Αφηρημένο

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) είναι ένα συγκεκριμένο υπότυπο του καρκίνου του πνεύμονα που παρουσιάζουν ως ιδιαίτερα μεταστατική νόσο με εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση. Παρά ανταποκρίνεται αρχικά καλά στην χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, SCLC σχεδόν αμετάβλητα υποτροπές και αναπτύσσει αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Αυτό είναι ύποπτο ότι σχετίζεται με κύτταρο όγκου υποπληθυσμών με διαφορετικά χαρακτηριστικά που μοιάζουν βλαστικά κύτταρα. Μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) είναι γνωστό ότι παίζει βασικό ρόλο στην μεταστατική διεργασιών και την ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου. Αυτό ισχύει επίσης για NSCLC, αλλά υπάρχει πολύ λίγες πληροφορίες σχετικά με τις διαδικασίες EMT στο SCLC μέχρι στιγμής. SCLC, σε αντίθεση με κυτταρικές σειρές NSCLC, αναπτύσσονται κυρίως σε επιπλέοντα συμπλέγματα κυττάρων και ένα μικρό μέρος ως κύτταρα προσκολλημένα. Συγκρίναμε αυτές μορφολογικά διαφορετικούς υποπληθυσμούς των κυτταρικών σειρών SCLC για ΕΜΤ και επιγενετικές χαρακτηριστικά, ανιχνεύοντας σημαντικές διαφορές στα προσκολλημένα υποπληθυσμούς με υψηλά επίπεδα δεικτών μεσεγχυματικών όπως βιμεντίνης και φιμπρονεκτίνη και πολύ χαμηλά επίπεδα των επιθηλιακών δεικτών, όπως Ε-καδερίνης και Zona Οοοίιιάεηδ 1. Επιπλέον, η έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με παράγοντες μεταγραφής όπως σαλιγκάρι /Snai1, Slug /Snai2, και Zeb1, τα πρότυπα μεθυλίωσης DNA των EMT σήμα κατατεθέν γονίδια, λειτουργικές αποκρίσεις όπως η μετανάστευση, εισβολή, έκκριση μεταλλοπρωτεασών μήτρας, και αντοχή σε χημειοθεραπευτική αγωγή φάρμακο όλα διέφερε σημαντικά μεταξύ των sublines. Αυτή η μεταβλητότητα φαινοτυπική μπορεί να αντανακλά την ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων και EMT κατά τη διάρκεια της μετάστασης

in vivo

, συνοδεύεται από την ανάπτυξη των πυρίμαχων νόσου σε υποτροπή. Προτείνουμε ότι η επιγενετική ρύθμιση διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο κατά τη διάρκεια φαινοτυπικά και λειτουργικές αλλαγές στα κύτταρα του όγκου και θα μπορούσε συνεπώς να παρέχει νέες επιλογές θεραπείας για ασθενείς με SCLC

Παράθεση:. Krohn Α, Ahrens Τ, Γιαλτσίν Α, Plönes Τ, Wehrle J , Taromi S, et al. Κυττάρων ετερογένεια (2014) Tumor σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC): φαινοτύπου και Λειτουργικές διαφορές που σχετίζονται με επιθηλιακά μεσεγχυματικά Μετάβασης (EMT) και μεθυλίωσης του DNA αλλαγές. PLoS ONE 9 (6): e100249. doi: 10.1371 /journal.pone.0100249

Επιμέλεια: Bernard W. Futscher, Το Πανεπιστήμιο της Αριζόνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 22η Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Krohn et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), C3 έργου, CRC 850 (σε MB), και την Deutsche Krebshilfe (110213 έως BH). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) είναι μια εξαιρετικά κακοήθης και επιθετική πνευμονική νεοπλασία αντιπροσωπεύουν περίπου το 10-15% όλων των καρκίνων του πνεύμονα που αναφέρθηκαν. Περίπου 30.000 περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], [2]. Ως ξεχωριστή υποομάδα καρκίνο του πνεύμονα διακρίνονται από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος πλακωδών κυττάρων, μεγάλο καρκίνωμα και αδενοκαρκίνωμα), SCLC χαρακτηρίζεται από πολύ νωρίς μετάσταση και φτωχή πρόγνωση. Οι περισσότεροι ασθενείς παρουσιάζουν κομβικών μεταστάσεις, και τα δύο τρίτα έχουν ήδη απομακρυσμένες μεταστάσεις κατά τη στιγμή της διάγνωσης [3]. Παρά ανταποκρίνεται αρχικά και σε ράδιο- και τη χημειοθεραπεία, η συντριπτική πλειοψηφία υποτροπές με ποσοστό 1 έτους επιβίωσης για SCLC μόνο 40%, και η επιβίωση 5 ετών κάτω των 5 ετών [4]%. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η θεραπεία NSCLC έχει προχωρήσει τα τελευταία χρόνια, SCLC θεραπεία παραμένει μη ικανοποιητική [5]. Έχουμε δει σημαντικές προόδους στην αντιμετώπιση της τα τελευταία 30 χρόνια από το πρότυπο σχήμα του Etoposide σε συνδυασμό με σισπλατίνη ή η καρβοπλατίνη ιδρύθηκε στα μέσα της δεκαετίας του 1980 [6]? χειρουργική εκτομή είναι η εξαίρεση και θα μπορούσε να ωφελήσει μόνο μια μειοψηφία των ασθενών προσεκτικοί επιλεγεί [7]. Υπάρχει προφανώς μια επείγουσα ανάγκη για νέες προσεγγίσεις για την κατανόηση και τη θεραπεία αυτού του συγκεκριμένου υποτύπου καρκίνου του πνεύμονα.

SCLC υποθέτει ένα ευρύ φάσμα των μορφολογικών εμφανίσεις ιστοπαθολογικά, με καρκινικά κύτταρα συνήθως μικρότερο από το μέγεθος του 3 αναπαύεται λεμφοκυττάρων. Ωστόσο, υπάρχουν δείγματα που περιέχουν κύτταρα φθάνοντας τόσο μεγάλη όσο 7 λεμφοκυττάρων, αποδεικνύοντας μορφολογικά μεταβλητότητα τους [8] εντός του ιστού του όγκου. Τυπικά κυτταρολογικά χαρακτηριστικά λεπτή κόκκους χρωματίνης, την έλλειψη εξέχοντα πυρήνια και των κελιών, και την έκφραση των δεικτών νευροενδοκρινείς [8]. Από το 2004, η ταξινόμηση WHO SCLC περιγράφει δύο υποτύπους: καθαρή SCLC με μεγάλα κύτταρα λιγότερο από 10%, και σε συνδυασμό με SCLC συστατικά άνω του 10% μη-μικρού κυττάρου [9]. Οι όγκοι με υψηλή ποσότητα των συστατικών μη-μικρού κυττάρου που περιγράφεται ως περισσότερο ανθεκτική στη θεραπεία από το καθαρό SCLC [10]. Έχει επίσης προταθεί ότι SCLC όγκοι αποκτούν χημειοθεραπεία και ραδιοαντοχή κατά τη διάρκεια της θεραπείας, εξελίσσεται σε συνδυασμό SCLC [11].

Για να μεταστάσεις, τα κύτταρα πρέπει να αλλάξουν φαινότυπο τους. Μεμονωμένα κύτταρα ή μικρές ομάδες κυττάρων αποκτήσουν την ικανότητα να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν μέσω βασικής μεμβράνης του περιβάλλοντα ιστού. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα καρκινικά κύτταρα να διαλύσει συνδέσεις κυττάρου-κυττάρου, χάνοντας βασικοκυτταρικό-κορυφής πολικότητα τους, συνοδεύεται από μορφολογικές αλλαγές αποκαλύπτοντας ένα σχήμα της ατράκτου, μετά από την οποία μικρολάχνες, filopodia και microtentacles γίνει έντονη αντ ‘αυτού. Επιπλέον, πρωτεάσες όπως Matrix μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) γίνονται ρυθμίζεται προς τα πάνω, διευκολύνοντας αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας. Αυτές οι διαδικασίες είναι επίσης γνωστές ως επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) και έχουν περιγραφεί σε μία ποικιλία τύπων καρκίνου [12] – [15]. Ωστόσο, δεν υπάρχει σχεδόν καμία πληροφορία σχετικά με τις διαδικασίες EMT στο SCLC μέχρι σήμερα [16]. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η EMT είναι κρίσιμη τόσο μετάσταση και σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία και ραδιοαντοχή [17]. EMT είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει έντονη κυτταρική πλαστικότητα και πολλές διακριτές γενετικές και επιγενετικές αλλαγές [18]. μεταγραφικούς παράγοντες όπως σαλιγκάρι /Snai1, Slug /Snai2, Zeb1, FSP και άλλοι προκαλούν το πάνω και προς τα κάτω ρύθμιση πολλών γονιδίων. E-cadherin έχει περιγραφεί ως κεντρικό παράγοντα στην μετάβαση μεταξύ του επιθηλίου και του μεσεγχύματος φαινότυπο. Zeb1 και Σαλιγκάρι /Snai1 συνδέονται με υποκινητή E-cadherin και να καταστέλλουν τη μεταγραφή των μορίων προσκόλλησης κυττάρων [19]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η E-cadherin και Zona Οοοίιιάεηδ 1 συνήθως ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της EMT, οι μεσεγχυματικά γονίδια όπως βιμεντίνης, Ινωδονεκτίνης, και ΜΜΡ υπερεκφράζεται. Επιγενετικές μεταβολές όπως μεθυλίωσης του DNA, τροποποιήσεις των ιστονών και microRNAs είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε ΕΜΤ σχετίζονται γονιδιακής ρύθμισης [15] και ως εκ τούτου θα μπορούσε επίσης να είναι υπεύθυνο για τις αλλαγές στο φαινότυπο των κυττάρων προκειμένου να καταστεί δυνατή εξάπλωση και την προσαρμογή σε νέα μικρο-περιβάλλοντα.

στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε διαφορετικούς υποπληθυσμούς κυττάρων σε SCLC κύτταρα γραμμές, ειδικά σε κύτταρα ΝΟΙ-Η69, για τις διαφορές στο EMT βασικά γονίδια και λειτουργικά χαρακτηριστικά. Συγκρίναμε floating-κυτταρικά συσσωματώματα (NCI-Η69) με προσκολλημένα αναπτυσσόμενη παραλλαγή υποπληθυσμών (NCI-H69V). επελέγη NCI-H69V από την γονική κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η69 και είναι μια παραλλαγή λόγω των χαμηλών επιπέδων των δεικτών νευροενδοκρινικών [20]. Συγκρίνοντας τις υποσειρές των ΝΟΙ-Η69 αποκαλύπτει σαφώς διαφορετικό σχήμα έκφρασης για δείκτες ΕΜΤ και μεθυλίωσης του DNA, το οποίο με τη σειρά του συνδέεται με λειτουργικές συνέπειες, όπως η ικανότητα για εισβολή, τη μετανάστευση, ΜΜΡ έκκριση και ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και χημειοαντίσταση. Συνοπτικά, αυτή η μελέτη εισηγείται ότι υπάρχει ένα ποσοστό των μεσεγχυματικών κυττάρων εντός κυτταρικές σειρές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα που θα μπορούσαν να αντανακλούν το

in-vivo

κατάσταση στην SCLC με όγκους που περιέχουν ετερογενή υποπληθυσμών των κυττάρων του όγκου με περισσότερο ή λιγότερο επιθηλιακά και /ή μεσεγχυματικών χαρακτηριστικά που θα μπορούσαν να σχετίζονται με τις λειτουργικές αποκρίσεις κατά τη διάρκεια των διαδικασιών της μετάστασης.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου SCLC ΝΟΙ-Η69, NCI-H82 και NCI-N592 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA). ΝΟΙ-Η69 και NCI-N592 ελέγχθηκε από LGC Προτύπων Κυτταρικής Γραμμής ταυτότητας. NCI-H69V ευγενικά παρέχεται από το BIOSs Εργαλειοθήκη (Freiburg, Γερμανία). Επιπλέον, ΝΟΙ-Η69 και ΝΟΙ-H69V κύτταρα συγκρίθηκαν με συστοιχία SNP (τα δεδομένα δεν φαίνονται), η οποία αποδείχθηκε ίδιο κυτταρικής προέλευσης. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI (Gibco-BRL, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco-BRL, Grand Island, ΝΥ, USA) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα (5% CO2) στους 37 ° C. Για να επιλέξετε για προσκολλημένα υποπληθυσμών, τα προσκολλημένα κύτταρα μέσα σε ΝΟΙ-Η69, NCI-H82 και NCI-N592 κρατήθηκαν σε πολιτισμό, ενώ επιπλέοντα κύτταρα απορρίπτονται σε πολλαπλά περάσματα.

ρυθμούς ανάπτυξης και χρόνος διπλασιασμού του πληθυσμού

οι ρυθμοί ανάπτυξης του ΝΟΙ-Η69 και NCI-H69V προσδιορίστηκαν σπορά 3 * 10

6 κύτταρα (εις τριπλούν) σε φιάλες καλλιέργειας ιστού. Τα κύτταρα μετρήθηκαν την ημέρα 2, 4 και 6 χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Για τον υπολογισμό του πληθυσμού διπλασιασμού χρόνου (PDT), ο τύπος PDT = h * ln (2) /ln (c2 /c1) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες ATCC. Χρώσης

ανοσοφθορισμού βιμεντίνης, Ε-καδερίνης, Zona Οοοίιιάεηδ και Ki-67

τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 2% PFA, διαπερατά με 0.5% TritonX-100 σε 4 ° για 10 min, και αποκλείστηκαν με PBS που περιέχει 5,0% (ν /ν) φυσιολογικό ορό αίγας και 0,3% (ν /ν) Triton Χ-100. χρώση ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε με mAb ποντικού Ki-67 (Dako, Αμβούργο, Γερμανία), βιμεντίνη XP Rabbit mAb, Ε-καδερίνη mAb κουνελιού και Zona Οοοίιιάεηδ mAb (Cell Signaling Technologies, ΜΑ, USA), και τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα (κατσίκα-αντι -mouse IgG-Alexa488 και κατσίκας-αντι-κουνελιού IgG-Alexa467, Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Οι πλάκες στη συνέχεια τοποθετείται με Αντιδραστήριο Gold Prolong αντιξεθωριάσματος με DAPI (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Αντίστροφη μεταγραφή PCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, που ακολουθείται από πέψη του DNA με ϋΝάση Ι (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK). Για την σύνθεση cDNA 1 μg συνολικού RNA μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας το κιτ iScript (

Bio-Rad

, Hercules, CA, USA). Το cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας

Taq πολυμεράση

(Qiagen, Hilden, Germany) με χρήση ακόλουθο πρόγραμμα PCR για όλους τους εκκινητές: 94 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 28 κύκλους των 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα και τελευταίο γύρο ενίσχυσης στους 72 ° C για 5 λεπτά. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1,0%, οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από φως UV. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, ζώνες PCR αναλύθηκαν από ImageJ 1.42q. Για αλληλουχίες εκκινητή βλέπε Πίνακα 1.

Η

Παρασκευή εκχυλισμάτων κυττάρου και ανάλυση Western blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και λύθηκαν χρησιμοποιώντας Qproteome θηλαστικών Protein Prep Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) ή με ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 20 mM Tris /HCl ρΗ 8,0, 150 mM ΚΟΙ, 1 mM EDTA, 0.2 mM Na3VO4, 1% Triton Χ-100, 0,5 mM PMSF με αναστολέα πρωτεΐνης κοκτέιλ (πλήρης, Roche Applied Science, Basel, Switzerland). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης δείγματα μετουσιώθηκαν στους 95 ° C για 5 λεπτά, διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PDVF. Οι μεμβράνες στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS /0.1% Tween-20 και επωάστηκαν για μία νύχτα με τα ακόλουθα αντισώματα: ΖΩ-1 mAb, βιμεντίνης XP κουνέλι mAb, Ε-καδερίνης κουνέλι mAb, σαλιγκάρι κουνέλι mAb, Slug κουνέλι mAb, TCF8 /ZEB1 Rabbit mAb, β-κατενίνης κουνελιού IgG mAb αντι-κουνελιού, GAPDH κουνέλι mAb, HRP-συνδεδεμένο αντίσωμα (μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) αντίσωμα Sampler Kit # 9782 από τη Cell Signaling Technologies, ΜΑ, USA) και L -Dopa (# 8786 Cell Signaling Technologies, ΜΑ, USA), Neuron-ειδική ενολάση (NSE) (# 9536 Cell Signaling Technologies, ΜΑ, USA). Τέλος, ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο και το ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Freiburg, Γερμανία)

Pyrosequencing

Γονιδιωματικό ϋΝΑ εξήχθη χρησιμοποιώντας DNeasy Blood & amp.? Ιστού Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) και ποσοτικά με τη χρήση NanoDrop 1000 Φασματοφωτόμετρο (peqlab, Erlangen, Γερμανία). DNA ήταν κατεργασμένου με όξινο θειώδες χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold Kit (Zymo Research, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αποθηκεύονται σε κλάσματα στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Pyrosequencing Δοκιμασία Σχεδιασμός Λογισμικού (Qiagen, Hilden, Γερμανία) (Πιν.2). Μια καθολική ετικέτα τοποθετήθηκε στο 5 ‘άκρο της αλληλουχίας-ειδικό αντίστροφο εκκινητή για Cdh1 και ένα αντίστοιχο καθολική βιοτινυλιωμένο εκκινητή που περιέχει μια ετικέτα 5’ βιοτίνης προστέθηκαν σε αυτές τις PCR αντιδράσεις. Το 5 ‘άκρο της αλληλουχίας-ειδικό αντίστροφο εκκινητή που χρησιμοποιείται για VIM αμπλικόνιο 1 και 2 αμπλικόνιο σημάνθηκε με βιοτίνη. Το αμπλικόνιο (που εκτείνονται σε -61 έως 18 σε σχέση με το TSS) της Cdh1 περιλαμβάνονται επτά περιοχές CpG. Σε περίπτωση βιμεντίνης, το αμπλικόνιο χωρίστηκε σε δύο μέρη, που χωρίζονται από ένα 73-bp κενό. Η πρώτη amplicon της βιμεντίνης μεταξύ nt +608 σε +703 σε σχέση με το TSS περιείχε δώδεκα και το δεύτερο αμπλικονίου (εκτείνεται +468 να +537 σε σχέση με το TSS) οκτώ θέσεις CpG, αντίστοιχα. Κάθε 25 μΙ αντιδράσεως PCR περιείχε 1,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 0,03 υ /μΙ Hot Start Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, CA, USA), 0,16 μΜ προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή και 1 μΐ των επεξεργασμένων με όξινο θειώδες DNA. Για Cdh1 0.16 μΜ πρόσθιου εκκινητή και 0.03 μλ ουρά αντίστροφο εκκινητή και 0.14 μΜ καθολική βιοτινυλιωμένου εκκινητής χρησιμοποιήθηκε. Οι συνθήκες κύκλων είχαν ως εξής: 95 ° C για 5 λεπτά για αρχική μετουσίωση? 50 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, μεταβάλλοντας τη θερμοκρασία ανόπτησης για 30 s και επέκταση στους 72 ° C για 30 s. PCR προϊόντα έγιναν ορατά σε πηκτώματα αγαρόζης 2%. Κάθε Pyrosequencing αντίδραση λήφθηκε με 8-10 μΐ κάθε βιοτινυλιωμένο PCR προϊόντος και την Pyromark Gold Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε ένα pyrosequencer PyroMark Q96 MD (Qiagen, Hilden, Germany). Εν συντομία, βιοτινυλιωμένα μονό κλώνο DNA ακινητοποιήθηκε σε σφαιρίδια Sepharose High Performance επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη (GE Healthcare, UK) και διαχωρίζονται με μετουσίωση με 0.2 Ν ΝαΟΗ. Μετά την ανόπτηση του εκκινητή προσδιορισμού αλληλουχίας (0,25 μΜ /αντίδραση) στη βιοτινυλιωμένο μονού κλώνου DNA, το μίγμα υποβλήθηκε σε ανάλυση αλληλουχίας. Πυρογραμμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Pyro Q-ΟρΟ να προσδιοριστεί το επίπεδο μεθυλίωσης των μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων κυτοσίνες σε κάθε θέση CpG στο αμπλικόνιο. Κάθε ανάλυση Pyrosequencing έγινε ανεξάρτητα πραγματοποιείται τουλάχιστον τρεις φορές. ζευγαρωμένο t τεστ του Student έγιναν για τη δοκιμή στατιστικές διαφορές στη μέση στάθμη μεθυλίωση των αναλύθηκαν αμπλικονίων. Καλλιεργημένα ινοβλάστες πνεύμονα απομονώθηκαν από τρεις ασθενείς χωρίς ινωτικές ασθένειες χρησίμευσε ως κανονικός έλεγχος. Τα ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για PCR παρατίθενται στον Πίνακα 2.

Η

δοκιμασία πρωτεόλυση Ζωντανά κυττάρων

πλακίδια θαλάμου LabTek 4-φρεατίων επικαλύφθηκαν με μήτρα μεμβράνη δωρεάν υπόγειο ερυθρού φαινόλης, το οποίο περιέχει 30 ng /ml DQ-κολλαγόνο IV (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Μετά από 12 λεπτά στερεοποίηση, 3 × 10

4 κύτταρα σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης RPMI με 1% FCS απλώθηκαν πάνω από την μήτρα βασικής μεμβράνης επικαλυμμένη. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 2% PFA, χρωματίστηκαν με Hoechst και τοποθετημένα. προϊόντων αποδόμησης της DQ-υπόστρωμα (πράσινος φθορισμός) αναλύθηκαν σε ένα αυτοματοποιημένο μικροσκόπιο (scan∧R – της Olympus) χρησιμοποιώντας ένα 20x, NA 0,75 στόχος UPLSAPO με εκπομπή Hoechst μετράται σε 440 έως 475 nm και DQ-κολλαγόνο στα 520-550 nm . Η μέση ένταση της υποβάθμισης DQ-υποστρώματος υπολογίστηκε με τη χρήση του scan∧R Λογισμικό Ανάλυσης (ν. 1.2.0.6) και ομαλοποιήθηκε ως προς τον αριθμό των κυτταρικών πυρήνων.

συστοιχία αντισωμάτων Matrix μεταλλοπρωτεϊνασών

Matrix μεταλλοπρωτεϊνάσες στο κελί-ρυθμισμένα μέσα αναλύθηκαν με το Array Human ΜΜΡ 1 (RayBiotech, Norcross, GA, USA). Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με FCS-ελεύθερο και ελεύθερο ερυθρού φαινόλης RPMI 1640 για όλη τη νύχτα. Μετά από φυγοκέντρηση, ρυθμισμένο μέσο κυττάρων εφαρμόστηκε σε προ-αποκλεισμένη μεμβράνες, επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα και υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίσωμα συστοιχίες ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό ImageJ v. 1.42q.

Η ζελατίνη Ζυμογράφημα

ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 δραστηριότητες αξιολογήθηκαν με ζυμογραφία ζελατίνης. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με FCS-ελεύθερο και ελεύθερο ερυθρού φαινόλης RPMI 1640 για όλη τη νύχτα. Κυττάρων ρυθμισμένα μέσα συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας Amicon Ultracel 10 k στήλες. Μετά τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων πρωτεΐνης από Bradford προσδιορισμό, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης και 2 μl ΜΜΡ-2 Ζυμογράφημα ελέγχου (ProteaImmun, Βερολίνο, Γερμανία) ηλεκτροφορήθηκαν σε 7% γέλες SDS-πολυακρυλαμιδίου, που περιέχει 1 mg /ml ζελατίνη (Merck, Darmstadt, Γερμανία) . Τα πηκτώματα πλύθηκαν σε 2.5% Triton Χ-100 διαλύματος για 1 ώρα, στη συνέχεια επωάζονται όλη τη νύκτα σε ρυθμιστικό διάλυμα επώασης (0,05 Μ Tris /HCl ρΗ 7,5, 0,2 Μ NaCl και 0.005 Μ CaCl2) στους 37 ° C. Τα πηκτώματα σταθεροποιήθηκαν εντός 12% TCA για 1 ώρα και χρωματίστηκαν σε Coomassie brilliant blue-R250 λύση χρώση για 1 ώρα, ακολουθούμενη από αποχρωματισμού. Για τους ελέγχους φόρτωσης, τα δείγματα φορτώθηκαν σε SDS-PAGE και χρώση με Coomassie λαμπρό χρώση blue-R250.

Drug Resistance

Για να δοκιμάσετε χημειοευαισθησία, 3 × 10

4 ΝΟΙ-Η69 ή κύτταρα NCI-H69V σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων για 12 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 200 μΜ ετοποσίδη (Sigma-Aldrich, Μόναχο, Γερμανία) για 48 ώρες όπως περιγράφεται προηγουμένως [21]. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Sigma-Aldrich, Μόναχο, Γερμανία) και 3,3′-dihexyloxacarbocyanine ιωδίδιο (DiOC6) (Sigma-Aldrich, Μόναχο, Γερμανία). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 0.5% BSA, 10 ηΜ DIOC 6 και 2 mg /ml ΡΙ στους 37 ° C για 20 λεπτά και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε ένα FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Η κυτταρομετρία ροής δεδομένων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo v.7.6.3 λογισμικού (Δέντρο Αστέρι Inc., San Carlos, CA, USA).

Transwell μετανάστευσης

Η μετανάστευση των SCLC κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας 24- καλά μικροχημειοταξίας πλάκες (Costar, New York, USA), στην οποία 1 × 10

6 κύτταρα σε 100 μL RPMI 1640 χωρίς FCS μετά ασιτία για 12 ώρες τέθηκαν σε άνω θάλαμο και ο κατώτερος θάλαμος περιείχε RPMI με 10% FCS . Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C σε 5% CO

2, τα κύτταρα μετρήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εισβολή κύτταρα στον πυθμένα του ενθέτου μεμβράνης διαχωρίστηκαν με θρυψίνη και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Μετανάστευση δείκτης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν διαιρείται με τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν στο μη επεξεργασμένο ομάδα. Κάθε πείραμα έγινε εις τριπλούν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή +/- SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα

δοκιμασίες Invasion

Για εισβολή προσδιορισμούς της QCMTM 24 φρεατίων κυττάρων Δοκιμασία Invasion. (ECM 550? Chemicon International, Temecula, CA, USA) με ένα μέγεθος πόρων 8 μm πολυανθρακικής μεμβράνης και ένα στρώμα ECMatrix-σαν υλικό χρησιμοποιήθηκε. Οι δοκιμασίες έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με την οποία 6 × 10

5 κύτταρα στερήθηκαν για 12 ώρες, εμβολιάζεται εντός του άνω θαλάμου, και επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2. Το κάτω θάλαμος περιείχε RPMI με 10% FCS. Μετά από 48 ώρες τα κύτταρα στον άνω θάλαμο απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας μπατονέτες, εισέβαλαν κύτταρα στον πυθμένα του ενθέτου μεμβράνης διαχωρίστηκαν με θρυψίνη και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ελέγχων και των ατομικών συνθήκες εκτιμήθηκε με GraphPad Prism Software 5 χρησιμοποιώντας το t-test. * Αντιπροσωπεύει μια τιμή Ρ από 0,01 έως 0.05 ** αντιπροσωπεύει μια τιμή Ρ από 0,01 έως 0,001 και το *** αντιπροσωπεύει μια τιμή Ρ μικρότερη από 0,001. Μία τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Τα βασικά δείκτες EMT βιμεντίνης και E-cadherin εκφράζονται διαφορικά

SCLC κυτταρικές σειρές όπως. ΝΟΙ-Η69 συνήθως αυξάνεται όσο πιο σφιχτά συσκευασμένο σε κυμαινόμενο αδρανών υλικών. Ωστόσο, ένα σταθερό ποσοστό (5-10%) του συνολικού αριθμού των κυττάρων παρατηρήσιμο μεγαλώνει προσκολλημένα. Για την κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η69 οπαδός υπογραμμή έχει συστάθηκε το όνομα NCI-H69V [20]. χρώση ανοσοφθορισμού διέφεραν σημαντικά κατά τη σύγκριση ΝΟΙ-Η69 και υπογραμμή του ΝΟΙ-H69V για τους βασικούς δείκτες των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών κυττάρων φαινοτύπους Ε-καδερίνης και βιμεντίνης: ΝΟΙ-Η69 ήταν θετικά για Ε-καδερίνης (Εικόνα 1a) και Zona Οοοίιιάεηδ (Σχήμα 1β ), αλλά δεν έδειξε βιμεντίνης έκφρασης (Σχήμα 1γ), ενώ η προσκολλημένα NCI-H69V ήταν αρνητική για Ε-καδερίνης (Εικόνα 1δ) αλλά ισχυρά θετικά για βιμεντίνη (Σχήμα 1F). Πλειονότητα των κυττάρων NCI-H69V ήταν αρνητικά για Zona Οοοίιιάεηδ (Σχήμα 1ε)? Ωστόσο, ορισμένα μεμονωμένα κύτταρα έδειξαν μικρή υπόλοιπο έκφραση Zona Οοοίιιάεηδ (Σχήμα 1ε, αστερίσκος). Η έκφραση του Ε-καδερίνης και βιμεντίνης, ως γονίδια σήμα κατατεθέν της ΕΜΤ, διακρίνει μεταξύ των διαφόρων υποπληθυσμών εντός της κυτταρικής γραμμής, καταδεικνύοντας την πλειοψηφία των επιθηλιακών κυττάρων που μοιάζουν και λιγότερες προσκολλημένα αναπτυσσόμενα κύτταρα με μεσεγχυματικά φαινότυπο.

κύτταρα ανάρτησης (ΝΟΙ-Η69) είναι έντονα θετικές για το E-cadherin (κόκκινο) (α) και Zona Οοοίιιάεηδ (κόκκινο) (β), ενώ τα προσκολλημένα κύτταρα NCI-H69V είναι αρνητικές για το E-cadherin (δ). Πλειονότητα των κυττάρων NCI-H69V ήταν αρνητικά για Zona Οοοίιιάεηδ, αλλά μερικά μεμονωμένα κύτταρα έδειξαν μικρή έκφραση Zona Οοοίιιάεηδ (αστερίσκο, ε). κύτταρα ανάρτησης (ΝΟΙ-Η69) είναι αρνητικά (γ), ενώ προσκολλημένα NCI-H69V είναι θετικά (στ) για βιμεντίνη (κόκκινο). Ki-67 συν-χρώση (πράσινο). Τα κύτταρα απαθανατίστηκε από Zeiss Αχίορίαπ μικροσκόπιο και AxioCam Digital και αναλύονται από το λογισμικό ZeissAxioVision. Ράβδος αντιπροσωπεύει 20 μm.

Η

διαφορετική μορφολογία των κυττάρων μέσα σε κυτταρικές σειρές SCLC

Ερευνήσαμε την κυτταρική μορφολογία των υποπληθυσμών (κυμαινόμενο εναντίον προσκολλημένα) σε SCLC κυτταρικές σειρές. Για το σκοπό αυτό η προσκολλημένη υποπληθυσμός αυξήθηκε κατά επιλογή έως ότου τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μια εντελώς προσκολλημένα μονοστιβάδα (Σχήματα 2β, e, g). Οι κυτταρικές σειρές έδειξαν διαφορές στην αυθόρμητη προσκόλληση: NCI-N592 συνδέεται πιο συχνά και πιο γρήγορα από ό, τι ΝΟΙ-Η69 (NCI-H69: σχήματα 2α, β /NCI-N592: Τα σχήματα 2d, ε). Μια προσκολλημένη υπογραμμή έχει καθιερωθεί εδώ και ΝΟΙ-Η69, δηλαδή NCI-H69V (Σχήμα 2γ) [20]. Η προσκολλημένη κυτταρική σειρά έχουμε επιλέξει τους εαυτούς μας αποκάλυψε παρόμοια μορφολογία (Εικόνες 2β, γ). Οι ρυθμοί ανάπτυξης και οι χρόνοι διπλασιασμού του ΝΟΙ-Η69 και NCI-H69V ήταν συγκρίσιμα με 28 ώρες (± 6,02) για ΝΟΙ-Η69 και 30 ώρες (± 7,34) για NCI-H69V (Σχήμα S1).

οι κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η69 SCLC αναπτύσσονται σε πλωτή συστάδες (α) με ένα μικρό υποπληθυσμό προσκολλημένα αναπτυσσόμενα κύτταρα τα οποία επιλέχθηκαν από τη διάθεση επιπλέοντα κύτταρα σε πολλαπλά περάσματα (β) που μοιάζει με την καθιερωμένη υπογραμμή NCI-H69V (γ). NCI-N592 και NCI-H82 σε τυπικά κυμαινόμενο συστάδες (δ, στ) και επιλεγμένα προσκολλημένα κύτταρα (ε, ζ). Προσκολλημένη υποπληθυσμών αποκαλύπτουν μια άτρακτο σχήμα, filopodia και microtentacles. Τα κύτταρα απαθανατίστηκε από Zeiss Αχίορίαπ μικροσκόπιο και AxioCam Digital και αναλύονται από Zeiss LSM Image Browser. Bar αντιπροσωπεύει 200 ​​μm

Η

Υπάρχουν εντυπωσιακές μορφολογικές διαφορές μεταξύ των προσκολλημένων και κυμαινόμενου κύτταρα σε όλες τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε SCLC:. Ενώ τα κύτταρα στην πλωτή συστάδες εμφανίζονται μικρά και στρογγυλά, με μικρές πυρήνες, που επισυνάπτεται κύτταρα είναι μεγαλύτερα, απλώνονται, και να έχουν ένα μεγάλο λόγο κυτόπλασμα προς τον πυρήνα. Ειδικότερα, τα κύτταρα NCI-H69V έχουν ένα σχήμα ατράκτου με μακριά ψευδοπόδια και ίνες, λεπτή κοκκώδη χρωματίνης και η έλλειψη εξέχοντα πυρήνια. Επιπλέον, προσκολλημένα κύτταρα δεν αναπτύσσονται μέσω σφιχτό επαφές κυττάρου-κυττάρου μέχρι να είναι εξαιρετικά συρροή.

Η έκφραση του ΕΜΤ-σχετικών γονιδίων και οι αλλαγές μεθυλίωσης DNA σε βιμεντίνης και Ε-καδερίνης διάρκεια ΕΜΤ

mRNA έκφραση των τυπικών προϊόντων γονιδίου ΕΜΤ συγκρίθηκαν μεταξύ των διαφόρων SCLC κυτταρικές σειρές και επιλέγονται προσκολλημένα sublines του με RT-PCR (Σχήμα 3α). Η επιθηλιακή γονίδιο δείκτη Ε-καδερίνης ήταν εντόνως εκφρασμένο σε πλωτά ΝΟΙ-Η69. Αντίθετα, η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν χαμηλή σε προσκολλημένα NCI-H69V. Βιμεντίνης ήταν απούσα στα επιπλέοντα κύτταρα ΝΟΙ-Η69, ενώ έντονα εκφράζεται σε μεγαλώνουν προσκολλημένα NCI-H69adh και NCI-H69V (Σχήμα 3α). Αυτές οι διαφορές στην έκφραση του mRNA ανιχνεύθηκαν επίσης σε NCI-H82 και ΝΟΙ-N592 υποσειρές, με τα προσκολλημένα κύτταρα επιδεικνύοντας μια πιο μεσεγχυματικά-σαν πρότυπο. Ωστόσο, η μετατροπή δεν ήταν τόσο σαφής όσο ότι σε ΝΟΙ-Η69 /NCI-H69V (Σχήμα 3α).

δείκτες EMT και μεταγραφικοί παράγοντες εκφράζονται με διαφορετικό τρόπο στα SCLC γραμμές (ΝΟΙ-Η69, NCI-H82, και NCI-N592). κύτταρα ΝΟΙ-Η69 δεν εκφράζουν δείκτες μεσεγχυματικών ή πηνία σε καλλιέργειες εναιωρήματος, εμφανής στο επίπεδο του mRNA με RT-PCR (α). Zeb1, σαλιγκάρι /Snai1, Slug /Snai2, και FSP εκφράζονται στο προσκολλημένα υπογραμμή (NCI-H69V), αλλά E-cadherin εκφράζεται μόνο σε κύτταρα αναστολή. σημειωτές μεσεγχυματικά φιμπρονεκτίνη και βιμεντίνης ρυθμίζονται προς τα άνω στα προσκολλημένα υποσειρές (α). Η έκφραση mRNA σε NCI-H82 και ΝΟΙ-N592 σύγκριση με προσκολλημένα υποκαλλιέργειες του αποκάλυψε γενικά μια παρόμοια τάση προς έναν φαινότυπο μεσεγχυματικά στα προσκολλημένα κύτταρα (α). Western blot ανάλυση εμφανίζει μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης στο επιθηλιακά δείκτες Ε-καδερίνης και Zona occludens 1, και έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών βιμεντίνης και ZEB1 σε NCI-H69V. EMT πηνία Σαλιγκάρι /Snai1, γυμνοσάλιαγκας /Snai2 εκφράζονται σε NCI-H69V (β). Η αλλαγή στην έκφραση προσκολλημένα NCI-N592 προς μια μεσεγχυματικά φαινότυπο είναι πιο σημαντική στο επίπεδο της πρωτεΐνης από το επίπεδο mRNA (b). Η δείκτες νευροενδοκρινών NSE και L-Dopa εκφράζονται στο γονική κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η69, αλλά δεν είναι ανιχνεύσιμα στο προσκολλημένα υπογραμμή NCI-H69V (γ). Ανάλυση μεθυλίωσης του DNA (δ) της EMT σήμα κατατεθέν γονίδιο βιμεντίνης δείχνει την ισχυρή μεθυλίωση σε ΝΟΙ-Η69 και σημαντική υπομεθυλίωση στην NCI-H69V, E-cadherin μεθυλίωση είναι σημαντικά υψηλότερο σε H69V. Ως έλεγχος, καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες πνεύμονα απομονώθηκαν από τρεις ασθενείς για επίπεδα μεθυλίωσης βιμεντίνης και από δύο ασθενείς για επίπεδα μεθυλίωσης Ε-καδερίνης χωρίς ινωτικές ασθένειες χρησίμευσε ως κανονικός έλεγχος. Η ράβδος δείχνει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων μετρήσεων. Οι διαφορές μεταξύ των επιπέδων μέσης μεθυλίωση της αναλύθηκαν amplicon ελέγχθηκε με τη χρήση μη ζευγαρωμένο t-test (* ρ τιμή από 0,01 έως 0.05 ** ρ τιμή από 0,01 έως 0,001 και το *** ρ τιμή μικρότερη από 0,001) Student.

στο σύνολό τους, η μεταγραφή EMT που σχετίζονται με παράγοντες Zeb1, σαλιγκάρι /Snai1, Slug /Snai2 και FSP εκφράστηκαν ποικιλοτρόπως στις διάφορες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3α). Σημειώσαμε τα ισχυρότερα διαφορές στην NCI-H69V σε σύγκριση με ΝΟΙ-Η69 και επομένως επικεντρώθηκε σε εκείνα τα κύτταρα στα ακόλουθα πειράματα.

Αυτή η μετατροπή από επιθηλιακά κύτταρα ΝΟΙ-Η69 σε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά (NCI-H69V) ήταν απέδειξε ακόμη περισσότερο προφανώς από το επίπεδο πρωτεΐνης (σχήμα 3β): ανιχνεύσαμε σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω της επιθηλιακής δεικτών Ε-καδερίνης και Zona occludens 1 σε NCI-H69V συνοδεύεται από προς τα πάνω ρύθμιση πηνία ΕΜΤ και τελεστές όπως ZEB1, σαλιγκάρι /Snai1, Slug /Snai2 και βιμεντίνης. Αν και η έκφραση του mRNA του NCI-N592 έτειναν μόνο προς ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά (Σχήμα 3a), η έκφραση της πρωτεΐνης αποκάλυψε σαφώς ένα μοτίβο μεσεγχυματικά (σχήμα 3β).

Είναι ενδιαφέρον ότι η δείκτες νευροενδοκρινική NSE και L-Dopa εκφράστηκαν σε η γονική κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η69, αλλά δεν ήταν ανιχνεύσιμα σε προσκολλημένα υποσειρά του (Σχήμα 3γ).

μεθυλίωσης του DNA της βιμεντίνης και E-cadherin

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον επιγενετική ρύθμιση μέσω μεθυλίωσης του DNA υποκινητή θα μπορούσαν να παίζουν ένα ρόλο στα επίπεδα έκφρασης, εφαρμόσαμε ποσοτική Pyrosequencing στις περιοχές υποκινητή της βιμεντίνης και Ε-καδερίνης (Εικόνα 3d). Ενώ ο υποκινητής βιμεντίνη έδειξε τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA του 35% σε κύτταρα ΝΟΙ-Η69, τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα NCI-H69V ήταν σημαντικά χαμηλότερα με 1,3% (p & lt? 0,0001). Αυτό οδηγεί σε δραστική μεταγραφή του γονιδίου, η οποία εμπίπτει σύμφωνα με την παρατηρούμενη αύξηση της βιμεντίνης στο /επίπεδο πρωτεΐνης mRNA (Σχήμα 1 και 2). Φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα (n = 3) έδειξε βιμεντίνης επίπεδα μεθυλίωσης του 1,1%. Αντιστρόφως, τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA του Ε-καδερίνης /Cdh1 ήταν 31% σε Η69 κύτταρα και αυξήθηκε σε 40% σε κύτταρα NCI-H69V (p = 0,0032). Φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα (n = 2) έδειξε 17% και 8% μεθυλίωση, αντίστοιχα. Αυτή η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης και της μεθυλίωσης του DNA μπορεί να υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση του DNA συμβάλλει στη ρύθμιση του mRNA βιμεντίνης και E-cadherin και την έκφραση της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας EMT σε κυτταρικές σειρές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα.

Ανώτατη τη μετανάστευση και επεμβατικές δυνατότητες των προσκολλημένων ΝΟΙ-Η69

Για να διερευνήσουν κατά πόσον αυτές οι δραματικές φαινοτυπικές διαφορές έχουν λειτουργικές συνέπειες, θα πραγματοποιηθεί μεταξύ φρεατίων δοκιμασιών μετανάστευσης και της εισβολής. Τα προσκολλημένα κύτταρα NCI-H69V κατέδειξε σημαντικά υψηλότερη μετανάστευση και εισβολή σε πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας προς 10% FCS-περιέχον μέσον από τα κύτταρα NCI-Η69 (Σχήμα 4). ΝΟΙ-Η69 έδειξε πολύ μικρή πιθανότητα μετανάστευσης και σχεδόν καμία εισβολή. Το επίπεδο της μετανάστευσης στα κύτταρα αναστολή ΝΟΙ-Η69 ήταν 15 κύτταρα ανά θάλαμο μετανάστευση (± 6 /n = 3), ενώ NCI-H69V αυξήθηκε 11 φορές με 196 κύτταρα ανά θάλαμο μετανάστευση (± 81 /n = 3) (p = 0,0001 ). Το επίπεδο εισβολή στο Η69 ήταν 7 κύτταρα ανά θάλαμο μετανάστευση (± 3 /n = 3), ενώ NCI-H69V ήταν 16 φορές υψηλότερη με 118 κύτταρα ανά θάλαμο μετανάστευση (± 35 /n = 3) (p = 0,0001).

προσκολλημένα αναπτυσσόμενα κύτταρα ΝΟΙ-Η69 επιδεικνύουν σημαντικά υψηλότερη μετανάστευση (α) και εισβολή (β) προς 10% FCS που περιέχει μέσο σε σύγκριση με το κυτταρικό εναιώρημα γραμμή (*** ρ = 0,0001). Μετανάστευση Index ορίστηκε ως ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν διαιρείται με τον αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων στην ομάδα χωρίς αγωγή (χωρίς FCS) μετά από 48 ώρες. Εισβολή Index ορίστηκε ως αριθμός των καταμετρηθέντων κυττάρων σε πέντε τομείς άποψη διαιρείται με τον αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων στην ομάδα χωρίς αγωγή (χωρίς FCS) μετά από 48 ώρες.

Η

Ζωντανές απεικόνισης κυττάρων εξωκυτταρικής πρωτεολυτική δραστικότητα υποδηλώνει υψηλότερη πρωτεολυτική δυναμικό των προσκολλημένων sublines

εισβολή των κυττάρων του καρκίνου συνοδεύεται με αποικοδόμηση εξωκυττάριας μήτρας (ECM). Λόγω της μεγαλύτερης εισβολής του προσκολλημένη υποσειρά, αναλύσαμε τις δυνατότητές της για την αποικοδόμηση του κολλαγόνου IV. Μετά από 48 ώρες επώασης επί matrigel περιέχουν DQ-κολλαγόνο IV, προσκολλημένα κύτταρα NCI-H69V αποκάλυψαν σημαντικά υψηλότερη περικυτταρική αποικοδόμηση του κολλαγόνου από τα κύτταρα ΝΟΙ-Η69, όπως μετράται με πράσινο φθορισμό. Ποσοτικοποίηση των πρωτεολυτικά ενεργά κύτταρα αποκάλυψε ότι το 77% των κυττάρων NCI-H69V ήταν θετικά, ενώ μόνο το 8% των κυττάρων ανάρτησης ΝΟΙ-Η69 ήταν θετικά (Εικόνα 5)

δοκιμασία ζωντανό κύτταρο πρωτεόλυση:. Αναστολής NCI -H69 και προσκολλημένα κύτταρα ΝΟΙ-H69V επωάστηκαν για 48 ώρες επί matrigel που περιέχει 30 ng /μl DQ-κολλαγόνο IV. (Α) Η αποδόμηση του κολλαγόνου προσδιορίζεται από πράσινο φθορισμό που περιβάλλει θετικά κύτταρα. Ράβδος αντιπροσωπεύει 30 μm.