Αφηρημένο

Μια καλή πρόγνωση μπορεί να αναμένεται για τις περισσότερες, αλλά όχι όλες, τις περιπτώσεις καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδους. Πολυάριθμες μοριακές μελέτες έχουν δείξει ευεργετική αγωγή και προγνωστικοί παράγοντες σε διάφορες μοριακών δεικτών. Ενώ οι περισσότερες προηγούμενες εκθέσεις έχουν επικεντρωθεί στη γονιδιωματική και πρωτεομική, λίγες έχουν επικεντρωθεί στην lipidomics. Με την έλευση της φασματομετρίας μάζας (MS), έχει καταστεί δυνατό να προσδιοριστεί πολλούς τύπους μορίων, και αυτό το αναλυτικό εργαλείο έχει καταστεί κρίσιμη στον τομέα της omics. Πρόσφατα, αναπτύχθηκε φασματομετρία μάζας απεικόνισης (IMS). Μετά από μια απλή διαδικασία προεπεξεργασίας, IMS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξεταστούν τομές ιστών σε γυάλινες πλάκες με πληροφορίες θέσης.

Εδώ, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση IMS επτά περιπτώσεις καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδης με σύγκριση των καρκινικών με φυσιολογικούς ιστούς, εστιάζοντας σχετικά με την κατανομή των φωσφολιπιδίων. Εντοπίσαμε ότι φωσφατιδυλοχολίνη (16: 0/18: 1) και (16: 0/18: 2) και σφιγγομυελίνη (D18: 0/16: 1) είναι σημαντικά υψηλότερες στον καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδους ό, τι σε κανονικό ιστό του θυρεοειδούς, όπως προσδιορίζεται με διαδοχικό μάζας (MS /MS) ανάλυση. Αυτές οι διαφορές στην κατανομή μπορεί να σχετίζεται με τη βιολογική συμπεριφορά του καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδους

Παράθεση:. Ishikawa S, Tateya Ι, Hayasaka Τ, Masaki Ν, Takizawa Υ, Ohno S, et al. (2012) αύξησε την έκφραση φωσφατιδυλοχολίνη (16: 0/18: 1) και (16: 0/18: 2) σε Θυρεοειδούς θηλώδους καρκίνου. PLoS ONE 7 (11): e48873. doi: 10.1371 /journal.pone.0048873

Επιμέλεια: Yunli Zhou, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 18, 2012? Αποδεκτές: 2η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Ishikawa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση SENTAN από την Ιαπωνία Επιστήμης και Τεχνολογίας Οργανισμού για την MS (https://www.jst.go.jp/sentan/en/)? μια Grant-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα στην MS (WAKATE-S: 20670004, https://www.jsps.go.jp)? και μια επιχορήγηση από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, της Ιαπωνίας σε αυτό και ΜΚ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του θυρεοειδούς είναι η πιο συχνή κακοήθης όγκος στην περιοχή της κεφαλής και του λαιμού. Τα ιστολογικά τύποι καρκίνου του θυρεοειδούς ποικίλλουν και περιλαμβάνουν θηλώδες καρκίνωμα (80% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς), θυλακιώδες καρκίνωμα, μυελοειδές καρκίνωμα, και αδιαφοροποίητο καρκίνωμα. Η πρόγνωση ποικίλλει επίσης ανάλογα με ιστολογικό τύπο. Μη διαφοροποιημένα καρκίνωμα έχει κακή πρόγνωση, με ένα ρυθμό επιβίωσης 10 χρόνια από 10-20% ή λιγότερο, ενώ οι ασθενείς με άλλους ιστολογικούς τύπους, όπως θηλώδες καρκίνωμα, θυλακιώδες καρκίνωμα και καρκίνωμα μυελοειδές, μπορούμε να περιμένουμε καλά αποτελέσματα με μια 10-χρόνια ποσοστό επιβίωσης 90%, 90%, και 70-80%, αντίστοιχα. [1] Ωστόσο, ακόμη και περιπτώσεις θηλώδους καρκινώματος μπορεί να αποτύχει να ελέγχεται λόγω μακρινό μετάσταση ή αναπλαστικό μετασχηματισμού. Θα είναι απαραίτητο να προβλέψει αξιόπιστα αναπλαστικό μετασχηματισμού πριν συμβεί κάτι τέτοιο, και για τον εντοπισμό περιπτώσεων κακής πρόγνωσης μεταξύ θηλώδες καρκίνωμα, προκειμένου να βελτιωθεί η γενική πρόγνωση του καρκίνου του θυρεοειδούς.

Οι εξελίξεις στον τομέα της γονιδιωματικής και της μοριακής βιολογίας έχουν ρίξει φως επί παθογόνοι μηχανισμοί που σχετίζονται με τον καρκίνο του θυρεοειδούς [2]. Μεγάλες προσπάθειες έχουν γίνει για την ταυτοποίηση γονιδίων και βιομόρια που εκφράζονται διαφορικά σε καρκινικούς ιστούς, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για τη διαλεύκανση του θυρεοειδούς παθογένεση του καρκίνου και να κατευθύνει κατάλληλα και στοχευμένες θεραπείες μοριακού [3], [4], [5]. Αρκετά υποψήφια γονίδια (για υποδοχείς TSH, RET /PTC, Ras, BRAF, ρ53) στην ανάπτυξη των διαφόρων τύπων καρκίνου του θυρεοειδούς [2] έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα. Επιπλέον, ορισμένες προσπάθειες έχουν γίνει να χρησιμοποιηθούν πρωτεομική ως εργαλείο ανακάλυψης για νεοπλάσματα θυρεοειδούς. Lewis και συνεργάτες ανέφεραν μία διαφορά στην έκφραση πρωτεΐνης μεταξύ θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς και φυσιολογικό ιστό θυρεοειδούς με φασματομετρία μάζας (MS) [6]. Ωστόσο, ο μηχανισμός του κακοήθους μετασχηματισμού δεν είναι καλά κατανοητή, ειδικά στο επίπεδο της πρωτεΐνης.

Τα λιπίδια που σχετίζονται με τη δομή της κυτταρικής μεμβράνης, του πολλαπλασιασμού [7], διαφοροποίηση, μεταβολική ρύθμιση, φλεγμονή [8], και την ανοσία. Είναι σημαντικό να κατανοηθεί η σχέση μεταξύ του όγκου και των λιπιδίων στη διάγνωση και θεραπεία. Lipids, ειδικά φωσφολιπίδια (πίν), παίζουν σημαντικό ρόλο στη σύνθεση της κυτταρικής μεμβράνης. Είναι γενικά αποδεκτό ότι τα χαρακτηριστικά της μεμβράνης καθορίζεται από τις συνιστώσες των ειδών PL, και η σύνθεση αυτών των ειδών αυστηρά προσδιορίζεται από τα συστατικά του είδους των λιπαρών οξέων [9], [10]. Λίγες αναφορές διεξαχθεί μέχρι σήμερα έχουν επικεντρωθεί σε λιπίδια, ειδικά δεσμευτικό λιπαρών οξέων σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου? Ωστόσο, μέχρι σήμερα, καμία μέθοδος δεν έχει αναπτυχθεί που επιτρέπει την ανίχνευση της σύνδεσης λιπαρών οξέων σε πίν.

μάζα Imaging φασματομετρία (IMS) είναι ένα ισχυρό, πρόσφατα αναπτύχθηκε εργαλείο που προσδιορίζει την κατανομή των γνωστών /άγνωστα μόρια για ένα τμήμα ιστού [11], [12], [13]. σάρωση με λέιζερ επιτρέπει την ακριβή, δύο διαστάσεων MS σε γυάλινες πλάκες. Επί του παρόντος, η IMS είναι το μόνο εργαλείο που επιτρέπει την οπτικοποίηση της δέσμευσης των λιπαρών οξέων στο PLS σε τομές ιστών, και αυτή η προσέγγιση επόμενης γενιάς προσελκύει σημαντική προσοχή.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να χρησιμοποιήσει IMS για να αποσαφηνιστεί η οποία PL-δεσμεύεται λιπαρά οξέα ήταν τα κύρια συστατικά των κυτταρικών μεμβρανών, και ιδιαίτερα, ποια εκφράστηκαν σε σχετικά υψηλά επίπεδα σε καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδη. Αυτή η μελέτη ήταν η πρώτη για τη διερεύνηση υποθέσεων της PLS στον καρκίνο του θυρεοειδούς με τη χρήση ανάλυσης IMS, και η πρώτη για τον εντοπισμό επιτυχία PLs που εκφράζεται έντονα στον καρκίνο του θυρεοειδούς.

Αποτελέσματα

1. IMS ανάλυση της περίπτωσης 1

Οι περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) στον καρκίνο και φυσιολογικό περιοχές ορίστηκαν σύμφωνα με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) -χρώση αποτελέσματα ενός τμήματος ιστού δίπλα στο τμήμα που χρησιμοποιείται για την ανάλυση IMS. Σχήμα 1Α παρέχει αποτελέσματα HE-χρώση για την περίπτωση 1, ενώ το σχήμα 1Β δείχνει μεγεθυμένη αντιπροσωπευτικές περιοχές του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού. Τα καρκινικά κύτταρα είχαν μια υψηλή αναλογία κυτταροπλασματικό και εμφανίζονται χαρακτηριστικά στοιχεία του θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς πυρηνικών. Ιστολογικά ευρήματα του καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδους αποτελείται από κυλινδρικό επιθήλιο θυρεοειδικών που στο θηλώδες προβολής. Η κανονική θυρεοειδικού ιστού αποτελείται από πολλές σφαιρικό κοίλο σάκοι που ονομάζεται θυλάκια του θυρεοειδούς.

(Α) θυρεοειδούς θηλώδους καρκίνου του ιστού εντοπίστηκε στα αριστερά, και η κανονική θυρεοειδικού ιστού εντοπίστηκε στα δεξιά (αρχική μεγέθυνση 40 ×). Η περιοχή στρωματικών αποκλείστηκε. Το ROI καθορίστηκε από τα αντίστοιχα αποτελέσματα HE-χρώση. Τα μαύρα κουτιά δείχνουν την αντιπροσωπευτική περιοχή του καρκίνου και φυσιολογικά θυρεοειδικού ιστού. (Β) Μεγέθυνση αντιπροσωπευτικές περιοχές του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού (αρχική μεγέθυνση 200 ×). Τα καρκινικά κύτταρα είχαν μια υψηλή αναλογία κυτταροπλασματικό και εμφανίζονται χαρακτηριστικά στοιχεία του θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς πυρηνικών. Ιστολογικά ευρήματα του καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδους αποτελείται από κυλινδρικό επιθήλιο θυρεοειδικών που στο θηλώδες προβολής. Η κανονική θυρεοειδούς ιστός αποτελείται από πολλές σφαιρικό κοίλο θύλακες ονομάζεται θυλάκια του θυρεοειδούς.

Η

Το Σχήμα 2 δείχνει φάσματα ελήφθησαν από τη θήκη 1 ιστού με πλαίσια Α και Β που προήλθαν από καρκίνο και φυσιολογικό περιοχές, αντίστοιχα. Και τα δύο φάσματα είναι κατά μέσο όρο φάσματα, και λήφθηκαν από ROI σε καρκίνο και φυσιολογικό ιστό. Ο αριθμός των υπολογισμένα σημεία στον καρκίνο και φυσιολογικό περιοχή ήταν 1.425 και 258, αντίστοιχα. Ο οριζόντιος άξονας δείχνει την αναλογία μάζας προς φορτίο (

m /z

) και ο κάθετος άξονας δείχνει τη σχετική αφθονία του ιόντος. Το πιο έντονο ιόν έχει εκχωρηθεί μια αφθονία των 100, και αναφέρεται ως βασικής κορυφής. Τα περισσότερα ιόντα σχηματίζονται σε ένα φασματομετρία μάζας έχουν μια μόνο φόρτιση, έτσι ώστε η

m /z

αξία είναι ισοδύναμη με την ίδια τη μάζα.

(Α) Φάσμα της περιοχής του καρκίνου και (Β) φάσμα της κανονικής περιοχής. Κάθε φάσμα ήταν κατά μέσο όρο από την ROI του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού στο Σχήμα 1. Κάθε αριθμός φαίνονται στον Πίνακα 1 τοποθετήθηκε χρησιμοποιώντας αυτά τα φάσματα.

Η

Ο Πίνακας 1 δείχνει την κορυφή 50 κορυφής picking αποτελέσματα για την περίπτωση 1 ( εξαιρουμένων ισοτοπικές κορυφές) που αναλύθηκαν στατιστικά. Καρκίνος και κανονική ένταση νοείται ο μέσος όρος (± τυπικό σφάλμα) ένταση που διαιρέθηκε με το σημείο σάρωσης σε καρκίνο και φυσιολογικό περιοχές. Welch t-test διεξήχθη μεταξύ της μέσης έντασης του καρκίνου και φυσιολογικές περιοχές. Οι

m /z

τιμές στον Πίνακα 1 παρατίθενται κατά σειρά έντασης τους στην περιοχή του καρκίνου. Ο αριθμός των

m /z

τιμών χωρίς ισοτοπική κορυφές ήταν 40, ενώ ο αριθμός των τιμών με σημαντικές διαφορές ήταν 26. Όλα

m /z

τιμές του πίνακα 1 αποδόθηκαν χρησιμοποιώντας την φάσμα που φαίνεται στο Σχήμα 2Α και Β

Η

2. Απεικόνιση των μοριακών διανομής σε θυρεοειδικού ιστού της περίπτωσης 1

Το σχήμα 3 δείχνει την εικόνα ιόντων που οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα

m /z

τιμές που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Το φάσμα του κάθε χρώματος ιόντων εικόνες ήταν βελτιστοποιηθεί το χέρι, έτσι ώστε οι κορυφές έχουν διαφορετικές κλίμακες χρώμα. Σε γενικές γραμμές, τα κακοήθη κυτταρικό πολλαπλασιασμό διεγέρθηκε λόγω παράγοντες κυτταρικής ανάπτυξης, η οποία επάγει μία αύξηση στην κυτταρική πυκνότητα και συστατικά των καρκινικών κυττάρων, όπως πίν. Ως εκ τούτου, ενώ η ένταση του συνόλου

m /z

τιμές θα πρέπει να είναι υψηλότερη στις περιφέρειες του καρκίνου, η ένταση της ορισμένες τιμές (ειδικότερα,

m /z 772,5

, 782.5 και 848.5) στον καρκίνο περιοχές ήταν χαμηλότερη.

οπτικοποιούνται ιόν εικόνες που αντιστοιχούν στα αποτελέσματα που φαίνονται στον πίνακα 1. σε όλες τις εικόνες, ο καρκινικός ιστός είναι στα αριστερά και φυσιολογικό ιστό είναι στα δεξιά. Η κατανομή της έντασης για κάθε

m /z

αξία δεν ήταν σταθερή στον καρκίνο και φυσιολογικό θυρεοειδικού ιστού.

Η

3. Σύγκριση των αποτελεσμάτων σε όλες τις περιπτώσεις

Με τον ίδιο τρόπο όπως στην περίπτωση 1, κορυφή picking και στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις. Ο Πίνακας 2 παρουσιάζει τα 50 καλύτερα να πάρει κορυφή των αποτελεσμάτων και αποκλείει ισοτοπικές κορυφές. Η

m /z

τιμές δεν δείχνει σημαντικές διαφορές αποκλείστηκαν. Τρεις

m /z

αξιών *, συμπεριλαμβανομένων των

m /z

798,5, 796,5 και 741,5, βρέθηκαν να είναι κοινή για όλες τις περιπτώσεις.

Η

Η κοινή οι

m /z

τιμές σε όλες τις περιπτώσεις που εμφανίζεται στο Σχήμα 4. ROIs του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού σε όλες τις περιπτώσεις περιγράφηκαν στο HE-βάφονται αποτελέσματα για όλες τις περιπτώσεις. Η ένταση του σχεδόν όλα

m /z

τιμές ήταν υψηλότερη στην περιοχή του καρκίνου σε σύγκριση με την κανονική περιοχή θυρεοειδούς. Μόνο η κατανομή της έντασης του

m /z

741,5 τους διαφοροποιείται από τις άλλες.

Το ROI κάθε περίπτωση ορίζεται από μια διακεκομμένη γραμμή σε εικόνες HE-χρώση. Η ένταση όλων των τιμών της περιοχής του καρκίνου ήταν υψηλότερη από ότι στα φυσιολογικά περιοχές. Η κατανομή της έντασης στο

m /z

741,5 ήταν διαφορετική από την κατανομή της έντασης στο άλλο

m /z

τιμές.

Η

4. Μοριακή ταυτοποίηση

Η κοινή ανάλυση των τριών

m /z

τιμές σε όλες τις περιπτώσεις υποβλήθηκαν σε συνδυασμό μάζας (MS /MS) για τον προσδιορισμό των δομών των βιομορίων που συνδέονται με τα πρόδρομα ιόντα. (Σχήμα 5). Ο μεταβολίτης MS αναζήτησης (https://www.hmdb.ca/labm/jsp/mlims/MSDbParent.jsp) χρησιμοποιήθηκε για την αναφορά.

(Α) δεδομένα MS /MS του

m /z

798,5. Η δομή του μία κορυφή αναλύθηκε. Το φάσμα του προϊόντος ιόντος της

m /z 798,5

ως πρόδρομο ιόν ελήφθη με MS /MS της περιοχής του θυρεοειδούς καρκίνο θηλώδης. Αυτό το βιολογικό μόριο αναγνωρίστηκε από ουδέτερη απώλεια ως [PC (16: 0/18: 1) + K]

+. Με τον ίδιο τρόπο, στο (Β)

m /z 796,5

ταυτοποιήθηκε ως [PC (16: 0/18: 2) + K]

+. (C)

m /z

741,5 αναγνωρίστηκε ως [SM (D18: 0/16: 1) + K]

+

Η

Στο MS /MS για πίν. με κατιόντα, ορισμένες χαρακτηριστικές κορυφές θραύσμα συχνά ανιχνεύονται. Η κορυφή σε

m /z 798,5

(Σχήμα 5Α) ταυτοποιήθηκε ως φωσφατιδυλοχολίνη (PC), λόγω της ουδέτερης απώλεια 59 Da και 183 Da κατά τη διάρκεια της MS /MS, η οποία είναι ενδεικτική του PC [14], [ ,,,0],15]. Εν τω μεταξύ, η ουδέτερη απώλεια του 256 Da αντιστοιχούσε σε παλμιτικό οξύ. Ο τύπος του κατιόντος με προσθήκη σε ένα βιομόριο είναι συνήθως είτε ένα ιόν νατρίου ή καλίου, όταν το δείγμα λαμβάνεται από βιολογικό ιστό. Μια διαφορά 38,0 παρατηρήθηκε μεταξύ του

m /z 577,5

και 615.5, η οποία είναι συνεπής με την αντικατάσταση ενός ιόντος καλίου (μοριακό βάρος, 39.10) με ένα πρωτόνιο (μοριακό βάρος, 1.01). Σύμφωνα με μια έρευνα μεταβολίτης MS, η κορυφή

m /z

798,5 δείχνει [PC (16: 0/18: 1) + K]

+. Με τον ίδιο τρόπο, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι

m /z

796,5 αντιστοιχούσαν σε [PC (16: 0/18: 2) + K]

+ (Σχήμα 5Β)

Η. τα αποτελέσματα των

m /z

741,5 έδειξε κορυφές του

m /z

682,4 και 558,4 (Σχήμα 5C). Η κορυφή σε

m /z 682,4

αντιστοιχούσε σε ουδέτερη απώλεια της τριμεθυλαμίνης (59 Da), και της κορυφής σε

m /z 577,5

αντιστοιχούσε σε ουδέτερη απώλεια της τριμεθυλαμίνης (59 Da) και cyclophosphate (124 Da). Η κορυφή σε

m /z 184

αντιστοιχούσε σε τριμεθυλαμίνης (59 Da), cyclophosphate (124 Da) και ένα ιόν πρωτονίου (1 Da). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

m /z 741,5

περιείχε φωσφοχολίνη μετάλλου αλκαλίων προσαγωγού? Ως εκ τούτου,

m /z

741,5 ήταν ένα PC ή σφιγγομυελίνη (SM) είδη. Εφαρμόζοντας τον κανόνα αζώτου προς φωσφολιπίδια, το περίεργο ονομαστική μάζα υποδεικνύεται SM λόγω της παρουσίας ενός επιπλέον αζώτου στο σφιγγοσίνης του SM. Εμείς έτσι στο συμπέρασμα ότι

m /z

741,5 ήταν ένα είδος SM. Η αναζήτηση μεταβολίτης MS μάλιστα πρότεινε ότι

m /z

741,5 αντιστοιχούσαν σε [SM (D18: 0/16: 1) + K].

+

Συζήτηση

για περισσότερο από έναν αιώνα, παθολογικές εξετάσεις ήταν το κύριο και πιο σημαντικό εργαλείο για τη διάγνωση των καρκινικών περιοχών. ίδιο τον καρκίνο ταξινόμηση έχει συσταθεί με βάση τα πορίσματα των κλασικών μεθόδων χρώσης, όπως HE χρώση, και τέτοιες μέθοδοι θα συνεχίσει να διαδραματίζει ηγετικό ρόλο στη διάγνωση του καρκίνου. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί οι περιορισμοί της κατάταξης με βάση την κλασική ευρήματα χρώση. Είναι συχνά η περίπτωση ότι ασθενείς με την ίδια παθολογική διάγνωση δεν έχουν πάντα την ίδια πρόγνωση. Οι διαγνώσεις γίνονται συχνά με βάση την μορφολογία. Χρησιμοποιώντας συμβατικές τεχνικές παθολογικές, μπορούμε να διεξάγει μόνο μορφολογικές παρατηρήσεις, και είναι δύσκολο να αποκαλύψει τις λεπτομέρειες των συστατικών σε τομές ιστών.

Η in situ υβριδοποίηση

ή /και ανοσοϊστοχημεία αναλύει επιτρέψει την ανάλυση της κατανομής των γνωστών μορίων? Ωστόσο, έχει παραμείνει αδύνατο να εξεταστεί η διανομή του αγνώστου μορίων. Για μια λεπτομερή και ακριβή διάγνωση, είναι αναγκαίο να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με συστατικά όπως ειδικές πρωτεΐνες και λιπίδια σε ένα δείγμα.

Ως σημαντική τεχνική στην παραγωγή πρωτεώματος μετα-γονιδίωμα εποχή, MS έχει γίνει χρησιμοποιείται ευρέως στην πολυάριθμα ιατρικά πεδία για τη διάγνωση και τη θεραπεία των διαφόρων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Πολυάριθμες νέων βιολογικών δεικτών έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα με τη χρήση MS, η οποία έκτοτε έχει επεκταθεί για να περιλάβει IMS [11], [16], μια τεχνική που επιτρέπει την ανάλυση και την απεικόνιση της κατανομής των επιμέρους βιομορίων σε οποιαδήποτε περιοχή ενός τμήματος ιστού [17] . Έτσι, αυτή η προσέγγιση είναι δυνητικά μεγάλη σημασία.

Ένα IMS ακολουθία δημιουργεί μια σειρά από φάσματα. Για να αποκτήσετε έγκυρες πληροφορίες από αυτά τα φάσματα, εκτελέσαμε την προσθήκη ενός ιόντος προϊόντος προσθήκης. Σε βιολογικό ιστό, λιπίδια τείνουν να χρεώνονται θετικά από ένα πρωτόνιο, νάτριο, και ένα ιόν καλίου, το οποίο υποδεικνύει ότι η κατανομή του θετικού ιόντος επηρεάζει την κατανομή των λιπιδίων? διαφορετικές τιμές τείνουν να ληφθούν τα αποτελέσματα των αναλύσεων IMS. Σε αυτή τη μελέτη, προσθέσαμε άλας καλίου στη μήτρα με βάση τις εκθέσεις των Sugiura και συν-εργάτες που αναλύθηκαν επιλεκτικά PC με διαφορετικές συνθέσεις λιπαρών οξέων με την προσθήκη άλατος καλίου στο διάλυμα μήτρας [18]. Όταν προστίθεται στη μήτρα, το διάλυμα άλατος καλίου προκάλεσε συγχώνευση των διαφόρων προϊόντων προσθήκης ιόντος (προσαγωγοί με πρωτόνιο, νάτριο, κάλιο και) σε μια ενιαία potassiated είδος. Η προσέγγιση αυτή μας επέτρεψε να μειώσει τον αριθμό των κορυφών και έκανε ευκολότερη την αναγνώριση των μορίων του ενδιαφέροντος.

Στην προηγούμενη έκθεση, δείξαμε τη σκοπιμότητα της IMS ως εργαλείο για την ανάλυση των παθολογικών δειγμάτων [19]. Δείξαμε ότι IMS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για προφίλ βιολογικά μόρια, συμπεριλαμβανομένων των υποτύπων της PLS. Έχουμε επικεντρωθεί στην κατανομή της PLS στον καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδες. PLs είναι παρούσες ως συστατικό της κυτταρικής μεμβράνης και επίσης εκφράζονται σε καρκινικό ιστό. Οι εντάσεις των πιο

m /z

τιμές σε καρκινικούς περιοχές είναι υψηλότερες από εκείνες που σε κανονικές περιοχές? Ωστόσο, η ένταση του ορισμένες τιμές (

m /z 772,5

, 782.5 και 848.5) στις περιφέρειες του καρκίνου ήταν χαμηλότερη από ότι σε φυσιολογικές περιοχές του ιστού (βλέπε σχήμα 2 και Πίνακας 1). Σε γενικές γραμμές, τα κακοήθη κυτταρικό πολλαπλασιασμό διεγέρθηκε λόγω παράγοντες κυτταρικής ανάπτυξης, η οποία επάγει μία αύξηση στην κυτταρική πυκνότητα και συστατικά των καρκινικών κυττάρων, όπως πίν. PLs αποτελούνται από πολυάριθμους συνδυασμούς των λιπιδίων που βασίζονται σε μήκος τους, το βαθμό κορεσμού ακυλ αλύσου, και την πολική ομάδα κεφαλής. Το Σχήμα 2 δείχνει ότι μπορεί να προκύψουν αυτές οι διαφορές στην ένταση από τη διανομή των καρκίνο του θυρεοειδούς-ειδικά λιπαρά οξέα που είναι συνδεδεμένα με πίν.

Στον καρκίνο του μαστού, PLS, ειδικά PCs, σε καρκινικούς ιστούς αναφέρθηκαν για να έχουν μια σχετικά υψηλό επίπεδο του λινελαϊκού οξέος (18: 2) και τα χαμηλά επίπεδα του στεατικού οξέος (18: 0) [20] και ελαϊκό οξύ (18: 1) [21], σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του μαστού. Luisa

et al.

Εντοπιστεί το μοτίβο στο σχέδιο και τάξη διαφορές PL σε καρκινικά κύτταρα του μαστού [22]. Στην έκθεσή τους, τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν υψηλή σχετική αφθονία του PC (16: 0/18: 1) και PC (18: 1/18: 1) που αντιστοιχεί σε [ΜΗ]

+ σε

m /z

760 και 786. για SM, SM (18: 1/16: 0) αντιστοιχεί σε [ΜΗ]

+ σε

m /z

703 ανιχνεύθηκε κυρίως στα καρκινικά κύτταρα

μια άλλη προηγούμενη αναφορά έδειξε ότι το mRNA του 1-ακυλγλυκερίνη-3-φωσφορική-ο-ακυλτρανσφεράσης (AGPAT) 11 που χρησιμοποιεί αποτελεσματικά LPA (18: 1) σαν ένα ακύλιο δέκτη και λιπαρό οξύ 18: 1 ως ένα δότη ακυλίου είναι αισθητά ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινα μαστού και του καρκίνου του τραχήλου [23]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η

m /z

798,5 κορυφές περιέχει C18 λιπαρών οξέων: 1, και εκφράζονται έντονα σε περιοχές του καρκίνου του θυρεοειδούς. Ενώ μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε την επιλογή των συγκεκριμένων λιπαρών οξέων δέσμευσης PLs, παρέχουμε περισσότερες πληροφορίες για τις σχετικές μεταβολές της PLS στον καρκίνο του θηλώδους θυρεοειδούς.

Στο Σχήμα 4, η κατανομή της έντασης στο

m /z

741,5 αντιστοιχούσε σε [SM (D18: 0/16: 1) + K]

+ και είναι διαφορετική από την κατανομή της έντασης στις άλλες εκτός από την περίπτωση 1 και 5. αποτελέσματα HE-χρώση έδειξαν ότι η περιοχή στην οποία

m /z

741,5 ένταση εκφράζεται έντονα αποτελούνταν κυρίως από στρωματικά και του καρκίνου περιοχές. Έχουμε αναφερθεί ότι η ένταση του εξέφρασε SM ήταν υψηλότερη σε καρκίνο και στρωματικά περιοχές από ότι στα φυσιολογικά περιοχές σε μια μελέτη του κόλου καρκίνου του ήπατος μετάσταση [19]. Το αποτέλεσμά μας ήταν σύμφωνο με την παρούσα έκθεση

στεαροϋλ-ΟοΑ 1 (SCD1) είναι το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στην κυτταρική σύνθεση μονοακόρεστων λιπαρών οξέων, περιλαμβανομένων των C18:. 1, από κορεσμένα λιπαρά οξέα. Falvella

et al.

Ανέφεραν ότι υπερέκφραση της γονιδιακής SCD 1 σχετίζεται με ηπατοκαρκινογένεσης σε ποντικούς [24]. Scaglia

et al.

Ανέφεραν ότι η αναστολή της έκφρασης SCD 1 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μειώνει την ογκογένεση, ενώ ο ρυθμός της απόπτωσης ανυψώθηκε [25]. Αυτές οι αναφορές υποδεικνύουν ότι SCD 1 προκαλεί αύξηση του C18:. 1 σε ιστό καρκίνου

Το είδος των λιπαρών οξέων σχήμα επιρροές κυττάρου και ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης [9]. Οι μεταβολές της ρευστότητας της μεμβράνης των καρκινικών κυττάρων μπορεί να επηρεάσει τη βιολογική συμπεριφορά του καρκίνου όπως εισβολή /μετάσταση. IMS είναι το μόνο εργαλείο που επιτρέπει την οπτικοποίηση της δέσμευσης των λιπαρών οξέων στο PLS σε τομές ιστών. Πρόσφατα, ένας αυξανόμενος αριθμός αναφορών έχει επικεντρωθεί στη σχέση μεταξύ παθολογικής προσβολές και PLs, συμπεριλαμβανομένων των ηλεκτρονικών υπολογιστών [26], δηλαδή, την αναδιαμόρφωση μονοπάτι της PLS [27]. Αναμένεται ότι η ανάλυση IMS θα βοηθήσει να επιτευχθεί μια καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ των λιπαρών οξέων και των μηχανισμών του καρκίνου.

Χρησιμοποιώντας IMS, έχουμε προφίλ άμεσα PC και έκφραση SM από δείγματα ιστών. Αυτή η διερευνητική προφίλ της PL με βάση την ανάλυση της IMS παρέχονται τα αποτελέσματα που τονίζουν τις δυνατότητες του IMS για παθολογικές διαγνώσεις. Η πιθανή εφαρμογή της ανάλυσης IMS στην κλινική ροή εργασίας έχει προταθεί στην προηγούμενη έκθεση [28]. Σε σύγκριση με τις συμβατικές μεθόδους, όπως η MS και ανοσοϊστοχημεία, IMS έχει ορισμένα πλεονεκτήματα ως κλινική εφαρμογή. Δείγμα καθαρισμού και είναι απαραίτητη η εκχύλιση πριν από την ανάλυση MS. Επιπλέον, η απόδοση μιας δοκιμασίας αντισώματος που βασίζεται στη ανοσοϊστοχημεία είναι πάντα υποβαθμισμένη να εύκολα παρατηρούνται μεταβολές στην ένταση ή εντοπισμού. Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση IMS απαιτεί μόνο μια απλή προεπεξεργασία, δηλαδή, απόθεση μήτρας και για τον καθορισμό των ρυθμίσεων κατάσταση IMS. Αυτό σημαίνει ότι ο χρόνος δεν χάνεται μεταξύ συλλογής και ανάλυσης του δείγματος. Προβλέπεται ότι η IMS θα εύκολα εισάγεται στο σκηνικό παθολογική εξέταση.

Πρόσφατες μελέτες έχουν προσκομίσει αποδεικτικά στοιχεία από τα κλινικά οφέλη της ανάλυσης IMS, δηλαδή, ότι το προφίλ της σε διακρίσεις μεταξύ των άλλων ασθενειών και του καρκίνου του προστάτη [29] και η κατάσταση του HER2 του καρκίνου του μαστού [30]. Στις εκθέσεις αυτές, η IMS επέτρεψε την κατάταξη των μορφολογικών και διαγνωστικά χαρακτηριστικά. Μια που αναπτύχθηκε πρόσφατα παραλλαγή της ανάλυσης IMS, που αναφέρεται ως «στοχευμένες απεικόνισης φασματομετρίας μάζας» (TIMS), περιγράφηκε από Thiery και οι συνεργάτες του [31]. Τέτοια στοχευμένη ανάλυση επέτρεψε την οπτικοποίηση των μορίων που ενδιαφέρουν άμεσα από το τμήμα ιστού με τη χρήση του λέιζερ αντιδραστικών φωτο μοριακές ετικέτες που συνδέονται με αντισώματα. Η προσέγγιση αυτή παρέχει ποσοτικοποίηση με εκτίμηση της έντασης του σήματος, και μια εξαιρετική αναλογία σήματος προς θόρυβο στα προκύπτοντα φάσματα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι αυτή η διάγνωση έγινε σε ένα μόνο τμήμα του δείγματος? Λίγα βιοψίες καρκίνου ήταν διαθέσιμα, και θα χρειαζόταν περισσότερο για να ποσοτικοποιηθεί βιοδείκτη από την IHC. Στο μέλλον, η ανάλυση IMS θα προσφέρει νέες βιοδείκτες και με τη σειρά τους, νέα παθολογικά κατηγορίες, και ως εκ τούτου θα μπορούσε να γίνει ένα σημαντικό διαγνωστικό εργαλείο στην κλινική.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

συλλογή δειγμάτων και την αρχειοθέτηση των δεδομένων του ασθενούς πραγματοποιήθηκε με τη χρήση γραπτή συγκατάθεση, και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Κιότο. Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Πανεπιστημίου του Κιότο για παθολογικές χειρισμό δείγματος.

1. Δείγμα προετοιμασία

Επτά Ιάπωνες ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε θυρεοειδεκτομή ρουτίνας στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Κιότο συμμετείχαν στην παρούσα μελέτη. Έξι γυναίκες και ένας άνδρας είχαν συμπεριληφθεί και η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 52 έτη. Δεν υπήρχε υποτροπή σε όλες τις περιπτώσεις. Τα δείγματα ελήφθησαν από ένα τμήμα του καρκίνου του θυρεοειδούς και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό αμέσως μετά την εκτομή του όγκου. Η παθολογική διάγνωση ήταν θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς. Το ληφθέν ιστός καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο αμέσως να ελαχιστοποιηθεί η αποικοδόμηση και διατηρήθηκε στους -80 ° C. Οι τομές ιστού κόβονται σε φέτες με πάχος 10 μm χρησιμοποιώντας κρυοστάτη (CM 1950? Leica, Wetzler, Germany). Ένα τμήμα είχε τοποθετηθεί πάνω σε ένα ινδίου-κασσιτέρου-οξείδιο-επικάλυψη (ITO) γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα για ανάλυση IMS. Ένα άλλο τμήμα που γειτνιάζουν με εκείνη που χρησιμοποιείται για την IMS ήταν τοποθετημένα πάνω σε ένα γυάλινο πλακίδιο (MAS παλτό? Matsunami, Osaka, Japan) για HE χρώση για τον εντοπισμό του καρκίνου και κανονικές περιοχές του θυρεοειδούς

2.. Matrix εναπόθεση

Το διάλυμα μήτρας παρασκευάστηκε με διάλυση 50 mg 2, 5-διυδροξυβενζοϊκό οξύ (DHB? Bruker Daltonics, Leipzig, Germany) σε 1 mL 70% μεθανόλη και 10 mM οξικό κάλιο. DHB είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μήτρα για μόρια μικρού μοριακού βάρους. Η προσθήκη του άλατος καλίου στο διάλυμα μήτρας προκάλεσε συγχώνευση των διαφόρων προϊόντων προσθήκης ιόντος σε ένα ενιαίο potassiated είδος. Αυτή η προσέγγιση μας επέτρεψε να μειωθεί ο αριθμός των κορυφών και απλοποίησε την ταυτοποίηση των μορίων ενδιαφέροντος. Ένα λεπτό στρώμα μήτρας εφαρμόστηκε στην επιφάνεια των τμημάτων ιστού χρησιμοποιώντας ένα αερογράφο ακροφυσίου 0,2-mm (Procon αγόρι FWA Platinum? Κ Hobby, Tokyo, Japan) που διατηρείται στους 15 cm από την επιφάνεια του ιστού. Η συνολική ποσότητα διαλύματος μήτρας σε κάθε διαφάνεια ήταν 1 ml. Η τεχνική ψεκασμού ενεργοποιηθεί η πλήρης κάλυψη μήτρα σε όλη την επιφάνεια του ιστού και διευκόλυνε την συν-κρυστάλλωση της μήτρας και βιο-μόρια.

3. Απεικόνιση φασματοσκοπία μάζης ανάλυση

Οι τομές ιστού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας υποβοηθούμενης από μήτρα εκρόφησης λέιζερ /ιονισμός-χρόνος-πτήσης /ώρα της πτήσης (MALDI-TOF /TOF) -τύπου όργανο, Ultraflex II TOF /TOF (Bruker Daltonics), το οποίο ήταν εξοπλισμένο με ένα 355-nm Nd: YAG laser στα 200 Hz επανάληψη. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν στον τρόπο θετικού ιόντος-χρησιμοποιώντας μια μέθοδο εξωτερική διακρίβωση με ιόντα από DHB, η αγγειοτενσίνη II και βραδυκινίνη. προϊόντα αποσύνθεσης τους που καλύπτονται από το

m /z 100

να 1200. πρωτεΐνες Calibration αποτέθηκαν επί των επιφανειών των υλικών του δείγματος. Κάθε σάρωση raster πραγματοποιήθηκε αυτόματα στις περιοχές καρκίνου και φυσιολογικό ιστό. Το διάστημα μεταξύ των σημείων των δεδομένων ήταν 100 μm και 100 βολές λέιζερ ακτινοβολούνται σε κάθε σημείο δεδομένων. Οι παράμετροι φασματομετρία μάζας βελτιστοποιήθηκαν με το χέρι για να ληφθεί η υψηλότερη ευαισθησία με

m /z

τιμές στο εύρος των 400-900. Όλα τα φάσματα αποκτήθηκαν αυτόματα χρησιμοποιώντας flexImaging 2.1 του λογισμικού (Bruker Daltonics), και η μορφή του αρχείου μετατράπηκε σε δυνατή ανάλυση με Biomap (https://www.maldi-msi.org) και SIMtools λογισμικού (in-house λογισμικό? Shimadzu Corporation) . Η εικόνα ιόντων οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Biomap λογισμικού.

4. Η σύγκριση των εντάσεων των σημάτων μεταξύ του καρκίνου και της κανονικής περιοχές του θυρεοειδούς

IMS αποτελέσματα ανάλυσης εντάχθηκαν, και το ROI στον καρκίνο και φυσιολογικούς ιστούς του θυρεοειδούς ορίστηκαν αντιστοιχούν σε HE αποτελέσματα χρησιμοποιώντας το λογισμικό SIMtools. Οι 50 κορυφές με εξαίρεση τις ισοτοπικές κορυφές συλλέχθηκαν από ROI που ορίστηκε ως ο καρκίνος και η κανονική περιοχή του θυρεοειδούς, και η στατιστική διαφορά προσδιορίστηκε με Welch t-test. Οι διαφορές με ρ & lt? 0,01 θεωρήθηκαν σημαντικές

5.. Σύγκριση των αποτελεσμάτων για όλες τις περιπτώσεις

Πραγματοποιήσαμε IMS και στατιστική ανάλυση σε όλες τις περιπτώσεις, και πήρε το

m /z

αξία που είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε περιοχές καρκίνο και ήταν κοινή σε όλες τις περιπτώσεις.

6. Μοριακή ταυτοποίηση

Οι κοινές

m /z

τιμές σε όλες τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση MS /MS για το μόριο αναγνώρισης. ανάλυση MS /MS διεξήχθη επί τομών ιστού στον τρόπο θετικού ιόντων χρησιμοποιώντας QSTAR Elite (Applied Biosystems /MDS Sciex, Foster City, CA, USA), ένα φασματόμετρο μάζας υβρίδιο τετραπολικό /TOF εφοδιασμένο με ένα ορθογώνιο πηγή MALDI και παλμική Nd : YAG laser. Ο μεταβολίτης MS Search χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των μοριακών ειδών της PLS. Το διάλυμα μήτρας παρασκευάστηκε με τον ίδιο τρόπο όπως και για την ανάλυση IMS. Οι παράμετροι φασματομετρία μάζας βελτιστοποιήθηκαν με το χέρι για να ληφθεί η υψηλότερη ευαισθησία με τιμές m /z στην περιοχή των 100-850.