Αφηρημένο

Ερευνήσαμε

ΚΟΑ

κατάσταση έκφρασης του mRNA χρησιμοποιώντας RNA σε in situ υβριδισμού (ISH) τεχνική στην πρωτοβάθμια και μεταστατικών βλαβών των 535 χειρουργικά γαστρικό καρκίνωμα (GC) περιπτώσεις. Συγκρίναμε τα αποτελέσματα με αυτά της ανοσοϊστοχημείας και αργύρου in situ υβριδισμό, και εξέτασαν τη σχέση με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά και την πρόγνωση. Μεταξύ των 535 πρωτοβάθμια GCs, 391 (73,1%) βαθμολογήθηκαν 0, 87 (16,3%) βαθμολογήθηκαν 1, 38 (7,1%) βαθμολογήθηκαν 2, 12 (2,2%) βαθμολογήθηκαν 3 και 7 (1,3%) βαθμολογήθηκαν 4 από RNA ISH. Υψηλή

ΚΟΑ

έκφραση του mRNA (βαθμολογία ≥3) συνδέθηκε με λεμφαδένα μετάσταση (

P

= 0,014), μακρινή μετάσταση (

P

= .001), και ανώτερο στάδιο ΤΝΜ (

P

. 001). Οι ασθενείς παρουσιάζουν υψηλού

ΚΟΑ

mRNA σε πρωτογενείς ή μεταστατικές αλλοιώσεις είχαν μικρότερη συνολική επιβίωση από αυτούς που δείχνει χαμηλής

ΚΟΑ

mRNA (πρωτοπαθείς όγκους,

P

= 0.002? μεταστατικούς λεμφαδένες,

P

& lt? .001). Οι ασθενείς που εμφανίζουν θετική μετατροπή των

ΚΟΑ

κατάσταση mRNA σε μεταστατικούς λεμφαδένες είχαν μικρότερη συνολική επιβίωση από εκείνους που δεν έχουν μετατροπής (

P

= 0,011). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η υψηλή

ΚΟΑ

έκφραση mRNA σε μεταστατικούς λεμφαδένες ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση (

P

= 0,007). Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι

ΚΟΑ

έκφραση του mRNA αξιολογείται από την RNA ISH θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως ένας πιθανός δείκτης για τον εντοπισμό

ΚΟΑ

ογκογονίδιο-εθισμένος GC

Παράθεση:. Choi J , Lee HE, Kim MA, Jang BG, Lee ΕΣ, Kim WH (2014) Ανάλυση του

ΚΟΑ

έκφραση mRNA σε γαστρικών καρκίνων Χρησιμοποιώντας RNA σε Δοκιμασία Situ Hybridization: κλινική επίπτωση και Σύγκριση με ανοσοϊστοχημεία της και Silver In Situ Παραγωγή μικτών γενών. PLoS ONE 9 (11): e111658. doi: 10.1371 /journal.pone.0111658

Επιμέλεια: Svetlana Pack, CCR, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, ΝΙΗ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Μαρτίου του 2014? Αποδεκτές: 6 Οκτωβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών του προγράμματος Κορέα (NRF) Α3 Προοπτική Διερεύνηση (https://www.nrf.re.kr). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK) οδοί έχουν αποδειχθεί ότι είναι ελκυστικοί στόχοι φάρμακο για αντικαρκινική θεραπεία [1], και η οδός ΜΕΤ είναι ένα από αυτά τα ελπιδοφόρα στόχων.

ΜΕΤ

είναι ένα πρωτο-ογκογονίδιο που βρίσκεται στην 7q31 τόπο και κωδικοποιεί μια RTK για αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) [2], [3]. Η στενή ρύθμιση του μονοπατιού HGF /MET που παρατηρείται στην ανάπτυξη και αναγέννηση χάνεται στον καρκίνο, και τέτοια απορύθμιση συμβαίνει μέσω πολλαπλών μηχανισμών [1]. Η ανώμαλη ενεργοποίηση MET παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, την ανάπτυξη, την αγγειογένεση, και μετάσταση σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του μαστού, του νεφρού, και κακοήθειες του γαστρεντερικού σωλήνα [4]. Ωστόσο, αν και η διαστρωμάτωση των ασθενών σύμφωνα με την έκφραση ΚΟΑ ή δραστηριότητα είναι σημαντική για την θεραπευτική επιτυχία, οι μέθοδοι για την εκτίμηση του επιπέδου έκφρασης ΚΟΑ ή δραστηριότητα δεν έχει τεκμηριωθεί [4].

Για γαστρικό καρκίνωμα (GC), παρεκκλίνουσα MET ενεργοποίησης έχει πιστεύεται ότι σχετίζεται με ένα γονίδιο δοσολογία επίδραση [5], και

MET

γονιδιακής ενίσχυσης (GA) ή πρωτεΐνη υπερέκφραση έχει συσχετισθεί με την επιθετική χαρακτηριστικά όγκου και /ή χειρότερα κλινικής έκβασης [6] – [14]. Επιπλέον,

ΚΟΑ

-amplified ή -overexpressed GC έδειξε ανταπόκριση στη θεραπεία με διάφορους αναστολείς του μονοπατιού σηματοδότησης HGF /ΚΟΑ σε προκλινικές μελέτες [15] και τη φάση των κλινικών δοκιμών I [12], [16]. Ως εκ τούτου, η αναστολή ΚΟΑ έχει τη δυνατότητα ως μια άλλη επιτυχημένη θεραπευτική στρατηγική παρακάτω υποδοχέα του παράγοντα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού 2 (HER2) -targeted θεραπεία σε προχωρημένο GC. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει διάφορες μεθόδους για την αναγνώριση ΚΟΑ θετικά GC και έδειξαν διαφορά στον επιπολασμό της ΚΟΑ υπερέκφραση ή ενίσχυση: ΚΟΑ υπερέκφραση κυμάνθηκε 18% έως 73,7% σε μελέτες με ανοσοϊστοχημεία (IHC) [7] – [9], [13], [14], [17],

ΚΟΑ

αριθμού αντιγράφων γονιδίου (GCN) κέρδος κυμάνθηκε από 10% έως 21,2% σε μελέτες με τη χρήση ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qPCR) [10], [ ,,,0],11], και

ΚΟΑ

GA κυμαίνονταν από 2% έως 3,9% στις μελέτες χρησιμοποιώντας φθορισμό σε in situ υβριδισμού (FISH) [12], [18] ή ασήμι in situ υβριδισμού (SISH) [13]. Από αυτές τις μεθόδους, IHC χρησιμοποιείται ευρέως στην κλινική πρακτική και η καταλληλότερη μέθοδο διαλογής για την ανίχνευση της MET-θετικών GC. Ωστόσο, περαιτέρω διερεύνηση χρειάζεται ακόμα να βρει μια έξυπνη βιοδείκτη ή μεθοδολογία προσδιορισμού για τη θεραπεία της αναστολής ΚΟΑ.

Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε ένα RNA in situ υβριδισμού (ISH) δοκιμασία χρησιμοποιώντας ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων DNA ανιχνευτές και προενισχυτή-ενισχυτή -τίτλου ανιχνευτές για οπτικοποίηση [19]. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) σε ιστούς και επιτρέπει την απεικόνιση μίας μόριο κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. Σε προηγούμενη μελέτη μας, αποδείξαμε ότι

HER2

έκφραση του mRNA αξιολογείται από την RNA ISH ήταν καλά συσχετίζονται με την πρωτεΐνη υπερέκφραση και GA αξιολογήθηκε από την IHC και FISH σε 211 περιπτώσεις GC [20]. Επίσης, δείξαμε τη συσχέτιση μεταξύ

MET

GCN και την έκφραση της πρωτεΐνης σε μια προηγούμενη μελέτη [13]. Εδώ, θα αξιολογηθούν

ΚΟΑ

έκφραση του mRNA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του RNA ISH, και σε σύγκριση με τα αποτελέσματα με εκείνα των IHC και SISH σε μια μεγάλη σειρά GC. Επιπλέον, κλινικοπαθολογική παραμέτρους και κλινικές εκβάσεις των ασθενών GC σύμφωνα με το

ΚΟΑ

κατάσταση έκφρασης του mRNA αξιολογήθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και ιστών δείγματα

Συλλέξαμε δείγματα αρχειακό ιστό των ασθενών GC που διαδοχικά υποβλήθηκαν σε γαστρεκτομή στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Νοσοκομείο, Σεούλ, Κορέα, από τον Ιανουάριο του 2004 έως τον Δεκέμβριο του 2005. Τέλος, 535 δείγματα πρωτογενούς GC και 199 δείγματα της σύγχρονης περιφερειακής μεταστατικών λεμφαδένων (LN) από 535 ασθενείς ήταν διαθέσιμοι για αυτή τη μελέτη. Τα κλινικοπαθολογικοί χαρακτηριστικά των ασθενών που εξετάστηκαν από την αναθεώρηση ιατρικών διαγράμματα και παθολογικές αρχεία (Πίνακας 1). στάδιο TNM ταξινομήθηκε σύμφωνα με το σύστημα της μεικτής επιτροπής Αμερικανικής Εγχειρίδιο του καρκίνου Σταδιοποίηση, 7

ου έκδοση. Τα κλινικά αποτελέσματα παρακολουθήθηκαν από την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης μέχρι το θάνατο ή 60 μήνες.

Η

Όλα τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24-48 ώρες και στη συνέχεια εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Πυρήνας ιστούς (διαμέτρου 2 mm) ελήφθησαν χρησιμοποιώντας συσκευή τρεφίνη (Superbiochips Laboratories, Σεούλ, Κορέα). Για τις πρωτογενείς GCs, επιλέχθηκε η μπροστινή εισβολή του κάθε πρωτοπαθούς όγκου. Μεταστατικό LNs υποβλήθηκαν σε συστοιχία ιστού αλλά αποκλείστηκαν οι περιπτώσεις με μικρομεταστάσεων. Σύνολο μπλοκ μικροσυστοιχίες 22 ιστού που περιείχε έως και 60 πυρήνες κατασκευάστηκαν.

Ηθικοί κανόνες

Όλα τα ανθρώπινα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής χειρουργικής επέμβασης. Οι συμμετέχοντες δεν παρέχουν τη γραπτή συγκατάθεση για να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη. Η αναδρομική μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των δειγμάτων πάνω στα ράφια μετά την παθολογική διάγνωση, και όλα τα δείγματα είχαν ανώνυμα πριν από τη μελέτη. IRB μας (Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Νοσοκομείο) ενέκρινε αυτή την αναδρομική μελέτη, υπό τον όρο της ανωνυμίας (Αναφορά: H-1006-035-320).

RNA ISH

Για την in situ ανίχνευση

ΚΟΑ

mRNA, το κιτ δοκιμασίας 2.0 RNAscope FFPE (Διαγνωστικά Σύνθετη κυττάρων, Hayward, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 έως 3 μm τομές ιστού πάχους FFPE αποπαραφινοποιήθηκαν, θερμαίνεται, κατεργάζεται με πρωτεάση, και υβριδοποιήθηκε με ανιχνευτή σε 40 ° C για 2 ώρες (η αλληλουχία αναφοράς, NM_001127500? Περιοχή ιχνηλάτη, 1236-2257). Μετά το πλύσιμο και την ενίσχυση, 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη προστέθηκε για ανίχνευση του RNA στόχου. Οι πυρήνες με αιματοξυλίνη. Θετική χρώση δεικνύεται με τελείες καφέ στικτή στον πυρήνα ή /και κυτταρόπλασμα.

ΚΟΑ

επίπεδα έκφρασης του mRNA κατηγοριοποιήθηκαν σε 5 βαθμούς, σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή βαθμολόγησης του κατασκευαστή: σκοράρει 0, καμία χρώση ή & lt? 1 κουκίδα ανά κύτταρο? θα σκοράρει 1, 1-3 κουκίδες ανά κύτταρο (ορατό στο 20-40 ×)? σκοράρει 2, 4-10 κουκίδες ανά κύτταρο και καθόλου ή πολύ λίγες συστάδες τελεία (ορατό στο 20-40 ×)? βαθμολογία: 3, & gt? 10 κουκίδες ανά κύτταρο και & lt? 10% θετικά κύτταρα έχουν τελεία συστάδες (ορατό σε 20 ×)? βαθμολογία 4, & gt? 10 κουκίδες ανά κύτταρο και & gt? 10% θετικά κύτταρα έχουν συστάδες τελεία (ορατό στα 20 ×) (Σχήμα 1). Οι ανιχνευτές για

UBC

(ουβικιτίνη C) και

dapB

(ένα βακτηριακό γονίδιο) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός και αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα. Τα δείγματα θεωρήθηκαν επαρκείς όταν οι

UBC

mRNA σήματα ήταν εύκολα ορατό κάτω από ένα αντικειμενικό φακό 10x και το

dapB

σήμα δεν ήταν ορατό.

(Α-Γ) μια αρνητική περίπτωση δείχνει

ΚΟΑ

RNA ISH σκορ 0: (Α)

ΚΟΑ

mRNA, (Β)

UBC

mRNA, και (Γ)

dapB

mRNA . (D-F) σε θετική περίπτωση δείχνει ΚΟΑ RNA ISH βαθμολογία: 4: (D)

ΚΟΑ

mRNA, (Ε)

UBC

mRNA, και (F)

dapB

mRNA (αρχική μεγέθυνση: × 400).

η

IHC και SISH

η ανοσοϊστοχημική χρώση για ΚΟΑ έγινε με αντι-συνολικής ΚΟΑ (SP44) κουνελιού μονοκλωνικό πρωτογενή αντισώματα (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA). Μια αυτόματη ανοσοκηλιδωτή (BenchMark XT, Ventana Medical Systems) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. MET ανοσοχρώση σκόραρε με τις κατευθυντήριες γραμμές HercepTest βαθμολόγησης για GC (DAKO, Glostrup, Δανία): 0 γκολ, δεν χρώση μεμβράνη ή χρώση μεμβράνης σε & lt? 10% των κυττάρων του όγκου? θα σκοράρει 1, χρώση αμυδρή /μόλις αντιληπτή μερική μεμβράνης & gt? 10% των κυττάρων του όγκου? στείλει 2, αδύναμη έως μέτρια χρώση ολόκληρου μεμβράνης σε & gt? 10% των κυττάρων του όγκου? βαθμολογία 3, ισχυρή χρώση ολόκληρου μεμβράνης σε & gt?. 10% των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 2)

(Α) IHC σκοράρει 1, σκορ (Β) IHC 2, (Γ) IHC στείλει 3, και (D) ενίσχυση του γονιδίου (αρχική μεγέθυνση: × 400).

η

δοκιμασία SISH Dual-χρώματος έγινε με INFORM ανιχνευτή DNA ΚΟΑ και ενημερώνει χρωμοσώματος 7 καθετήρα (Ventana Medical Systems) σε ένα σημείο αναφοράς XT Ventana παρακάτω τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Σήματα που απαριθμούνται στο 40 πυρήνες όγκου ανά πυρήνα, και

ΚΟΑ

κατάσταση γονίδιο που ταξινομούνται σε 6 ομάδες χρησιμοποιώντας το Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Κέντρο Καρκίνου κριτήρια για το γονίδιο του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [21] (Σχήμα 2).

Η στατιστική ανάλυση

Ο χ

δοκιμή 2 ή ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης ΚΟΑ και κλινικοπαθολογική παράγοντες. Η Φοιτητών

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση μέσων συνεχείς μεταβλητές. Το τεστ συσχέτισης Spearman χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ RNA αποτελέσματα ISH και IHC ή τα αποτελέσματα SISH. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συνολική επιβίωση (OS), και οι διαφορές OS μεταξύ των ομάδων με διαφορετικό καθεστώς ΚΟΑ συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία log-rank. πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του μοντέλου αναλογία αναλογικού κινδύνου του Cox. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση SPSS έκδοση 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA), και τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν

P

& lt?. .05

Αποτελέσματα

1.

ΚΟΑ

κατάσταση mRNA αξιολογείται από την RNA ISH

535 πρωτοπαθείς όγκους, 391 (73,1%), 87 (16,3%), 38 (7,1%), 12 (2,2%) και 7 ( 1,3%) εμφάνισαν RNA ISH στείλει 0, 1, 2, 3, και 4, αντίστοιχα. Όταν συγκρίναμε τα αποτελέσματα της RNA ISH με κλινικοπαθολογική δεδομένων, συμπεριλαμβανομένων επιβίωσης, και αναλύονται τα αποτελέσματα της RNA ISH με IHC και SISH δεδομένων, οι ομάδες της βαθμολογίας 3 και 4 έδειξαν διακριτά χαρακτηριστικά. Ως εκ τούτου, θεωρείται το σκορ 3 και 4 ως υψηλής

ΚΟΑ

ομάδα mRNA, και το σύνολο των 19 περιπτώσεις (3,5%) ανήκε στην ανάδειξη

ΚΟΑ

mRNA.

Υψηλή –

ΚΟΑ

mRNA σχετίστηκε με μεγαλύτερη ηλικία (

P

= .002), μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου (

P

= 0,006), LN μετάσταση (

P

= 0,014), λεμφική εισβολή (

P

& lt? .001), αύξηση του αριθμού των μεταστατικών λεμφαδένων (

P

& lt? .001), μακρινή μετάσταση (

P

= .001), και υψηλότερο στάδιο ΤΝΜ (

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με την χαμηλή τους

ΚΟΑ

mRNA (Πίνακας 2). Ωστόσο, υψηλής

ΚΟΑ

mRNA δεν έδειξαν καμία συσχέτιση με το φύλο, τη θέση του όγκου, την ταξινόμηση Lauren, και το βάθος εισβολή (Πίνακας 2).

Η

199 σύγχρονη μεταστατικό LNs, 119 (59,8%), 45 (22,6%), 22 (11,1%), 4 (2,0%) και 9 (4,5%) εμφάνισαν RNA ISH στείλει 0, 1, 2, 3, και 4, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, 13 περιπτώσεις (6,5%) ήταν υψηλού

ΚΟΑ

mRNA. Μεταξύ των 199 ζεύγη των πρωτογενών και μεταστατικών βλαβών, 186 (93,5%) παρουσίασαν σύμφωνη

ΚΟΑ

κατάσταση mRNA και 13 (6,5%) δεν το έκανε. Από αυτές τις 13 περιπτώσεις ασύμφωνα, αρνητική μετατροπή βρέθηκε στο 50% (7/14) του υψηλού

ΚΟΑ

πρωτοπαθείς όγκους του mRNA, και η θετική μετατροπή βρέθηκε στο 3,2% (6/185) των χαμηλών

ΚΟΑ

mRNA πρωτογενείς όγκους (Πίνακας 3).

Η

2. ΚΟΑ πρωτεΐνες και την κατάσταση GCN αξιολογούνται από την IHC και SISH

Χρησιμοποιώντας IHC, 236 (44,1%), 171 (32%), 113 (21,1%) και 15 (2,8%) πρωτοπαθείς όγκους βαθμολογήθηκαν 0, 1, 2 και 3, αντίστοιχα. IHC σκοράρει 3 έδειξε διακριτή κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά, και αυτή η ομάδα υπερέκφραση ΚΟΑ ήταν σημαντικά σχετίζονται με μεγαλύτερη ηλικία (

P

= .005), μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου (

P

= 0.009), το βάθος εισβολή (

P

= .05), LN μετάσταση (

P

= 0,018), λεμφική εισβολή (

P

= 0,026), αύξηση του αριθμού των μεταστατικών λεμφαδένων (

P

& lt? .001), μακρινή μετάσταση (

P

= 0.007), και υψηλότερο στάδιο ΤΝΜ (

P

= .001). Ωστόσο, το ΚΟΑ υπερέκφραση δεν έδειξαν καμία συσχέτιση με το φύλο, τη θέση του όγκου, και ταξινόμηση Lauren (Πίνακας S1).

199 σύγχρονη μεταστατικό LNs, 46 (23,1%), 92 (46,2%), 46 (23,1 %) και 15 (7.5%) εμφάνισαν IHC στείλει 0, 1, 2 και 3, αντίστοιχα. Μεταξύ των 199 ζεύγη των πρωτογενών και μεταστατικών βλαβών, 187 (94,0%) παρουσίασαν σύμφωνη ΚΟΑ πρωτεΐνη και 12 (6,0%) δεν το έκανε. Από αυτές τις 12 περιπτώσεις ασύμφωνα, αρνητική μετατροπή βρέθηκε στο 36,4% (4/11) των πρωτογενών όγκων με ΚΟΑ υπερέκφραση, και θετική μετατροπής βρέθηκε στο 4,3% (8/188) των πρωτογενών όγκων χωρίς ΚΟΑ υπερέκφραση.

Χρήση SISH,

ΚΟΑ

GA παρατηρήθηκε στο 2,6% (14/535) των πρωτογενών όγκων.

ΚΟΑ

GA έδειξε σημαντική συσχέτιση με το μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου (

P

= 0,038), λεμφική εισβολή (

P

= 0,009), αύξηση του αριθμού των μεταστατικών λεμφαδένων (

P

& lt? .001), μακρινή μετάσταση (

P

= 0.005), και υψηλότερο στάδιο ΤΝΜ (

P

= .002). Ωστόσο,

ΚΟΑ

GA δεν δείχνουν καμία συσχέτιση με το φύλο, τη θέση του όγκου, ταξινόμηση Lauren, βάθος εισβολής και LN μετάσταση (Πίνακας S2).

3. Συσχέτιση της ΚΟΑ αξιολογούνται από την RNA ISH, IHC και SISH

Η συσχέτιση μεταξύ

ΚΟΑ

mRNA και την κατάσταση της πρωτεΐνης εκτιμάται από RNA ISH και IHC παρουσιάζεται στον Πίνακα 4. Σε 535 πρωτοπαθείς όγκους, υπάρχει ήταν μια θετική συσχέτιση μεταξύ του

ΚΟΑ

έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης (r = 0.398,

P

& lt? .001). Όλα τα 7 περιπτώσεις με RNA ISH βαθμολογία 4 έδειξε ΚΟΑ πρωτεΐνης υπερέκφραση. Μεταξύ των 12 περιπτώσεων με RNA ISH βαθμολογία: 3, 5 περιπτώσεις (41,7%) παρουσίασαν βαθμολογία IHC 3. Οι περιπτώσεις με RNA ISH σκοράρει 2 παρουσίασαν μεταβλητή βαθμολογία IHC. Οι περιπτώσεις με RNA ISH σκοράρει 0 ή 1 δεν δείχνουν ΚΟΑ υπερέκφραση της πρωτεΐνης εκτός από την 1η περίπτωση. Μεταξύ των 10 περιπτώσεων που δείχνουν απόκλιση (δηλαδή, θετικό RNA ISH και αρνητική σε IHC ή αντίστροφα), 8 έδειξε IHC σκοράρει 2 ή RNA ISH σκοράρει 2. Σε 199 μεταστατικό LNs, υπήρχε μια καλή θετική συσχέτιση μεταξύ

ΚΟΑ

mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης (r = 0,462,

P

& lt? .001). (Πίνακας S3)

η

Επιπλέον, υπήρξε μια θετική συσχέτιση μεταξύ του

ΚΟΑ

mRNA έκφραση και

MET

GCN (r = 0,345?

P

& lt? 0.001) (Πίνακας 4). Μεταξύ των 7 περιπτώσεις με RNA ISH βαθμολογία: 4, 6 (85,7%) παρουσίασαν

ΚΟΑ

GA και μόνο μία περίπτωση έδειξε HP (14,3%). Οι 12 περιπτώσεις με RNA ISH βαθμολογία 3 έδειξε GA (50%) ή πολυσωμία (50%) από SISH. Οι περιπτώσεις με RNA ISH σκορ 2 έδειξαν διάφορα SISH πρότυπα, συμπεριλαμβανομένων GA (5,3%). Καμία από τις υποθέσεις με RNA ISH σκοράρει 0 ή 1 έδειξε GA.

Ο Πίνακας 5 συνοψίζει τα αποτελέσματα της RNA ISH, IHC και SISH πρωτογενούς GC. Μεταξύ των 535 περιπτώσεων, 513 περιπτώσεις (95,9%) ήταν αρνητικά τόσο από RNA ISH και IHC, και μόνο 22 περιπτώσεις (4,1%) παρουσίασαν θετικά αποτελέσματα είτε RNA ISH ή IHC. Αυτές οι 22 περιπτώσεις εμφάνισαν

ΚΟΑ

GA (54,5%) ή πολυσωμία (45,5%) από SISH και δισωμία ή τρισωμία δεν παρατηρήθηκε ποτέ. Από την άποψη της SISH, μεταξύ των 14 περιπτώσεων που δείχνουν GA, 11 περιπτώσεις (78,6%) εμφάνισαν υψηλή έκφραση τόσο του mRNA και της πρωτεΐνης. Μεταξύ των 58 περιπτώσεων που δείχνουν ΗΡ, ωστόσο, μόνο 7 περιπτώσεις (12,1%) εμφάνισαν υψηλή έκφραση είτε mRNA ή πρωτεΐνης. Μεταξύ των 111 υποθέσεων που δείχνει LP, μόνο 3 περιπτώσεις (2,7%) εμφάνισαν υψηλή έκφραση του mRNA. Όλα τα 352 περιπτώσεις που δείχνει δισωμία ή τρισωμία παρουσίασαν αρνητικά αποτελέσματα τόσο από RNA ISH και IHC.

Η

4. Προγνωστικές συνέπειες της ΚΟΑ στην πρωτοβάθμια και μεταστατικών βλαβών

Υψηλής

ΚΟΑ

mRNA σε πρωτογενείς όγκους ή μεταστατικό LNs συσχετίστηκε με κακή OS (πρωτοπαθείς όγκους,

P

= .002, Σχήμα 3Α? μεταστατικό LNs,

P

& lt? .001, Σχήμα 3D). Στις πρωτογενείς όγκους με χαμηλή

ΚΟΑ

mRNA, οι ασθενείς με θετική μετατροπή έδειξε χειρότερο λειτουργικό σύστημα από εκείνους που δεν έχουν μετατροπής (

P

= .011, Σχήμα 3F). Στον πρωτογενή όγκων με υψηλής

ΚΟΑ

mRNA, οι ασθενείς με αρνητικό μετατροπή έδειξε καλύτερη OS από εκείνους που δεν μετατροπή, αλλά δεν υπήρξε καμία στατιστικά σημαντική (

P

= 0.137, Εικόνα 3F ).

σε 535 πρωτοβάθμια GC, (Α) υψηλής

ΚΟΑ

mRNA συσχετίστηκε με κακή OS σε σύγκριση με την χαμηλή τους

ΚΟΑ

mRNA (

P

= 0.002), (Β) συναντήθηκε υπερέκφραση συσχετίστηκε με κακή OS σε σύγκριση με καμία υπερέκφραση (

P

= .001), και (C)

ΚΟΑ

ενίσχυση του γονιδίου σχετίζεται με κακή OS σε σύγκριση με καμία ενίσχυση (

P

= .005). Σε 199 μεταστατικούς λεμφαδένες, (D) υψηλής

ΚΟΑ

mRNA συσχετίστηκε με κακή OS σε σύγκριση με την χαμηλή τους

ΚΟΑ

mRNA (

P

& lt? .001), και (Ε) συνεδρίασε υπερέκφραση συσχετίστηκε με κακή OS σε σύγκριση με καμία υπερέκφραση (

P

= 0,024). (F) Σε 199 συμφωνημένα πρωτογενείς όγκους και μεταστατικούς LNs, να συμπίπτει με θετική και θετική ομάδες μετατροπή σχετίστηκαν με την κακή OS σε σύγκριση με το να συμπίπτει με αρνητική ομάδα (να συμπίπτει με αρνητική έναντι αρνητικών μετατροπής,

P

= 0.640? Να συμπίπτει με αρνητικό vs . θετική μετατροπή,

P

= 0.011? να συμπίπτει με αρνητικό εναντίον του να συμπίπτει με θετικές,

P

& lt? .001? να συμπίπτει με θετικό έναντι αρνητικού μετατροπής,

P

=. 137? να συμπίπτει με θετικά έναντι θετικής μετατροπής,

P

= 0.382?. αρνητική μετατροπή εναντίον θετική μετατροπής,

P

= 0.260)

Η

ΚΟΑ υπερέκφραση σε πρωτογενείς όγκους ή μεταστατικό LNs συσχετίστηκε με κακή OS (πρωτοπαθείς όγκους,

P

= .001, Σχήμα 3Β? μεταστατικό LNs,

P

= 0.024, Σχήμα 3Ε). Στις πρωτογενείς όγκους χωρίς ΚΟΑ υπερέκφραση, θετικά μετατροπή κινήθηκαν προς την πρόβλεψη των φτωχών OS, αλλά δεν υπήρξε καμία στατιστικά σημαντική (

P

= 0,393). Στις πρωτογενείς όγκους με υπερέκφραση ΚΟΑ, αρνητική μετατροπή έδειξε μια τάση καλύτερη OS από τη μη μετατροπή, αλλά αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0,132). Επιπλέον,

ΚΟΑ

GA σε πρωτογενείς όγκους ήταν επίσης σημαντικά που συνδέονται με την κακή OS (

P

= .005, Σχήμα 3C).

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, υψηλής

ΚΟΑ

mRNA σε μεταστατικό LNs ήταν ένας ανεξάρτητος αρνητικό προγνωστικό παράγοντα για το OS, μετά την προσαρμογή για την ηλικία (& lt? 60 y έναντι ≥60 y), Lauren ταξινόμηση (εντερικού τύπου εναντίον διάχυτη ή μικτού τύπου), και TNM στάδιο (Ι-ΙΙ έναντι III-IV). Η αναλογία κινδύνου ήταν 2,27 (

P

= 0,007) (Πίνακας 6). Ωστόσο, το ΚΟΑ υπερέκφραση σε μεταστατικό LNs δεν ήταν στατιστικά σημαντική προγνωστικός παράγοντας από πολυπαραγοντική ανάλυση, αν και η αναλογία κινδύνου ήταν 1,76 (

P

= 0,067). Επιπλέον,

ΚΟΑ

GA, υψηλής

ΚΟΑ

mRNA ή πρωτεΐνης υπερέκφραση σε πρωτοπαθή όγκο, δεν ήταν στατιστικά σημαντική προγνωστικός παράγοντας από πολυπαραγοντική ανάλυση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η υψηλή

ΚΟΑ

mRNA έκφραση ήταν σημαντικά σχετίζεται με δυσμενείς κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά και κακή πρόγνωση σε μια μεγάλη σειρά ασθενών GC χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του RNA ISH. Επιπλέον, τα αποτελέσματα του RNA ISH ήταν καλά συσχετίζονται με εκείνες των SISH και IHC. Οι προηγούμενες μελέτες που αξιολογούν

MET

επίπεδα mRNA σε GC χρησιμοποίησε τη δοκιμασία κηλίδος Northern [8], [22] ή αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής (RT-PCR) [8], [14], [23] – [25]. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις μελέτες που είχαν μικρά μεγέθη δείγματος, και μόνο λίγα από αυτά διερευνώνται κλινικές επιπτώσεις της [22], [24] ή εκτελούνται σύγκριση με το DNA ή το καθεστώς πρωτεΐνη [14], [25]: Kuniyasu et al. πρώτον μελετηθεί η έκφραση του mRNA ΚΟΑ χρησιμοποιώντας την ανάλυση του Northern κηλίδων, και ανέφεραν ότι η έκφραση του 6.0-kb μεταγραφής συσχετίζεται στενά με το στάδιο του όγκου και LN μετάσταση [22]. Amemiya et al. ανέφερε ότι οι ασθενείς σταδίου IV GC με μετάσταση στο ήπαρ έδειξαν υψηλότερη έκφραση ΚΟΑ, τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης από ό, τι οι ασθενείς σταδίου IV GC χωρίς μετάσταση στο ήπαρ, χρησιμοποιώντας RT-PCR και IHC [24].

Πρόσφατα, ανέφερε ότι τα υψηλά επίπεδα του

HER2

mRNA ήταν καλά συσχετίζονται με την πρωτεΐνη υπερέκφραση και GA συγκρίνοντας τα αποτελέσματα των 4 διαφορετικές μεθοδολογίες τόπου που βασίζεται (RNA ISH, IHC, FISH και SISH) σε 211 περιπτώσεις GC [20]. Ομοίως, στην παρούσα μελέτη για την κατάσταση της αγοράς, τα αποτελέσματα της RNA ISH έδειξε αρκετά καλή συσχέτιση με εκείνες των IHC και SISH. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι το RNA ISH μπορεί να είναι μια αξιόπιστη δοκιμασία για τα δείγματα ιστού FFPE, αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες επικύρωσης που απαιτούνται.

Έχουμε αποδείξει ότι

ΚΟΑ

GA, υψηλή

ΚΟΑ

mRNA και της πρωτεΐνης υπερέκφραση αξιολογούνται από SISH, RNA ISH και IHC ήταν πολύ συγκλίνουσες, και υψηλή θέση ΚΟΑ στο DNA, mRNA και της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν ότι η ΚΟΑ υπερέκφραση οφείλεται κυρίως στην αύξηση των

MET

GCN και ο μηχανισμός αυτός συμβάλλει στην επιθετική συμπεριφορά του

ΚΟΑ

ογκογονίδιο-εθισμένος GC. Παρ ‘όλα αυτά, υπήρξαν κάποιες περιπτώσεις δείχνει ασυνέπεια μεταξύ των

ΚΟΑ

GCN, mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης. Θεωρούμε ότι τα τεχνικά προβλήματα (π.χ., η ευαισθησία και η ειδικότητα του ανιχνευτή ή του αντισώματος, και η κακή ποιότητα του mRNA των ιστών FFPE) και εντός του όγκου ετερογένεια της κατάστασης ΚΟΑ μπορεί να είναι οι κύριες αιτίες αυτής της απόκλισης. Ωστόσο, ορισμένοι βιολογικοί μηχανισμοί μπορούν επίσης να σχετίζονται με αυτή την διαφορά. Για παράδειγμα, συναντήθηκε υπερέκφραση χωρίς GA μπορεί να συμβεί μέσω μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω ΗΟΡ-εξαρτώμενη αυτοκρινείς /παρακρινείς βρόχοι ή άλλων οδών σηματοδότησης [23], [26]. Αντίθετα,

ΚΟΑ

GA δεν μπορεί να αυξήσει το γονίδιο προϊόντος. Asaoka et al. ανέφεραν ότι μερικές κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν GC

MET

GA εξέφρασε την πρωτεΐνη ως ίδιο επίπεδο με άλλες κυτταρικές γραμμές χωρίς GA, αλλά υπολείμματα τυροσίνης τους στο πεδίο κινάσης ήταν περισσότερο φωσφορυλιωμένες [27]. Οι μηχανισμοί ενεργοποίησης ΜΕΤ και το ρόλο του HGF σε GC μένει να διευκρινιστεί.

Είναι γνωστό ότι

MET

παίζει ένα ρόλο στην μεταστατική εξέλιξη του καρκίνου. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι το

ΚΟΑ

GA ή υπερέκφραση συνδέθηκε με LN μετάσταση [7], [13], [22] ή μακρινή μετάσταση [13], σε ασθενείς με GC. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η χορήγηση του ΚΟΑ αναστολέα μειωμένη περιτοναϊκή διάχυση του GC σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος [23]. Επιπλέον, Di Renzo et al. Διαπιστώθηκε ότι τα καρκινικά κύτταρα που φέρουν

MET

επιλέχθηκαν ενεργοποίηση μεταλλάξεων κατά την διάρκεια μεταστατικής εξάπλωσης της κεφαλής και του λαιμού καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, συγκρίνοντας την αλληλουχία του γονιδίου ανάμεσα πρωτογενούς όγκου και των μεταστατικών λεμφαδένων [28]. Ωστόσο, η άμεση σύγκριση της κατάστασης της ΚΟΑ μεταξύ πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων δεν έχει εκτελεστεί σε μια μεγάλη σειρά GC. Όταν συγκρίναμε την κατάσταση έκφρασης ΚΟΑ μεταξύ 199 συμφωνημένα πρωτοπαθείς όγκους και μεταστατικούς LNs, και η συνολική συμφωνία ήταν 93,5% και 94% από την RNA ISH και IHC, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η κατάσταση έκφρασης ΚΟΑ του GC είναι σχετικά σταθερή κατά τη διάρκεια της μετάστασης σε περιφερειακό LNs. Ωστόσο, η θετική μετατροπή του

ΚΟΑ

κατάσταση mRNA ήταν σημαντικά σχετίζεται με κακή πρόγνωση από μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η αξιολόγηση της ΚΟΑ στον μεταστατικών βλαβών μπορεί να είναι σημαντική για την πρόβλεψη πρόγνωση και για τον εντοπισμό πρόσθετων υποψηφίων για ΚΟΑ-στοχευμένη θεραπεία.

Κατά την ανάλυση του RNA επί τόπου με βάση έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με την «άλεσμα και δεσμεύουν »ανάλυσης, όπως η RT-PCR [19] και εφαρμόζεται τόσο για την κλινική πρακτική και την αναδρομική έρευνα. Επιπλέον, RNA ISH είναι ευνοϊκότερη από IHC όταν δεν υπάρχει κατάλληλο αντίσωμα ή όταν το μόριο στόχος είναι η εκκρινόμενη πρωτεΐνη. Σε σχέση με

ΜΕΤ

, το πλεονέκτημα αυτό μπορεί να είναι χρήσιμο, επειδή τα κύτταρα HGF που παράγουν μπορεί να απεικονιστεί σε ένα τμήμα ιστού χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή HGF. Ωστόσο, οι ευάλωτες σταθερότητα του mRNA κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας του ιστού και υψηλότερο κόστος από αυτό της IHC είναι τα μειονεκτήματα της μεθόδου RNA ISH. Ελπίζουμε ότι η περαιτέρω τεχνική βελτίωση θα επιλύσει αυτούς τους περιορισμούς.

Στην αναδρομική αυτή μελέτη,

ΚΟΑ

κατάσταση mRNA αξιολογείται από την RNA ISH συσχετίζεται καλά με την πρωτεΐνη και GCN αξιολογούνται από IHC και SISH, αντίστοιχα, και

ΚΟΑ

GA είναι ιδιαίτερα σύμφωνη με υψηλή έκφραση είτε mRNA ή της πρωτεΐνης. Στην ανάλυση επιβίωσης, υψηλή έκφραση του

ΚΟΑ

mRNA στην πρωτοβάθμια ή μεταστατικών βλαβών, και η θετική μετατροπή του

ΚΟΑ

κατάσταση mRNA σχετίζονται σημαντικά με κακή πρόγνωση. Επιπλέον,

ΚΟΑ

κατάσταση mRNA σε μεταστατικό LNs είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας από πολυπαραγοντική ανάλυση. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι

ΚΟΑ

mRNA μπορεί να είναι μια εναλλακτική λύση δείκτης για τον προσδιορισμό του

ΚΟΑ

ογκογονίδιο-εθισμένος GC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0111658.s001

(DOCX)

Πίνακας S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0111658.s002

(DOCX)

Πίνακα S3.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111658.s003

(DOCX)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στην κα Hyun Ju Πάρκο για την τεχνική υποστήριξη της