Αφηρημένο

Ο ψευδάργυρος νουκλεάσες δακτύλων (ZFN) αποτελούν ισχυρά εργαλεία για την επεξεργασία των γονιδίων στα κύτταρα. Εδώ χρησιμοποιούμε ZFNs να ανακρίνει τη βιολογική λειτουργία του

ADPGK

, το οποίο κωδικοποιεί μια εξαρτώμενη από ΑϋΡ γλυκοκινάση (ADPGK), σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η υπόθεση που δοκιμάσαμε είναι ότι ADPGK χρησιμοποιεί ADP να φωσφορυλιώνει γλυκόζη κάτω από συνθήκες όπου ΑΤΡ καθίσταται περιοριστικό, όπως υποξία. Εμείς χαρακτηρίζεται δύο κλώνους ZFN νοκ-άουτ σε κάθε μία από τις δύο γραμμές (Η460 και HCT116). Και οι τέσσερις κλώνοι είχαν μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε όλα τα αλληλόμορφα στη θέση στόχο στο εξόνιο 1 του

ADPGK,

και ήταν ADPGK-null με ανοσοκηλίδωση.

ADPGK

νοκ-άουτ είχαν μικρή ή καθόλου επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αλλά σε κίνδυνο την ικανότητα των κυττάρων Η460 για να επιβιώσουν siRNA αποσιώπηση του εξοκινάσης-2 υπό όξινες συνθήκες, με κλωνογόνο επιβίωση πέφτουν από 21 ± 3% για την γονική γραμμή προς 6,4 ± 0,8% (ρ = 0,002) και 4,3 ± 0,8% (ρ = 0.001) για τις δύο knockouts. Μια παρόμοια αυξημένη ευαισθησία σε κλωνογόνο θανάτωση των κυττάρων παρατηρήθηκε κάτω από ανοξία. Κανένα τέτοιο βρέθηκαν αλλαγές όταν

ADPGK

χτυπήθηκε έξω σε κύτταρα HCT116, για την οποία η γονική γραμμή ήταν λιγότερο ευαίσθητο από Η460 σε ανοξία και εξοκινάση-2 αποσιώπηση. Ενώ knockout του

ADPGK

σε κύτταρα HCT116 που προκαλούνται μερικές αλλαγές στην παγκόσμια γονιδιακής έκφρασης, knockout του

ADPGK

σε κύτταρα Η460 προκάλεσε αξιοσημείωτη πάνω ρύθμιση του mRNA που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες κυτταρικής πρόσφυσης. Παραδόξως, θα μπορούσαμε να διακρίνουμε καμία συνεπή επίδραση στην γλυκόλυση, όπως μετράται από την κατανάλωση γλυκόζης ή γαλακτικό σχηματισμό κάτω από ανοξία, ή εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (αναλυτή Seahorse XF) κάτω από όξινες συνθήκες σε μια ποικιλία μέσων. Ωστόσο, τα ποσοστά κατανάλωσης οξυγόνου ήταν γενικά χαμηλότερες στους

ADPGK

knockouts, σε ορισμένες περιπτώσεις σημαντικά τόσο. Συλλογικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το

ADPGK

μπορεί να συμβάλλει στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων κάτω από συνθήκες υψηλής γλυκόλυσης εξάρτηση, αλλά ο φαινότυπος που προκύπτει από την νοκ-άουτ του

ADPGK

είναι κυτταρική σειρά που εξαρτάται και δεν φαίνεται να σχετίζεται με πλήρωση της γλυκόλυσης σε αυτές τις γραμμές

Παράθεση:. Richter S, Morrison S, Connor Τ, Su J, Εκτύπωση CG, Ronimus RS, et al. (2013) δακτύλου ψευδαργύρου Nuclease διαμεσολαβούμενη Knockout της ADP-Εξαρτημένων γλυκοκινάσης στον Καρκίνο Κυτταρικές Γραμμές: Επιδράσεις στην Επιβίωση κυττάρων και μιτοχονδριακού οξειδωτικό μεταβολισμό. PLoS ONE 8 (6): e65267. doi: 10.1371 /journal.pone.0065267

Επιμέλεια: Mark Isalan, Κέντρο Genomic κανονισμού, Ισπανία

Ελήφθη: 5 του Μάρτη του 2013? Αποδεκτές: 23 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 14, Ιουνίου, 2013

Copyright: © 2013 Richter et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Royal Society της Νέας Ζηλανδίας Ταμείου Marsden (www.royalsociety.org.nz/programmes/funds/marsden/). SLM υποστηρίζεται από ένα Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Συμβούλιο Έρευνας (NHMRC) Career Development Fellowship και επιδότηση σχεδίου από το NHMRC (1027226 και 1027227). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο προσδιορισμός του μεγάλου αριθμού των υποψηφίων γονιδίων μέσω της γονιδιωματικής ανάλυσης έχει δημιουργήσει μια πιεστική ανάγκη για νέες προσεγγίσεις για αποδίδουν βιολογική λειτουργία. Εξαιρετικά ακολουθία νουκλεάσες ειδικής ψευδαργύρου-δακτύλου (ZFN) έχουν χρησιμότητα για στοχευμένη επεξεργασία γονιδίων σε ζωντανά κύτταρα [1] – [6] και είναι μία από τις αναδυόμενες λειτουργικά εργαλεία γονιδιωματικής για την εξερεύνηση των σχέσεων γονότυπο /φαινότυπο. Συγκεκριμένα, διμερή ZFNs ικανά να αναγνωρίζουν 18-42 αλληλουχιών ζεύγους βάσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή θραύσεων διπλής έλικος DNA σε μοναδικές θέσεις στο γονιδίωμα. Αυτά τα διαλείμματα του DNA ξεκινήσει επιρρεπής σε λάθη μη-ομόλογο τέλος ενώνει επισκευής για τη δημιουργία site-specific, ετερογενή μεταλλάξεις (κυρίως μικρές indels που διαταράσσουν τη λειτουργία του γονιδίου) ή, με την παρουσία μιας αλληλουχίας DNA δότη, για την εισαγωγή καθορισμένων μεταλλάξεων μέσω ομολογία-σκηνοθεσία επισκευής . Πρόσφατες μελέτες επιβεβαιώνουν την υψηλή εξειδίκευση ακολουθία ειδικά σχεδιασμένα ZFNs στα κύτταρα [7] – [10].

Εδώ χρησιμοποιούμε ZFN τεχνολογία για να ανακρίνουν την βιολογική λειτουργία ενός ανθρώπινου γονιδίου,

ADPGK

, το οποίο κωδικοποιεί ένα ADP-εξαρτώμενη γλυκοκινάσης (ADPGK). Παραδόξως, δεδομένου εκτεταμένη έρευνα της φωσφορυλίωσης της γλυκόζης ως το κεντρικό αντίδραση ενδιάμεσο μεταβολισμό για πολλές δεκαετίες [11], ADPGK θηλαστικού ανακαλύφθηκε μόλις πρόσφατα, μέσω της αλληλουχία παρόμοια με αρχαιοϊστονών εξαρτώμενη από ΑϋΡ glucokinases [12]. Φυλογενετική ανάλυση υποδηλώνει το προγονικό γονίδιο πλευρικά μεταφέρθηκε από Αρχαία νωρίς μεταζώων εξέλιξη [12]. Το καθαρισμένο ανασυνδυασμένο ποντικού [12] και την ανθρώπινη [13], έχουν ένζυμα έχουν επιβεβαιωθεί ότι φωσφορυλιώνει γλυκόζη, με το ασυνήθιστο χαρακτηριστικό (όπως για τα αρχαιοϊστονών enyzmes [14]) ότι ο δότης φωσφορυλ είναι ADP σε αντίθεση με το καλά μελετηθεί ΑΤΡ-εξαρτώμενη σπονδυλωτά ισομορφές εξοκινάση (HK1-4). Ποντικού ADPGK είναι αρκετά ειδικό για γλυκόζη, με μικρότερο ικανότητα να φωσφορυλιώνουν μαννόζη και φρουκτόζη (20% και 10% αντίστοιχα του ρυθμού με γλυκόζη)? έχει μια χαμηλή φαινόμενη Κ

Μ τόσο για τη γλυκόζη (96 μΜ) και ADP (260 μΜ), και αναστέλλεται από υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης και με το προϊόν της ΑΜΡ αλλά, σε αντίθεση HK1-4, όχι από γλυκόζη-6- φωσφορικό άλας. Ο βιολογικός ρόλος των ευκαρυωτικών ADPGKs δεν είναι καλά κατανοητός? οθόνες RNAi στο

C. elegans

και HeLa κύτταρα δεν έχουν εντοπίσει ένα φαινότυπο [15] – [17], αν και μια πρόσφατη αναφορά κατέδειξε ένα ρόλο ADPGK σε υποδοχέα Τ-κυττάρου σηματοδότηση μέσω διοχέτευσης γλυκολυτικής ροής για το διαστημικό λεωφορείο αφυδρογονάση γλυκερόλης-3-φωσφορικής , με αποτέλεσμα τη διέγερση του μιτοχονδριακού παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) [18]. Ωστόσο, οι βιοχημικές ιδιότητες του ADPGK, ιδιαίτερα η ικανότητά του να χρησιμοποιεί ADP, μας οδήγησε να υποθέτουν ότι μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην εκκίνηση γλυκόλυση υπό συνθήκες στρες όπου ΑΤΡ καθίσταται περιοριστικό [12], όπως κάτω από υποξία όταν τα κύτταρα εξαρτώνται από γλυκολυτικά άκρως ΑΤΡ γενιάς [19].

Λόγω της σημασίας της φωσφορυλίωσης της γλυκόζης στο μεταβολισμό του όγκου, θα επικεντρωθεί εδώ σχετικά με το ρόλο των ADPGK σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται γλυκόλυση υψηλά, όπως παρατηρήθηκε για πρώτη φορά από τον Otto Warburg κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1920 [20], [21], και η σχετική επαναπρογραμματισμό μεταβολικές Πρόσφατα έχει προταθεί ως μια πιθανή σήμα κατατεθέν του καρκίνου [22]. Ειδικότερα, αυξημένα γλυκολυτικής ροής σε κύτταρα όγκου θεωρείται ότι παρέχει ενδιάμεσα για αναβολικές οδούς και για την αύξηση της αντιοξειδωτικής άμυνας μέσω δημιουργίας NADPH μέσω της φωσφορικής πεντόζης μονοπάτι [23], [24]. Έκφραση εξοκινάσες είναι συχνά επάνω ρυθμισμένη σε καρκινικά κύτταρα ως μέρος αυτής της μεταβολικής διακόπτη [25]. ADPGK εκφράζεται έντονα σε ανθρώπινους όγκους και κυτταρικές γραμμές όγκου, τόσο στο επίπεδο του mRNA και της πρωτεΐνης, αν και υπάρχει μικρή ένδειξη πάνω ρύθμιση σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς και (σε ​​αντίθεση με πολλά γλυκολυτικά ένζυμα) δεν ρυθμίζεται προς τα πάνω με ανοξία, υποξία ή HIF-1 σε κυτταρικές καλλιέργειες όγκου και παρουσιάζει μικρή εξάρτηση από την εξωκυτταρική συγκέντρωση γλυκόζης [13]. Ωστόσο, δεδομένου ότι η αντιμετώπιση καταστάσεων έκτακτης ανάγκης σε εξάντληση του ΑΤΡ θα τοποθετηθεί πιο γρήγορα από ένα συστατικά εξέφρασε ένζυμο, η έλλειψη ρύθμισης των

ADPGK

έκφρασης από υποξία δεν αποκλείει έναν ρόλο στην έναρξη γλυκόλυση υπό αυτές τις συνθήκες.

η αρχική μας προσπάθεια να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση εξετάστηκε η επίδραση της καταστολής

ADPGK

έκφραση, με και χωρίς καταστολή της πρωτείνης hK2, σε HCT116 και κυτταρικές σειρές ανθρώπινου όγκου Η460 χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA [13]. Αυτή η μελέτη έδειξε υψηλότερη έκφραση mRNA και πρωτεΐνης τόσο ADPGK και HK2 σε Η460 παρά σε κύτταρα HCT116, αλλά δεν απέδειξε σημαντική επίδραση στην αναερόβια γλυκόλυση (κατανάλωση γλυκόζης και τον σχηματισμό γαλακτικού), ή σε κλωνογονική επιβίωση των κυττάρων με βάση βραχυπρόθεσμη ανοξίας σε οποιαδήποτε γραμμή , αν και μια μικρή μείωση στην αερόβια ικανότητα επίστρωσης των κυττάρων Η460 φάνηκε όταν

ADPGK

χτυπήθηκε κάτω [13]. Ωστόσο, η αναστολή της

ADPGK

έκφραση ήταν ελλιπής σε αυτή τη μελέτη (συνήθως μείωση ~60-90% σε πρωτεΐνες που υποδεικνύεται από κηλίδωση Western), αυξάνοντας το ερώτημα ως προς το αν υπολειμματική δράση ADPGK μπορεί να καλυφθεί το φαινότυπο.

στην παρούσα μελέτη θα παρακάμψει την ελλιπή αποσιώπηση του

ADPGK

με τη χρήση ειδικών ZFNs για την πραγματοποίηση πολλαπλών αλληλομόρφων μεταλλάξεων αδρανοποίηση του γονιδίου, δημιουργώντας ADPGK-null Η460 και κυττάρων HCT116 γραμμές. Το ζεύγος των ZFNs χρησιμοποιείται εδώ στοχεύουν σε ένα γονιδίωμά μοναδική αλληλουχία αναγνώρισης ζεύγος 37 βάσεων μέσα στο πρώτο εξώνιο του

ADPGK

γονίδιο. Δύο ανεξάρτητες

ADPGK

-null κλώνους με επιβεβαιωμένη πλαισίου μεταλλάξεις που παράγονται σε κάθε γενετικό υπόβαθρο. Αυτοί οι κλώνοι χαρακτηρίστηκαν σε σχέση με τον πολλαπλασιασμό, κλωνογονική επιβίωση και γλυκολυτικής ροής υπό αερόβιες και αναερόβιες συνθήκες. Εξωκυτταρική οξίνιση (ως μέτρο της γλυκόλυσης) και μιτοχονδριακή κατανάλωση οξυγόνου μετρήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας αναλυτή Seahorse XF. Τέλος, η ικανότητα αυτών των κυτταρικών γραμμών να αναπτύσσονται ως ξενομοσχεύματα όγκου, και η σταθερή κατάσταση αναλογία των υποξικών κυττάρων στα προκύπτοντα όγκους, συγκρίθηκαν με γονικών γραμμών.

Αποτελέσματα

Δημιουργία

ADPGK

-null γραμμές κυττάρων χρησιμοποιώντας ZFNs

ADPGK

ήταν νοκ άουτ σε δύο γενετικό υπόβαθρο (HCT116 και Η460) χρησιμοποιώντας CompoZr ™ ZFNs ειδικά σχεδιασμένα για να εισαγάγει διπλό σκέλος διαλείμματα στο ένα γονιδιωματικά μοναδική θέση στόχο στο πρώτο εξώνιο του

ADPGK

γονίδιο (Σχήμα 1Α). Η ικανότητα των ZFNs να εισαγάγει μεταλλάξεις σε αυτήν την περιοχή ελέγχθηκε σε κύτταρα HCT116 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανίχνευσης μετάλλαξης Surveyor ™ (Σχήμα 1Β), μετά λιπίδιο που βασίζονται συν-επιμόλυνση με ένα πλασμίδιο GFP και FACS διαλογής 24 ώρες αργότερα για τον εμπλουτισμό για επιμολυσμένα κύτταρα . Μια περιοχή 473 bp που περιβάλλει τη θέση κοπής ZFN ενισχύθηκε με PCR και τα προϊόντα ήταν μετουσιωμένα και την εκ νέου ανόπτηση για να δημιουργήσει αναντιστοιχία φυσαλίδες σε θέσεις κοπής ZFN. CEL-ΙΙ νουκλεάσης [26] διάσπαση της αναντιστοιχίας φούσκες οδήγησε στις προβλεπόμενες προϊόντων (256 και 217 bp) για διάσπαση στη θέση στόχο. Band πυκνομετρία της εικόνας στο Σχήμα 1Β έδειξε ότι η αναλογία των αθροίζονται προϊόντων διάσπασης με τη γονική ζώνη ήταν 66% (0,399 /0,601) για την ZFN επεξεργασμένο DNA παρέχεται από τον κατασκευαστή (λωρίδα 2) και 68% (0,403 /0,597) για κύτταρα ZFN επιμολυσμένα HCT116 (λωρίδα 4) σε αυτό το πείραμα, δείχνοντας μια υψηλή συχνότητα θέσεως-ειδικές μεταλλάξεις. Σε μεταγενέστερα πειράματα, ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιήθηκε αντί του μετεμβολιασμού βάση λιπίδιο για την περαιτέρω αύξηση της αποτελεσματικότητας μορφομετατροπής.

(Α) Χαρακτηριστικά της

ADPGK

γονίδιο, με την τοποθεσία του ζεύγη εκκινητών και η διμερής ZFN στόχευσης τοποθεσία. (Β) PCR /CEL-ΙΙ νουκλεάση (Surveyor) δοκιμασία για την ανίχνευση μετάλλαξης στη θέση στόχο ZFN. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με ένα ζεύγος ADPGK ZFNs και ένα πλασμίδιο GFP. Μία ημέρα αργότερα γονιδιωματικό DNA παρασκευάστηκε από ομαδοποιήθηκαν FACS ταξινομημένα GFP θετικά κύτταρα για την δοκιμασία (λωρίδα 4). Διαδρομή 1: DNA σκάλα. Διαδρομή 2: θετικός μάρτυρας DNA από ADPGK ZFN-επεξεργασμένα κύτταρα Κ562. Διαδρομή 3: Μη επεξεργασμένα κύτταρα HCT116. κύτταρα (C) ADPGK ZFN επεξεργασμένο HCT116 κλωνοποιούνται και ελέγχονται για

ADPGK

με κηλίδα western. (Δ) Το γονιδιακό DNA αντιγραφή αριθμό από qPCR για ζεύγη εκκινητών CNV1-3. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται σε σχέση με WT DNA το οποίο έχει δύο

ADPGK

αλληλόμορφα. (Ε) αλληλουχίας σε όλη την περιοχή αναγνώρισης ZFN (προβλεπόμενη θέση κομμένα σε μικρά γράμματα) οδήγησε σε διαγραφές (-) και παρεμβολές (υπογραμμισμένη) για

ADPGK

-null HCT116 κλώνους C3 και IC10. Ο συναχθεί αριθμός αντιγράφων για κάθε αλληλόμορφο δείχνεται.

Η

Οι κλώνοι που απομονώθηκαν από

ADPGK

ZFN επεξεργασμένου πληθυσμοί υποβλήθηκαν σε διαλογή με ανοσοστύπωση για την απουσία του χαρακτηριστική ζώνη 54-kDa ADPGK. Δύο υποψήφια knockouts (HCT116 C3 και IC10) χωρίς ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη ADPGK (Σχήμα 1C) ταυτοποιήθηκαν από δύο διαφορετικές γύρους διαμόλυνσης (C3 από τον έλεγχο του 12 κλώνων μετά τον εμπλουτισμό FACS, και IC10 από 131 κλώνους μετά την ηλεκτροδιάτρηση χωρίς ροή διαλογή χρησιμοποιώντας συνθήκες οι οποίες έδωσε αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης από ~ 70% με τη χρήση ενός πλασμιδίου GFP), υποδεικνύοντας μία χαμηλή συνολική συχνότητα bi-αλληλόμορφης knockout με αποτέλεσμα την πλήρη απώλεια της ανοσοανιχνεύσιμη πρωτεΐνης. Ένα υψηλότερο ποσοστό των κλώνων φάνηκε να εμφανίσουν μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης ADPGK (τα δεδομένα δεν φαίνονται), πιθανώς λόγω μεταλλάξεων απενεργοποιήσεως ενός μόνο αλληλόμορφου. Για να ελέγξετε αν η χαμηλή συχνότητα των null γραμμές (2/143 κλώνοι) αντανακλά μειωμένη επιβίωση ή τον πολλαπλασιασμό σε bi-αλληλομόρφων knockouts, ακολουθήσαμε τη συχνότητα των μεταλλάξεων σε ένα ZFN-επιμολυσμένα πισίνα HCT116 χρησιμοποιώντας το Surveyor (PCR /CEL-II νουκλεάση) χημική δοκιμή. Τα 256 και 217 bp ζώνες μειωθεί πάνω από δύο εβδομάδες σε καλλιέργεια (Σχήμα S1 Α), αν και μια παρόμοια μείωση σε βάθος χρόνου παρατηρήθηκε με ένα ξεχωριστό ζευγάρι ZFN στόχευση του 8

ου εξόνιο του

POR

(Σχήμα S1B) , το οποίο κωδικοποιεί NADPH? κυτοχρώματος Ρ450 οξειδοαναγωγάση. POR-null κλώνοι HCT116 απομονώθηκαν σε υψηλότερη συχνότητα (3/14) με τη χρήση του

POR

ζευγάρι ZFN. Έτσι, η προοδευτική απώλεια του

ADPGK

και

POR

μεταλλάξεις είναι πιο πιθανό να αντανακλά μειωμένη πολλαπλασιασμού /επιβίωσης των κυττάρων με τα υψηλότερα αριθμό αντιγράφων του πλασμιδίου μετά την επιμόλυνση.

Αριθμό

Αντιγραφή στο η

ADPGK

γονίδιο εκτιμήθηκε για τις δύο ADPGK null κλώνους (C3 και IC10) με qPCR χρησιμοποιώντας ζεύγη εκκινητών που πλευρίζουν την αλληλουχία-στόχο ZFN (CNV2 και 3) και ένα άλλο που αναγνωρίζει το εξόνιο 7 (CNV1) & gt? 31 kb μακριά (Σχήμα 1 D). Αυτό έδειξε την παρουσία δύο αντίγραφα του

ADPGK

στα knockouts, όπως και για τη μητρική γραμμή (σύμφωνα με το Πρόγραμμα Sanger Cancer Genome? Www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/cghviewer /CghViewer.cgi), εκτός από μια ενιαία περιοχή αντίγραφο κοντά στο στόχο ZFN αναφέρουν σε HCT116 κλώνο C3. Αλληλούχιση κατά μήκος της θέσης στόχο ZFN του γενωμικού DNA από αυτούς τους κλώνους null καταδεικνύεται μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε δύο (Σχήμα 1 Ε). Αυτές οι μετατοπίσεις πλαισίου δημιουργούν πρόωρα κωδικόνια στοπ με αποτέλεσμα προβλεπόμενη κολοβωμένες πρωτεΐνες των 75 και 84 αμινοξέα, έχει έλλειψη του πεδίου κινάσης ADP βρίσκεται μεταξύ των αμινοξέων 52 και 497 της ισομορφής πλήρους μήκους (www.uniprot.org), και έτσι αναμένεται να είναι καταλυτικά αδρανής. Το εύρημα ενός μόνο μεταλλαγμένο (και όχι WT) αλληλουχία για τον κλώνο 1C10, σε συνδυασμό με έναν αριθμό αντιγράφων από δύο στο CNV2 και 3, υποδεικνύει ομόλογο ανασυνδυασμό με το αρχικό ZFN επαγόμενη μετάλλαξη ως μήτρα είχε ως αποτέλεσμα μείωση σε ομοζυγωτία. HCT116 C3 παρέχεται επίσης μία μόνο αλληλουχία στη θέση-στόχο ZFN, αλλά ο αριθμός αντιγράφων του ένα σε CNV2 και 3 πρότεινε μια μεγάλη διαγραφή. Αυτό επιβεβαιώθηκε από την ενίσχυση και αλληλούχιση μια εκτεταμένη περιοχή, εντοπίζοντας ένα 2963 διαγραφή εκτείνονται τις τοποθεσίες CNV2 και CNV3 (Εικόνα S2).

Η επιμόλυνση των κυττάρων Η460 με το ίδιο

ADPGK

ZFN πλασμίδια απέδωσε καμία

ADPGK

-null κλώνους από τον έλεγχο ασφαλείας των 127 κλώνων μετά nucleofection μόνο και διαλογή των 24 κλώνων μετά nucleofection και τον εμπλουτισμό FACS. Αυτή η χαμηλή απόδοση μπορεί να αντανακλά την παρουσία τριών

ADPGK

αλληλόμορφα σε Η460 (Sanger Cancer Genome έργου), η οποία επιβεβαιώσαμε με τον προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων qPCR με βάση (Σχήμα S3). Δύο κλώνοι έδειξαν μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης ADPGK (ID5 και VD6? Εικόνα 2Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να φέρει μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, επομένως υποβλήθηκαν σε ένα δεύτερο γύρο μορφομετατροπής ZFN (ηλεκτροδιάτρηση και FACS), παρέχοντας 5/121 κλώνοι χωρίς ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη ADPGK από οποίων δύο επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση (IID10 από ID5 και IIE5 από VD6) (Εικόνα 2Α). προσδιορισμός αριθμός αντιγραφής (Σχήμα 2Β), σε συνδυασμό με ανάλυση αλληλουχίας της θέσης στόχου ZFN (Σχήμα 2C) έδειξε μία μετάλλαξη υποκατάστασης ομόζυγη πλαισιοτροποποιητικού ένωση διαγραφής /βάση για τον κλώνο Η460 IIE5 δίνοντας μια προβλεπόμενη κολοβωμένη πρωτεΐνη 89 αμινοξέων. Ο κλώνος IID10 είχε ένα 62-bp διαγραφή σε τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο, πιθανώς δημιουργώντας μια πρωτεΐνη των 62 αμινοξέων, ενώ το άλλο αλληλόμορφο (-α) φέρει μια σειρά από επαναλήψεις ενός τμήματος του DNA προς τα κάτω από τη θέση κοπής ZFN, τα οποία δεν ήταν πλήρως εξακριβωμένα.

(Α) Western blots των κυττάρων Η460 μετά από επιμόλυνση με ADPGK ZFNs (κλώνοι ID5 και VD6), και

ADPGK

-null κλώνων που προέρχονται από αυτά σε ένα δεύτερο γύρο των ZFN επιμόλυνσης (IID10 και IIE5). (Β) Το γονιδιακό DNA αντιγραφή αριθμό από qPCR για ζεύγη εκκινητών CNV1-3. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται σε σχέση με WT DNA το οποίο έχει τρεις

ADPGK

αλληλόμορφα. (C) αλληλουχίας σε όλη την περιοχή κοπής ZFN δείχνει διαγραφές (-). Και παρεμβολές (υπογραμμισμένη) για το

ADPGK

αλληλόμορφα σε Η460 κλώνους IID10 και IIE5

Η

Διάδοση και ικανότητας κλωνισμού των

ADPGK

Knockout τηλέφωνα γραμμές

Οι ADPGK-null κυτταρικές σειρές και από τις δύο γενετικό υπόβαθρο έδειξε παρόμοιους χρόνους διπλασιασμού στις γραμμές WT όταν καλλιεργούνται υπό κανονικές συνθήκες αερόβιας καλλιέργειας κυττάρων (Εικόνα 3Α και Β), με πιθανή μικρή μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για τη γραμμή HCT116 IC10. Μορφολογία αποικίας με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης ήταν επίσης παρόμοια με τα γονικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3C και D) αν και τα Η460 IID10 κύτταρα ήταν κάπως πιο επιρρεπείς σε στρογγυλοποίηση και αποσπώντας από το τρυβλίο.

(Α /Β). Η πυκνότητα των κυττάρων μετά τη σπορά πλάκες 24 φρεατίων σε 10

5 /ml. Οι τιμές είναι μέση τιμή και SEM για καλλιέργειες εις τριπλούν. (CD). μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (10 χ μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού) του WT και κλώνων knockout σε φιάλες Τ.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω πολλαπλασιασμό, κυτταρικές σειρές HCT116 και Η460 καλλιεργήθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση για 54 και 72 ώρες, αντίστοιχα, και τον αριθμό των κυττάρων, τον όγκο των κυττάρων, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου και κλωνογονικότητας μετρήθηκε (Πίνακας 1). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές για HCT116 C3 σε σύγκριση με WT? ωστόσο, μια διπλάσια αύξηση σε κύτταρα G1 φάση παρατηρήθηκε για HCT116 IC10, συνεπής με τη μείωση του πολλαπλασιασμού προαναφέρθηκε. Επιμετάλλωση αποδοτικότητα ήταν παρόμοια και για τις τρεις HCT116 κυτταρικές γραμμές, αλλά η πιο αργή εξάπλωση των HCT116 IC10 αντικατοπτρίστηκε σε μία σημαντικά μειωμένη ακτίνα αποικίας. Τόσο Η460

ADPGK

-null κλώνους έδειξε μια μικρή αλλά σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων, καθώς και μια μικρή αύξηση της G2 φάσης κύτταρα /M. Επιπλέον, Η460 IID10 είχαν αυξημένο μέσο όγκο κυττάρων και έδειξε μία τάση προς μειωμένη αποτελεσματικότητα απλώματος καθώς και μειωμένη ακτίνα αποικίας, πιθανώς λόγω της απόσπασης των κυττάρων από τις αποικίες. Συνολικά, τα αποτελέσματα δείχνουν μια μικρή επίδραση στον πολλαπλασιασμό, αλλά αυτό δεν ήταν ένα σταθερό εύρημα σε όλη την κυτταρικές σειρές και κλώνους.

Η

Παγκόσμια Gene Expression στο

ADPGK

-null Lines

για να διερευνηθεί αν νοκ-άουτ του

ADPGK

επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση, δύο

ADPGK

-null κλώνους (HCT116 C3 και Η460 IIE5) με παρόμοια πολλαπλασιασμό και τη μορφολογία των αποικιών με τη γονική τους γραμμές επιλέχθηκαν για μικροσυστοιχιών ανάλυση χρησιμοποιώντας Affymetrix Human Gene 1.0 ST μικροσυστοιχίες. Ενιαία πολιτισμών των HCT116 C3

ADPGK

-null γραμμή και γονικών κυττάρων HCT116 συγκρίθηκαν σε ένα πρώτο πείραμα, και εις διπλούν πολιτισμών των δύο ζεύγη HCT116 και Η460 σε ένα δεύτερο πείραμα.

Το μεταγραφικό του

ADPGK

-null γραμμή HCT116 C3 φαίνεται να είναι σε μεγάλο βαθμό παρόμοια με εκείνη της γραμμής WT HCT116 (Σχήμα 4Α) και δεν διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφές εντοπίστηκαν όταν το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη ελέγχθηκε σε 5% από την Benjamini μέθοδο -Hochberg. Ενώ αυτή η ανάλυση έδειξε ότι ο αριθμός των φαινομενικά διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφές δεν ήταν μεγαλύτερη από την αναμενόμενη οφείλεται στην τύχη, παραμένει πιθανό ότι μικροί αριθμοί μεταγραφών mRNA μπορεί να είναι αυθεντικά ρυθμιζόμενη ακόλουθη

ADPGK

γονίδιο αδρανοποίησης σε κύτταρα HCT116. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη για αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων γλυκολυτικών πλην εμφανή μείωση κατά 2 φορές της μεταφοράς γλυκόζης

SLC2A3

. Περιέργως όμως, μέσα στις κορυφαίες 22 ομάδες ανιχνευτών (Πίνακας S1), αντίγραφα από οκτώ γονίδια Υ-χρωμόσωμα ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στη γραμμή νοκ-άουτ. Για τη σύγκριση του καρυοτύπου του HCT116 C3 με τη γραμμή WT, διαπιστώσαμε ότι η τελευταία περιέχει έναν υποπληθυσμό των κυττάρων διατηρώντας ένα χρωμόσωμα Υ, ενώ η γραμμή HCT116 C3 (και η γραμμή HCT116 1C10) περιλαμβάνει μόνο ένα καρυότυπο λείπει το χρωμόσωμα Υ (Πίνακας S2 ). Έτσι, η ρύθμιση προς τα κάτω των μεταγραφών Υ-χρωμόσωμα μπορεί να είναι ένα τεχνούργημα που προκύπτουν από κλωνική επιλογή ενός Υ-minus παραλλαγή.

RNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Affymetrix Human Gene Scatterplot 1,0 ST μικροσυστοιχίες (Α) δείχνει μέσες τιμές έκφρασης για HCT116 C3 έναντι WT (3 καλλιέργειες καθένα). (Β) Scatterplot δείχνουν μέσες τιμές έκφρασης για Η460 IIE5 έναντι WT (2 πολιτισμούς το καθένα). (C) Heat χάρτη των 50 κορυφαία διαφορικά εκφρασμένων σετ καθετήρα εις διπλούν καλλιέργειες Η460 WT και Η460 IIE3. (D) qPCR του RNA από κυτταροκαλλιέργειες 3 επαναληπτικές καθένας για Η460 WT και

ADPGK

νοκ-άουτ κλώνους IIE5 και IID10, κανονικοποιημένη έναντι 18S rRNA.

Η

Knockout του

ADPGK

σε Η460 (κλώνος IIE5) προκάλεσε μια εμφανώς μεγαλύτερη μεταβολή στην έκφραση του γονιδίου (Εικόνα 4Β). Πιο συγκεκριμένα ο ανιχνευτής οριστεί για cadherin 11 (

CDH11

) σημαντικά μειώθηκε, από 150 φορές, το Η460 IIE5 (p = 0.03). Κανένα άλλο διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφές εντοπίστηκαν όταν το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη ελέγχθηκε σε 5% με τη μέθοδο Benjamini-Hochberg, μια συντηρητική στατιστικό όριο που είναι κατάλληλη όταν υπάρχουν τόσο λίγες επαναλήψεις. Παρ ‘όλα αυτά, σχεδιάζοντας τις διαφορές έκφραση των top-κατετάγη 50 σετ καθετήρα σε heatmap δείχνει μια ορατή αλλά όχι στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ WT Η460 γραμμή και οι IIE5 Η460 νοκ-άουτ τον κλώνο των διπλών καλλιεργειών (Σχήμα 4C). Ενώ δεν υπήρχε καμία ένδειξη για τις αλλαγές στην αφθονία της γλυκόλυσης mRNA, δύο mRNAs που κωδικοποιούν ρυθμιστές του κυτταρικού μεταβολισμού φάνηκε να εκφράζονται διαφορικά ακριβώς κάτω από το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας (

PPARGC1A

, 3 φορές μειωτικά? Και

ΑΚΤ3

, 2,7 φορές απορυθμίζεται). Καντερίνες 2, 6 και 10 ήταν επίσης εκφράζονται διαφορικά & gt? 2,5-φορές, αλλά κάτω από το επίπεδο σημαντικότητας. Τα κορυφαία 150 σετ καθετήρα από Η460 (Πίνακας S3) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση με το εργαλείο γονίδιο οντολογία DAVID ([27]? https://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp). Κοντά στο 50% των γονιδίων εισόδου συσχετίστηκαν με την πλασματική μεμβράνη και προβλέπεται να είναι γλυκοζυλιωμένη, το 20% ήταν εντοπισμένες στον εξωκυτταρικό χώρο και -16% σχετίστηκαν με προσκόλληση κυττάρου (Πίνακας S4). Ανάλυση χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανάλυσης μονοπάτι GeneSetDB [28] αποκάλυψε επίσης ότι οι κορυφαίες 150 σετ καθετήρα από Η460 κύτταρα εμπλουτίζεται σημαντικά (p ≤ 0,05) για Γονιδιακή Οντολογία (GO, https://www.geneontology.org/) κατηγορίες «adherens διασταύρωση οργάνωση» και «συναρμολόγησης διασταύρωση των κυττάρων», καθώς και για τις Reactome (https://www.reactome.org/) μοριακή κατηγορίες μονοπάτι της «adherens κόμβους αλληλεπιδράσεις» και «Κυττάρου οργάνωση διασταύρωση».

προκειμένου να επιβεβαιωθεί η καταστολή του mRNA για cadherin 11 και άλλα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης που φάνηκε να είναι διαφορικά εκφρασμένων εξής

ADPGK

νοκ-άουτ (

NCAM2

,

L1CAM

και

CDH2)

, την έκφρασή τους ποσοτικά με qPCR σε Η460 WT και τόσο η

ADPGK

-null κλώνους IIE5 και IID10 (Σχήμα 4D).

ADPGK

mRNA επίσης ποσοτικά με qPCR, και έδειξε χαμηλή αφθονία μεταγραφή στους μεταλλαγμένους κλώνους συνεπής με τις ανοησίες μεσολάβηση αποσύνθεσης. Έκφραση του

CDH11

έντονα καταστέλλεται στο

ADPGK

knockouts (& gt? 10.000 φορές σε Η460 IIE5 και -200 φορές σε Η460 IID10).

NCAM2

και

L1CAM

RNA μειώθηκαν στο εύρος των 30 έως 40 φορές και 3 έως 4 φορές, αντίστοιχα, σε αμφότερα τα

ADPGK

-null κλώνους.

CDH2

μειώθηκε μόνο σε Η460 IIE5 (περίπου 1000 φορές). Αντίθετα, αυτή η καταστολή των

CDH11, NCAM2 και LICAM

δεν ανιχνεύθηκε όταν

ADPGK

χτυπήθηκε κάτω στο ~ 80% των επιπέδων WT με siRNA (Σχήμα S4) γεγονός που υποδηλώνει ότι η πλήρης απώλεια του γονιδίου λειτουργία μπορεί να απαιτείται για αυτό το φαινότυπο.

Επίδραση του

ADPGK

νοκ-άουτ για επιβίωση κυττάρων και τη γλυκόλυση σε HK2 εξαντλημένο κύτταρα και Under ανοξία και υποξία

Οι παραπάνω μελέτες έδειξαν μικρή αν οποιαδήποτε επίδραση της

ADPGK

νοκ-άουτ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή επίστρωση απόδοσης (κλωνογενοποιήσεως) υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης. Ως εκ τούτου, δοκιμάζονται αν ADPGK θα μπορούσε να συμβάλει στην κυτταρική επιβίωση, όταν η φωσφορυλίωση της γλυκόζης περιορίζεται από τη θεραπεία με

HK2

siRNA, ή όταν γλυκολυτικό η ζήτηση αυξάνεται με αυστηρά αναερόβιες συνθήκες (6-h ανοξία). Μια ημέρα μετά την επιμόλυνση του Η460 WT, IIE5 και IID10 με

HK2

siRNA ή ελέγχου GC-συμφωνημένα siRNA,

HK2

knockdown όπως μετρήθηκε με qPCR ήταν στο εύρος 70-80% (Σχήμα 5Α ). Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση με siRNA ελέγχου, οι αριθμοί των κυττάρων κλώνων knockout δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από την WT, αν και ένα μικρό τάση προς μειωμένη πολλαπλασιασμός παρατηρήθηκε για Η460 IID10 όπως παραπάνω (Σχήμα 5Β).

HK2

siRNA μείωσε σημαντικά τους αριθμούς των κυττάρων σε WT καλλιέργειες σε σχέση με τον έλεγχο siRNA, και οι δύο κλώνοι knockout έδειξε μια μικρή αλλά σημαντική περαιτέρω μείωση στον αριθμό των κυττάρων σε σύγκριση με το

HK2

siRNA αγωγή WT (σχήμα 5Β) . Επιμετάλλωση απόδοση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με siRNA ελέγχου, σημείωσε 10 ημέρες μετά την εκ νέου επίστρωση κυττάρων, μειώθηκε επίσης για τη γραμμή IID10 (~ 50% του ότι για Η460 WT), αλλά όχι για IIE5 (Σχήμα 5C).

HK2

χτυπήθηκε κάτω από siRNA σε δύο ανεξάρτητα πειράματα, συνδυάζεται εδώ, καθένα από τα οποία περιλαμβάνονται τρεις βιολογικούς επαναλήψεις για WT και δύο για κάθε κλώνο νοκ-άουτ. (Α) mRNA HK2 με qPCR μία ημέρα μετά την επιμόλυνση siRNA. (ΣΙ). Ο αριθμός των κυττάρων δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA, κατά τον οποίο τα κύτταρα απλώνονται εκ νέου χρόνο για κλωνογονική δοκιμασία. αποτελεσματικότητας (Γ) επιμετάλλωση δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο siRNA. (D) Επίδραση

HK2

siRNA επί κλωνογόνων κλάσμα επιζώντα δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, σε σχέση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA. (Ε) Επίδραση 6 ώρες ανοξίας επί κλωνογονική κλάσμα επιβίωσης, σε σχέση με τους ελέγχους οξυγονικό, προσδιορίζεται με επίστρωση κυττάρων σε μία ανοξική θάλαμο δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA και τη μεταφορά σε μία αερόβια επωαστήρα 6 ώρες αργότερα. (F) Επίδραση του

HK2

siRNA για κλωνογονικού κλάσμα επιζών μετά από έκθεση σε 6 ώρες ανοξία, σε σχέση με ένα ισοδύναμο ανοξική έκθεση μετά τον έλεγχο siRNA.

Η

Η ικανότητα της γλυκόλυσης περιορισμού (

HK2

siRNA) ή αυξημένη γλυκολυτικό ζήτησης (ανοξία) για την περαιτέρω καταστολή της ικανότητας κλωνισμού αξιολογήθηκε από τον υπολογισμό του κλάσματος επιβίωσης (επιμετάλλωση απόδοση ως ένα κλάσμα του ότι για την ορθοξικές έλεγχο κύτταρα siRNA-θεραπεία).

HK2

siRNA σκότωσε 79% του Η460 WT (κλάσμα επιβίωσης 0,21 στο σχήμα 5D) και οι προκύπτουσες αποικίες ήταν μικρότερες (μείωση κατά 40% της μέσης ακτίνας αποικία? Δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τόσο

HK2

siRNA επιμολυσμένα

ADPGK

-null κυτταρικές σειρές έδειξε ένα επιπλέον πολύ σημαντικό ~ 4-φορές απώλεια της ικανότητας κλωνισμού (Σχήμα 5D), χωρίς να υπάρξει αλλαγή στο μέγεθος των αποικιών, σε σύγκριση με WT, επίσης, αντιμετωπίζονται με

HK2

siRNA. Όταν τα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν σε ένα αναερόβιο θάλαμο και εκτέθηκαν σε 6 ώρες ανοξία πριν μεταφερθούν σε μία αερόβια CO

2 θερμοκοιτίδα, κλωνογόνο επιβίωση των κυττάρων WT μειώθηκε κατά 71% (Σχήμα 5Ε) και την ακτίνα αποικίας κατά 30% (όχι απεικονίζεται). Τόσο Η460

ADPGK

-null κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα στην θανάτωση κάτω από ανοξία (Σχήμα 5Ε), χωρίς καμία περαιτέρω αλλαγή στην ακτίνα της αποικίας.

HK2

νοκ ντάουν σε συνδυασμό με ανοξία είχε μια παρόμοια επίδραση στη βιωσιμότητα με αυτή που παρατηρήθηκε υπό αερόβιες συνθήκες, και πάλι με σημαντικά μεγαλύτερη επίδραση στο

ADPGK

-null από τις γραμμές WT (Σχήμα 5F).

η αυξημένη ευαισθησία των δύο ADPGK νοκ-άουτ Η460 κλώνους σε ανοξία επιβεβαιώθηκε σε μια δεύτερη σειρά πειραμάτων, με και χωρίς το γλυκολυτικό αναστολέα 2-δεοξυ-D-γλυκόζης (Σχήμα S5). Αυτά τα πειράματα δείχνουν σαφώς ότι

ADPGK

έχει μια προστατευτική επίδραση έναντι του κυτταρικού θανάτου κάτω από ανοξία και όταν

HK2

καταρριφθεί υπό αερόβιες ή ανοξικές συνθήκες στην κυτταρική σειρά Η460.

Μια παρόμοια μελέτη με εκείνη για Η460 κυτταρικές σειρές που διεξήχθη για HCT116 WT και

ADPGK

-null παράγωγά του C3 και IC10 (Σχήμα S6). Σε αυτήν την περίπτωση, η μόνη στατιστικά σημαντική επίδραση της

ADPGK

knockout ήταν μια μέτρια μείωση της ικανότητας επίστρωσης (του ελέγχου κυττάρων siRNA-θεραπεία), που εμφανίστηκε να είναι πιο έντονη από ό, τι στο πείραμα χωρίς διαμόλυνση RNA ελέγχου που αναφέρθηκαν σε Πίνακας 1. Knockdown του

HK2

, και η έκθεση σε ανοξία για 6 ώρες, προκάλεσε μικρότερη θανάτωση των κυττάρων του HCT116 WT από κύτταρα Η460 WT κατά ένα συντελεστή περίπου 2, και τα νοκ άουτ του

ADPGK

έκανε δεν αυξήσει περαιτέρω τη δολοφονία από

HK2

siRNA ή ανοξία στο παρασκήνιο HCT116.

Είμαστε ακόμη διερευνηθεί κατά πόσον η παρατεταμένη έκθεση του υποξία (0,2% του οξυγόνου στην αέρια φάση) έχει παρόμοια επίδραση στην Η460

ADPGK

-null κλώνους όπως φαίνεται για την ανοξία. Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές πολλαπλασιάσθηκαν σε παρόμοια ποσοστά κάτω από υποξία για 3 ή 6 d, χωρίς σημαντική διαφορά στην πλάσια αύξηση στην clonogens ανά καλλιέργεια (Σχήμα S7A). Ομοίως,

ADPGK

νοκ-άουτ δεν είχε καμία συνεπή επίδραση στην ανάπτυξη των clonogens HCT116 κάτω από 0,2% οξυγόνο για 3, 6 ή 9 ημέρες (Σχήμα S7B).

Η εμφανής διαφορά στη δράση του

ADPGK

νοκ-άουτ για την επιβίωση των κυττάρων Η460 κάτω από ανοξία έναντι 0,2% το οξυγόνο μας οδήγησαν να δοκιμάσει την ενεργοποίηση της εκτυλίχθηκε απόκρισης πρωτεΐνης (UPR), η οποία είναι πιο έντονη υπό σοβαρή από ό, τι μέτρια υποξία [29], [30].

XBP1

μάτισμα από την ενδονουκλεάση IRE-1, ενός δείκτη της UPR [31], παρουσίασαν παρόμοιες αυξήσεις σε Η460

ADPGK

-null κλώνους και WT κύτταρα μετά από 6-h ανοξία (Σχήμα S8) .

επιπτώσεις του

ADPGK

knockout για γλυκόλυση και μιτοχονδριακού μεταβολισμού

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν τα αποτελέσματα των

ADPGK

νοκ-άουτ για την επιβίωση Η460 υπό ανοξία αντανακλούν μια ρόλος της ADPGK στη γλυκόλυση. Γλυκόζη κατανάλωση και το σχηματισμό γαλακτικού οξέος κατά τη διάρκεια της 6-h ανοξία κατεστάλησαν όταν

HK2

χτυπήθηκε κάτω σε Η460 (Σχήμα 6Α, Β) και HCT116 (Σχήμα 6C, D) κυτταρικές σειρές, η οποία ορίζει ότι η φωσφορυλίωση της γλυκόζης είναι περιορισμού του ρυθμού για γλυκόλυση υπό αυτές τις συνθήκες. Παραδόξως, δεν υπήρχε καμία ένδειξη για μια χαμηλότερη γλυκολυτικό ρυθμό στα

ADPGK

knockouts, και γλυκόλυση στα knockouts δεν ήταν πιο ευαίσθητα σε

HK2

καταστολή. Ομοίως, νοκ ντάουν του

HK2

κατέστειλε τα επίπεδα σταθερής κατάστασης ΑΤΡ (είτε υπό αερόβιες ή αναερόβιες συνθήκες) σε κυτταρικές σειρές Η460, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν μεγαλύτερη για οποιαδήποτε από τις

ADPGK

-null κλώνους (Σχήμα 7Α). Ανοξία και

HK2

siRNA είχε μόνο μικρές επιπτώσεις στα επίπεδα ATP στα κύτταρα HCT116 WT, σύμφωνα με το μικρότερο αποτέλεσμα αυτών των θεραπειών για κλωνογονικού επιβίωσης από ό, τι στα κύτταρα Η460, χωρίς προφανείς διαφορές στο

ADPGK

νοκ-άουτ κλώνους (Σχήμα 7Β).

γλυκόζης κατανάλωση (Α, D) και γαλακτικό σχηματισμό (Β, Ε) μετρήθηκαν 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση με siRNA έλεγχο ή

HK2

siRNA. coli

. (ΣΙ).