Αφηρημένο

Μια υποξικό μικροπεριβάλλον των όγκων έχει αναγνωριστεί ως αιτία της κακοήθειας ή αντίσταση σε διάφορες θεραπείες του καρκίνου. Σε αντίθεση με την πρόσφατη πρόοδο στην κατανόηση της οξεία απόκριση των καρκινικών κυττάρων στην υποξία, τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων σε χρόνια υποξία παραμένουν ασαφείς. Έχουμε εντοπίσει μία παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή, AsPC-1, που είναι εξαιρετικά σε θέση να επιβιώσουν για εβδομάδες υπό συνθήκες οξυγόνου 1% ενώ οι περισσότερες εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές καρκίνου πεθαίνουν μετά από μόνο μερικές ημέρες υπό αυτές τις συνθήκες. Στη χρόνια υποξία, κύτταρα AsPC-1 εισήλθε σε μια κατάσταση λήθαργου που χαρακτηρίζεται από κανέναν πολλαπλασιασμό, χωρίς το θάνατο, και μεταβολικές καταστολή. Θα αναστρέψιμα αλλάξει σε ενεργή κατάσταση αφού έχουν τεθεί και πάλι σε βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας. ΑΤΡ κύκλου εργασιών, ένας δείκτης της ενεργειακής ζήτησης, ήταν σημαντικά μειωμένη και συνοδεύεται από μειωμένη φωσφορυλίωση ΑΚΤ. Αναγκαστική ενεργοποίηση της ΑΚΤ οδήγησε σε αύξηση του κύκλου εργασιών ΑΤΡ και μαζική θάνατο των κυττάρων

in vitro

και ένα μειωμένο αριθμό των αδρανών κυττάρων

in vivo

. Σε αντίθεση με τις περισσότερες καρκινικές κυτταρικές σειρές, πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα ορθοκολικού καρκίνου εισέλθει εύκολα το αδρανοποιημένα κατάσταση με καταστολή ΑΚΤ υπό υποξία σε συνδυασμό με συνθήκες αυξητικό παράγοντα-εξαντλημένο. Πρωτογενή ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα σε λανθάνουσα κατάσταση ήταν ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία. Έτσι, η ικανότητα να επιβιώνουν σε μία κατεστραμμένη μικροπεριβάλλον συνάπτοντας λήθαργο κάτω χρόνια υποξία μπορεί να είναι μια κοινή ιδιότητα μεταξύ των καρκινικών κυττάρων. Στόχευση του κανονιστικού μηχανισμού που προκαλεί αυτή την λανθάνουσα κατάσταση θα μπορούσε να προσφέρει μια νέα στρατηγική για την αντιμετώπιση του καρκίνου

Παράθεση:. Endo Η, Okuyama Η, Ohue Μ, Inoue Μ (2014) Λήθαργος των καρκινικά κύτταρα με καταστολή της ΑΚΤ δραστηριότητα συμβάλλει στην επιβίωση σε χρόνια υποξία. PLoS ONE 9 (6): e98858. doi: 10.1371 /journal.pone.0098858

Επιμέλεια: Pankaj Κ Singh, του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Ιανουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 8 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από KAKENHI (25461937) (www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/, HE, ΜΙ), το Φιλανθρωπικό Ταμείο Οσάκα Καρκίνου Ερευνητής-Βρέθηκαν (ΗΕ), η Ιαπωνία Ίδρυμα Εφαρμοσμένης Ενζυμολογία (www.mt- pharma.co.jp/jfae/, HE, HO, ΜΙ), Ίδρυμα Takeda Science (www.takeda-sci.or.jp/, ΜΙ), και Το Ίδρυμα Naito (www.naito-f.or.jp/, ΜΙ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μικροπεριβάλλον μέσα σε ένα συμπαγή όγκο μπορεί να είναι εξαιρετικά ετερογενής [1]. Λόγω της ατελούς δικτύων των αιμοφόρων αγγείων και την ανισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης, το μικροπεριβάλλον σε ορισμένα τμήματα ενός συμπαγούς όγκου μπορεί να είναι υποξικό και κακώς που παρέχονται με τα θρεπτικά συστατικά [2], [3]. Ανάλογα με το μικροπεριβάλλον τους, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να παρουσιάζουν αρκετά διαφορετικά χαρακτηριστικά της δραστηριότητας των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, ογκογόνο ενεργοποίηση μονοπατιού, και ο μεταβολισμός [4]. Tumor κύτταρα σε ένα υποξικό περιοχή μακρινή από τα αιμοφόρα αγγεία εμφανίζουν μειωμένο πολλαπλασιασμό [5] και αντίσταση σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία [6], [7]. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ένα

in vivo

μέθοδο γονίδιο-tagging, καταδείχθηκε ότι τα καρκινικά κύτταρα σε υποξικές περιοχές θα μπορούσε να είναι η προέλευση της επανεμφάνισης μετά την ακτινοθεραπεία [8]. Αναφέρθηκε επίσης ότι η αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης σε χρόνια υποξία συσχετίστηκε με υψηλά ποσοστά υποτροπής σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος [9]. Διερεύνηση της βιολογίας των καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες υποξίας μπορεί να είναι κρίσιμη για τη βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας και για την εξάλειψη του καρκίνου. Μετά την ανακάλυψη των υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α), μεταγραφική ρύθμιση σε απόκριση σε οξεία υποξία έχει αρκετά καλά διευκρινιστεί [10]. Σε αντίθεση με τις απαντήσεις των καρκινικών κυττάρων σε οξεία υποξία, όμως, πώς τα καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται στο σημαντικό αλλά διαφορετικές συνθήκες χρόνιας υποξίας [11] παραμένει άπιαστο.

σηματοδότησης PI3K /AKT διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην επιβίωση, πολλαπλασιασμός, και ο μεταβολισμός σε καρκινικά κύτταρα [12]. Λόγω της ακατάλληλης ενεργοποίησης του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK) ή ΡΙ3Κ, ή απώλεια της λειτουργίας του ΡΤΕΝ, συστατική ενεργοποίηση του ΑΚΤ παρατηρείται συχνά σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους [12]. Ενεργοποιημένος ΑΚΤ προωθεί γλυκολυτικού ή βιοσυνθετικών οδών ενεργοποιώντας GLUT1, εξοκινάση 2, ή ΑΤΡ-κιτρική λυάση. Ένα από τα κατάντη μορίων ΡΙ3Κ /ΑΚΤ είναι πολύπλοκη mTOR 1 (mTORC1), η οποία ενισχύει τη σύνθεση πρωτεϊνών και κυτταρικής ανάπτυξης. Έτσι, AKT mTORC1 μονοπάτια /παίζουν σημαντικό ρόλο για την ανάπτυξη του όγκου και το μεταβολισμό? ωστόσο τα διαθέσιμα υλικά για τη βιοσύνθεση δεν είναι πάντοτε άφθονα στην ετερογενή μικροπεριβάλλον του όγκου. Στην υποξική περιοχή μακριά από τα αιμοφόρα αγγεία, που υπέστη η ενεργοποίηση του μονοπατιού AKT /mTORC1 θα μπορούσε να οδηγήσει σε κρίσιμες εξάντληση των θρεπτικών ουσιών και ενεργειακής κρίσης.

Η ικανότητα να καταστέλλουν το βασικό μεταβολικό ρυθμό και να τεθεί σε ένα υπομεταβολική κατάσταση είναι ζωή-αποταμιευτής για πολλούς οργανισμούς, όταν η πηγή ενέργειας, όπως το οξυγόνο και τη διατροφή περιορίζονται [13], [14]. Πράγματι, ρύθμιση προς τα κάτω της δραστηριότητας mTORC1 στην οξεία υποξία είναι ευρέως γνωστό [15] – [17], και η καταστολή της mTORC1 φέρεται να είναι σημαντική για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου υπό συνθήκες στρες [4], [18], [19]. Παρ ‘όλα αυτά, όπως σημειώνεται, η χρόνια απάντηση των καρκινικών κυττάρων είναι λιγότερο καλά κατανοητές.

Ένας παράγοντας που εμποδίζει βελτιωμένη κατανόηση της αντίδρασης των καρκινικών κυττάρων σε χρόνια υποξία είναι η έλλειψη των καθιερωμένων

in vitro

μοντέλα . Οι περισσότερες μελέτες που χρησιμοποιούν κυτταρικές γραμμές καρκίνου έχουν διεξαχθεί εντός 24 ωρών ή μέχρι και μερικές ημέρες επειδή οι περισσότερες καρκινικές κυτταρικές γραμμές δεν μπορεί να επιβιώσει από την σοβαρή εξάντληση οξυγόνου ή θρεπτικών ουσιών για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι μια παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή, AsPC-1, μπορεί σταθερώς να επιβιώσει από την είσοδο σε μια ανενεργή κατάσταση, λήθαργο, για εβδομάδες υπό συνθήκες υποξίας. Κατά την εξέταση της κυτταρικής απόκρισης σε αυτή τη χρόνια υποξία, βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ ήταν μειωτικά, επιτρέποντας κύτταρα AsPC-1 για τη μείωση της ενεργειακής ζήτησης και να επιβιώσει κάτω από συνθήκες στρες. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα πρωτογενή καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα θα μπορούσαν εύκολα να εισέλθουν λήθαργου υπό συνθήκες παράγοντα στερούνται υποξική και την ανάπτυξη, στην οποία έδειξε αξιοσημείωτη χαρακτήρες χημειοθεραπεία.

Αποτελέσματα

Η επιβίωση των κυτταρικών σειρών σύμφωνα με χρόνιες υποξία

για να διερευνηθεί η επίδραση της παρατεταμένης υποξίας σε καρκινικά κύτταρα

in vitro

, εξετάσαμε διάφορα καρκίνο του παγκρέατος και του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 1% οξυγόνο για περισσότερο από μία εβδομάδα για να αντιπροσωπεύουν το χρόνιο κατάσταση, σε αντίθεση με το μικρότερο χρονικό μιας ημέρας ή έτσι για την οξεία πάθηση (Σχήμα S1). Οι περισσότερες από τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές δεν έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και πέθαναν μέσα σε 7 ημέρες. Έτσι, ήταν γενικά δύσκολο να κυτταρικές σειρές καρκίνου καλλιέργεια πάνω από μια εβδομάδα κάτω από υποξικές συνθήκες.

Σε αντίθεση, AsPC-1, ένα παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή, ήταν εξαιρετικά σε θέση να επιβιώσει υπό παρατεταμένη συνθήκες υποξίας (Σχήμα 1Α και ΝΤΟ). Στην οξεία φάση, AsPC-1 κύτταρα σε υποξία μεγάλωσε καθώς και σε νορμοξικές συνθήκες, αλλά ο ρυθμός πολλαπλασιασμού μειώθηκαν σταδιακά μέχρι την ημέρα 7, και ο αριθμός των κυττάρων σταθεροποιήθηκαν περίπου την 10η ημέρα σε λιγότερο από 80% συρροή σε πειραματικές συνθήκες. Τα κύτταρα σε νορμοξία έδειξαν μαζικό θάνατο των κυττάρων μετά από 14 ημέρες, πιθανώς λόγω της εξάντλησης των αυξητικών παραγόντων ή θρεπτικά συστατικά (Σχήμα 1 Β και C). Σε αντίθεση, τα κύτταρα σε υποξία ήταν βιώσιμες για περισσότερο από τρεις εβδομάδες χωρίς καμία ένδειξη κυτταρικού θανάτου, ενώ το μέσο δεν άλλαξε καθόλου. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι τα κύτταρα φάσης S μειώθηκαν δραστικά κατά την 7η ημέρα σε υποξία σε σύγκριση με την ημέρα 1 σε νορμοξία ή υποξία (Εικόνα 1D). Τα κύτταρα συσσωρευτεί σε είτε G0 /1 ή G2 /M φάση. Αυτή η μείωση του πολλαπλασιασμού ήταν αναστρέψιμη? μια φορά εκ νέου οξυγονωμένο και επανα-επιστρώθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο, ​​τα κύτταρα AsPC-1 έδειξε μια ανάκαμψη του ρυθμού πολλαπλασιασμού να ελέγχουν τα επίπεδα με μια μικρή καθυστέρηση, ακόμη και αφού έχουν καλλιεργηθεί επί 14 ημέρες σε υποξία (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα AsPC-1 θα μπορούσε αναστρέψιμα εισάγετε ένα ανενεργό κατάσταση, λήθαργο, υπό παρατεταμένη συνθήκες υποξίας.

αριθμός βιώσιμων κυττάρων (Α) και επί τοις εκατό θανάτου κυττάρου (Β) του AsPC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε νορμοξία ( 20% O

2) ή υποξία (1% O

2). C) αντίθεσης φάσης και εικόνες ΡΙ-χρώση του AsPC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό τις υποδεικνυόμενες συνθήκες. μπαρ κλίμακας = 50 μm. Δ) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων AsPC-1 την ημέρα 1 σε φυσιολογική οξυγόνωση ή την ημέρα 1 και την ημέρα 7 σε υποξία. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με BrdU για 2 ώρες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με αντι-BrdU αντίσωμα και ΡΙ. Τα ποσοστά των κυττάρων στη φάση S υποδεικνύεται. Ε) Re-ανάπτυξη των AsPC-1 κύτταρα σε λανθάνουσα κατάσταση. κύτταρα AsPC-1 καλλιεργήθηκαν σε υποξία για 14 ημέρες, και οι μετρήσεις των κυττάρων παρακολουθήθηκαν μετά την εκ νέου σπορά σε νορμοξικά συνθήκες.

Η Επειδή οι περισσότεροι φάρμακα χημειοθεραπείας στοχεύουν πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα, τα κύτταρα πλανάται στο ληθάργου θα ήταν

ανθεκτικά σε αυτά τα κυτταροτοξικά αντιδραστήρια. Πράγματι, τα κύτταρα AsPC-1 καλλιεργήθηκαν σε υποξικές συνθήκες ήταν ανθεκτικά σε όλα τα τρία φάρμακα χημειο εξετάστηκαν (Σχήμα S2A). Και τα δύο επίπεδα του οξυγόνου και του ρυθμού πολλαπλασιασμού επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας [20]. AsPC-1 κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας ήταν πιο ανθεκτικά στην ακτινοβολία ακτίνων-Χ σε σύγκριση με κύτταρα σε νορμοξία ή σε οξεία υποξία (Σχήμα S2B). Έτσι, AsPC-1 κύτταρα σε λανθάνουσα κατάσταση ήταν ανθεκτικά στη συμβατική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπείας.

Η αξιολόγηση του μεταβολισμού της ενέργειας στο πλαίσιο της χρόνιας υποξίας

Εμείς περαιτέρω αξιολόγησε την κατάσταση του ενεργειακού μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων σε λανθάνουσα κατάσταση. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα AsPC-1 καταναλώνεται περισσότερη γλυκόζη και παρήγαγε περισσότερο γαλακτικό στην οξεία φάση της υποξίας σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση. Αντίθετα, μετά από 7 ημέρες από την υποξία, η πρόσληψη γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή σταδιακά εξασθενημένα (Σχήμα 2Α, S3A και S3b). Ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου μειώθηκε επίσης κάτω από τη χρόνια υποξία (Σχήμα 2Α). Υπολογίσαμε το ATP κύκλου εργασιών από γαλακτικό ρυθμού παραγωγής και του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (Εικόνα 2Α) και διαπίστωσε ότι η ATP κύκλος εργασιών μειώθηκε κάτω χρόνιας υποξίας. Το εύρημα αυτό υποστηρίχθηκε επίσης από βραδύτερη μείωση στην κυτταρική επίπεδα ΑΤΡ μετά την προσθήκη ενός κοκτέιλ αναστολέων της γλυκόλυσης και οξειδωτική φωσφορυλίωση (Σχήμα S3C και S3D) [21].

Α) Γαλακτικό ρυθμού παραγωγής (αριστερά) υπολογίστηκε από γαλακτικό συγκέντρωση και αναπόσπαστο αριθμό των κυττάρων σε υποδεικνύεται περιόδους. O

2 ρυθμός κατανάλωσης (μέση) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρόδιο τύπου οξυγόνου Clark. κύκλου εργασιών ΑΤΡ (δεξιά) υπολογίστηκε από το ρυθμό παραγωγής του γαλακτικού οξέος και O

2 ρυθμός κατανάλωσης (σκούρο γκρι: γαλακτικό? ανοιχτό γκρι: το οξυγόνο). Ν1, νορμοξίας 1 ημέρα? Η1, υποξία 1 ημέρα? Η7, υποξία 7 ημέρες. **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001. Β) Ποσοτική RT-PCR ενός μεταφορέα γλυκόζης και γλυκολυτικά ένζυμα σε AsPC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υποξία για τις υποδεικνυόμενες ημέρες.

Η

Εκτός από αυτές τις δοκιμασίες, εξετάσαμε τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης γλυκολυτικών ενζύμων και τους μεταφορείς (Σχήμα 2Β). Μετά από έκθεση σε οξεία υποξία, η έκφραση του

GLUT1

,

HK2

, και

ΡϋΚ1

αυξηθεί. Σε αντίθεση, τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων μειώθηκε στα καρκινικά κύτταρα σε λήθαργο. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με την μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης σε χρόνια υποξία (Σχήμα S3A). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα έδειξαν ότι οι αδρανείς καρκινικά κύτταρα που παράγονται λιγότερο ATP, ενώ καταναλώνει λιγότερη ΑΤΡ σε σύγκριση με ενεργά διαιρούμενα κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει μείωση της ζήτησης ενέργειας. Έτσι, η καταστολή της μεταβολικής διαδικασίας είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων στο λανθάνουσα κατάσταση.

ενδοκυτταρική σηματοδότηση σε κύτταρα στο

κατάσταση ηρεμίας

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε ενδοκυτταρική σηματοδότηση στον καρκίνο αδρανοποιημένων-state κύτταρα (Σχήμα 3Α). Η φωσφορυλίωση των ΑΚΤ μειώθηκε μετά από 7 ημέρες από την υποξία, ακόμη και υπό παρατεταμένη ενεργοποίηση της ανάντη RTKs (Σχήμα S4A). Η φωσφορυλίωση της S6, ενός κατάντη μόριο mTORC1, μειώθηκε από μια προγενέστερη χρονική στιγμή, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [15], [16]. Προς τα πάνω ρύθμιση της φωσφο-p38MAPK και προς τα κάτω ρύθμιση της φωσφο-ΕΚΚ έχουν αναφερθεί ότι είναι ένας μοριακός διακόπτης για την επαγωγή των αδρανοποιημένων κατάσταση σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [22], [23], αλλά παρατηρήσαμε μικρή αλλαγή στα επίπεδα τους, και φωσφο-p38MAPK ήταν μάλλον μειώθηκε σε χρόνια υποξία. Η φωσφορυλίωση του eIF2α, η οποία στη συνέχεια ρυθμίζει προς τα κάτω τη σύνθεση παγκόσμια πρωτεΐνη [24], ρυθμίζεται αυξητικά στην οξεία υποξία, αλλά μείωσε σε χρόνια υποξία (Σχήμα S4A), υποδηλώνοντας μία κρίσιμη διαφορά στην απόκριση των κυττάρων κάτω από αυτές τις δύο συνθήκες. Τα επίπεδα του PHLPP, ενός ΑΚΤ Ser473-ειδική φωσφατάση [25], [26], οι αμοιβαίως αυξήθηκαν με ΑΚΤ de-φωσφορυλίωση (Σχήμα 3Α).

Α) Ανοσοστύπωμα της ΑΚΤ /mTORC1 ή ERK /p38 ΜΑΡΚ μονοπάτι σε AsPC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υποξία. Β) Ανοσοστύπωμα ΑΚΤ σηματοδότησης και HIF-1α σε κύτταρα AsPC-1 που εκφράζει τον έλεγχο των φορέων, ΑΚΤ-κβ, ή ΑΚΤ-3A (ανενεργό). Γ) κατάσταση του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων την ημέρα 7 σε υποξία. Τα ποσοστά των κυττάρων στη φάση S αναφέρεται ανωτέρω οικοπέδου και στο δεξί γράφημα. κύκλου εργασιών D) ΑΤΡ μετριέται με την προσθήκη αναστολέα κοκτέιλ για γλυκόλυση και οξειδωτική φωσφορυλίωση. Ν1, νορμοξίας 1 ημέρα? Η1, υποξία 1 ημέρα? Η7, υποξία 7 ημέρες. E, F) αριθμός βιώσιμων κυττάρων (Ε) και το ποσοστό κυτταρικού θανάτου (F) του AsPC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υποξία. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Επειδή η μειώθηκε ΑΚΤ φωσφορυλίωση συνέπεσε με την επαγωγή της λανθάνουσα κατάσταση, εξετάσαμε το λειτουργικό ρόλο της φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ σε λήθαργο. Εμείς μετάγονται τρία ΑΚΤ κατασκευασμάτων σε AsPC-1 κύτταρα: WT-ΑΚΤ, ΑΚΤ-3A (αδρανής μορφή του ΑΚΤ), και ΑΚΤ mΔPH (συστατική δραστική μορφή της ΑΚΤ) [27]. Όταν υπερεκφράζεται WT-AKT ή ΑΚΤ-mΔPH, φωσφορυλίωση ΑΚΤ διατηρήθηκε ακόμα και σε χρόνιες υποξία (Σχήμα 3Β, S4B). Σε κύτταρα ελέγχου, η έκφραση της GLUT1 αυξήθηκε σε οξεία υποξία, αλλά μειώθηκε σε παρατεταμένη υποξία, υπογραμμίζοντας και πάλι μια αντίθετη αντίδραση κάτω από τις δύο προϋποθέσεις. Αντίθετα, σε wt-ΑΚΤ υπερεκφράζουν κύτταρα, τα επίπεδα GLUT1 παρέμεινε υψηλή ακόμη και χρόνια υποξία (Σχήμα 3Β), που συνοδεύεται από συνεχή κατανάλωση γλυκόζης (Σχήμα S4C). Από την άλλη πλευρά, η φωσφορυλίωση S6 στη χρόνια υποξία μειώθηκε ακόμη και σε WT-ΑΚΤ υπερεκφράζουν κύτταρα (Σχήμα 3Β). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι η WT-ΑΚΤ-κύτταρα που υπερεκφράζουν στη χρόνια υποξία έδειξε ένα υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3C, Σχήμα S4D). Σε AsPC-1 κύτταρα που εκφράζουν τον φορέα ελέγχου ή αδρανείς ΑΚΤ-3A, ΑΤΡ κύκλος εργασιών μειώθηκε μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας σε υποξία (Εικόνα 3D)? Ωστόσο, WT-ΑΚΤ-κύτταρα που εκφράζουν υπέστη υψηλό κύκλο εργασιών ATP ακόμα και σε χρόνιες υποξία. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παρατεταμένη ενεργοποίηση της ΑΚΤ σηματοδότησης ανέστειλε κύτταρα AsPC-1 από την είσοδο σε μια λανθάνουσα κατάσταση σε χρόνια υποξία, υποδηλώνοντας ένα ρόλο για την καταστολή της ΑΚΤ στην είσοδο λήθαργο. Ο βιώσιμος αριθμός κυττάρων μειώθηκε ενώ το ποσοστό θανάτων αυξήθηκε μετά από 14 ημέρες σε WT-ΑΚΤ που εκφράζουν κύτταρα (Σχήμα 3Ε και F). ΑΚΤ mΔPH εκφράζουν κύτταρα έδειξαν μαζικό κυτταρικό θάνατο σε πρώιμα χρονικά σημεία κάτω από συνθήκες υποξίας (Σχήμα S4E και S4F). Τέλος, όταν ΡΤΕΝ, μία φωσφατάση του ΡΙ3Κ, χτυπήθηκε κάτω, παρατηρήθηκε μία μικρή αύξηση στη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, η οποία συνοδεύεται από μια αύξηση στον κυτταρικό θάνατο σε χρόνια υποξία (Σχήμα S5). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η καταστολή της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ είναι λειτουργικό στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων στο αδρανοποιημένων κατάσταση.

HIF-1α μερικώς συμβάλλει στην επαγωγή των αδρανών κατάστασης σε χρόνια υποξία

στη συνέχεια, εξετάσαμε την συμβολή του HIF σε ανενεργά κύτταρα καρκίνου (Σχήμα S6). Τα επίπεδα πρωτεΐνης του HIF-1α αυξήθηκαν μετά από έκθεση σε υποξία και διατηρήθηκε μέχρι την ημέρα 7 (Σχήμα S6D). Όταν HIF-1α επίπεδα βίαια μειώθηκαν κατά shRNA (Σχήμα S6a), ο αριθμός βιώσιμων κυττάρων μειώθηκε μετά από 7 ημέρες, ενώ το ποσοστό των θανάτων αυξάνεται (Σχήμα S6B και S6C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η διατήρηση της HIF-1α συνέβαλε επίσης στην κυτταρική επιβίωση κάτω από συνθήκες χρόνιας υποξίας. Knockdown του HIF-1α είχε μικρή επίδραση στην ΑΚΤ /σηματοδότηση mTORC1 και κάπως αυξημένα επίπεδα PS6 (Σχήμα S6D), αλλά υπερέκφραση της ΑΚΤ δεν είχε επίδραση στην επαγωγή του HIF-1α (Εικόνα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HIF-1α και AKT ανεξάρτητα ρυθμίζεται η λανθάνουσα κατάσταση στη χρόνια υποξία.

Τροποποίηση των αδρανών κατάσταση

in vivo

με αναγκαστική ενεργοποίηση της ΑΚΤ

Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα χαρακτηριστικά των όγκων που προέρχονται από ΑΚΤ mΔPH εκφράζουν AsPC-1 κύτταρα

in vivo

(Σχήμα 4). Η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ ήταν ανιχνεύσιμη μόνο στους όγκους ΑΚΤ mΔPH αλλά όχι στους όγκους ελέγχου (Σχήμα 4Α). Παρατηρήσαμε ρύθμιση προς τα κάτω της φωσφορυλίωσης S6 και βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) πρόσληψη στην πιμονιδαζόλη-θετικά περιοχή και εγγύς της ζώνη όγκους ελέγχου, σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας χρησιμοποιώντας μια άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου [4]. Αυτές οι περιοχές υποδεικνύουν την ύπαρξη μιας ζώνης της υποξίας που επάγεται ληθάργου

in vivo

. Σε αντίθεση, η ΑΚΤ mΔPH εκφράζουν όγκους σπάνια περιείχε το κοιμισμένο ζώνη στην περιοχή πιμονιδαζόλη εγγύς. Οι pS6- ή BrdU-θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν ακόμη και στο όριο του νέκρωση (Σχήμα 4Α).

Α) Ανοσοϊστοχημεία των xenotumors κυττάρων AsPC-1 που εκφράζει τον φορέα ελέγχου (άνω) ή ΑΚΤ mΔPH (κατώτερο) . Ν, νέκρωση? κλίμακα bar = 100 μm. Β) Ποσοστό BrdU-θετικών κυττάρων στο περιφερικό περιοχή ή πλησίον πιμονιδαζόλη θετικά ζώνη. Γ) Πλάτος πιμονιδαζόλη θετικών ζώνη σε όγκους από τον φορέα ή την ΑΚΤ-mΔPH? *

σ

& lt? 0,05, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Εμείς ποσοτικά περαιτέρω τις BrdU-θετικών κυττάρων στις περιοχές εγγύς ή άπω η πιμονιδαζόλη-θετικά ζώνη (Σχήμα 4Β). Το ποσοστό των BrdU-θετικών κυττάρων ήταν αξιόλογα μειωμένη στην εγγύς περιοχή στην πιμονιδαζόλη περιοχή σε σύγκριση με την περιφερειακή περιοχή σε όγκους ελέγχου. Σε αντίθεση, η ΑΚΤ mΔPH εκφράζουν όγκων περιείχαν υψηλά επίπεδα πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, ακόμη και στην εγγύς περιοχή. Επιπλέον, σε όγκους ΑΚΤ mΔPH, το εμβαδόν των πιμονιδαζόλη-θετικών κυττάρων μειώθηκε σε σχέση με τον έλεγχο των όγκων (Σχήμα 4C), υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα ΑΚΤ mΔPH δεν μπορούσε να εισέλθει σε μια αδρανή κατάσταση

in vivo

και ήταν πιο επιρρεπείς σε θάνατο κάτω από συνθήκες υποξίας.

πρόκληση λανθάνουσα κατάσταση στον πρωτογενή καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

στη συνέχεια, εξετάσαμε αν η επαγωγή των αδρανών καθεστώς βάσει της χρόνιας υποξίας παρατηρήθηκε επίσης σε πρωτογενή καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα . Ιδρύσαμε πρόσφατα ένα νέο πρωτεύον σύστημα καλλιέργειας, CTOs (καρκίνος του ιστού-προήλθε σφαιροειδές), σε ορθοκολικό, πνεύμονα, και urothelial καρκίνου [28] – [30]. Παρασκευάσαμε δείγματα CTOs από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και τους καλλιεργήθηκαν

in vitro

(Σχήμα 5Α και Β). ανάπτυξη CTOs ανεστάλη πλήρως υπό ένα συνδυασμό συνθηκών παράγοντα στερούνται υποξία και την ανάπτυξη, αν και υποξία από μόνη της δεν ήταν αρκετή για να εξαλείψει την ανάπτυξη. Δοκιμάσαμε CTOs από τρεις ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο, και όλα τα δείγματα εκ νέου αναπτύχθηκαν καλά αμέσως μετά την εκ νέου έκθεση σε μέσο που περιέχει τον παράγοντα οξυγόνο και την ανάπτυξη (Σχήμα 5C). Έτσι, η επαγωγή του λήθαργου δεν περιορίζεται σε κύτταρα AsPC-1, αλλά επίσης παρατηρήθηκε σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα.

Α) η ανάπτυξη CTOs μετρήθηκε με μέγεθος σε σχέση με την ημέρα 0. δείγματα C45 CTOs καλλιεργήθηκαν σε μέσο με (GF +) ή χωρίς (GF-) παράγοντες ανάπτυξης. Β) Εκπρόσωπος εικόνες της C45 CTOs καλλιεργούνται σε συνθήκες που υποδεικνύονται. Κλίμακα bar = 100 μm. Γ) τριχοφυία της CTOs σε λανθάνουσα κατάσταση, μετά την εκ νέου οξυγόνωση και την έκθεση σε μέσο ανάπτυξης που περιέχουν παράγοντα. Δ) Ανοσοϊστοχημεία του C45 CTOs καλλιεργούνται σε υποδεικνύεται συνθήκες για 1 ημέρα. χρώση TUNEL ήταν την ημέρα 14. Κλίμακα bar = 50 μm. Ε) Ανοσοστύπωμα ΑΚΤ /σηματοδότηση mTORC1 και HIF-1α σε C45 CTOs καλλιεργούνται σε συνθήκες που υποδεικνύονται.

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε ενδοκυτταρική σηματοδότηση σε CTOs με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοστύπωμα (Σχήμα 5D και Ε). Η υποξία σε συνδυασμό με την εξάντληση του αυξητικού παράγοντα εντελώς αποκλεισμένη σηματοδότησης AKT. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν συνεπή με την αύξηση CTOs (Σχήμα 5Α). Μετρήσαμε επίσης το οξυγόνο και την κατανάλωση γλυκόζης σε δείγματα CTOs (Σχήμα S7). Υποξία και συνθήκες ανάπτυξης παράγοντα-στερούνται εξασθενημένα σοβαρά αυτές τις μεταβολικές διαδικασίες, όπως επίσης παρατηρήθηκε σε κύτταρα AsPC-1.

Στη συνέχεια εξετάστηκε η χημειο-ευαισθησία CTOs σε κατάσταση ηρεμίας (Σχήμα 6). δείγματα CTOs προ-καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες παράγοντα-στερούνται υποξία και ανάπτυξη για 7 ημέρες. Μετά από αυτό, εκτέθηκαν σε 5FU ή SN38, του ενεργού μεταβολίτη της ιρινοτεκάνης, για 7 ημέρες, ακολουθούμενη από πλύση και καλλιέργεια σε φρέσκο ​​StemPro hESC. Τα δείγματα CTOs στην κατάσταση ηρεμίας έδειξε regrowth μετά επιστρέφονται σε βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας σε 10-φορές υψηλότερη δόση από τα δείγματα CTOs στην ενεργή κατάσταση (Σχήμα 6Α και Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα καρκινικά κύτταρα στην λανθάνουσα κατάσταση ήταν πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπείες από εκείνες σε μία ενεργή κατάσταση.

Α) δείγματα CTOs καλλιεργήθηκαν σε μέσο με (GF +) ή χωρίς (GF-) παράγοντες ανάπτυξης, και κάτω από το 20% O

2 ή 1% O

2 συνθήκες. 5FU ή SN38 προστέθηκαν στο μέσο και υποβάλλονται σε θεραπεία για 7 ημέρες (υποδεικνύεται με μαύρες μπάρες). Κατά την ημέρα 7, μέσο άλλαξε σε φρέσκο ​​StemPro ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα που περιέχει αυξητικούς παράγοντες (μαύρα βέλη), και τα δείγματα CTOs είχαν τη δυνατότητα να αναγεννηθούν κάτω του 20% O

2. Β) Εκπρόσωπος εικόνες των δειγμάτων CTOs στο (Α). μπαρ κλίμακα = 100 μm.

Η

Συζήτηση

Εμείς αποδεικνύεται στην παρούσα μελέτη ότι μία κυτταρική σειρά καρκίνου και πρωτογενή καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μεταβάλλουν τον πολλαπλασιασμό και μεταβολική κατάσταση υπό παρατεταμένη συνθήκες υποξίας. Κάτω από συνθήκες χρόνιας υποξίας, τα κύτταρα θα μπορούσαν να εισέλθουν σε μια λανθάνουσα κατάσταση που περιλαμβάνει τέσσερα χαρακτηριστικά: α. 1) δεν πολλαπλασιασμού, 2) κανένας θάνατος, 3) μεταβολικές καταστολή, και 4) την ανάκτηση σε ενεργή κατάσταση μετά την αποκατάσταση των βέλτιστων συνθηκών καλλιέργειας

ΑΚΤ αποτελεί βασικό πολλαπλασιασμός μόριο ρυθμίσεως των κυττάρων, την επιβίωση, και το μεταβολισμό. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η ενεργοποίηση του ΑΚΤ συμβάλλει στην κυτταρική επιβίωση και την αντίσταση φαρμάκου στην οξεία υποξία [1], [31] – [33]. Αντιθέτως, όπως δείξαμε εδώ, στη χρόνια υποξία, η καταστολή της δραστηριότητας ΑΚΤ είναι απαραίτητη για την επαγωγή του λήθαργου και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Επειδή η προμήθεια τόσο οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών θα πρέπει να περιορίζεται σε μια περιοχή μακριά από τα αιμοφόρα αγγεία σε έναν κακοήθη όγκο, διατηρώντας την πηγή ενέργειας με τη μείωση της ενεργειακής ζήτησης θα μπορούσε να είναι μια στρατηγική των καρκινικών κυττάρων να επιβιώσουν σε ένα χρονίως επιδείνωση μικροπεριβάλλον.

Ο μηχανισμός με τον οποίο δραστηριότητας ΑΚΤ καταστέλλεται στη χρόνια υποξία παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα. Πιθανοί υποψήφιοι περιλαμβάνουν 1) απενεργοποίηση του ανάντη κινάσες όπως RTKs και ΡΙ3Κ, 2) βρόχο ανάδρασης με ενεργοποίηση S6K, ή 3) την ενεργοποίηση του φωσφατασών όπως ΡΤΕΝ και PHLPP. Οι πρώτες δύο δυνατότητες είναι απίθανο, παρέχονται οι ακόλουθες διαπιστώσεις στις τρέχουσες εργασίες: 1) φωσφορυλίωσης της οικογένειας erbB RTKs και ΚΟΑ παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα ακόμα και σε χρόνιες υποξία (Σχήμα S4A), και 2) δραστηριότητα mTORC1 καταστέλλεται τόσο σε οξείες και χρόνιες υποξία (Σχήμα 3Α). Η τρίτη δυνατότητα υποστηρίζεται από τα ευρήματα μας ότι τα επίπεδα PHLPP αυξήθηκαν παράλληλα με αδρανοποίηση ΑΚΤ (Σχήμα 3Α) και εν αναγκαστική καταστολή της ΡΤΕΝ προωθούνται θανάτου σε χρόνια υποξία (Σχήμα S5B). Η περαιτέρω μελέτη θα διευκρινίσει τον ακριβή μηχανισμό.

Στην αντίδραση στο στρες σε υποξία, προς τα κάτω ρύθμιση της δραστηριότητας mTOR, το εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνης και μεταγραφική ενεργοποίηση του HIF έχουν μελετηθεί καλά [10], [34]. REDD1 καταστέλλει δραστικότητα mTORC1 μέσω TSC1 /2 σε υποξία, οδηγώντας σε αναστολή της μετάφρασης Cap-εξαρτώμενη mRNA [15], [16]. Στο εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνη, μια κινάση ER κάτοικος, PERK, φωσφορυλιώνει eIF2α και καταστέλλει mRNA μετάφρασης [24]. Επειδή η πρωτεϊνική σύνθεση είναι μια διαδικασία που καταναλώνουν ενέργεια, τα μονοπάτια καταστολή θα μπορούσε να παίξει ρόλο στην επαγωγή του λήθαργου υπό χρόνιες συνθήκες υποξίας. Πράγματι, παρατηρήσαμε καταστολή της δραστηριότητας mTORC1 και αυξημένη φωσφορυλίωση του eIF2α σε οξεία υποξία (Σχήμα 3Α, το Σχήμα S4A). Επειδή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του μεταβολισμού διατηρήθηκαν σε οξεία υποξία, θα μπορούσαν να είναι αναγκαία, αλλά δεν αρκεί για να προκαλέσει λήθαργο στη χρόνια υποξία. HIF-1α και HIF-2α αποτελούν βασικούς παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν την υποξική απόκριση [10]. Στην οξεία υποξία, οι HIF πρωτεϊνών σταθεροποιήθηκε και ενεργοποιούν τη μεταγραφή διαφόρων γονιδίων προς τα κάτω. Από την άλλη πλευρά, σε παρατεταμένη υποξία, HIF πρωτεΐνες φέρεται μειωτικά από μηχανισμούς ανάδρασης. Στα αποτελέσματα μας, ωστόσο, η έκφραση του HIF-1α διατηρήθηκε σε ανενεργά κατάσταση κατά τη διάρκεια της παρατεταμένης υποξία (σχ S6D), και knockdown του HIF-1α οδήγησε σε αυξημένη κυτταρικό θάνατο σε χρόνια υποξία (Σχήμα S6a και S6B), υποδεικνύοντας ότι παρατεταμένη έκφραση του HIF-1α ήταν επίσης απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων AsPC-1 κάτω από χρόνια υποξία.

Αν και ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου, ανθρώπινων όγκων καθώς και ξενομοσχεύματα ανθρώπινων όγκων παρουσιάζουν πολλαπλασιαστικών δεικτών τόσο χαμηλή όσο 20% [ ,,,0],35]. Αυτά τα μη πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα σε όγκους έχουν μερικές φορές αναφέρεται ως αδρανή κύτταρα. Πρόσφατα, η θεωρία καρκινικό κύτταρο στέλεχος, στο οποίο οι όγκοι υποτίθεται ότι διατηρούνται από τους δικούς τους βλαστικά κύτταρα, έχει δοκιμαστεί εντατικά [36]. Επειδή ησυχίας είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των φυσιολογικών ενήλικων βλαστικών κυττάρων, έχουν ηρεμίας καρκινικά βλαστικά κύτταρα έχουν σκεφτεί, αλλά η ύπαρξή τους στην ανθρώπινη συμπαγείς όγκους δεν έχει διερευνηθεί άμεσα [36]. Σε ενήλικα βλαστικά κύτταρα, ηρεμία ορίζεται ως μια φάση του κυτταρικού κύκλου, G0 [37], ενώ AsPC-1 κύτταρα στο αδρανοποιημένων κατάσταση ήταν παρόντες στην τρέχουσα εργασία τόσο G1 /Ο0 και G2 /M φάσεις (Σχήμα 1 C). Η λανθάνουσα κατάσταση σε αυτή τη μελέτη μπορεί να διαφέρουν από την αδράνεια, αλλά οι ενώσεις παραμένουν αναπάντητα ερωτήματα.

όγκου λήθαργου έχει μελετηθεί ως η κατάσταση κατά την οποία οι όγκοι παραμένουν ασυμπτωματικοί για μεγάλο χρονικό διάστημα, χρόνια σε ορισμένες περιπτώσεις [37], [38]. Υπάρχουν δύο μοντέλα για το λήθαργο του όγκου, του όγκου λήθαργο μάζα και καρκινικών κυττάρων λήθαργο. Ο πρώην προϋποθέτει μια κατάσταση ισορροπίας μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου, ενώ στη δεύτερη περίπτωση, τα καρκινικά κύτταρα εισέλθουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου και παραμένουν εν ηρεμία. Η υποξία που προκαλείται από το λήθαργο που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, που προκύπτουν από τη χρόνια και όχι οξεία υποξία, μπορεί να μοιράζονται χαρακτηριστικά με την τελευταία, αλλά τα βασικά μόρια που προσδιορίζονται εδώ διαφέρουν. Σε μία επιδερμοειδούς κυτταρικής γραμμής καρκινώματος, για παράδειγμα, το υπόλοιπο της φωσφο-ΕΚΚ και φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ έχει αναφερθεί ότι είναι ο μοριακός διακόπτης για διέγερση των κυττάρων του όγκου λήθαργου [39]. Σηματοδότηση από μια δυσμενή μικροπεριβάλλον ή κυτταρικής επιφάνειας υποδοχείς απορυθμίζει φωσφο-p38 ΜΑΡΚ, και τα κύτταρα στη συνέχεια πληκτρολογήστε G1 /G0 φάση. Σε αντίθεση, το γεγονός κλειδί για την επαγωγή της ανενεργού κατάστασης στην τρέχουσα εργασία ήταν προς τα κάτω ρύθμιση της ρΑΚΤ αλλά όχι την ενεργοποίηση του p38 ΜΑΡΚ (Σχήμα 3Α).

Μεταξύ των πέντε κυτταρικές σειρές που εξετάσαμε, μόνο AsPC-1 κύτταρα θα μπορούσαν εισέλθουν στην κατάσταση ηρεμίας, υπό συνθήκες χρόνιας υποξίας (Σχήμα 1 και S1). Σε αντίθεση, και οι τρεις πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα εξετάζονται μπορούσε να τεθεί σε μια λανθάνουσα κατάσταση κάτω από ένα συνδυασμό εξάντληση παράγοντα υποξίας και ανάπτυξης (Σχήμα 5). Επειδή οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές επιλεγμένα κύτταρα με ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης υπό συνθήκες καλλιέργειας με υψηλή οξυγόνο, τη διατροφή, και αυξητικούς παράγοντες, που μπορεί να έχουν χάσει την ικανότητα να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό υπό επιδεινώθηκε συνθήκες. Έτσι, CTOs θα μπορούσε να παρέχει μια πλατφόρμα για να ερευνήσει το λήθαργο των καρκινικών κυττάρων. Παρά το γεγονός ότι τα αδρανοποιημένα τα καρκινικά κύτταρα δεν συμβάλλουν άμεσα στην ανάπτυξη του όγκου, μπορούν να είναι μια δεξαμενή και μια πηγή ογκογονικά κύτταρα και χημειοαντίσταση. Ο μηχανισμός της ρΑΚΤ αρνητική ρύθμιση στο πλαίσιο της χρόνιας υποξίας θα μπορούσε να είναι ένας στόχος των νέων φαρμάκων έχουν σχεδιαστεί για να ξεπεραστούν θεραπευτική αντίσταση.

Υλικό και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Προετοιμασία και τον πολιτισμό της πρωτοβάθμιας παχέος εντέρου του καρκίνου από ασθενείς εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας, Osaka Ιατρικό Κέντρο για τον καρκίνο και Καρδιαγγειακά Νοσήματα (OMCCCD), και χειρουργικά δείγματα ελήφθησαν μετά από γραπτή συγκατάθεση. Οι μελέτες σε πειραματόζωα εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής OMCCCD Θεσμικών και εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος.

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

Ένα παγκρέατος κυτταρική σειρά καρκίνου, AsPC-1, που ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Υποξική καλλιέργεια επιτεύχθηκε με επώαση των κυττάρων με 1% O

2 και 5% CO

2 σε ένα Multigas Incubator (ASTEC, Fukuoka Ιαπωνία). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά 35 mm Petri για την καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων και 2,5 χ 10

5 κύτταρα ανά 60-mm δίσκο για RT-PCR και κηλίδωση Western. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε από την trypan μπλε δοκιμασία αποκλεισμού χρώσης ή ιωδιούχου προπιδίου χρώση (PI).

Δημοτικό πολιτισμό καρκίνου του παχέος εντέρου

Προετοιμασία και τον πολιτισμό του πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο CTOs [28]. Εν συντομία, χειρουργικά δείγματα ή ξενομοσχεύματος όγκους NOD ποντίκια /SCID υποβλήθηκαν σε μερική πέψη με Liberase DH (Roche, Mannheim, Germany) και διηθείται μέσω κελί σουρωτήρια. Κομματιών πάνω στην 100-μm ή 40 μm-σουρωτήρι κυττάρων (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) συλλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε StemPro hESC (GIBCO). Για υποξική καλλιέργεια, τα δείγματα CTOs εγκλείστηκαν σε BD Matrigel Matrix Παράγοντα Ανάπτυξης Μειωμένο (GFR) (BD Biosciences, San Jose, CA) και καλλιεργήθηκαν σε StemPro hESC ή βασικό μέσο (DMEM F12 /Glutamax, 0.1 mM 2-μερκάπτο αιθανόλη, 2% βόεια λευκωματίνη ορού). Για τη δοκιμασία χημειοευαισθησίας κατά τη διάρκεια της ανενεργού περιόδου, δείγματα CTOs προ-καλλιεργήθηκαν σε βασικό μέσο κάτω από 1% O

2 συνθήκες για 7 ημέρες, και στη συνέχεια επεξεργάστηκε με 5-FU ή SN38. Μετά από 7 ημέρες έκθεσης σε αυτά τα φάρμακα, τα δείγματα CTOs επανα-οξυγονωμένο, και το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε σε φρέσκο ​​StemPro hESC.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

AsPC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για οι υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους και επισημάνθηκαν με 10 μΜ BrdU για την τελευταία από μία ώρα κάθε θεραπεία. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μg /mL του ΡΙ και αντι-BrdU αντίσωμα (BD Pharmingen). Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Attune Ακουστική Εστιάζοντας Κυτταρόμετρο (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Μέτρηση της γλυκόζης και γαλακτικού συγκέντρωση

Η συγκέντρωση γλυκόζης στο μέσο καλλιέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας γλυκόζης Δοκιμή 2 (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan). Το γαλακτικό μετρήθηκε με τη χρήση του F-Kit L-γαλακτικού οξέος (Roche, Darmstadt, Germany).

Μέτρηση της κατανάλωσης οξυγόνου

Διαλυμένο οξυγόνο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρόδιο τύπου Clark οξυγόνου (Μοντέλο 203 , Instech Laboratories). **

σ

& lt? 0,01.