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SYBR PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-30c και ΜΤΑ-1 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το

-ΔΔCt μέθοδος ανάλυσης 2? τα επίπεδα του GAPDH και U6 χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για το ΜΤΑ-1 και miR-30c, pri-miR-30c, προ-miR-30c.

Western Blot

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ραδιοανοσοκατακρήμνισης δοκιμασίας (RIPA) ρυθμιστικό λύσης (Sigma, USA) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των συνολικών κυτταρικών κυτταρολυμάτων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Micro BCA (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, USA). Μία ίση ποσότητα (50 μα) του κάθε κυτταρικό λύμα αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ), τα οποία αποκλείστηκαν σε TBST με 10% μη-λιπαρά, γάλα σε σκόνη. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα έναντι ΜΤΑ-1 (1:500, Abcam, Cambridge, UK) και ένα δευτερεύον υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης αντίσωμα (1:5000, Bioworld Technology, USA). Οι πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος στη συνέχεια ανιχνεύεται με χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) σύστημα ανίχνευσης στύπωσης (Millipore, Billerica, ΜΑ). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η σχετική ένταση των ζωνών στόχος αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Ποσότητα One.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με χρήση 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο), άμεσα ή σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και επωάστηκαν για 24, 48, 72 και 96 ώρες, αντίστοιχα. Μετά την επώαση με 25 μΙ ΜΤΤ (5 mg /ml, Sigma, USA) στους 37 ° C για 4 ώρες, τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν, και 150 μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO, Sigma, USA) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η τιμή απορρόφησης (OD) του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε στα 490 nm. Για κάθε πειραματική συνθήκη, 6 φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν, και το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασία

μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία επούλωση της πληγής. Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν μέχρι συρροής. Τα τραύματα έγιναν χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας ρ10, και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS για να απομακρυνθούν τα συντρίμμια και αποσπασμένων κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για άλλες 24 ή 48 ώρες. Τα μεμονωμένα κενά παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε 0, 24 και 48 ώρες στην ίδια θέση του τραύματος.

προσδιορισμοί κυττάρων εισβολή διεξήχθησαν σε 24 καλά, επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμους εισβολή. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, 2 × 10

4 κύτταρα σε 0,2 ml ελεύθερο ορού-ϋΜΕΜ προστέθηκαν στα άνω θαλάμους (8-μm, Millipore), τα οποία καλύφθηκαν με 30 μΐ matrigel (BD Bioscience, San Jose , CA), και 0,6 ml 10% FBS-DMEM προστέθηκαν ως χημειοελκτικό στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες, μετά την οποία, τα μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν με μπατονέτες. Τα εισβάλλοντα κύτταρα βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε 5 τυχαία πεδία υψηλής ισχύος σε × 200 μεγέθυνση ανά φρεάτιο. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, USA). Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνουμε τις τιμές των δειγμάτων δοκιμής και ελέγχου. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας εξετάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε ως P & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Έκφραση of Mir-30c και ΜΤΑ-1 σε δείγματα ΕΚ και κυτταρικές σειρές

MiR-30γ αναφέρθηκε να παρουσιάζουν σχετικά μειωμένη έκφραση από την κανονική του ενδομητρίου να άτυπη υπερπλασία σε καρκίνο [16] και για να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου σε κυτταρικές σειρές ΕΚ [17]. Ωστόσο, καμία άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι miR-30c παίζει ένα ρόλο στην ΕΚ. Συνεπώς, ερευνήσαμε πρώτα την σχετική έκφραση του miR-30c μεταξύ των δειγμάτων ιστού σε αυτή τη μελέτη. Οι αναλύσεις μας qRT-PCR έδειξε ότι το miR-30c είναι σημαντικά μειωμένη σε δείγματα ΕΚ (Σχήμα 1Α.), γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-30c παίζει ρόλο στην εμφάνιση της ΕΚ.

(Α). MiR-30c μειώθηκε σε 21 δείγματα ΕΚ έναντι 14 ΝΕ δείγματα, όπως υποδεικνύεται από την ανάλυση qRT-PCR. Κάθε δείγμα αξιολογήθηκε εις τριπλούν. (ΣΙ). MiR-30c ήταν εντόνως εκφρασμένο σε HEC-1-Β κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα Ishikawa, όπως υποδεικνύεται από την ανάλυση qRT-PCR. (Γ) και (Δ). Η έκφραση του ΜΤΑ-1 ήταν μειωμένη σε HEC-1-Β κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα Ishikawa στο mRNA (C) και τα επίπεδα (D) πρωτεΐνη. Κάθε ράβδος αναπαριστά τις μέσες τιμές ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

Στη συνέχεια εκτιμήσαμε την έκφραση του miR-30c σε διάφορες κυτταρικές σειρές. ER-θετικά κύτταρα Ishikawa και ER αρνητικά HEC-1-Β κύτταρα αντιπροσωπεύουν μοντέλα τύπου Ι και τύπου II ΕΚ, αντίστοιχα. Μας ανάλυση qRT-PCR αποκάλυψε ότι miR-30c εκφράζεται έντονα σε HEC-1-Β κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα Ishikawa, από 1,79 φορές (Σχήμα 1Β.), Υποδηλώνοντας ότι η έκφραση του miR-30c συσχετίζεται με ER ή Ε

2. Στη συνέχεια, αξιολόγησε τα επίπεδα ΜΤΑ-1 έκφραση σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και διαπίστωσε ότι εκφράζεται έντονα σε κύτταρα Ishikawa, τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 1 C και 1 D). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ miR-30c και ΜΤΑ-1, σύμφωνα με το προηγούμενο συμπέρασμα μας είναι ότι το miR-30c στοχεύει ΜΤΑ-1.

Μεταβολή της έκφρασης miR-30c ρυθμίζει την έκφραση του στόχου του γονίδιο, ΜΤΑ-1, στα κύτταρα ΕΚ

Έχουμε ήδη αποδείξει ότι οι στόχοι miR-30c ΜΤΑ-1 μεταγραφές mRNA σε Ishikawa και κυτταρικές σειρές HEC-1-Β χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή. Να διευκρινίσει λεπτομερώς τη σχέση μεταξύ των miR-30c και ΜΤΑ-1, χρησιμοποιήσαμε miR-30c-μιμείται και miR-30γ-αναστολέα για την αποκατάσταση και τη μείωση της έκφρασης του miR-30c, αντίστοιχα. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε SIR-ΜΤΑ-1 έως knockdown ΜΤΑ-1 σε κύτταρα Ishikawa.

Η έκφραση του miR-30c σε κύτταρα Ishikawa ήταν πάνω ρυθμισμένα με 23,14 φορές και ρυθμισμένα προς τα κάτω από 0.043 φορές με επιμόλυνση με miR-30c-μιμείται και miR-30c-αναστολέα, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α). Μετά επαρκή αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, βρήκαμε ότι η ΜΤΑ-1 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη όταν αποκαταστάθηκε miR-30c και ότι η μείωση του miR-30c επάνω ρυθμισμένη έκφραση ΜΤΑ-1 (Σχήμα 2Β).

(Α) . Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης των κυττάρων Ishikawa αξιολογήθηκε με qRT-PCR στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του miR-30c-μιμείται και miR-30c-αναστολέα, που δείχνεται ως πτυσσόμενο αλλαγές σε σχέση με τους ελέγχους τους κωδικοποιημένα. (ΣΙ). έκφραση πρωτεΐνης ΜΤΑ-1 αξιολογήθηκε με ανάλυση κηλίδας Western σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-30c-μιμείται, miR-30c-αναστολέα και κωδικοποιημένα τους ελέγχους τους. (ΝΤΟ). Συμμετασκευή με αναστολέα miR-30c, Sir-ΜΤΑ-1 και κωδικοποιημένα ελέγχους τους διεξήχθη, και η έκφραση πρωτεΐνης ΜΤΑ-1 αξιολογήθηκε με ανάλυση Western blot. (Δ και Ε). Sir-ΜΤΑ-1 μειώνει την έκφραση ΜΤΑ-1 στο mRNA (D) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Ε) στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. (ΦΆ). ανάλυση QRT-PCR δείχνει μια αύξηση στην έκφραση miR-30c μετά ΜΤΑ-1 έκφραση αναστέλλεται. Κάθε ράβδος αναπαριστά τις μέσες τιμές ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

Σε πειράματα αντιμόλυνση, βρήκαμε ότι ο αναστολέας miR-30c και Sir-ΜΤΑ-1 έπαιξε ανταγωνιστικό τρόπο με τον κανονισμό ΜΤΑ-1 (Εικ 2C). Μαζί με την παρατήρηση ότι ο σερ-ΜΤΑ-1 suppresseed την έκφραση του ΜΤΑ-1 τόσο στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2D και 2Ε), πιστεύουμε ότι miR-30c πράγματι αρνητικά ρυθμίζονται ΜΤΑ-1. Είναι ενδιαφέρον ότι η καταστολή της ΜΤΑ-1 έκφρασης από τον Sir-ΜΤΑ-1 είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του miR-30c (Σχήμα 2 F).

Στο σύνολό τους, επιβεβαιώσαμε ότι το miR-30c κατασταλεί άμεσα ΜΤΑ-1 έκφραση και ότι μια ανάδραση βρόχου είναι παρούσα μεταξύ τους. Αν και οι περισσότερες μελέτες για να διερευνήσει τη συγκεκριμένη υποκείμενος μηχανισμός ρύθμισης ανάδρασης-βρόχο τους, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι το miR-30c θα μπορούσε να λειτουργήσει με την παρεμπόδιση ΜΤΑ-1 στο ΕΚ.

MiR-30c ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε ΕΚ

Όπως προηγούμενη μελέτη μας έδειξε, η έκτοπη έκφραση του miR-30c μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΕΚ, τη μετανάστευση και εισβολή [17]. Εδώ, θα παρέχονται περαιτέρω στοιχεία για να επιβεβαιώσει αυτές τις επιδράσεις στα κύτταρα Ishikawa. Η έκτοπη έκφραση του miR-30c ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε μία δοκιμασία ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των επιμολυσμένων καταστάλθηκε (Σχήμα 3Α) και σχετικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό μειώθηκε στις 72 και 96 ώρες μετά τη διαμόλυνση (Σχήμα 3Β). Από την άποψη της μετανάστευσης και της εισβολής, πραγματοποιήσαμε μια επούλωση των πληγών και έναν προσδιορισμό transwell. Η επιμόλυνση του miR-30c-μιμείται μειωμένη μετανάστευση και εισβολή σε σύγκριση με την μιμείται-sc, όπως φαίνεται στο Σχ 3C και 3D. Από την άλλη πλευρά, οι ικανότητες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή ενισχύθηκαν μετά τις κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-30c-αναστολέα (Σχήμα 3Α-3D).

(Α). Μια δοκιμασία ΜΤΤ δείχνει ότι μιμείται miR-30c κατέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (άνω), ενώ αναστολέας miR-30c προωθείται η βιωσιμότητα των κυττάρων (κάτω). (ΣΙ). MiR-30γ-μιμείται μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σχέση (άνω), ενώ miR-30γ-αναστολέα αυξάνει σε σχέση πολλαπλασιασμού των κυττάρων (κατώτερο), αντιστοίχως στις 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. (ΝΤΟ). Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες του προσδιορισμού επούλωση της πληγής που δείχνει το μεταναστευτικών ικανότητα των επιμολυσμένων κυττάρων σε 0, 24 και 48 ώρες μετά τον τραυματισμό. (ΡΕ). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της κυτταρικής εισβολής σε μια δοκιμασία φρεατίων. Ο μέσος αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε από 5 τυχαία μικροσκοπικά πεδία (Χ 200). Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές ± SD της σχετικής κυτταρικής εισβολής. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

Έτσι, μεταβλητή έκφραση του miR-30c προκάλεσε διαφορετικές επιδράσεις στα κακοήθη χαρακτηριστικά των κυττάρων Ishikawa. Πιστεύουμε ότι miR-30c δρα ως καταστολέας όγκου επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων ΕΚ.

λειτουργίες MiR-30c ως καταστολέας όγκου μέσω της-1 miR-30γ-MTA μονοπάτι σηματοδότησης

προσδιορίστηκε προηγουμένως ότι οι στόχοι miR-30c ΜΤΑ-1, το οποίο υπερεκφράζεται σε ΕΚ [37] και το οποίο δρα ως ένα ογκογονίδιο σε πολλούς ανθρώπινους όγκους [38], [39]. Ωστόσο, η λειτουργία του ΜΤΑ-1 σε ΕΚ παρέμεινε απροσδιόριστη. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν λειτουργεί miR-30c μέσω της οδού σηματοδότησης miR-30γ-ΜΤΑ-1. Καταστολή της ΜΤΑ-1 του Sir-ΜΤΑ-1 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Ishikawa, όπως υποδεικνύεται από τα αποτελέσματα ΜΤΤ μας (Εικόνα 4Α). Επιπλέον, η απώλεια της ΜΤΑ-1 μείωσε επίσης την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, όπως υποδεικνύεται από την επούλωση των πληγών μας και επικοινωνούντα αποτελέσματα της ανάλυσης (Σχ 4Β και 4C). Αυτά τα ευρήματα αποκάλυψαν ότι ΜΤΑ-1 παίζει ένα προ-ογκογόνο ρόλο σε κύτταρα ΕΚ ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων Ishikawa. Επειδή miR-30c μπορεί να καταστείλει άμεσα την έκφραση του ΜΤΑ-1, και επειδή ΜΤΑ-1 είναι ένα ογκογονίδιο σε ΕΚ, πιστεύουμε ότι οι λειτουργίες miR-30c ως καταστολέας όγκου με στόχευση ΜΤΑ-1.

(Α ). Μία δοκιμασία ΜΤΤ δείχνει η βιωσιμότητα των κυττάρων (αριστερά) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σχέση (δεξιά) έχουν κατασταλεί με επιμόλυνση SIR-ΜΤΑ-1 στις 72 και 96 ώρες. (ΣΙ). Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες του προσδιορισμού επούλωση της πληγής δείχνουν την μεταναστευτικά ικανότητα των επιμολυσμένων κυττάρων σε 0, 24 και 48 ώρες μετά τον τραυματισμό. (ΝΤΟ). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της κυτταρικής εισβολής σε μια δοκιμασία φρεατίων. Ο μέσος αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε από 5 τυχαία μικροσκοπικά πεδία (Χ 200). Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές ± SD της σχετικής κυτταρικής εισβολής. (Δ) και (Ε). Συνδιαμόλυνση του miR-30c-αναστολέα και Sir-ΜΤΑ-1? συνδιαμόλυνση του miR-30c-αναστολέα και Sir-sc χρησίμευσε ως μάρτυρας. (ΡΕ). Σε σύγκριση με την επιμόλυνση ελέγχου, η βιωσιμότητα των κυττάρων (άνω) και η σχετική κυτταρικού πολλαπλασιασμού (κατώτερο) κατεστάλη στις 96 ώρες. (ΜΙ). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της κυτταρικής εισβολής σε μια δοκιμασία φρεατίων. Ο μέσος αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε από 5 τυχαία μικροσκοπικά πεδία (Χ 200). Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές ± SD της σχετικής κυτταρικής εισβολής. Οι σχετικές διαφορές πολλαπλασιασμού των κυττάρων μεταξύ των ομάδων εμφανίστηκε στις 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

Για την επέκταση της μελέτης μας, συνεπιμολύνθηκαν miR-30c-αναστολέα και Sir-ΜΤΑ-1 σε κύτταρα Ishikawa και διαπίστωσε ότι η μείωση του ΜΤΑ -1 εξασθενημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή διαμεσολαβείται από miR-30γ-αναστολέα σε σύγκριση με τον έλεγχο-επιμολυσμένα ομάδα (Σχ 4D και 4Ε). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η λειτουργία miR-30c εξαρτάται από το ΜΤΑ-1 και επικύρωσε την ύπαρξη του miR-30γ-ΜΤΑ-1 μονοπάτι σηματοδότησης.

Το οιστρογόνο ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του miR-30c στα κύτταρα ΕΚ

Έχοντας αποδείξει την ικανότητά κατασταλτική του όγκου του miR-30c, είμαστε δίπλα διερευνήθηκε η ρύθμιση του miR-30c. Η διαφορά στην έκφραση miR-30c μεταξύ ER-θετικά κύτταρα Ishikawa και ER αρνητικά HEC-1-Β κύτταρα υποδηλώνει ότι E

2 και ER μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της miR-30c. Έτσι, ερευνήσαμε κατά πόσο οι αλλαγές έκφραση του miR-30c κατόπιν E

2 θεραπεία.

Σε σύγκριση με το μάρτυρα, η έκφραση του miR-30c ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε ένα χρόνο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στις 6, 12, 24 και 48 ώρες μετά την 10

-8 Μ και 10

-10 ME

2 θεραπεία της ER-θετικών κυττάρων Ishikawa (Σχήμα 5Α). Οι αλλαγές στην έκφραση του miR-30c που προκαλείται από Ε

2 θεραπεία ήταν εν μέρει αντιστράφηκε από ταυτόχρονης θεραπείας με ICI182780 στα κύτταρα Ishikawa (Σχήμα 5Β). Εκτός από την Ε

2 θεραπεία επαγόμενης καταστολή του miR-30c, PRI-miR-30c και προ-miR-30c επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω (Σχήμα 5C), υποδεικνύοντας ότι Ε

2-ER μπορεί να αναστείλει η μεταγραφή του miR-30c στα κύτταρα Ishikawa.

(Α). MiR-30c μειώθηκε κατά την κατεργασία με 10

-8 Μ και 10

-10 Μ Ε

2 στις 6, 12, 24 και 48 ώρες μετά την αγωγή με ανάλυση qRT-PCR σε κύτταρα Ishikawa. Η θεραπεία με 10

-8 Μ Ε

2 ασκείται μια πιο σημαντική αναστολή εκτός από 48 ώρες. (ΣΙ). 10

-8 Μ ICI182780 αντιστραφεί μερικώς τη μείωση των επιπέδων του miR-30c που προκαλείται από τη θεραπεία με 10

-8 Μ και 10

-10 Μ Ε

2 σε 24 ώρες μετά ταυτόχρονης θεραπείας σε κύτταρα Ishikawa. (ΝΤΟ). επίπεδα προ-miR-30c μειώθηκαν κατά E

2 θεραπεία τόσο στο HEC-1-Β κύτταρα (επάνω) Ishikawa και. επίπεδα-30c Pri-miR μειώθηκαν κατά E

2 θεραπεία σε Ishikawa, αλλά όχι στο HEC-1-Β κύτταρα (κάτω). (ΡΕ). επίπεδα MiR-30c μειώθηκαν κατά 10

-8 Μ και 10

-10 ME

2 θεραπεία στις 6, 12, 24 και 48 ώρες μετά την αγωγή με ανάλυση qRT-PCR σε HEC-1-Β κύτταρα . Το αποτέλεσμα των δύο συγκεντρώσεις διέφεραν σε 12 ώρες μετά τη θεραπεία. (ΜΙ). 10

-8 Μ ICI182780 δεν ανέστρεψε τη μείωση των επιπέδων του miR-30c που προκαλείται από τη θεραπεία με 10

-8 Μ και 10

-10 ME

2 σε 48 ώρες μετά ταυτόχρονης θεραπείας στο HEC-1 -Β κύτταρα. (ΦΆ). Η θεραπεία με 10

-8 ME

2 επάνω ρυθμισμένη έκφραση mRNA του ΜΤΑ-1 σε αμφότερα τα κύτταρα Ishikawa και HEC-1 κύτταρα σε 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα, μια επίδραση που αντιστράφηκε με ταυτόχρονης θεραπείας με 10

-8 Μ ICI182780 στα κύτταρα Ishikawa (επάνω), αλλά όχι τα HEC-1-Β κύτταρα ((κάτω) (* Ρ & lt?. 0.05, ** P & lt?. 0.01)

η

Ωστόσο , βρήκαμε ότι E

2 επίσης μειωμένα επίπεδα έκφρασης miR-30c σε ER-αρνητικά HEC-1-Β κύτταρα (Σχ 5D). ήταν αναμενόμενο ότι η αναστολή της έκφρασης miR-30c από Ε

αγωγής 2 ήταν δεν εμποδίζεται από ICI182780 στο HEC-1-Β κύτταρα (Σχήμα 5Ε). Διαφορετικά από τα κύτταρα Ishikawa, Ε

2 μειώνεται μόνο την έκφραση των προ-miR-30c, αλλά δεν pri-miR-30c στο HEC-1-Β κύτταρα (Σχήμα 5C), υποδεικνύοντας ότι Ε

2 θα πρέπει να παρεμποδίζουν την ωρίμανση του miR-30c σε ένα ER-ανεξάρτητο τρόπο.

Επιπλέον, το Ε

2 επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του ΜΤΑ-1 mRNA σε τόσο Ishikawa και HEC-1-Β κύτταρα, μια επίδραση που αντιστράφηκε με ICI182780 σε κύτταρα Ishikawa μόνο σε επιλεγμένη συγκέντρωση και την ώρα (Σχήμα 5F). Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε σε μείωση του miR-30c που προκαλείται από τη θεραπεία με E

2 ή τον άλλο από ακόμα αγνώστων μονοπατιού σηματοδότησης.

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι E

2 αντιπροσωπεύει ένα ρυθμιστικός παράγοντας για την έκφραση του miR-30c, η οποία λειτουργεί σε αμφότερες τις ER-εξαρτώμενα και ER-ανεξάρτητης τρόπους. Ωστόσο, ο ακριβής υποκείμενη μοριακό μηχανισμό με τον οποίο E

2 ρυθμίζει την έκφραση του miR-30c απαιτεί περαιτέρω λεπτομερείς μελέτες.

Συζήτηση

Η απελευθέρωση των miRNAs στον καρκίνο μπορεί να προάγουν την αγγειογένεση, την ανάπτυξη πλεονέκτημα, εισβολή ιστού και μετάσταση. Όμως, η κατανόηση της παρεκκλίνουσας έκφρασης και το δυναμικό τους ρόλους των miRNAs στον καρκίνο παραμένει περιορισμένη. MiR-30c, ένα μέλος της οικογένειας των miR-30, έχει δειχθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ΕΚ σε μικροσυστοιχία αναλύσεις [16] και στον καρκίνο του μαστού [23] σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς αλλά επάνω ρυθμισμένη στον καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με καλοήθη ή οριακά όγκοι των ωοθηκών [18] και σε μεσοθηλίωμα κύτταρα [29]. MiR-30c μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως μια πιθανή βιοδείκτη λόγω απορρύθμισης της σε διαφορετικούς υποτύπους και κακοήθεις όγκους στάδια, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [21], τον καρκίνο των ωοθηκών [18] και το μεσοθηλίωμα [28], [29]. Επιπλέον, η αυξημένη έκφραση του miR-30c συσχετίζεται με ευνοϊκή πρόγνωση και κλινική αποτελεσματικότητα της θεραπείας με ταμοξιφαίνη στον καρκίνο του μαστού [22], καθώς και μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σαφή κυττάρων νεφρικού καρκινώματος [25], αλλά χειρότερη επιβίωση σε κακόηθες μεσοθηλίωμα [29] και χημειοθεραπευτικά αντίσταση στον καρκίνο του πνεύμονα [24]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε σχέση με τον ρόλο της miR-30c σε χημειοθεραπευτική αντοχή στον καρκίνο των ωοθηκών, Eitan et al. και Sorrentino et al. έχουν κάνει αντίθεση συμπεράσματα [40], [41]. Οι αμφιλεγόμενες διαπιστώσεις σχετικά με miR-30c επιβεβαιώνουν τον σημαντικό ρόλο της στην ογκογένεσης και της εξέλιξης, ανεξάρτητα από την ακριβή εμφάνιση όγκων ή όγκων κατασταλτικό χαρακτήρα της.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε περαιτέρω τον ρόλο του miR-30c στο ΕΚ. Βρήκαμε ότι miR-30c ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε δείγματα ΕΚ σε σχέση με τα κανονικά δείγματα, όπως υποδεικνύεται από την ανάλυση qRT-PCR, σύμφωνα με την προηγούμενη ανάλυση μικροσυστοιχιών με Boren κ.ά. [16]. Δυστυχώς, δεν είχαμε αρκετές περιπτώσεις να εκτιμούν την απορρύθμιση της έκφρασης miR-30c μεταξύ των διαφορετικών υποτύπων και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. μελλοντικές μελέτες μας θα έχει ως στόχο να αποσαφηνίσει το θέμα αυτό. Παρ ‘όλα αυτά, βρήκαμε ότι η έκφραση miR-30c ήταν υψηλότερη σε ER-αρνητική κυτταρική σειρά, υποδηλώνοντας ότι miR-30c θα μπορούσε να συσχετιστεί με E

2 και ER, καθώς επίσης και με ειδικούς υποτύπους του ΕΚ.

να επεκτείνει προηγούμενη μελέτη μας, εξετάσαμε σε βάθος τη σχέση μεταξύ miR-30c και ΜΤΑ-1. Προηγουμένως, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή που απέδειξε την 3′-UTR του ΜΤΑ-1 στοχεύονται από miR-30c. Επιπλέον, δείξαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-30c μειωμένη έκφραση ΜΤΑ-1 σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης στα δύο Ishikawa και HEC-1-Β κύτταρα [17]. Εδώ, όχι μόνο αποκαθίσταται, αλλά επίσης μείωσε την έκφραση του miR-30c και αξιολόγησε τις προκύπτουσες αλλαγές στη ΜΤΑ-1. Χρησιμοποιήσαμε κύτταρα Ishikawa μόνο σε αυτή τη μελέτη, επειδή miR-30c λειτούργησε το ίδιο και στις δύο κυτταρικές σειρές σε προηγούμενη μελέτη μας. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι συνεπείς με αυτές της προηγούμενης μελέτης μας, και διαπίστωσε επίσης ότι ο Sir-ΜΤΑ-1 και ο αναστολέας miR-30c εργαστεί σε ένα ανταγωνιστικό τρόπο. Όπως διαπιστώσαμε την άμεση καταστολή της ΜΤΑ-1 από τον Sir-ΜΤΑ-1, ήμασταν σε θέση να συμπεράνουμε μια λειτουργική σχέση μεταξύ του miR-30c και ΜΤΑ-1. Αξίζει να σημειωθεί ότι, εντοπίσαμε επίσης μια ανάδραση βρόχου όπου η καταστολή της ΜΤΑ-1 αυξημένα επίπεδα miR-30c, ένα φαινόμενο ανάδρασης που συνέβη επίσης με miR-145 και το γονίδιο του στόχου, Oct4 [42]. MiR-30c είχε προηγουμένως αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο σε καταστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, μετάσταση και αντοχής φαρμάκου με στόχευση BCL9 [19], TWF1, βιμεντίνη [21] και KRAS [20]. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαίωσε ότι το miR-30γ-ΜΤΑ-1 σηματοδοτικό μονοπάτι αποτελεί ένα λειτουργικό μηχανισμό με τον οποίο miR-30c καταστέλλει ΕΚ. Ωστόσο, Mirs συνήθως εργάζονται στη ρύθμιση των πολλαπλών στόχων και δεν θα μπορούσε να πει ότι δεν υπάρχει άλλη οδός σηματοδότησης που εργάζονται με miR-30c στο ΕΚ.

Επί του παρόντος, η ρύθμιση των miRNAs είναι ένα θέμα που έχει συγκεντρώσει η αύξηση προσοχή. Ογκονάσης [43], Λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) [19], και ο EGF και μετεωρολογικές υποδοχείς [24] έχει αναφερθεί ότι διαμορφώνουν την έκφραση του miR-30c. Λαμβάνοντας υπόψη τη διαφορική έκφραση του miR-30c μεταξύ των κυτταρικών σειρών ER-θετική και ER-αρνητικό ΕΚ που χρησιμοποιούνται στη μελέτη μας και τη σχέση μεταξύ ΕΚ και Ε

2, επιλέξαμε να εξετάσουμε E

2 ως υποψήφιος ρυθμιστής της έκφραση του miR-30c.

στην ΕΚ, miR-206 [44] και το Let-7 οικογένεια miRNAs [9] συσχετίζονται με E είτε με

2 και ER στόχευσης ΕΡα ή με το να υπόκεινται σε διαφοροποίηση από Ε

2. Η διαμόρφωση των miRNAs από Ε

2-ER έχει οριστικά αποδειχθεί [45]. Yamagata et al [6] έδειξε ότι ΕΚα, δεν ΕΚβ, που ανέστειλαν την ωρίμανση των miRNAs εμποδίζοντας την PRI-miRNA-to-pre-miRNA μετατροπής. Αυτή η αλληλεπίδραση συμβαίνει σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο μέσω της ένωσής τους με Drosha και ρ68 /ρ72, το οποίο μπορεί να ενεργοποιηθεί με E

2. Ωστόσο, ακόμη και με την απουσία του Ε

2, μια φυσική σύνδεση μεταξύ ΕΚα και Drosha εξακολουθεί να εμφανίζεται, πιθανώς αντιπροσωπεύοντας για την καταστολή του miR-30c στα κύτταρα Ishikawa σύγκριση με τα HEC-1-Β κύτταρα που παρατηρήσαμε σε αυτό μελέτη. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι ΕΡα κατασταλεί η έκφραση του miR-140 στο μεταγραφικό επίπεδο μέσω σύνδεσης με ένα συγκεκριμένο στοιχείο υποκινητή (-79 /-50) του miR-140 [10]. Εκτός από την ΕΡα, ΕΚβ [14] και Dicer [13] είχαν επίσης αναφερθεί ότι είναι σημαντικό από την άποψη της Ε

2 στη ρύθμιση των miRNAs. Παρ ‘όλα αυτά, όλα αυτά τα αποτελέσματα προήλθαν από κύτταρα του μαστού MCF-7. Έτσι, προτείνουμε ότι οι περαιτέρω μηχανιστικών μελετών σε κύτταρα ΕΚ ήθελε.

Η μελέτη μας έδειξε ότι E

2 αρνητικά ρυθμίζεται miR-30c και προκαλείται από το γονίδιο-στόχο της, ΜΤΑ-1, στα κύτταρα ΕΚ, ένα κανονιστικό επίδραση που είχε επίσης εκτεθεί από miR-140 και το γονίδιο του στόχου, SOX2, σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [10]. Η επαγωγή της ΜΤΑ-1 από Ε

2 σε κύτταρα ΕΚ θα μπορούσε να αποδοθεί στη μείωση των miR-30c ή να κατευθύνει διέγερση από Ε

2, οι οποίες απαιτούν περαιτέρω μελέτες.

Αντίθετα, μια μελέτη έχει δείξει ότι miR-30c ρυθμίζεται προς τα πάνω από την E

2 σε ER-θετικό καρκίνο του μαστού MCF-7cells [13], αποδεικνύοντας των διαφόρων μηχανισμών διαμορφωτική με τους οποίους E

2 ρυθμίζει miR-30c σε διαφορετικά καρκινικά κύτταρα.