Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα έναρξη (CICs) αντιπροσωπεύουν ένα μοναδικό πληθυσμό κυττάρων απαραίτητη για τη διατήρηση και την ανάπτυξη των όγκων. Οι περισσότεροι

in vivo μελέτες

CICs χρησιμοποιούν ξενομοσχευμάτων ανθρωπίνου όγκου σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια. Τα μοντέλα αυτά παρέχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με την αλληλεπίδραση της CICs με το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή και είναι περιορισμένης αξίας για την εκτίμηση CICs θεραπείες που στοχεύουν, ιδιαίτερα το ανοσοποιητικό θεραπείες που βασίζονται. Για την εκτίμηση αυτή, απαιτείται μια συγγενή μοντέλο καρκίνου. Εξετάσαμε την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας των δεκατριών ποντικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών και προσδιορίζονται TC-1 και ένα μεταστατικό υποκλώνος του καρκινώματος πνεύμονα Lewis (ΗΜ-LLC) ως κυτταρικές γραμμές που σχηματίζονται εύκολα και διατηρείται σφαίρες σε πολλαπλές διελεύσεις. TC-1 tumorspheres δεν εμπλουτίστηκαν για την έκφραση του CD133 ή CD44, υποθετικό δείκτες CIC, ούτε αποδεικνύουν Hoechst 33342 πλευρά χρώση πληθυσμού ή δραστηριότητα Aldefluor σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα TC-1. Ωστόσο, σε tumorsphere καλλιέργεια, τα κύτταρα αυτά εμφάνισαν αυτο-ανανέωση και η μακροχρόνια συμμετρική ιδιότητα διαίρεση και εκφράζονται περισσότερο Oct-4 σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα. HM-LLC κύτταρα σφαίρα προερχόμενα παρουσίασαν αυξημένη Oct-4, CD133, και η έκφραση CD44, επέδειξε μια Hoechst 33342 πλευρά του πληθυσμού και δραστηριότητα Aldefluor σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα ή ένα χαμηλό μεταστατικό υποκλώνος του LLC (LM-LLC). Σε συγγενικά ποντίκια, HM-LLC κύτταρα σφαίρα που προέρχονται απαιτούνται λιγότερα κύτταρα για την έναρξη της ογκογένεσης σε σύγκριση με προσκολλημένα ή LM-LLC κύτταρα. Παρομοίως TC-1 σφαίρα προερχόμενα κύτταρα ήταν περισσότερο από ογκογόνα προσκολλημένα κύτταρα σε συγγενή ποντίκια. Σε αντίθεση, σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, λιγότερο από 500 σφαίρα ή προσκολλημένα κύτταρα TC-1 και λιγότερο από 1000 σφαίρα ή προσκολλημένα κύτταρα LLC όφειλαν να κινήσει έναν όγκο. Προτείνουμε ότι καμία μεμονωμένη φαινοτυπικό δείκτη μπορεί να προσδιορίσει CICs σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ποντικού πνεύμονα. Tumorsphere πολιτισμός μπορεί να παρέχει μια εναλλακτική προσέγγιση για τον εντοπισμό και τον εμπλουτισμό για CICs πνεύμονα ποντικού. Επιπλέον, προτείνουμε ότι η εκτίμηση καρκινογένεση από CICs πνεύμονα ποντικού σε συγγενικά ποντίκια καλύτερα μοντέλα η αλληλεπίδραση της CICs με το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή

Παράθεση:. Morrison BJ, χάλυβα JC, Morris JC (2012) Σφαίρα Πολιτισμού Ποντικού πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές είναι εμπλουτισμένα με Καρκίνο Έναρξη κύτταρα. PLoS ONE 7 (11): e49752. doi: 10.1371 /journal.pone.0049752

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 12 Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 15 του Οκτ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Morrison et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Τμήμα Αιματολογίας-Ογκολογίας του Πανεπιστημίου του Cincinnati. BJM υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο του Cincinnati, Συμβούλιο Έρευνας του Πανεπιστημίου, επιχορήγηση Μεταδιδακτορικός Υπότροφος Προγράμματος Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η αιτία της σχεδόν το 20% όλων των θανάτων από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Ευθύνεται για περισσότερους θανάτους από ό, τι τα επόμενα τέσσερα πιο κοινούς καρκίνους σε συνδυασμό. Παρά τις βελτιώσεις στη διάγνωση και θεραπεία, η συνολική επιβίωση 5 ετών για όλους τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα είναι μια μελαγχολική 15%, και αυτό μειώνεται σε λιγότερο από 2% σε ασθενείς με μεταστατική νόσο [2]. Ως εκ τούτου, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένα μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας, καθώς και μια καλύτερη κατανόηση της βιολογίας της νόσου και τη βελτίωση της θεραπείας είναι μεγάλη ανάγκη.

Αύξηση στοιχεία υποστηρίζουν την ιδέα ενός εξειδικευμένου πληθυσμού των κυττάρων εντός των όγκων ονομάζεται καρκίνο έναρξη κύτταρα (CICs), εναλλακτικά «καρκινικά βλαστικά κύτταρα» ή καρκινικά κύτταρα-κίνηση. Αυτά τα κύτταρα πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για του όγκου προέλευση, τη συντήρηση, την εξέλιξη και την αντίσταση στη θεραπεία. CICs εμφανίζει λειτουργικά χαρακτηριστικά των βλαστοκυττάρων, όπως η ικανότητα για αυτο-ανανέωση και την ικανότητα να προκαλούν διαφοροποιημένα απογόνους. Οι Υποθετικές CICs έχουν ταυτοποιηθεί σε μυελοειδή λευχαιμία [3], και οι όγκοι του εγκεφάλου [5], [6] και του μαστού [7]. Πιο πρόσφατα, CICs πνεύμονα έχουν απομονωθεί από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και τα δείγματα ασθενούς [8] – [15]. Διερεύνηση των πνευμόνων CICs μπορεί να αυξήσει την κατανόηση της προέλευσης του καρκίνου του πνεύμονα και μπορεί να οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν αυτά τα κύτταρα.

έχουν CICs έχει αποδειχθεί για να σχηματίσουν πολυκύτταρους τρισδιάστατες σφαίρες

in vitro

όταν μεγαλώσει σε μη προσκολλημένα συνθήκες χωρίς ορό [6], [16]. Υπό αυτές τις συνθήκες, τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα υφίστανται anoikis, μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, ενώ τα σπάνια CICs διαιρούν για να παράγει σφαιροειδή όγκου. Η δοκιμασία σφαίρα και μια προτεινόμενη πρόσφατα μαθηματική ερμηνεία επιτρέπουν την εκτίμηση της συμμετρικής ρυθμό διαστολής διαίρεση των κυττάρων κακοήθων βλαστικών κυττάρων-όπως, και η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας για την αυτο-ανανέωση και πολλαπλασιαστική δραστηριότητα αυτών των κυττάρων [17]. Αυτή η δοκιμασία είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την αξιολόγηση των λειτουργικών και φαινοτυπικές ιδιότητες που συνδέονται με CICs. Σε μια μελέτη χρησιμοποιώντας δείγματα ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, το σχηματισμό σφαίρα βρέθηκε σε επτά από τις 19 όγκων εξετάστηκαν [10]. Αυτά τα κύτταρα βρέθηκαν να έχουν

in vitro

και

in vivo

ιδιότητες CICs συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης, πολλαπλασιαστικών και διαφοροποίηση ικανότητα, η έκφραση του CD133, ο εμπλουτισμός για την πλευρά του πληθυσμού κυττάρων (SP), η έκφραση εμβρυϊκών «βλαστική ικανότητα» των γονιδίων των Oct-4 και Nanog, αντίσταση χημειοθεραπεία και την γένεσιν όγκων. πολιτισμός σφαίρα έχει χρησιμοποιηθεί για τον εμπλουτισμό των πληθυσμών καρκίνο του πνεύμονα CIC [8], [9], [13], [14].

φωτομικρογραφίες (10Χ) της διόδου 2 ημέρες 7 πολιτισμών σφαίρα (Α) TC -1 σφαίρες, (Β) σφαίρες HM-LLC και (C) LM-LLC πολιτισμό σφαίρα των μέσων ενημέρωσης. Bar = 100 μm. (Δ) Συνολική επέκταση φορές και (Ε) συμμετρική συχνότητα διαίρεσης πάνω από οκτώ περάσματα για TC-1 σφαίρες (κόκκινο) και σφαίρες HM-LLC (μαύρο), και δύο περάσματα για LM-LLC πολιτισμό σφαίρα μέσα μαζικής ενημέρωσης (γκρι) παρουσιάζει σημαντικές διαφορές? * P & lt? 0.001. (F-G) Διπλώστε την επέκταση σε επτά περάσματα για TC-1 σφαίρες (κόκκινο) και σφαίρες HM-LLC (μαύρο). (H) Πέρασμα 2 σφαίρες καλλιεργήθηκαν και μετρήθηκαν για συνολικό αριθμό των κυττάρων κατά τις ημέρες όπως φαίνεται. Πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Την ημέρα 1, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων σε καλλιέργεια είναι μειωμένη. Οι επιζώντες από μιτογόνο απόκριση καρκίνος κίνηση κύτταρα είναι υπεύθυνα για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την παραγωγή νωπών πολυκύτταρων σφαίρες που μπορούν να συλλέγονται την ημέρα 7. Bars: ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM)

Η

καρκίνος του πνεύμονα ποντικού δεν έχει χαρακτηριστεί καλά για την παρουσία και τη συχνότητα CICs. Η πλειοψηφία των μελετών των CICs πνεύμονα έχουν χρησιμοποιήσει ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές ή δείγματα πρωτογενούς όγκου, με κακοήθεια εξεταστεί μόνο σε ανοσοκατεσταλμένους μοντέλα ποντικών. Είναι σημαντικό, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ του ανοσοποιητικού συστήματος και στο μικροπεριβάλλον του όγκου έχουν καταδειχθεί ότι παίζουν ένα ρόλο στην ανταπόκριση στη θεραπεία. Πράγματι, ο καρκίνος του πνεύμονα και πολλά άλλα καρκινώματα που συμβαίνουν στο ανοσοκατασταλμένους συμπεριφέρονται ξενιστή περισσότερο επιθετικά, μικρή ανταπόκριση στη θεραπεία, και έχουν χειρότερη έκβαση [18], [19]. Ως εκ τούτου, για τη μοντελοποίηση με μεγαλύτερη ακρίβεια τις ανοσοποιητικού αλληλεπιδράσεις που εμπλέκονται στη δημιουργία όγκων με CICs, ερευνήσαμε καρκινικά κύτταρα ποντικού πνεύμονα εμπλουτισμένα για CICs σε ανοσοεπαρκείς συγγενικά ζώα. Η παρούσα μελέτη αναφέρει την αναγνώριση και τον χαρακτηρισμό των CICs πνεύμονα ποντικού χρησιμοποιώντας μεθόδους σφαίρα του πολιτισμού και τη συγκριτική αξιολόγηση αυτών των κυττάρων σε συγγενή και ανοσοκατεσταλμένους μοντέλα ποντικών.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

ποντικού TC-1 και τα κύτταρα γονική καρκινώματος πνεύμονα Lewis (LLC) αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). Η υψηλή μεταστατική (ΗΜ-LLC) και χαμηλό μεταστατικό (LM-LLC) υποκλώνων του LLC [20], [21] ήταν δώρα από τον Δρ Ζόνγκγιουν Dong (University of Cincinnati, Cincinnati, ΟΗ), και καλλιεργήθηκαν όπως προσκολλημένα κύτταρα σε τροποποιημένο Eagle μέσο Dulbecco (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 1% πενικιλλίνη G-στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Κυτταρικές σειρές 18948, 18955-προσκολλημένα, 18955-Κυμαινόμενο (μη-προσκολλημένη κλώνος 18955 κύτταρα) και 18.959 κύτταρα είναι

de novo

καρκίνου ποντικού μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) κυτταρικές σειρές και ήταν ένα δώρο του Δρ . Kathryn Wikenheiser-Brokamp (Ιατρικό Κέντρο Σινσινάτι των παιδιών, Cincinnati, ΟΗ). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές μελετήθηκαν κάτω από το Πανεπιστήμιο του Cincinnati έγκριση Θεσμική Επιτροπή Φροντίδα και Χρήση των Ζώων (Πρωτόκολλο Νο 11-03-21-01). Ποντικού πνεύμονα κυτταρικές γραμμές όγκου MLE12 και MLE15 [22], που προέρχεται από διαγονιδιακά ποντίκια που φέρουν το ιό πιθήκου 40 (SV40) μεγάλο αντιγόνο όγκου υπό μεταγραφικό έλεγχο της ανθρώπινης πρωτεΐνης επιφανειοδραστικού C (SP-C) προαγωγό, ήταν δώρα του Dr. Jeffrey Whitsett (Cincinnati Παιδικό Ιατρικό Κέντρο). κυτταρικές σειρές SCLC και τα κύτταρα MLE12 και MLE15 καλλιεργήθηκαν σε μέσα HITES [23]. καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές ποντικού αδενοκαρκινώματος 393P, 344P, και 344SQ [24] που προέρχεται από Kras

La1 /+ p53

ποντίκια R172HΔG ήταν ένα δώρο του Jonathan M. Κυπβ (το Πανεπιστήμιο του Τέξας, MD Anderson Cancer Center, Houston , TX) και καλλιεργήθηκαν σε DMEM με 10% FCS.

Ζώα και Ηθική Δήλωση

C57BL /6 ποντίκια ελήφθησαν από Jackson Laboratories (Bar Harbor, μΕ) και NOD-SCIDγ (NSG , NOD.Cg-

Prkdc

SCID Il2rg

tm1Wjl

/SzJ) ποντίκια από μια καθιερωμένη αποικία αναπαραγωγής στο Ιατρικό Κέντρο Σινσινάτι των παιδιών. Το Πανεπιστήμιο του Cincinnati Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση χορήγησε την έγκριση για το έργο αυτό (Πρωτόκολλο Νο 11-03-21-01). Όλες οι διαδικασίες ήταν, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές καλής μεταχείρισης των ζώων θεσμική, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

πραγματικού χρόνου ποσοτικό PCR έγινε για Oct-4, ένα γονίδιο που σχετίζεται με τη χρήση βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση, την έκφραση του mRNA. TC-1 σφαίρες (Α) και σφαίρες HM-LLC (Β) εμφανίζουν αυξημένη Oct-4 έκφραση σε σχέση με συμφωνημένα προσκολλημένα κύτταρα? * P≤0.001. κύτταρα HM-LLC εκφράζεται σημαντικά πιο Oct-4 από κύτταρα προσκολλημένα LM-LLC? ** Ρ = 0,005. Οικόπεδα αντιπροσωπεύουν συνδυασμένα δεδομένα 2-4 βιολογική αντίγραφα, το καθένα με τρεις τεχνικές επαναλήψεις. TC-1 κύτταρα (κόκκινο)? LM-LLC προσκολλημένα (γκρι)? κύτταρα HM-LLC (μαύρο). Μπαρ:. ± SEM

Η

(Α-Β) Εκπρόσωπος οικόπεδα δείχνει χρώση Aldefluor (μπλε) και χρώση ελέγχου ϋΕΑΒ (κόκκινο) για την HM-LLC, LM-LLC και TC-1 προσκολλημένα κύτταρα σε σύγκριση με πέρασμα 2, ημέρα 1 και την ημέρα 7 σφαίρα προερχόμενα κύτταρα. Aldefluor υψηλής έκφρασης κύτταρα (ορθογώνιο κουτί) είναι σημαντικά μεγαλύτερες σε (C) συχνότητα και (Δ) μέση ένταση φθορισμού (MFI) Aldefluor εντός ΗΜ-LLC σφαίρες σύγκριση με τα κύτταρα προσκολλημένα LM-LLC ή ΗΜ-LLC, και ΗΜ-LLC προσκολλημένα κύτταρα εκφράζουν περισσότερο Aldefluor από τα κύτταρα προσκολλημένα LM-LLC? συχνότητα (C) * P≤0.001? ΝΧΙ (D) * P≤0.002. Σε σύγκριση με χρώση ϋΕΑΒ, Aldefluor θετικότητα (μη ορθογώνιο κουτί) βρέθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε TC 1-προσκολλημένα κυττάρων σε σύγκριση με σφαίρες (Ε)? * P≤0.004. MFI του Aldefluor εντός των ομάδων TC-1 (F) δεν βρέθηκε να είναι σημαντικά διαφορετική. Δεν Aldefluor υψηλή πληθυσμιακή σημειώθηκε για TC-1 σφαίρες ή προσκολλημένων κυττάρων. Οικόπεδα αντιπροσωπεύουν συνδυασμένα δεδομένα από δύο βιολογικές επαναλήψεις με τρεις τεχνικές επαναλήψεις η κάθε μία. Μπαρ:. ± SEM

Η

Εκπρόσωπος οικόπεδα SP για (Α) κύτταρα LLC και (Β) κύτταρα TC-1 συγκρίνοντας ταιριάζουν προσκολλημένων κυττάρων σε πέρασμα 2, την ημέρα 1 και την ημέρα 7 σφαίρα που προέρχονται από τα κύτταρα. Hoechst χρώση 33342 επιβεβαιώθηκε με αποκλεισμό βεραπαμίλη. (Γ) συχνότητα SP ήταν σημαντικά αυξημένη σε ΗΜ-LLC σφαίρες σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα? * P & lt? 0.001? ** P≤0.012. προσκολλημένα κύτταρα HM-LLC και LM-LLC δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές για συχνότητα SP. (D) SP δεν βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε TC-1 κύτταρα σφαίρα προερχόμενα σύγκριση με συμφωνημένα προσκολλημένα κύτταρα. Ημέρα 1 σφαίρα προερχόμενα κύτταρα είχαν σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα των κυττάρων SP σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα και την ημέρα 7 κύτταρα σφαίρα προερχόμενα? * P = 0,03. Οικόπεδα αντιπροσωπεύουν συνδυασμένα δεδομένα από τρεις βιολογικούς επαναλήψεις με τρεις τεχνικές επαναλήψεις η κάθε μία. Μπαρ:. ± SEM

Η

(Α) Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής οικόπεδα για CD133 (Υ-άξονας) και CD44 (Χ-άξονας) συν-χρώση. (Β και D) Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) της CD44 δείχνεται διορθώνεται για την ένταση της χρώσης ισοτύπου για LLC και TC-1 κύτταρα. (Β) ΗΜ-LLC σφαίρες και προσκολλημένα κύτταρα καθώς και κύτταρα LLC (ATCC) εκφράζουν υψηλότερες ποσότητες CD44 σε σύγκριση με κύτταρα LM-LLC. κύτταρα Σφαίρα προερχόμενα βρέθηκαν να έχουν χαμηλότερη MFI για CD44 συγκριτικά με κύτταρα προσκολλημένα HM-LLC. D7 κύτταρα σφαίρα που προέρχονται είχαν μικρότερο των ΝΧΙ για CD44 σε σύγκριση με τα κύτταρα D1? * P & lt? 0.001. (D) Ημέρα 1 TC-1 σφαίρα που προέρχονται από κύτταρα που εκφράζουν λιγότερο CD44 από την ημέρα 7 ή προσκολλημένα κύτταρα? * P≤0.002. (Γ) CD133 συχνότητα των θετικών κυττάρων είναι υψηλότερο σε ΗΜ-LLC σφαίρες σύγκριση με τα κύτταρα προσκολλημένα LM-LLC? * P≤0.043. έκφραση CD133 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των κυττάρων προσκολλημένων HM-LLC και σφαίρες ή μεταξύ των τριών διαφορετικών προσκολλημένα κύτταρα LLC. (Ε) Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση CD133 μεταξύ των συνθηκών καλλιέργειας TC-1. Πείραμα γίνεται εις τριπλούν, αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Μπαρ:. ± SEM

Η

Η εμπιστοσύνη διάστημα οικόπεδο ανάλυση περιοριστικής αραίωσης εμφανίζεται με τον άξονα y εμφανίζει την εκτιμώμενη συχνότητα του καρκίνου κίνηση κυττάρων (CIC). (Α) Ένα περιοριστική αραίωση των κυττάρων TC-1 (120000, 80000, 40000, 10000, 5000, και 1000) ενέθηκαν υποδορίως σε συγγενικά C57BL /6 ποντίκια (η = 4 έως 8). Σφαίρα προερχόμενα κύτταρα βρέθηκαν να είναι περισσότερο από ογκογόνα προσκολλημένα κύτταρα? * P≤0.001? ** P & lt? 0,02. Ημέρα 1 σφαίρα προερχόμενα κύτταρα ήταν περισσότερο από ογκογόνα ημέρα 7? *** P = 0,04. Μια περιοριστική αραίωση (10000, 1000 και 500 κύτταρα) (n = 6 έως 8) από τις ίδιες τρεις ομάδες ενέθηκαν σε ποντικούς NSG και συχνότητα CIC βρέθηκε να είναι κάτω από το 1/500 για όλες τις ομάδες. (Β) Ανάλυση LLC περιοριστική πειράματος όγκου αραίωσης για συγγενή (80000, 40000, 20000, και 10000 κυττάρων) και ανοσοκατεσταλμένους (NSG) ποντικούς (80.000, 40.000, 10.000, και 1000 κύτταρα) (η = 4 έως 9). Σημειώνεται Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές? Ωστόσο, τα κύτταρα που προέρχονται σφαίρα-κινήθηκαν προς την επίτευξη περισσότερο ογκογόνων από HM ή LM προσκολλημένα κύτταρα σε ποντικούς C57BL /6. Κάτω αριθμούς των εμφυτευμένων κυττάρων που απαιτούνται για την κίνηση των όγκων σε ανοσοκατεσταλμένους ζώα από ό, τι σε συγγενικά ζώα με την εκτιμώμενη συχνότητα CIC παρακάτω 1/1000 για όλες τις ομάδες LLC.

Η

Tumorsphere Αναλύσεις

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως tumorspheres σε DMEM /F12 (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) που περιέχει 20 ng /mL rhEGF (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), 10 ng /mL rhbFGF (R &? D Systems), 4 μg /mL θειική ηπαρίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ), 0.15% λευκωματίνη βόειου ορού (Sigma), και 1% πενικιλλίνη G-στρεπτομυκίνη [25]. ικανότητα σχηματισμού Sphere (SFC) προσδιορίσθηκε με την ικανότητα να σχηματίζουν τρισδιάστατες σφαιροειδή σε καλλιέργεια κατά τη διάρκεια μιας περιόδου πέντε έως εννέα ημέρες. Για την αξιολόγηση της μακροπρόθεσμης πολλαπλασιασμού και φορές διαστολής (FE), σφαίρες διαχωριστεί και περάστηκαν κάθε 7 ημέρες με τη χρήση 0,05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Σφαίρα καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε χαμηλές προσκολλημένα φιάλες (Nunc, Penfield, ΝΥ). Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Countess ™ (Invitrogen) αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων. Fold αξιολογήθηκαν διαστολή και τη συχνότητα διαίρεσης συμμετρική [17] για κάθε κυτταρική σειρά, καθώς και την ικανότητα των κυττάρων σε καλλιέργεια ως σφαιροειδή για περισσότερο από τρεις διόδους.

χρώση κυτταρικής επιφανείας και Δοκιμασία Aldefluor

Για την ανάλυση δείκτη επιφανείας, φυκοερυθρίνη (ΡΕ) -επισημασμένο ποντικού αντι-CD133 (κλώνος 13A4, eBioscience, Inc. San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:33 και ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου αντι-ανθρώπου /ποντίκι CD44 (κλώνος IM7, eBioscience) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:100. ΡΙΤΟ-επισημασμένο αρουραίου IgG2bκ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ισοτύπου (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Ένα κιτ δοκιμασίας Aldefluor χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το ένζυμο αφυδρογονάση αλδεΰδης 1 (ΑΙ_ϋΗ1? StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC). Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν για 60 λεπτά στους 37 ° C υπό την παρουσία αντιδραστηρίου Aldefluor, μόνο του ή με την προσθήκη ενός diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ) που περιέχει διάλυμα το οποίο μπλοκ ΑΙ_ϋΗ1 δραστηριότητα. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή Έπη XL-MCL κυτταρομετρητή (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Μη βιώσιμα κύτταρα αποκλείστηκαν από την ανάλυση χρησιμοποιώντας χρώση ιωδιούχου προπιδίου (Sigma). Η δραστικότητα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ταιριάζουν ϋΕΑΒ δείγματα ελέγχου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR).

Hoechst 33342 πλευρά Πληθυσμός (SP)

χρωστική Hoechst 33342 ανάλυση χρώση SP διεξήχθη χρησιμοποιώντας μεθόδους προσαρμοσμένες από Goodell et al. [26]. Εν συντομία, ένα εκατομμύριο κύτταρα επωάστηκαν με 10 μg /mL Hoechst 33342 (Sigma) για 90 λεπτά στους 37 ° C. Επιβεβαίωση των κυττάρων SP διεξήχθη χρησιμοποιώντας 50 βεραπαμίλη μΜ (Sigma) για να εμποδίσει την εκροή της χρωστικής. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα LSRII κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences). Μη βιώσιμα κύτταρα αποκλείστηκαν από την ανάλυση.

Real-time αλυσίδα Reverse Transcription-αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας PureLink ™ RNA mini-kit (Invitrogen). RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε 20 μι χρησιμοποιώντας το κιτ Verso cDNA (Thermo Fisher Scientific, Surrey, UK) και το σύστημα GeneAmp PCR 9700 θερμοκυκλωτή (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ανάλυση Oct-4 έκφραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Plexor® qPCR System (Promega, Madison, WI) και τα αντιδραστήρια ζεύγη εκκινητών StemElite ™ Mus-Pou5f1 /Actb (Promega) που περιέχουν εκκινητές τόσο για Oct-4 και του γονιδίου β-ακτίνης. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν με τη χρήση της RT-System Bio-Rad CFX96 ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης Plexor®. Όλα σε πραγματικό χρόνο αποτελέσματα RT-PCR συγκεντρώθηκαν χρησιμοποιώντας τρία να έξι τεχνικούς επαναλήψεις για κάθε βιολογικό επανάληψη και δύο ως τέσσερις βιολογικές επαναλήψεις έγιναν για κάθε δείγμα – συμφωνημένα προσκολλημένα κύτταρα και πέρασμα 2 (Ρ2) την ημέρα 1 (D1) και την ημέρα 7 ( D7) κύτταρα προερχόμενα από σφαίρα. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε ενδογενή β-ακτίνης για κάθε δείγμα. Τα δείγματα τυποποιηθεί είτε TC-1 ή HM-LLC κύτταρα προσκολλημένα να συγκρίνουν τα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων.

In vivo όγκου Έναρξη

Μια περιοριστική διάλυση της TC-1 (120.000, 80.000, 40.000 , 10000, 5000, ή 1000) από κύτταρα συμφωνημένα προσκολλημένα και Ρ2 σφαίρα προερχόμενα D1 ή καλλιέργειες D7 εγχύθηκαν υποδορίως στα πλευρά του C57BL /6 ποντικών (η = 4 έως 8). Μια άλλη περιοριστική αραίωση των κυττάρων (10000, 1000, και 500 κύτταρα) για τις ίδιες τρεις προϋποθέσεις ενέθηκαν επίσης σε NSG ποντίκια (η = 6 έως 8). Παρομοίως, για τα κύτταρα LLC διεξήχθη ένας περιοριστικός πείραμα αραίωση 80000, 40000, 20000, 10000 ή κυττάρων για C57BL /6 και 80.000, 40.000, 10.000, ή 1.000 κύτταρα για NSG ποντικών (η = 4 έως 9). Οι ποντικοί παρακολουθούνται δύο φορές την εβδομάδα για τον σχηματισμό time-to-όγκου. εκτιμήθηκε άνευ όγκου επιβίωσης μέχρι την ημέρα 65.

Στατιστική Ανάλυση

SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc., Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των ομάδων. Για

in vivo

σχηματισμό όγκων, ανάλυση περιοριστικής αραίωσης εκτίμηση διαφορές στην βλαστοκυττάρων /καρκίνος έναρξη συχνότητα κυττάρων μεταξύ δειγμάτων διεξήχθη χρησιμοποιώντας Extreme Περιορισμός Αραίωση Ανάλυσης (ΕΛΔΑ) λογισμικό, όπως περιγράφεται προηγουμένως [27]. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο 0,05.

Αποτελέσματα

Σφαίρα ικανότητα σχηματισμού

SFC εξετάστηκε σε 13 ποντικού κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ή υποκλώνοι των κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορες ποντικού γενετικά υπόβαθρα (Πίνακας 1). SFC σημειώθηκε για εννέα από αυτές τις κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, SFC δεν συσχετίζονται πάντα με την ικανότητα να πολιτισμό ως σφαίρες πάνω από σειριακά περάσματα. Από τις κυτταρικές σειρές εννέα σφαίρες που σχηματίστηκαν και ελέγχθηκαν για την μακροπρόθεσμη ικανότητα καλλιέργεια, μόνο δύο, TC-1 και ΗΜ-LLC κατέδειξε παρατεταμένη ανάπτυξη επί σειριακών διελεύσεων. TC-1 και ΗΜ-LLC κύτταρα ήταν ικανά να σχηματίζουν τρισδιάστατα σφαιροειδή σε καλλιέργεια (Σχήματα 1Α και 1Β). κύτταρα LM-LLC (Σχήμα 1C) και τα γονικά κύτταρα LLC δεν σχηματίζουν σφαίρες και ήταν ανίκανοι παρατεταμένη πέρασμα στην καλλιέργεια σφαίρα. TC-1 και ΗΜ-LLC σφαίρες επέδειξε μία δυνητική & gt FE? 1 σε πολλαπλά περάσματα (Εικόνα 1D). Σφαίρα καλλιέργειες TC-1 και HM-LLC παρουσίασαν CIC συμμετρική συχνότητα θετικό καρκίνο βλαστικών κυττάρων /διαίρεση, ενώ τα κύτταρα LM-LLC δεν το έκανε (Σχήμα 1Ε). Αυτό δείχνει ότι οι συνθήκες καλλιέργειας σφαίρα των μέσων ενημέρωσης μπορεί να εντοπίσει υποτιθέμενη CICs για αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. FE ήταν σχετικά σταθερή κατά αριθμό πέρασμα για TC-1 (Σχήμα 1 F) και σφαίρες HM-LLC (Σχήμα 1G). Εντός 24 ωρών από πέρασμα περίπου 30% (HM-LLC) ή 54% (TC-1) κύτταρα υφίστανται anoikis /κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 1). Τα υπόλοιπα μιτογόνο κύτταρα που αποκρίνονται σε D1 πήγε για να σχηματίσουν σφαίρες από D7. Υποθέσαμε ότι τα κύτταρα D1 εμπλουτίστηκαν για CICs σύγκριση με τα κύτταρα D7, καθώς τα κύτταρα D7 ήταν πιο πιθανό να αποτελείται από μερικές CICs και μεγαλύτερο αριθμό διαφοροποιημένων κυττάρων του όγκου.

Oct-4 Έκφραση mRNA είναι ενισχυμένη σε Σφαίρα προερχόμενο από κύτταρα

η έκφραση της Oct-4, ένα γονίδιο που εμπλέκεται στην βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση και βασικό ρυθμιστή της πλειοδυναμίας που μπορεί από μόνη της να επαναπρογραμματίσει κύτταρα να πλειοδυναμία [28], αξιολογήθηκε σε συμφωνημένα προσκολλημένη και πέρασμα 2, D1 και D7 κύτταρα σφαίρα για TC-1 και HM-LLC, και προσκολλημένα κύτταρα LM-LLC. Δεδομένα κανονικοποιήθηκε ως προς την έκφραση του β-ακτίνης και τυποποιείται με τα επίπεδα έκφρασης του είτε TC-1 (Σχήμα 2Α) ή ΗΜ-LLC προσκολλημένα κύτταρα (Σχήμα 2Β). κύτταρα σφαίρα που προέρχονται εκφράζεται σημαντικά μεγαλύτερη mRNA Oct-4 από συμφωνημένα προσκολλημένα κύτταρα? P≤0.001. TC-1 σφαίρα καλλιεργημένα κύτταρα είτε από D1 ή D7 εκφράζονται περίπου 6-φορές περισσότερο Oct-4 σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα. HM-LLC σφαίρες είτε από D1 ή D7 εκφράζεται πάνω από 1,7 φορές περισσότερο Oct-4 από προσκολλημένα κύτταρα. LM-LLC προσκολλημένα κύτταρα εξέφρασαν Oct-4 σε περίπου 60% τα επίπεδα των προσκολλημένων κυττάρων ΗΜ-LLC. Έκφραση των SOX2 και Nanog που σχετίζονται με την αυτο-ανανέωση και βλαστική ικανότητα, δεν βρέθηκαν να είναι σημαντικά διαφορετικά εκφρασμένη μεταξύ των σφαιρών και προσκολλημένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Aldefluor δραστικότητα αυξάνεται σε ΗΜ-LLC αλλά όχι σε TC-1 Σφαίρες

έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 και δραστηριότητα έχει συσχετιστεί με δραστικότητα CIC και αυξημένη επιθετικότητα των όγκων του πνεύμονα [12]. Εξετάσαμε δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1 στα συμφωνημένα προσκολλημένη και σφαίρα πολιτισμούς. Αντιπροσωπευτικά οικόπεδα παρουσιάζονται για προσκολλημένα HM-LLC και LM-LLC σύγκριση με Ρ2, Δ1 και D7 σφαίρα καλλιεργημένα κύτταρα (Σχήμα 3Α) και για προσκολλημένα TC 1-κυττάρων σε σύγκριση με Ρ2, Δ1 και D7 καλλιεργημένα κύτταρα σφαίρα (Σχήμα 3Β). Για ΗΜ-LLC σφαίρες, ένα υποσύνολο των κυττάρων που εκφράζουν υψηλά Aldefluor βρέθηκαν να αυξηθεί σημαντικά σε σφαίρα καλλιεργημένα κύτταρα σε σύγκριση με ΗΜ-LLC ή LM-LLC κύτταρα προσκολλημένα (Σχήμα 3Α)? P≤0.001 για τη συχνότητα, και P≤0.002 για μέση ένταση φθορισμού (MFI) (Σχήμα 3C και 3D). TC-1 προσκολλημένα και σφαίρα που προέρχονται από κύτταρα που εξέφραζαν χαμηλά επίπεδα δραστικότητας Aldefluor (Σχήμα 3Β). Προσκολλητικά TC-1 κύτταρα κατέδειξαν περισσότερο Aldefluor-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα που προέρχονται σφαίρα-(Σχήμα 3Ε)? P≤0.004. Αυτά τα επίπεδα δεν ήταν σημαντικά διαφορετική όταν αναλύθηκαν για ΝΧΙ (Σχήμα 3F).

SP είναι ενισχυμένη σε ΗΜ-LLC, αλλά όχι σε TC-1 Σφαίρες

εξετάσαμε συμφωνημένα προσκολλημένα κύτταρα και Ρ2, D1 και D7 σφαίρα καλλιέργειες με Hoechst 33342 για την SP. Ως μάρτυρας, βεραπαμίλη είχε χρησιμοποιηθεί για να διακόψει τη δραστηριότητα της Hoechst 33342 μεταφορέα. SP ορίστηκε ως η μειωμένη πληθυσμό κυττάρων παρουσία βεραπαμίλης. Παραδείγματα προφίλ για κύτταρα LLC (Σχήμα 4Α) και τα κύτταρα TC-1 (Σχήμα 4Β) απεικονίζεται. συχνότητα SP βρέθηκε να αυξηθεί εντός σφαίρες ΗΜ-LLC σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα είτε ΗΜ-LLC ή LM-LLC? P≤0.012 για σφαίρες D1 και P & lt? 0,001 για D7 σφαίρες (Σχήμα 4C). Το μέσο κλάσμα των κυττάρων SP για τρεις βιολογικούς επαναλήψεις για HM-LLC P2, Δ1 σφαίρες ήταν 1 ± 0,5%, για το P2, D7 σφαίρες 2 ± 0,7%, για το HM-LLC προσκολλημένα κύτταρα 0,4 ± 0,4% και για το LM-LLC προσκολλημένη κύτταρα 0.4 ± 0.3%. TC-1 προσκολλημένη και σφαίρα-πολιτισμών εκφράζεται χαμηλές συχνότητες των κυττάρων SP. συχνότητα SP δεν βρέθηκε να ενισχύεται για σφαίρα καλλιεργήθηκαν σε σύγκριση με προσκολλημένα TC-1 (Σχήμα 4D). Ημέρα 1 κύτταρα προερχόμενα από σφαίρα βρέθηκαν να έχουν μια μείωση στη συχνότητα του SP κυττάρων σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα ή D7 κύτταρα σφαίρα προερχόμενα? P = 0,03.

Η έκφραση CD133 είναι αυξημένη σε ΗΜ-LLC Σφαίρες και έκφραση CD44 είναι ενισχυμένη σε HM-LLC κυττάρων σε σύγκριση με LM-LLC κύτταρα

Εκτός από την αξιολόγηση των λειτουργικών χαρακτηριστικών των CICs όπως ως δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1 και χρωστική Hoechst 33342 εκροής, επιδιώξαμε επίσης να χαρακτηρίσει TC-1 και LLC κύτταρα για την έκφραση του CD44 και CD133, υποθετική δείκτες κυτταρικής επιφάνειας CIC. Τα αντιπροσωπευτικά οικόπεδα για CD44 και CD133 εμφανίζονται (Εικόνα 5Α). Μεταξύ TC-1 και LLC κύτταρα, όλα τα κύτταρα εξέφρασαν CD44. έκφραση CD44 για HM-LLC σφαίρες σύγκριση με τα κύτταρα προσκολλημένα ΗΜ-LLC έδειξε μια μείωση για σφαίρες στη συνολική έκφραση (Σχήματα 5Α και 5Β). έκφραση CD44 ήταν μεταβλητή μεταξύ των LLC κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας (Εικόνες 5Α και 5Β). Προσκολλημένη κυτταρικές σειρές εμφανίζεται μια πιο ομοιογενή έκφραση των CD44, ενώ σφαίρα-καλλιεργημένα κύτταρα παρουσίασαν μια πιο ετερογενής έκφραση με ορισμένα κύτταρα που εκφράζουν μειωμένα ποσά των CD44, ενώ οι περισσότεροι παρέμειναν CD44 φωτεινό. έκφραση CD44 ΝΧΙ βρέθηκε να μειώνεται μεταξύ των κυττάρων D1 και D7? Ρ & lt? 0.001 (Σχήμα 5Β). κύτταρα LM-LLC εμφανίζονται το λιγότερο έντονη χρώση για CD44 σε σύγκριση με όλους τους άλλους τύπους κυττάρων LLC και συνθήκες καλλιέργειας? Ρ & lt? 0.001 (Σχήμα 5Α). Καμία διαφορά ανιχνεύθηκε για έκφραση CD133 μεταξύ των κυττάρων προσκολλημένη HM-LLC και Ρ2, τα κύτταρα σφαίρα του πολιτισμού D1 και D7? Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα του CD133 θετικότητας μεταξύ HM-LLC σφαίρες, τόσο D1 και D7 καλλιεργημένα κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα LM-LLC (Σχήμα 5C).

έκφραση CD44 μειώθηκε σε Ρ2, Δ1 σφαίρα-κύτταρα προερχόμενα για TC-1 κύτταρα σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα και Ρ2, κύτταρα D7 (Σχήμα 5D). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην έκφραση CD44 σημειώθηκε για Ρ2, D7 TC-1 κύτταρα σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα TC-1. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση του CD133 μεταξύ των προϋποθέσεων TC-1 κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα 5Ε).

Σφαίρα που προέρχονται από κύτταρα παρουσιάζουν μεγαλύτερη Ογκογονικότητα σε συγγενικά ποντίκια σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα

Εμείς αξιολογούνται η καρκινογένεση από τη Δ1 και D7 σφαίρες σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα. Εξετάσαμε επίσης το ογκογονικότητας αυτών των κυττάρων σε ανοσοεπαρκή συγγενικά ποντίκια σε σύγκριση με ανοσοκατασταλμένα ποντίκια NSG, προκειμένου να αντιμετωπίσει καλύτερα το μοντέλο CIC σε αυτά τα δύο διαφορετικά περιβάλλοντα ποντίκι [29]. Χρησιμοποιώντας ανάλυση περιοριστικής αραίωσης, TC-1 σφαίρες βρέθηκαν να είναι σημαντικά πιο ογκογόνα σε συγγενικά ποντίκια σε σύγκριση με TC 1-προσκολλημένα κύτταρα? P≤0.001 για Ρ2, τα κύτταρα D1 και Ρ = 0.0158 για το Ρ2, D7 κύτταρα (Σχήμα 6Α). D1 TC-1 σφαίρες ήταν πιο ογκογόνο από D7 σφαίρες? Ρ = 0.04. TC-1 Ρ2, Δ1 σφαίρες εκτιμάται ότι θα έχουν συχνότητα CIC 1 κύτταρο ανά 9.533 κύτταρα. Ρ2, D7 σφαίρες ήταν η επόμενη πιο ογκογόνο με εκτιμώμενη συχνότητα CIC από 1 κύτταρο ανά 21,918 κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα βρέθηκαν να είναι το λιγότερο ογκογόνο με εκτιμώμενη συχνότητα 1 κύτταρο ανά 62,129 κύτταρα. Για τα κύτταρα LLC εμφυτεύονται σε συγγενή ποντίκια, υπήρχε μια τάση για χαμηλότερη συχνότητα CIC μεταξύ σφαίρες (κύτταρα D1, 1 ανά 29.694 κύτταρα και D7 κυττάρων 1 ανά 35.949 κύτταρα) σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα (HM-LLC 1 ανά 46.989 κύτταρα και LM-LLC 1 ανά 49.686 κύτταρα), αλλά η τάση αυτή δεν έφθασε σημασία (Σχήμα 6Β). Σε NSG ποντίκια Όλες οι αραιώσεις του κάθε κυτταρική σειρά και συνθήκες καλλιέργειας δοκιμάστηκε ήταν ικανό να σχηματίζει όγκων στο 100% των ποντικών. Όταν δοκιμάστηκε, λιγότερο από 500 κύτταρα για TC-1 και λιγότερο από 1000 κύτταρα για τα κύτταρα LLC ήταν αρκετή για να δημιουργήσει όγκων σε ποντίκια NSG (Εικόνα 6Α και 6Β).

Συζήτηση

Η πλειοψηφία των μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει CICs ασθενή προερχόμενο υλικό ή καθιερωμένες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου όγκου εμβολιάσθηκαν σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια. Ενώ αυτά τα ξενομόσχευμα μελέτες επιτρέπουν τον προσδιορισμό των υπο-πληθυσμό των κυττάρων είναι σε θέση να ανακεφαλαιώσω έναν όγκο σε ανοσοκατεσταλμένους ποντίκι, μπορεί να μην παρουσιάζουν μια ακριβή εικόνα των χαρακτηριστικών της αληθινής CICs. Για να σχηματιστεί ενός όγκου σε έναν άνθρωπο, δυναμικό CICs πρέπει να αλληλεπιδρούν με το ανοσοποιητικό σύστημα για την πρόληψη και την εξάλειψη αναγνώριση του όγκου. Ως απόδειξη για αυτό, δείξαμε ότι συγγενικά ανοσοϊκανά ποντίκια απαιτεί σημαντικά περισσότερα κύτταρα να κινήσει έναν όγκο από ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς. Από αυτό, μπορεί να έθεσε ευθέως ότι υπάρχει ένας μεγαλύτερος πληθυσμός των κυττάρων που είναι ικανά να αναπτύσσονται όγκων σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς που δεν μπορεί να κινήσει όγκους σε συγγενικούς αντίστοιχά τους, και ότι οι πραγματικοί CICs μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα πολύ πιο σπάνια πληθυσμό από προσδιορίζεται σε μοντέλα ξενομοσχεύματος.

Η εφαρμογή της καλλιέργειας σφαίρας για την ανίχνευση υποθετικών CICs έχει χρησιμοποιηθεί για διάφορους όγκους [10], [16], [17], [30]. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά που ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών ποντικού καρκίνου του πνεύμονα έχει εξεταστεί συστηματικά για σφαίρα ικανότητα και τον εμπλουτισμό του CICs (Πίνακας 1) που σχηματίζουν. Ειδικότερα, TC-1 και HM-LLC σφαίρες ήταν ικανή για βιώσιμη ανάπτυξη σε καλλιέργεια. Στο πέρασμα, ένας σημαντικός αριθμός κυττάρων που πεθαίνουν εντός των πρώτων 24 ωρών. Αυτό δείχνει ότι εντός καλλιέργειες σφαίρα υπάρχει μια υπο-πληθυσμός των κυττάρων ικανών αυτο-ανανέωση και τον πολλαπλασιασμό, υποθετικό CICs. Ωστόσο, δεν είναι όλα κυτταρικές γραμμές ήταν ικανές σταθερή ανάπτυξη, όπως σφαίρες. Επτά από τις κυτταρικές σειρές εννέα σφαίρες που σχηματίστηκαν και ελέγχθηκαν για την μακροπρόθεσμη ικανότητα καλλιέργεια είχε μια FE κάτω ή μέσα σε μια τυπική απόκλιση 1 (Πίνακας 1). Μια FE κάτω του 1 δείχνει ότι άλλα κύτταρα με περιορισμένη ικανότητα πολλαπλασιασμού εκτός αλήθεια CICs θα μπορούσαν να αποτελέσουν σφαίρες, ή ότι η αληθινή CICs μπορεί να ασύμμετρα διαιρούν την πάροδο του χρόνου σε διαφοροποιημένα κύτταρα δεν μπορούν πολιτισμού σε συνθήκες σφαίρα. Ως εκ τούτου, σφαίρα σχηματισμός πάνω από ένα ή δύο περάσματα δεν είναι τόσο χρήσιμο για τον προσδιορισμό CICs ως παρατείνεται καλλιέργεια σφαίρα κατά τη διάρκεια αρκετών περάσματα και την εφαρμογή ενός μαθηματικού μοντέλου για την αξιολόγηση των CIC συχνότητα διαίρεση συμμετρική [17].

Σε αντίθεση με γονικών LLC και τα κύτταρα LM-LLC, κύτταρα HM-LLC είναι ικανές να σχηματίζουν σφαίρες που θα μπορούσαν να περνιούνται μεγαλύτερη από οκτώ φορές, και επέδειξε μία ισχυρή επέκταση φορές και συμμετρική συχνότητα διαίρεσης. Επιπλέον, ο σχηματισμός σφαίρα σημειώθηκε για τους μεταστατικούς γραμμές αδενοκαρκινώματος ποντικού πνεύμονα 344P και 344SQ, αλλά όχι για τη μη μεταστατική κυτταρική γραμμή 393P. Αυτές οι τρεις κυτταρικές γραμμές έχουν προηγουμένως αναφερθεί για το σχηματισμό τρισδιάστατου σφαίρες σε καλλιέργεια matrigel και οι μετάσταση επιρρεπείς γραμμές έχουν χαρακτηριστεί ως ικανή να υποστεί μια επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [24]. Έχει προταθεί ότι μπορεί να υπάρχει μια άμεση σχέση μεταξύ της EMT των κυττάρων και την απόκτηση βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με φαινότυπο /CIC [31]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μεταστατικά κύτταρα έχουν μια εμπλουτισμένη δυνατότητα στον πολιτισμό ως μη προσκολλημένα σφαιροειδή, και ότι μεταστατικά κύτταρα εμπλουτισμένα για CICs. Οι μελλοντικές μελέτες που απαιτούνται για την αντιμετώπισή της.

Έχουμε αποδείξει ότι η συχνότητα των CICs αλλάζει κατά τη διάρκεια ενός περάσματος για ποντικού tumorspheres καρκίνο του πνεύμονα.