Αφηρημένο

ανδρογόνων υποδοχέων (AR) είναι ένα μέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων των μεταγραφικών παραγόντων. Κατά την σύνδεση στα ανδρογόνα, AR γίνεται μεταγραφικά ενεργή να ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων που φιλοξενούν στοιχεία ανδρογόνων απόκριση (AREs) σε προαγωγούς και /ή ενισχυτές τους. AR είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και επομένως είναι ένας στόχος για την τρέχουσα και την επόμενη γενιά θεραπευτικών μεθόδων κατά του καρκίνου του προστάτη. Παθοφυσιολογική σχετικά δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που περιλαμβάνει AR, ωστόσο, ελάχιστα κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε την πρωτεΐνη συντηγμένη /μεταφέρονται σε λιποσάρκωμα (FUS /TLS) ως ένα AR-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης με συν-ανοσοκαταβύθιση των ενδογενών πρωτεϊνών σε LNCaP κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου προστάτη. Η ορμονική απόκριση της έκφρασης FUS σε κύτταρα LNCaP δείχθηκε να μοιάζουν με εκείνη των άλλων AR συν-ενεργοποιητές. FUS εμφανίζεται μια ισχυρή ικανότητα εγγενή διενεργοποίησης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, όταν δεμένοι με βασική φορείς με τη χρήση του συστήματος GAL4. πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ότι FUS είχε προσληφθεί για να ARE ΙΙΙ της περιοχής ενισχυτή του

PSA

γονίδιο. Δεδομένα από έκτοπη υπερέκφραση και «knock-down» προσεγγίσεις έδειξαν ότι AR μεταγραφική δραστηριότητα ενισχύθηκε από FUS. Η εξάντληση των FUS μειωμένη ανδρογόνο-εξαρτώμενη πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP. Έτσι, FUS είναι ένα μυθιστόρημα συν-ενεργοποιητής της AR σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Χαϊλέ S, Lal Α, Myung JK, Sadar MD (2011) FUS /TLS είναι ένα συν-Activator των ανδρογόνων υποδοχέων σε κυττάρων καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (9): e24197. doi: 10.1371 /journal.pone.0024197

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιούλ 2011? Αποδεκτές: 2 Αυγ 2011? Δημοσιεύθηκε: 1 Σεπ, 2011

Copyright: © 2011 Χαϊλέ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας χορηγούν MOP-79308. www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποδοχέα ανδρογόνου (AR) απαιτείται για την επιβίωση και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Κατά συνέπεια, προχωρημένο καρκίνο του προστάτη μπορεί να αντιμετωπιστεί με θεραπείες ανδρογόνων κατάλυσης. Δυστυχώς, αυτές οι θεραπείες τελικά αποτυγχάνουν και η νόσος γίνεται θανατηφόρα, ο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC). Η πιο ευρέως υποστηρίζεται υποκείμενος μηχανισμός CRPC περιλαμβάνει AR. Ο τομέας αμινο-άκρο (NTD) του AR απαιτείται τόσο για εξαρτώμενη από συνδετήρα και συνδετήρα-ανεξάρτητη δράση του υποδοχέα (για μια επισκόπηση βλέπε [1]). Έτσι, οι τρέχουσες προσπάθειες για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών φαρμάκων κατά CRPC επικεντρώνονται στην πιο αποτελεσματική απόφραξη της σύνθεσης ανδρογόνων, αντι-ανδρογόνα που δεσμεύονται ανταγωνιστικά την περιοχή σύνδεσης προσδέματος AR (LBD) με πολύ υψηλότερη συγγένεια [2], και αναστολείς του AR NTD [3 ]. Η συνέχιση των προσπαθειών για την ανάπτυξη φαρμάκων θα ωφεληθούν από τη βελτιωμένη κατανόηση των δικτύων αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που αφορούν την AR. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια πρωτεομική προσέγγιση και προσδιορίζονται τα νέα ενδογενείς συνεργάτες αλληλεπίδρασης AR σε κύτταρα καρκίνου προστάτη που περιλαμβάνουν μέλη μιας ομάδας πρωτεϊνών που ονομάζονται FET /Tet. Αυτή η οικογένεια πρωτεϊνών περιλαμβάνει: συγχωνεύονται σε σάρκωμα (FUS) /μεταφέρονται σε λιποσάρκωμα (TLS), σάρκωμα πρωτεΐνη ewig (EWS), και η ΤΑΤΑ δεσμευτική πρωτεΐνη-Associated Factor, TAF15

πρωτεϊνών FET εμφανίσετε διάφορες λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης. μεταγραφική διαμόρφωση, μάτισμα, τη διάδοση των κυττάρων και την επιδιόρθωση του DNA. FET πρωτεΐνες έχουν παρόμοιες περιοχές ενεργοποίησης μεταγραφής (προσωρινές συσκευές στήριξης) στο μοτίβο τους NTD και RNA αναγνώρισης (ΜΤΑ) και επαναλήψεις της RGG τριπεπτιδίου στο καρβοξυλο άκρο τους [4], [5]. Η TAD του FET πρωτεϊνών περιέχει XYXXQ πλούσιο μοτίβο, το Χ είναι ένα μικρό αμινοξύ (Gly, Αία, Ser ή Pro) [6]. Αυτό το μοτίβο είναι επίσης από κοινού με το πρωτο-ογκοπρωτεϊνης SYT, το ανθρώπινο πυρηνικό υποδοχέα συν-ενεργοποιητή SYT-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης /Co-ενεργοποιητή Activator (SIP /CoAA), και SWI /SNF /BAF250 [6]. FET NTDs, συμπεριλαμβανομένων των ισχυρών προσωρινές συσκευές στήριξης, συντήκονται σε επικράτειες δέσμευσης DNA (DBDs) διαφόρων παραγόντων μεταγραφής σε μια υποκατηγορία των σαρκωμάτων και άλλων καρκίνων [5], η οποία οδηγεί σε υπερενεργοποίηση του αντίστοιχου μεταγραφικής δραστικότητας. Αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η μητρική, πλήρους μήκους FET πρωτεΐνες δεσμεύονται και να ενεργοποιήσετε τις λειτουργίες των συγκεκριμένων παραγόντων μεταγραφής εν μέρει από την πρόσληψη συν-παράγοντες, όπως η CBP /p300 [4] – [5].

Αποτελέσματα

AR και FUS βρίσκονται στην ίδια πρωτεΐνη συγκρότημα

LNCaP ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή [7] ανακεφαλαιώνει σημαντικά χαρακτηριστικά του καρκίνου του προστάτη, περιλαμβανομένης της έκφρασής του προστάτη-ειδικό αντιγόνο (PSA) και AR, καθώς και όπως ευαισθησία στο ανδρογόνων. Για την αρχική μας οθόνη, χρησιμοποιήσαμε την πυρηνική προϊόντα λύσης από κύτταρα LNCaP που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το συνθετικό ανδρογόνο R1881 (10 ηΜ) για 3 ώρες. Τα προϊόντα λύσης ανοσοκαταβυθίζονται με αντίσωμα αντι-AR και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε πολυδιάστατα τεχνολογία αναγνώρισης πρωτεΐνης (MudPIT) [8]. Ανάλυση φασματογράφου μάζας προσδιορίζονται FUS, το οποίο ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών FET αλληλεπιδρούν με AR (Σχήμα 1 Α, Εικόνα S1, S2 Εικόνα και Πίνακας 1). Συν-ανοσοκαταβύθιση (συν-ΙΡ) πειράματα που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western επικυρώνονται αλληλεπίδραση μεταξύ AR και FUS (Σχήμα 1Β). AR συν-ανοσοκαταβυθίζονται (συν-IP) με FUS, ενώ ανοσοκαταβύθιση με έλεγχο ισοτόπου IgG δεν pull-down AR ή FUS. Αντίστροφη συν-IP με αντι-AR που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western με αντι-FUS αντίσωμα έδειξε επίσης ότι AR αλληλεπίδρασε με FUS (Σχήμα 1 C). Συνεπής με προηγούμενες εκθέσεις, η θεραπεία με R1881 αυξημένα επίπεδα AR πρωτεΐνης.

In vivo

σύνδεση των FUS με AR επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα LNCaP ξενομοσχεύματα που αναπτύχθηκαν σε ποντίκια, πριν ή μετά τον ευνουχισμό (Εικόνα 1D). Μαζί υποστηρίζουν αυτά τα δεδομένα ότι η AR και FUS συνεργάτης στο ίδιο συγκρότημα με κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

(Α) Προσδιορισμός του FUS ως AR-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης με συν-immunopreciptation (Co-IP) και στη συνέχεια με φασματομετρία μάζας ( ΚΥΡΊΑ). MS /MS φάσματα m /z 1660,77 (από 831,39, 2+) της FUS και δύο άλλοι φαίνεται στο συμπληρωματικό υλικό ήταν σαφώς ανατεθεί η ταυτοποιημένη αλληλουχία LKGEATVSFDDPPSAK, APKPDGPGGGPGGSHMGGNYGDDR και TGQPMINLYTDR, αντίστοιχα. (Β) Επικύρωση της αλληλεπίδρασης AR-FUS χρησιμοποιώντας Co-IP ακολουθούμενη από ανάλυση Western blot. LNCaP κύτταρα σε καλλιέργεια διεγέρθηκαν με 10 ηΜ R1881 για 6 ώρες και ολόκληρα προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για ΙΡ με αντίσωμα αντι-FUS που ακολουθείται από αντι-AR Western Blot ανάλυση (WB). (Γ) Αντίστροφη IP με αντι-AR που ακολουθείται από WB με αντι-FUS αντίσωμα. (D) IP των ενδογενών συμπλεγμάτων των AR και FUS από υποδόρια ξενομοσχεύματα LNCaP. Οι όγκοι συλλέχθηκαν από ανέπαφα ποντικούς (Ι), 10 ημέρες μετά τον ευνουχισμό (C10) ή 30 ημέρες μετά τον ευνουχισμό (C30). Προϊόντα λύσης από αυτούς τους όγκους χρησιμοποιήθηκαν ξεχωριστά για την IP με αντίσωμα αντι-AR που ακολουθείται από WB με υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

υποκυτταρικός εντοπισμός της FUS στον προστάτη καρκινικά κύτταρα

πρωτεϊνών FET μπορεί να εντοπίζεται αποκλίνοντα στον πυρήνα ή /και κυτταρόπλασμα [5], [9]. Ανοσοφθορισμού μικροσκοπία χρησιμοποιώντας αντισώματα που στοχεύουν ενάντια ενδογενών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα LNCaP. FUS εντοπίστηκε αποκλειστικά στον πυρήνα (Εικόνα 2Α). FUS φάνηκε να εντοπίζεται σε διακριτές στίγματα μέσα στον πυρήνα (Σχήμα 2Α, Β). Ετερογένεια σε υπο-πυρηνικής διανομή του FUS μεταξύ του πληθυσμού των κυττάρων παρατηρήθηκε (Σχήμα 2Α, Β). Διπλή χρώση έδειξε συν-εντοπισμό του AR με FUS (Σχήμα 2Β) σε κύτταρα LNCaP που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 για 3 ώρες. συντελεστή κατά Pearson πλησίασε 0,8 σε ορισμένα κύτταρα μέσα σε συγκεκριμένες περιοχές των πυρήνων.

(Α) Πυρηνική εντοπισμό των FUS στα κύτταρα LNCaP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με R1881 (10 ηΜ) για 3 ώρες. Συνεστιακή ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-FUS (πράσινο) και τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). (Β) Κοινός εντοπισμός του AR και FUS. Διπλή χρώση δείχνει συν-εντοπισμό του AR (κόκκινο) με FUS (πράσινο) σε κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 για 3 ώρες. Το ένθετο στο σωστό πίνακα αντιπροσωπεύει το κύτταρο που συμβολίζεται με (*) μετά την περίφραξη κατώφλι για να αφαιρέσετε το φωτεινό κεντρικό πράσινο σημείο.

Η

FUS έχει εγγενή δραστηριότητα διενεργοποίησης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Η Οι προσωρινές συσκευές στήριξης των πρωτεϊνών FET μπορεί να προσδώσει ισχυρή μεταγραφική μετενεργοποίηση σε μερικούς όγκους [4] – [5], αλλά αυτό δεν έχει διερευνηθεί σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία μετενεργοποίησης GAL4 να διερευνήσει εάν δραστηριότητα διενεργοποίησης μπορούσαν να αποδοθούν σε FUS σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Χιμαιρικά κατασκευάσματα που φέρουν πλήρους μήκους FUS (ή θραύσματα εκεί) συντηγμένο με το Gal4-DBD χρησιμοποιήθηκαν για αυτή την ανάλυση (Σχήμα 3Α). PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη, στερείται λειτουργικών AR, συν-επιμολύνθηκαν με κάθε ένα από τα κατασκευάσματα σύντηξης Gal4, και ένα γονίδιο ανταποκριτή που περιέχει τις ελάχιστες θέσεις Gal4-δέσμευσης (ρ5 × Gal4UAS-ΤΑΤΑ-λουσιφεράση). GAL4-DBD μόνος χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος και είχε ελάχιστη δράση (Σχήμα 3Β). Σε αντίθεση, Gal4-FUS δραστικότητα που επάγεται λουσιφεράσης σημαντικά (Σχήμα 3Β) το οποίο ήταν σύμφωνο με αυτό που έχει εγγενή δραστικότητα μετενεργοποίησης. Για να αρχίσει να οριοθετηθούν οι οποίες τομέα (ες) λογαριασμό για αυτή την εγγενή ικανότητα διενεργοποίηση, χρησιμοποιήσαμε δύο κατασκευάσματα. Το πρώτο κατασκεύασμα είχε την τομέα διενεργοποίησης NTD (FUS-Ν) και το άλλο περιείχε το τερματικό ΜΤΑ καρβοξυλίου και RGGs (FUS-C) (Σχήμα 3Α). Αμφότερα τα θραύσματα εμφανίζονται δραστηριότητες που ήταν συγκρίσιμα με πλήρους μήκους FUS (Σχήμα 3Β). Για να αξιολογηθεί το πλαίσιο υποκινητή εξάρτηση από αυτές τις δραστηριότητες, χρησιμοποιήσαμε μια διαφορετική ρεπόρτερ που περιέχει τις ελάχιστες θέσεις δέσμευσης GAL4 και ένα στοιχείο ΤΑΤΑ, οι οποίες αντιπαρατίθενται στον υποκινητή Ε1. Παρόμοια, αν και γενικά υψηλότερη, χωρητικότητα μετενεργοποίηση παρατηρήθηκε στο πλαίσιο αυτού του υποκινητή όπως στο ελάχιστο προαγωγέα (Σχήμα 3C). Ισχυρή ικανότητα μετενεργοποίηση των συντήξεων GAL4-FUS καταδείχθηκε επίσης σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 3D).

(Α) χιμαιρικά μορφώματα πλήρους μήκους FUS, Ν- ή C-θραύσματα FUS συντηγμένο με το Gal4 DBD . TAD τομέα = Μετενεργοποίησης? μοτίβο ΜΤΑ = αναγνώριση RNA? RGG = επαναλήψεις ενός τριπεπτιδίου που περιέχει αργινίνη και δύο γλυκίνες. (Β) δραστηριότητα διενεργοποίησης του FUS σε PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη. PC-3 κύτταρα σε τρυβλία 6 φρεατίων συν-επιμολύνθηκαν με 50-100 ng του Gal4 χίμαιρα, και 1 ug του γονιδίου ανταποκριτή pFR-LUC που περιέχει θέσεις πρόσδεσης GAL4 και ένα στοιχείο ΤΑΤΑ. GAL4 DBD μόνο του χρησίμευσε ως αρνητικός μάρτυρας. 2 ug pGL2 κενό πλασμίδιο προστέθηκε σε όλα τα μείγματα DNA. (C) Όπως στο (Β), αλλά το πλασμίδιο αναφοράς περιείχε Gal4-θέσεις δέσμευσης και ΤΑΤΑ στοιχείο αντιπαρατίθενται σε E1a υποκινητή. (D) Όπως στο (Β), αλλά με LNCaP αντί των κυττάρων PC-3. Στήλες = μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. * Ρ & lt? 0,05, η = 3.

Η

FUS προάγει μεταγραφική δραστικότητα AR σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Αφού επιδείξει ικανότητα διενεργοποίησης του FUS που ήταν ανεξάρτητη του προαγωγού σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη όπως περιγράφεται ανωτέρω, αξιολογήσαμε την επόμενη της συμμετοχής των FUS ειδικά στο AR μεταγραφική δραστηριότητα σε γονίδια-στόχους. Δύο διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν ανεξάρτητες περιοχές του συγγενούς mRNA χρησιμοποιήθηκαν για να καταστρέφουν τα επίπεδα των FUS. δραστικότητα AR μετρήθηκε σε συν-επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP χρησιμοποιώντας το PSA (6.1 kb) κατασκεύασμα γονιδίου ανταποκριτή -luciferase. Αυτή η ρεπόρτερ περιέχει τις περιοχές προαγωγέα και ενισχυτή PSA φιλοξενούν διάφορα AREs που προσδίδουν επαγωγή από ανδρογόνα [10] – [11] σε ένα AR-εξαρτώμενο τρόπο [12] – [13]. Σε σχέση με τον μάρτυρα, R1881 επαγωγή δραστικότητας λουσιφεράσης ήταν σημαντικά μειωμένη κατά την εξάντληση του FUS χωρίς τη μείωση των επιπέδων του AR (Σχήμα 4Α). Για να επιβεβαιωθούν αυτά τα ευρήματα με μια προσέγγιση υπερ-έκφραση, θα συν-επιμολυσμένα φορέα έκφρασης AR, το πλασμίδιο ρεπόρτερ ARR3-tk-LUC, και διάφορες ποσότητες ενός πλασμιδίου που επιτρέπει την επισύναψη His έκφραση FUS σε κύτταρα ΗΕΚ293. Ο δημοσιογράφος ARR3-tk-LUC περιέχει έξι Άρη και είναι ιδιαίτερα επάγεται από τα ανδρογόνα. Η υπερέκφραση του FUS αυξημένη AR μεταγραφική δραστικότητα μετράται ως δραστικότητα λουσιφεράσης από ARR3-tk-LUC με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β, το άνω και το μεσαίο πάνελ). His-FUS δεν μετέβαλε σημαντικά την μεταγραφική δραστικότητα στο pRL-tk-LUC, το οποίο περιέχει μόνο την κινάση της θυμιδίνης (tk) βασικό υποκινητή (Σχήμα 4Β, κάτω πάνελ).

(Α) Εξάντληση FUS συσχετίζεται με μειωμένη δραστικότητα AR. Επίπεδα FUS μειώθηκαν σε κύτταρα LNCaP χρησιμοποιώντας siRNAs που στοχεύουν δύο διαφορετικές περιοχές των αντίστοιχων mRNAs και ακολούθως επιμολύνθηκαν με 1 μα του πλασμιδίου για το PSA (6.1) -luciferase. 2 ug ρ-LUC κενό πλασμίδιο προστέθηκε σε όλα τα μείγματα siRNA /DNA. Ποσά ανά φρεάτιο σε μία πλάκα 6 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 για 24 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western των αντίστοιχων δειγμάτων δείχνουν τα επίπεδα της FUS, AR, και ακτίνη. (Β) έκτοπη έκφραση της FUS ενισχύει τη δράση AR. 293FT κύτταρα σε μια πλάκα 48 φρεατίων μορφομετατράπηκαν με πλασμίδιο έκφρασης AR 15 ng, 620 ng ARR3-tk-λουσιφεράση πλασμίδιο ρεπόρτερ, 62 ng πλασμιδίου λουσιφεράσης Renilla και δεικνυόμενες ποσότητες του πλασμιδίου έκφρασης His-FUS. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκαν με εκείνα από λουσιφεράσης Renilla που περιέχει το ελάχιστο προαγωγέα ΤΚ. Τιμές πάνω από κάθε μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει πολλαπλάσια επαγωγή από R1881 μετά την κανονικοποίηση (άνω πάνελ). Η ανάλυση στυπώματος Western των αντίστοιχων δειγμάτων δείχνουν τα επίπεδα της FUS, AR, και ακτίνη (μεσαίο πλαίσιο). UT: μη επιμολυσμένα κύτταρα. δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla από τα ίδια δείγματα κανονικοποιήθηκαν για ολική πρωτεΐνη χρησίμευσε ως έλεγχος ειδικότητας (κάτω πίνακας). Στήλες = μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. * Ρ & lt? 0,05, η = 3.

Η

Για να καθοριστεί εάν FUS αυξάνει την έκφραση των ενδογενών γονιδίων, τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA γνωστών γονιδίων ανδρογόνο ρυθμίζονται ήταν επόμενο μετρήθηκαν.

PSA

mRNA και mRNA από πέντε άλλα γονίδια ανδρογόνων επαγόμενο μειώθηκαν σημαντικά κατά την εξάντληση του FUS (Σχήμα 5Α).

TMPRSS2

mRNA μειώθηκε μόνο ένα από τα siRNAs, και το γονίδιο ανδρογόνα κατασταλεί,

CAMK2N1

δεν επηρεάστηκε από καμία από τις siRNAs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνεπής με μειωμένα επίπεδα του mRNA, τα επίπεδα της πρωτεΐνης PSA μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα LNCaP την εξάντληση του FUS (Σχήμα 5Β). Για να προσδιορίσετε αν FUS προσλήφθηκε στο DNA με τον AR σε απάντηση των ανδρογόνων, χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία διεξήχθη. Ανοσοκαταβύθιση των συμπλοκών με σταυροειδείς δεσμούς πρωτεΐνης-ΟΝΑ χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα προς FUS ακολουθούμενη από ενίσχυση του ARE ΙΙΙ του

PSA

γονίδιο αποκάλυψε ότι FUS προσλήφθηκε σε αυτό είναι (Σχήμα 5C). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η FUS ενισχύει δραστικότητα AR, τουλάχιστον σε κάποια γονίδια στόχους, συνεπής με την ισχυρή λειτουργία εγγενή διενεργοποίησης αποδίδονται σε FUS (Εικ. 3).

επίπεδα (Α) mRNA ανδρογόνου ρυθμισμένων γονιδίων. siRNA μεσολαβεί εξάντληση των FUS μειώνεται συγγενή mRNA για PSA και πολλά άλλα γονίδια στόχους AR. qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθούν τα επίπεδα mRNA. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν αναλογίες GAPDH-κανονικοποιημένη σήματα προς εκείνα που προέρχονται από ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA. (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης PSA. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 8 ώρες με 10 ηΜ R1881 ή όχημα μετά την επιμόλυνση siRNA και κηλίδωση Western διεξήχθη για να μετρηθούν τα επίπεδα PSA. (C) FUS προσλαμβάνεται για τον ενισχυτή ΕΙΝΑΙ ΙΙΙ του

PSA

γονίδιο. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 επί 6 ώρες. Τσιπ εφαρμοστούν μελλοντικά και στοχεύουν DNA ενισχύθηκε με qPCR. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν αναλογία σημάτων από αντι-FUS ChIP με εκείνη του ελέγχου ισοτύπου IgG. Στήλες = μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. * Ρ & lt? 0,05, η = 3.

Η

Η εξάντληση των FUS μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP

AR είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP [14]. Για να εκτιμηθεί εάν μειωμένη δραστικότητα AR την εξάντληση του FUS θα έχει ως αποτέλεσμα μειωμένο πολλαπλασιασμό, εκτελέσαμε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Όπως ήταν αναμενόμενο, R1881 (0,1 ηΜ) αύξησε τον πληθυσμό των κυττάρων σε φάση S (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), το οποίο μειώθηκε κατά περίπου 30% με την εξάντληση του FUS (Σχήμα 6Α). Αξιοσημείωτα, τα δεδομένα ελήφθησαν από παροδική επιμόλυνση των siRNA αποτέλεσμα σχετικά μη αποδοτική εξάντληση του FUS (Σχήμα 6Β). Τα δεδομένα αυτά εμπλέκουν μια λειτουργία υπέρ της ανάπτυξης των FUS για ανδρογόνων που εξαρτώνται από τον πολλαπλασιασμό, το οποίο είναι σύμφωνο με αυξημένη AR μεταγραφική δραστηριότητα.

(Α) κυτταρομετρίας ροής ποσοτικοποίηση των κυττάρων S-φάσης. LNCaP κύτταρα siRNA επιμολυσμένα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0,1 ηΜ R1881 για 48 ώρες. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με BrdU, χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-Βτάυ αντίσωμα και ϋΑΡΙ, και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής. Το γράφημα στα δεξιά αντιπροσωπεύει ποσοτικοποίηση κυττάρων S-φάσεως ως αναλογία των αντίστοιχων ελέγχων. * Ρ & lt? 0,05, η = 3. (Β) Επίπεδα FUS πρωτεΐνης σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με FUS siRNA. Η ανάλυση στυπώματος Western των επιπέδων FUS και ελέγχου φόρτωσης ακτίνης που αντιστοιχούν στα δείγματα των οποίων κυτταρικού κύκλου προφίλ χαράσσεται στο (Α).

Η

Hormone-αποκρισιμότητα της έκφρασης FUS

Έκφραση μερικοί AR συν-ενεργοποιητές όπως στεροειδούς υποδοχέα συν-ενεργοποιητές (ΤΕΑ) διαμορφώνεται με ανδρογόνα και /ή AR [15] – [17] ως μέρος του τι φαίνεται να είναι ένα δίκτυο των μηχανισμών τροφοδοσίας προς τα εμπρός και η ανατροφοδότηση. έκφραση FUS, στο mRNA (Σχήμα 7Α, άνω φωτογραφία) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 7Α, μεσαίο πάνελ), καταστάλθηκε

in vitro

σε κύτταρα LNCaP μετά από 48 ώρες αγωγή με 10 ηΜ R1881. Η επεξεργασία των κυττάρων LNCaP με 0.1 ηΜ R1881 για ισοδύναμες χρονικό διάστημα (48 ώρες), ωστόσο, έχει αμελητέα αποτελέσματα επί της έκφρασης της έκφρασης FUS (Σχήμα 7Α, κάτω πάνελ). Ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η έκφραση γονιδίου FUS σε LNCaP ξενομοσχεύματα. δείγματα όγκου παρασκευάστηκαν από ανέπαφο (μη ευνουχισμένα) και ευνουχισμένοι ποντικοί (10 ημέρες μετά τον ευνουχισμό). Σύμφωνα με τις

in vitro

δεδομένων με 10 ηΜ R1881, ο ευνουχισμός οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του FUS (Σχήμα 7Β).

(α) Επίπεδα FUS mRNA σε απόκριση των ανδρογόνων θεραπεία. Πάνω πίνακας: έκφραση FUS μετρήθηκε με qRT-PCR σε κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Μεσαίο πάνελ: ανάλυση western blot των επιπέδων FUS, PSA και πρωτεΐνες ακτίνης στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Κάτω πίνακας: Ανάλυση στυπώματος Western των επιπέδων FUS πρωτεΐνης σε κύτταρα LNCaP που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ έναντι 0,1 ηΜ για 48 ώρες. Οι μπάρες σφάλματος = μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. * Ρ & lt? 0,05, η = 3. Τα επίπεδα (Β) FUS σε απόκριση σε ορμονική κατάσταση

in vivo

. ξενομοσχεύματα LNCaP συλλέχθηκαν από ανέπαφο (μη ευνουχισμένα) και ευνουχισμένοι ποντικοί (10 ημέρες μετά τον ευνουχισμό) βάφτηκαν για πρωτεΐνες FUS και AR. επίπεδα (C) FUS σε κλινικές καρκίνο του προστάτη έναντι αντίστοιχων καλοήθη ιστό. Τα επίπεδα του mRNA FUS σε κλινικά δείγματα καρκινώματος προστάτη έναντι φυσιολογικό προστατικό ιστό επανα-αναλύθηκαν από προηγουμένως ληφθεί σύνολα δεδομένων χρησιμοποιώντας Oncomine. Μαύρες μπάρες δείχνουν μελέτες όπου FUS ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται στον καρκίνο σε σχέση με καλοήθη ιστό. * P & lt?. 0.05

Η

έκφραση FUS τείνει να είναι υψηλότερο σε καρκίνωμα του προστάτη σε σχέση με καλοήθη ιστό

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση της FUS μεταβάλλεται σε καρκίνο σε σχέση με καλοήθη ιστό του προστάτη, Oncomine ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας επτά διαφορετικές κλινικές ομάδες. Έκφραση των FUS ήταν αυξημένα σε καρκίνωμα του προστάτη συγκριτικά με καλοήθη δεδομένων ιστού χρησιμοποιώντας από τρεις μελέτες (Σχήμα 7C). Ωστόσο, σε τέσσερις πρόσθετες μελέτες παρόμοιου μεγέθους, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των επιπέδων του mRNA FUS σε καρκίνωμα του προστάτη σε σύγκριση με τα επίπεδα σε καλοήθη προστατική ιστό.

Συζήτηση

AR είναι απαραίτητη για όλες τις φάσεις της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη περιλαμβανομένου του τερματικού CRPC στάδιο. Η εξέλιξη αυτή ο ρόλος του AR είναι μια δυναμική αλληλεπίδραση με διάφορα συν-ενεργοποιητές και συν-καταστολείς. Το πεδίο εφαρμογής της παθοφυσιολογική σχετικής αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που περιλαμβάνει AR σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη είναι, ωστόσο, δεν πλήρως γνωστοί. Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι FUS αλληλεπίδρασε με AR ενδογενώς στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη και περαιτέρω αποκάλυψε τα ακόλουθα: (1) FUS είχαν εγγενή ικανότητα διενεργοποίησης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη? (2) FUS ενισχυμένη AR-μεσολάβηση μεταγραφή? (3) εξάντληση FUS μειωμένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων ανδρογόνου που προκαλείται? (4) FUS προσλήφθηκε στον Άρη για την αντιμετώπιση των ανδρογόνων? (5) μείωση των επιπέδων του FUS περιορισμένης ανδρογόνο επαγόμενο πολλαπλασιασμό? (6) επίπεδα FUS είχαν μεταβληθεί από την κατάσταση των ανδρογόνων

in vitro

και

in vivo

? και (7) τα επίπεδα της FUS ήταν αυξημένα σε κλινικά δείγματα καρκίνου του προστάτη.

Οι περιοχές δέσμευσης DNA (DBD) υποδοχείς στεροειδών εμφανίζουν υψηλή ομολογία αλληλουχίας (π.χ. AR DBD έχει 77% και 57% ομοιότητα αλληλουχίας με εκείνες του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών και του υποδοχέα οιστρογόνου, αντίστοιχα), και μπορεί να αλληλεπιδράσει με πολλούς από τους ίδιους συνενεργοποιητές. Χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, FUS έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με τα DBDs του ρητινοειδούς Χ, το οιστρογόνο, του θυρεοειδούς, και υποδοχείς γλυκοκορτικοειδών, αλλά AR δεν εξετάστηκε [18]. Η δέσμευση του FUS να DBDs από άλλους υποδοχείς ορμονών δεν παρεμβαίνει με δραστηριότητες δέσμευσης DNA, αν και δεν αξιολογήθηκε ο ρόλος των FUS στις δραστηριότητες μεταγραφική τους [18].

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι FUS φιλοξενεί ισχυρή τομείς διενεργοποίησης ότι ήταν λειτουργικό σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η C-τερματική περιοχή που περιέχει τις ΜΤΑ και RGG μοτίβα του EWS μπορεί να καταστείλει την ικανότητα τρανσενεργοποίηση του NTD σε κουνέλι νεφρό προερχόμενα RK-13 ​​κύτταρα [19]. Αντίθετα, εδώ καμία λειτουργία κατασταλτική της περιοχής Ο-τερματικού παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση πλήρους μήκους FUS στην FUS 1-273 θραύσμα που στερείται της Ο-τερματικό ΜΤΑ και μοτίβα RGG. Επιπλέον, FUS 274-526 που περιέχει τα ΜΤΑ και RGG μοτίβα, αλλά δεν το ΣΕΔ, εμφανίζεται μια ισχυρή ικανότητα μετενεργοποίηση. Παρόμοια δεδομένα σχέση δομής-λειτουργίας που περιλαμβάνουν FUS είχαν αναφερθεί στο παρελθόν με τη χρήση κυττάρων τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά 293 [20]. Έτσι, υπάρχουν λειτουργικές περιοχές διενεργοποίησης σε FUS εκτός από εκείνα που βρέθηκαν σε NTD της τουλάχιστον στον καρκίνο του προστάτη και 293 κύτταρα. Διαφορές στη βιβλιογραφία μεταξύ FUS και EWS τομείς διενεργοποίησης ενδέχεται να είναι κύτταρο-ειδικό ούτε αντικατοπτρίζουν απόκλιση τομέα (45% ταυτότητα? 64% ομοιότητα) [5] μεταξύ EWS (α 699 aa μακρά πρωτεΐνης) και FUS (α 526 aa μακρά πρωτεΐνη).

η έκφραση των διαφόρων συν-ρυθμιστές του AR ανταποκρίνεται σε ανδρογόνα ίσως ως μέρος των μηχανισμών ανάδρασης [15] – [17]. Έκφραση FUS ανταποκρίνεται σε κατάσταση ορμόνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Σε φυσιολογικά επίπεδα ανδρογόνων, η έκφραση FUS αναφέρθηκε να μειωθούν σημαντικά σε κύτταρα LNCaP θεραπεία για 48-96 ώρες με 10 ηΜ μιβολερόνη [21], όπως φαίνεται και εδώ με 10 ηΜ R1881 (Σχ. 7Α). Ωστόσο, μια χαμηλότερη συγκέντρωση των ανδρογόνων, 0.1 ηΜ R1881, δεν μετέβαλλε σημαντικά τα επίπεδα του FUS

in vitro

, και

in vivo

ευνουχισμού επίπεδα ανδρογόνων συσχετίστηκαν με αυξημένα επίπεδα FUS. Αυτό το προφίλ έκφρασης μοιάζει με εκείνη του προηγουμένως χαρακτηριζόμενη AR συν-ενεργοποιητές που συγκρατημένα καταστέλλεται από ανδρογόνα [15] – [16]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η καταστολή αυτών των συν-ενεργοποιητών με ανδρογόνα είναι με μια πιο αργή κινητική που μοιάζει με εκείνη αποκρίνονται στο ανδρογόνο έκφραση του FUS. Ανάλυση των επιπέδων του mRNA FUS σε διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη και μη-προστάτη δεν αποκάλυψε συστηματικές διαφορές (Εικ S3). Σε συμφωνία με αυτό, Oncomine εξόρυξη δεδομένων των μικροσυστοιχιών από κλινικά δείγματα διαφόρων τύπων συμπαγούς όγκου δεν έδειξε σημαντική προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων FUS σε όγκους του προστάτη σε σχέση με άλλους τύπους όγκων (Σχ S4). Σε αντίθεση, η σύγκριση των δεδομένων mRNA από καλοήθεις έναντι ιστούς αδενοκαρκινώματος του προστάτη αποκάλυψε τη ρύθμιση των FUS σε τρεις ανεξάρτητες μελέτες και καμία σημαντική διαφορά σε τέσσερις άλλους. Καμία μελέτη έδειξε σημαντική μείωση της έκφρασης του FUS σε αδενοκαρκίνωμα του προστάτη έναντι καλοήθη ιστό.

AR μεταγραφική δραστικότητα απαιτείται για τη συντήρηση και την ανάπτυξη του προστάτη που σχηματίζει το σκεπτικό για θεραπείες ανδρογόνων για τον καρκίνο του προστάτη. Συνεπής με FUS είναι ένα συνενεργοποιητή του AR και της εξάντλησης του μειώνοντας AR μεταγραφική δραστικότητα και εξαρτώμενων από ανδρογόνα ανάπτυξης, όπως φαίνεται εδώ, μεταξύ των εξέχοντα φαινοτύπων σε FUS – /- ποντίκια είναι αρσενική στειρότητα, και μικρότερα αρσενικά αναπαραγωγικά όργανα με φαινομενική παλινδρόμηση ορισμένων από αυτά δομές [22]. Αυτές οι φαινότυποι θυμίζουν AR – /- ποντίκια, ή πιο εκλεπτυσμένη τομέα- και τον κυτταρικό τύπο

AR

γονίδιο διαταραχές [23] – [24]. Έτσι, είναι πιθανό ότι η εξάντληση των FUS μειώνει AR μεταγραφική δραστικότητα σε αυτές κλασική εξαρτώμενων από ανδρογόνα ιστούς σε συμφωνία με τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ. Αυτά τα δεδομένα είναι σε αντίθεση με μια προηγούμενη αναφορά ότι FUS υπερέκφραση σε κύτταρα LNCaP, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα που επάγεται από τετρακυκλίνη και μετέπειτα επεξεργασία με 10 ηΜ μιβολερόνη για τέσσερις ημέρες, οδηγεί σε εμφάνιση του υπο-G1 /αποπτωτικών κυττάρων [21]. Περιέργως, δεν υπο-G1 /αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν απουσία ανδρογόνων, με ή χωρίς FUS υπερέκφραση [21]. Έτσι, σε αυτές τις μελέτες FUS υπερέκφραση οδήγησε σε μια ανδρογόνο επαγόμενο προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα και οι αλλαγές στην έκφραση των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου [21].

Σε γενικές γραμμές, ενώ απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επιλύσει το ρόλο της FUS στον προστάτη την εξέλιξη της νόσου του καρκίνου, η μελέτη αυτή έδειξε ότι: 1) FUS αλληλεπιδρά με AR? και 2) FUS ενισχύει την μεταγραφική δραστηριότητα του AR.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδια, κυτταρική καλλιέργεια και επιμολύνσεις

πλασμίδια έκφρασης FUS [20], P5 × Gal4UAS-ΤΑΤΑ -luciferase [12], και φορέα έκφρασης AR, ARO, [25] έχουν περιγραφεί προηγουμένως. PFR-LUC ελήφθη από την Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. AR πλασμίδιο αναφοράς, PSA (6.1 kb) -luciferase περιέχει τις περιοχές υποκινητή /ενισχυτή του γονιδίου PSA και παρεσχέθη από τον Dr. J.-T. Hsieh (Πανεπιστημίου Southwestern Medical Center, Dallas, TX). ARR3-tk-Luc περιέχει τρία αντίγραφα της περιοχής ανδρογόνων απόκριση του αρουραίου

probasin

γονίδιο συντηγμένο στο κινάσης βασική θυμιδίνης (ΤΚ) υποκινητή [26].

κύτταρα LNCaP, ελήφθη από τον Dr. Leland WK Chung (Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, CA, USA), αναπτύχθηκαν σε RMPI που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και χρησιμοποιήθηκαν σε πέρασμα 39-50. ΗΕΚ293 κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM που περιείχε 10% FBS. Εκτός αν δηλώνεται διαφορετικά, τα κύτταρα επωάστηκαν σε, ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσα χωρίς ορό για 24-48 ώρες πριν από τη θεραπεία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις R1881. Η επιμόλυνση των κυττάρων LNCaP διεξήχθη χρησιμοποιώντας lipofectamine 2000 (Invitrogen) για πειράματα με siRNAs ή λιποφεκταμίνης (Invitrogen) για όλους τους άλλους σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή στο 0,2-0,4% και 0,5% (ν /ν), αντίστοιχα. FUS (HSC.RNAI.N001170634.11.7? HSC.RNAI.N001170634.11.8) και siRNAs ελέγχου (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκαν σε 10-50 ηΜ συγκεντρώσεις. ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 σε 0,4% ν /ν. Οι ακριβείς ποσότητες των πλασμιδίων ανά επιμόλυνση υποδεικνύεται στο Σχήμα λεζάντες.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (Invitrogen). Ολικό RNA (0.5 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα μέσω ολιγο-dT αστάρωμα χρησιμοποιώντας το κιτ SuperScript III (Invitrogen). PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας γονίδιο-ειδικών εκκινητών με την παρουσία SYBR Green Supermix (Invitrogen) χρησιμοποιώντας την PCR πραγματικού χρόνου μηχανή ΑΒΙ 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Το πρωτόκολλο θερμικού κύκλου ήταν ως ακολούθως: στους 95 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec και 55 ° C για 30 sec. Ct (κατώφλι αριθμός κύκλου) τιμές μετατράπηκαν να σημαίνει έκφραση τιμές σε σχέση με

GAPDH

επίπεδα σύμφωνα με τη μέθοδο Pfaffl. εκκινητές FUS [5] και όλα τα άλλα εκκινητήρια μόρια έχουν περιγραφεί προηγουμένως [27] – [28]

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 30 λεπτά. . Τα κύτταρα κατέστησαν περατά σε 0.1% Trition Χ-100 σε PBS δύο φορές για 5 λεπτά. Μετά από αποκλεισμό για 30 λεπτά σε 2% BSA σε PBS που περιέχει 0.1% Trition Χ-100, τα δείγματα επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (1:50) σε ρυθμιστικό δέσμευσης για 1 ώρα. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού 4 φορές και επωάστηκε με κατάλληλα δευτερογενή FITC ή ροδαμίνη-συζευγμένο IgG (1:100) σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 45 λεπτά. Μετά από 4 πλύσεις με PBS που περιέχει 0.1% Trition, προστέθηκε διάλυμα στερέωσης ϋΑΡΙ που περιέχει Χ-100. Διαφάνειες έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας χρησιμοποιώντας Fluoview ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Markham, ON, Καναδάς).

συνανοσοκαθίζησης και χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης

LNCaP κύτταρα (2-3 × 10

6) απλώθηκαν σε 15 πιάτα cm με RPMI που περιέχει 5% FBS. Μετά από 24 ώρες, τα μέσα άλλαξαν σε ελεύθερο ορού και άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με R1881 (10 ηΜ) ή όχημα (αιθανόλη) για 6 ώρες. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS πριν από τη συγκομιδή και στη συνέχεια λύθηκαν με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (20 mM Tris-HCl ρΗ 7.8, 140 mM NaCl, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,5% Nonidet Ρ-40) με την παρουσία ενός κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Roche, Mississauga, ON, Καναδάς). Τα λύματα διέρχονται μέσω 27-G βελόνες πέντε φορές και ήταν στη συνέχεια προ-καθαρίζεται με σφαιρίδια πρωτεΐνης Α /G αγαρόζης (5% ν /ν) και ένα μίγμα του IgG ποντικού και κουνελιού (2 μg /ml το καθένα) για 1 ώρα. Το προκύπτον υπερκείμενο επωάστηκε με τα υποδεικνυόμενα ειδικά αντισώματα συμπεριλαμβανομένων AR 441, AR C19, και FUS (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, USA) σε συγκέντρωση 1-2 μg /ml για 16-24 ώρες. σφαιρίδια αγαρόζης /G πρωτεΐνη Α (5% ν /ν) προστέθηκαν στη συνέχεια και το μίγμα επωάστηκε για επιπλέον 3 ώρες. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με 1 ml του ρυθμιστικού λύσης πέντε φορές και μετά επαναιωρήθηκαν σε 40-80 μΙ προτύπου ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος SDS.

δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης διεξήχθη όπως περιγράφεται [27]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με R1881 (10 ηΜ) ή όχημα για 6 ώρες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη για να cross-link χρωματίνης. Μετά κατεργασία με υπερήχους σε διάτμηση χρωματίνης /ΟΝΑ, λύματα παρασκευάστηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. DNA στόχου μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας το PCR πραγματικού χρόνου μηχανή ΑΒΙ 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν έναντι σήμα από τον αντίστοιχο έλεγχο IgG.

κηλίδος Western αναλύσεις

Τα δείγματα φορτώθηκαν σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές Τπδ /γλυκίνης που βασίζεται. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα με χρήση Τρις /γλυκίνης που βασίζονται σε ρυθμιστικό μεταφοράς υποβρύχιο σύστημα Bio-Rad του (Mississauga, ΟΝ, Canada). Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με ακόλουθα αντισώματα: AR PG21 (1:1000) (Upstate Biotechnology, Waltham, ΜΑ, USA)? AR 441 (1:500), ή FUS 4H1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc).

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

κύτταρα LNCaP (5 × 10

5) σε 10