Abstract

Οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές στο μικροπεριβάλλον του όγκου την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου, την αγγειακή ανάπτυξη και επιτρέπουν διαφυγή του κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων, απενεργοποιώντας διεισδύοντας δενδριτικά κύτταρα. Ωστόσο, τα συστατικά του μικροπεριβάλλον του όγκου που επηρεάζουν άμεσα ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων και η λειτουργία δεν είναι καλά χαρακτηρισμένες. Ο στόχος μας ήταν να προσδιορίσει σχετίζονται με όγκους φλεγμονωδών μεσολαβητών οι οποίοι επηρεάζουν την λειτουργία των δενδριτικών κυττάρων. Όγκου ρυθμισμένα μέσα που λαμβάνονται από καλλιεργημένα ορθοκολικό εκφύτευμα ιστού όγκου περιείχε υψηλά επίπεδα της CCL2 χημειοκινών, CXCL1, CXCL5 εκτός από VEGF. Προ-επεξεργασία των δενδριτικών κυττάρων που προέρχονται από μονοκύτταρα με αυτού του όγκου ρυθμισμένα μέσα ανέστειλε την ανιούσα ρύθμιση των CD86, CD83, CD54 και HLA-DR σε απόκριση σε LPS, ενισχύοντας IL-10, ενώ η μείωση της έκκρισης της IL-12p70. Εξετάσαμε αν συγκεκριμένες επιμέρους συνιστώσες του όγκου ρυθμισμένα μέσα (CCL2, CXCL1, CXCL5) θα μπορούσαν να διαμορφώσουν ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων ή έκκριση κυτοκινών σε απόκριση σε LPS. VEGF αξιολογήθηκε επίσης ως έχει κατασταλτική επίδραση στην ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων. Προ-επεξεργασία των ανώριμων δενδριτικών κυττάρων με VEGF ανέστειλε την επαγόμενη από LPS προς τα πάνω ρύθμιση του CD80 και CD54, ενώ CXCL1 ανέστειλε HLA-DR. Είναι ενδιαφέρον ότι, η επεξεργασία των δενδριτικών κυττάρων με CCL2, CXCL1, CXCL5 ή VEGF καταστέλλεται σημαντικά την ικανότητά τους να εκκρίνουν IL-12ρ70 σε απόκριση σε LPS. Επιπλέον, δενδριτικά κύτταρα που κατεργάζονται με ένα συνδυασμό CXCL1 και VEGF που εκκρίνεται λιγότερο IL-12ρ70 σε απόκριση LPS σε σύγκριση με προ-θεραπεία με οποιαδήποτε κυτοκίνη μόνη. Εν κατακλείδι, όγκου ρυθμισμένο μέσο επηρεάζει έντονα ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων και τη λειτουργία

Παράθεση:. Michielsen AJ, Hogan ΑΕ, Παντρέψου J, Tosetto Μ, Cox F, Hyland JM, et al. (2011) του όγκου των ιστών μικροπεριβάλλον μπορεί να αναστείλει την ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (11): e27944. doi: 10.1371 /journal.pone.0027944

Επιμέλεια: Francesco Dieli, Πανεπιστήμιο του Παλέρμο, Ιταλία

Ελήφθη: May 30, 2011? Αποδεκτές: 28 Οκτωβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Michielsen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Ερευνητικό Συμβούλιο της Ιρλανδίας για την Επιστήμη, Μηχανικής και Τεχνολογίας και το Ίδρυμα Darren Gibbons. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) είναι ισχυρά κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου ικανή ενεργοποίησης αθώα Τ κύτταρα. ΑΧ υπάρχουν σε ιστούς σε μια ανώριμη κατάσταση και εμφανίζουν χαμηλά επίπεδα ωρίμανσης ή συν-διεγερτικών δεικτών, όπως CD83, CD80 ή CD86. Ανώριμα δενδριτικά κύτταρα (iDCs) αναγνωρίζουν και να συλλάβει ειδικά αντιγόνα, συμπεριλαμβανομένων των αντιγόνων όγκου. ΑΧ υποβληθεί σε μια λειτουργική διαδικασία ωρίμανσης για την αντιμετώπιση φλεγμονωδών μεσολαβητών, όπως η IFN-α ή Toll σαν υποδοχέα (TLR) αγωνιστές. Όπως DCs ωριμάζουν αποκτούν τη δυνατότητα παρουσίασης αντιγόνου στα Τ κύτταρα και ενεργοποίηση ενός ειδικού κατά του όγκου απόκριση Τ κυττάρου [1], [2]. ΑΧ που εκκρίνουν υψηλά επίπεδα των βιοενεργών IL-12p70 επάγει τη βέλτιστη ανοσία κατά των όγκων, καθώς έχουν αυξημένη ικανότητα για την ενίσχυση της φυσικής δραστηριότητας φονικών κυττάρων, να παραποιήσει την απάντηση στην Th1 και ο κύριος όγκος ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα [3], [ ,,,0],4].

Ωστόσο, πολλοί όγκοι διαφεύγουν την ανοσολογική απόκριση με την έκκριση κυτοκινών και άλλων παραγόντων που αναστέλλουν DC διαφοροποίηση ή την ωρίμανση των DCs που διηθούν όγκο. [1]. Ένας από τους παράγοντες αυτούς τους «pro-όγκου», αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) είναι γνωστό για τη διατήρηση της ανάπτυξης του όγκου μέσω αγγειογενετικές ιδιότητες της, αλλά μπορεί επίσης να προκληθεί μια ανασταλτική δράση επί DC διαφοροποίηση και την ωρίμανση, την ενίσχυση της επιβίωσης των όγκων [1], [5] , [6], [7], [8]. VEGF έχει επιτυχώς στοχεύει το εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα Bevacizumab (Avastin) [9], ωστόσο τα ποσοστά απόκρισης είναι περίπου 40% και πολλοί ασθενείς αναπτύσσουν αντίσταση σε αυτή τη θεραπεία. Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας να διερευνήσει τις δυνατότητες των άλλων φλεγμονωδών μεσολαβητών που υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του όγκου που μπορεί να αναστέλλουν την ωρίμανση των DC, καθώς αυτά μπορεί επίσης να είναι εν δυνάμει θεραπευτικών στόχων.

Πολλά κυτταροκινών και χημειοκινών είναι παρούσα σε υψηλά επίπεδα στο μικροπεριβάλλον του όγκου, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς, όπως CCL2 (MCP-1), CXCL1 (ΟΚΟα) και CXCL5 (ΕΝΑ-78) [10], [11], [12]. CCL2 είναι γνωστό για την προσέλκυση μονοκυττάρων, Τ-κύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα [10], [13], ενώ η κύρια λειτουργία του CXCL1 και CXCL5 είναι να προσελκύσει και να ενεργοποιήσει τα ουδετερόφιλα [14], [15]. Εκτός από την χημειοελκτική των καθηκόντων τους, CCL2, CXCL1 και CXCL5 διαδραματίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση [15], [16], [17], γεγονός που αποδεικνύει τον πολυλειτουργικό χαρακτήρα αυτών των χημειοκινών. Είναι γνωστό ότι η ανθρώπινη μυελοειδή δενδριτικά εκφράζουν CCR2 και CXCR2, οι υποδοχείς για CCL2 και CXCL1 και CXCL5, αντίστοιχα [18], [19]. Ωστόσο, η επίδραση αυτών των χημειοκινών σε DC ωρίμανση και λειτουργία δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε εκφυτευτεί ανθρώπινο ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου για να μοντελοποιηθεί η μικροπεριβάλλον του όγκου [20]. Explant ιστούς διατηρούν την περίπλοκη δομή 3D του όγκου, περιλαμβανομένης της στρώμα, επιτρέποντας έτσι την παραγωγή πολλών διαφορετικών όγκων σχετιζόμενων παραγόντων, στενά μιμείται το περιβάλλον φλεγμονής του όγκου

in situ

. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι υπερκείμενα από κυτταρικές γραμμές όγκων μπορούν να αναστείλουν την ωρίμανση των DC [21], [22], ωστόσο, η σημασία των παραγόντων που εκκρίνονται από το σύνολο του όγκου την ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων δεν έχει εξεταστεί προηγουμένως.

Έχουμε αποδείξει ότι όγκου κλιματισμός Media (TCM) από καλλιεργημένα παχέος όγκους καρκίνου ανέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από LPS DC ωρίμανσης, σημαντικά αύξηση της IL-10, ενώ μειώνοντας την έκκριση IL-12p70 σε LPS. Βρήκαμε ότι η TCM περιείχε σημαντικές ποσότητες του CCL2 χημειοκινών, CXCL1 και CXCL5 εκτός από VEGF. Επίπεδα CCL2, CXCL1 και CXCL5 στο TCM συσχετίζεται με την έκφραση CD83 και την έκκριση της IL-12p70 από ΑΧ αγωγή με TCM. Σε ατομικό επίπεδο, όλες αυτές οι φλεγμονωδών μεσολαβητών αναστέλλει σημαντικά την επαγόμενη από LPS IL-12p70 έκκριση, ωστόσο IL-10 έκκριση παρέμεινε ανεπηρέαστη. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματα της CXCL1 και VEGF επί της αναστολής της επαγόμενης από LPS IL-12p70 έκκριση από DCs ήταν πρόσθετο. Επιπλέον, CXCL1 είχε επίσης μια αξιοσημείωτη ανασταλτική δράση επί LPS επαγόμενο πάνω ρύθμιση του HLA-DR.

Αποτελέσματα

όγκου εμπλουτισμένο μέσο αναστέλλει την έκκριση DC ωρίμανση και IL-12ρ70, ενώ αυξάνοντας IL-10 έκκριση σε απόκριση σε LPS

μονοκυττάρων που προέρχονται DCs ελήφθησαν από 2 υγιείς εθελοντές επωάστηκαν με διαφορετικούς όγκους TCM από ασθενείς με καρκίνο του παχέος 4 επί 4 ώρες πριν από την LPS προσομοίωσης για περαιτέρω 18 ώρες, για να προσδιοριστεί η βέλτιστη συγκέντρωση του TCM. Εξετάσαμε την επίδραση της TCM στην ικανότητα των DC να εκκρίνουν IL-10 και IL-12ρ70 σε απόκριση προς διέγερση με LPS. Η έκκριση της IL-12p70 από DCs αυξάνει και κατευθύνει την επέκταση και τη διαφοροποίηση των καρκινικών ειδικών αποκρίσεων Th1 ενώ υψηλά επίπεδα έκκρισης IL-10 οδηγεί κατά προτίμηση στην επέκταση της ανοσοκατασταλτικής ρυθμιστικών κυττάρων Τ. Η θεραπεία των DCs με αραίωση 1 σε 2 από TCM έδειξε να έχουν την πιο ισχυρή επίδραση στην IL-10 και IL αύξηση-12ρ70 αναστολή (ρ = 0,028) σε απόκριση σε LPS (Εικόνα 1). Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε στην έκφραση του CD80, CD86, CD54, CD83 και HLA-DR (MHC II), δείκτες που σχετίζονται με την ωρίμανση των DC, μεταξύ διαφορετικές αραιώσεις του TCM (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνεπώς χρησιμοποιήσαμε ένα 1 σε 2 αραίωση TCM για περαιτέρω ανάλυση.

Ανώριμα μονοκύτταρα δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται (iDCs) (n = 2) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 4 ώρες με 1:02, 1:04 και 1:10 αραιώσεις όγκου Ρυθμισμένα μέσα (TCM) που λαμβάνεται με καλλιέργεια των εξαχθέντα καρκινώματα των ασθενών με καρκίνο του παχέος 4

in vitro

για 72 ώρες. Προστέθηκε LPS (1 μg /mL) και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 18 ώρες. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν από τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και τα επίπεδα της IL-10 και την έκκριση της IL-12p70 από τα DCs μετρήθηκαν με ELISA. Οι στατιστικές διαφορές καθορίστηκαν με Mann-Whitney U test.

Η

μονοκυττάρων που προέρχονται DCs ελήφθησαν από 6 υγιείς δότες υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 στους 2 TCM 21 παχέος ασθενών για 4 ώρες πριν από τη θεραπεία με LPS για περαιτέρω 18 ώρα, και έχει ενδιαφέρον, TCM αντιμετωπίζονται DCs εκκρίνεται σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IL-10 σε απόκριση σε LPS (ρ & lt? 0,0001), αλλά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα IL-12p70 (ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 2Α). Επιπλέον IL-12ρ70 έδειξαν αρνητικό συσχετισμό με την έκφραση CD83 Spearman r = -0.71, ρ & lt?. 0.001 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι TCM θεραπεία DCs με την αύξηση της έκφρασης CD83 έχουν μειούμενα επίπεδα έκκρισης IL-12p70

iDC (n = 6) υποβλήθηκαν σε αγωγή με TCM από 21 ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο για 4 ώρες πριν από την προσθήκη LPS? τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 18 ώρες. Επίπεδα της IL-10 και την έκκριση της IL-12p70 από τα DCs μετρήθηκαν με ELISA. Οι στατιστικές διαφορές καθορίστηκαν με ΑΝΟνΑ. (Α) Εκφραση των ακόλουθων δεικτών ωρίμανση: CD80, CD54, CD86, HLA-DR, και CD83 αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα έξι παρουσιάζεται (Β). Η Fold Μεταβολή Μ.Ρ.Ι. του κάθε δείκτη υπολογίστηκε σε σχέση με μη διεγερμένα iDCs για κύτταρα κατεργασμένα με LPS ή TCM + LPS. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με Wilcoxon rank test. (ΝΤΟ). *

p & lt?

0.05, **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Θεραπεία ΑΧ με TCM, επίσης ανέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από LPS ωρίμανση DC, με μειωμένη έκφραση του CD54 (

σ

& lt? 0,0001), CD86 (

σ

= 0,0035), HLA-DR (

p

= 0,0474) και CD83 (

σ

= 0.0018) παρατηρήθηκε (Σχήμα 2Β & amp? C). Η θεραπεία των DCs με ρυθμισμένων μέσων που λαμβάνονται από κανονικό ιστό δίπλα στον ιστό του όγκου (NCM) δεν αναστέλλει την επαγόμενη από LPS ωρίμανση ή έκκριση κυτοκίνης από DCs (Σχήμα 3).

Κανονική ρυθμισμένων μέσων (NCM) 5 καρκίνο του παχέος ασθενών χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των μονοκυττάρων που προέρχονται ΑΧ πριν από την προσθήκη LPS. Έκφραση των CD80, CD54, CD86, HLA-DR και CD83 μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. Η στατιστική ανάλυση έγινε με Wilcoxon τεστ κατάταξης.

Η

Επίπεδα CCL2, CXCL1, και CXCL5 παρούσα σε TCM συσχετίζονται με την έκφραση του CD83 και την έκκριση της IL-12p70 από ΑΧ

TCM λαμβάνεται από 21 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου αναλύθηκαν με ELISA για αρκετές γνωστών παραγόντων που σχετίζονται με όγκους. Επίπεδα CCL2, CXCL1 και CXCL5 ήταν σταθερά υψηλότερες από εκείνες του VEGF (ένα ρεύμα θεραπευτικός στόχος σε καρκίνο του παχέος εντέρου) σε όλους τους ασθενείς που εξετάστηκαν. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα της CCL2 (Spearman r = 0.59,

σ

= 0.0053) CXCL1 (Spearman r = 0.50,

σ

= 0,0202) και CXCL5 (Spearman r = 0.50,

p

= 0,0199) που υπάρχουν στο TCM συσχετίζεται θετικά με την έκφραση του CD83 σε ΑΧ που έλαβαν θεραπεία με TCM (Εικόνα 4Α). Αυτό σημαίνει ότι με την αύξηση των επιπέδων της CCL2, CXCL1 και CXCL5 υπάρχουν στο TCM, η έκφραση CD83 είναι αυξημένα σε ΑΧ που έλαβαν θεραπεία με TCM. Ακόμα κι αν ο VEGF υπάρχει σε ανιχνεύσιμα επίπεδα στο TCM, αυτό δεν έδειξε συσχέτιση με DC ωρίμανση. Επιπλέον βρήκαμε ότι η IL-12p70 έκκριση από ΑΧ αγωγή με TCM συσχετίζεται αρνητικά με CCL2 (Spearman r = -0.64,

σ

= 0,0019), CXCL1 (Spearman r = -0,59,

p

= 0,0049) και CXCL5 (Spearman r = -0,57,

σ

= 0,0075) (Εικόνα 4Β). Αυτό υποδηλώνει ότι με την αύξηση των επιπέδων του CCL2, CCL1 και CXCL5 στο TCM, IL-12p70 έκκριση από DCs μειώνεται. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τεσσάρων κυτοκινών και των άλλων δεικτών DC, CD80, CD54, CD86, και HLA-DR, και IL-10 έκκριση.

Συγκεντρώσεις CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF σε όγκο ρυθμισμένο μέσων του 21 ασθενείς με καρκίνο του παχέος μετρήθηκαν με ELISA. Οι συγκεντρώσεις του CCL2, CXCL1 και CXCL5 συσχετίζεται με την έκφραση του CD83 επί DCs σε επεξεργασία με TCM (Α). CCL2, CXCL1 και CXCL5 αντιστρόφως ανάλογη με την έκκριση της IL-12p70 από δενδριτικά κύτταρα αντιμετωπίζονται με την TCM (Β). Το τεστ συσχέτισης τάξης Spearman χρησιμοποιήθηκε.

Η

Επίδραση της CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF στην έκφραση δείκτη ωρίμανσης DC και έκκριση κυτοκινών σε απόκριση σε LPS

Αφού διαπιστώθηκε ότι TCM αναστέλλει DC ωρίμανση σε LPS και ότι το TCM περιέχει υψηλά επίπεδα του CCL2 χημειοκινών, CXCL1 και CXCL5 είμαστε δίπλα προσδιοριστεί εάν αυτά τα επιμέρους συστατικά είχαν άμεση επίδραση στις ΑΧ. Ανασυνδυασμένο VEGF ανέστειλε σημαντικά LPS επαγόμενη έκφραση DC ωρίμανσης Σημάδια CD80 (

σ

= 0,0391) και CD54 (

σ

= 0,0078) και CXCL1 ανέστειλε σημαντικά την προς τα πάνω ρύθμιση του HLA-DR (

σ

= 0.0156) (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρά το γεγονός ότι CCL2 και CXCL5 παρουσίασαν μείωση της προκαλούμενης από LPS ωρίμανση των DCs, αυτό δεν έφθασε στατιστική σημασία (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ενώ η προ-επεξεργασία των DCs με CCL2, CXCL1, CXCL5 ή VEGF απέτυχε να αυξήσει LPS επαγόμενη IL-10 έκκριση, μια σημαντική μείωση των επιπέδων LPS-επαγόμενης ΙL-12ρ70 έκκριση παρατηρήθηκε: CCL2 (

ρ

= 0.048), CXCL1 (

σ

= 0.0068), CXCL5 (

σ

= 0,0255), VEGF (

σ

= 0.0402) (Σχήμα 5). IL-1β, ΤΝΡ-α, IL-8 και IL-6 παραγωγή από DCs σε απόκριση προς LPS απουσία ή παρουσία του προ-θεραπεία με VEGF, CCL2, CXCL1 ή CXCL5 μετρήθηκαν επίσης? ωστόσο δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα αυτών των κυτοκινών προσδιορίζεται υπό αυτές τις συνθήκες (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η θεραπεία των DCs με CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF δεν επηρέασε την ικανότητά τους να επάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ ή την παραγωγή ΙΡΝγ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα υπερκείμενα των DCs που καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία CCL2, CXCL1 , CXCL5 και VEGF (n = 8) συλλέχθηκαν και οι συγκεντρώσεις της IL-10 και IL-12p70 προσδιορίζεται με ELISA. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με την Mann-Whitney U. * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Επιπλέον διερευνήσαμε αν CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF θα μπορούσε να επηρεάσει DC μετανάστευσης. CCL19 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας δεδομένου ότι είναι γνωστό ότι συνδέεται με τον υποδοχέα χημειοκινών CCR7, που εκφράζεται από τα DCs [23]. Βρήκαμε ότι δεν αυξάνουν τη μετανάστευση σε σύγκριση με CCL19 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

CXCL1 και VEGF έχουν ένα πρόσθετο ανασταλτικό αποτέλεσμα στην έκκριση της IL-12p70 από ΑΧ ως απάντηση στην LPS

Η μονάδα TCM έχει μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στην ωρίμανση των DC και λειτουργία, αλλά CCL2 και CXCL5, τα οποία υπάρχουν σε υψηλά επίπεδα στο TCM, δεν έχουν σημαντική επίδραση επί της έκφρασης δείκτη ωρίμανσης δενδριτικών κυττάρων, ενώ CXCL1 μόνο ανέστειλε σημαντικά HLA-DR και VEGF ανέστειλε σημαντικά CD80 και CD54 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνεπώς, διερευνήσαμε αν συνδυάζοντας τις ανασυνδυασμένες κυτοκίνες θα μπορούσε να έχει μια πιο ισχυρή επίδραση στην ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων. Εξετάσαμε επτά διαφορετικούς συνδυασμούς των τεσσάρων κυτοκινών: CCL2 + CXCL1, CCL2 + CXCL5, CCL2 + VEGF, CXCL1 + CXCL5, CXCL1 + VEGF, CXCL5 + VEGF, CCL2 + CXCL1 + CXCL5 + VEGF. Ο συνδυασμός των CXCL1 και VEGF δεν αναστέλλουν σημαντικά την έκφραση δείκτη ωρίμανσης LPS επαγόμενη από δενδριτικά κύτταρα (CD80

σ

= 0,0625, CD54

σ

= 0,6, CD86

p =

0.6, HLA-DR

σ

= 0,1, CD83

σ

= 0,8) (Σχήμα 6Α). Ωστόσο συνδυάζοντας CXCL1 και VEGF σημαντικά μειωμένη LPS επαγόμενη IL-12p70 (

σ

= 0.0028), αλλά δεν μετέβαλε τα επίπεδα της IL-10 (Σχήμα 6Β). IL-1β, ΤΝΡα, IL-8 ή IL-6 εκκρίσεις δεν μεταβλήθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κανένας άλλος συνδυασμός είχαν άμεση επίδραση επί επαγόμενη από LPS DC ωρίμανση ή έκκριση κυτοκίνης από DCs σε απόκριση σε LPS σε σύγκριση με τα μεμονωμένα κυτοκίνες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον συμπερίληψη αντισωμάτων εξουδετέρωσης για CXCL1 και VEGF, μεμονωμένα και σε συνδυασμό, το έκανε δεν είναι σωστό TCM επαγόμενη μεταβολή του DC ωρίμανσης, IL-10 ή έκκριση IL-12p70 από DCs σε απόκριση σε LPS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

iDCs (n = 5) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό ανασυνδυασμένου CXCL1 (100 ng /mL) και VEGF (20 ng /mL), 4 ώρες πριν από την προσθήκη του LPS (1 μg /mL). Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για περαιτέρω 18 ώρες και τα επίπεδα των CD80, CD54, CD86, HLA-DR και CD83 αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα φαίνονται ως πολλαπλή μεταβολή σε Μ.Ρ.Ι. σε σχέση με το μη επεξεργασμένο iDCs. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με Wilcoxon Signed Rank δοκιμή (Α). Τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν από τα κύτταρα που κατεργάζονται όπως περιγράφεται ανωτέρω και η συγκέντρωση της IL-10 και IL-12p70 προσδιορίστηκε με ELISA. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με Mann-Whitney U test (Β). * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε για πρώτη φορά ότι ο όγκος ρυθμισμένα μέσα από ορθοκολικό μοσχεύματα όγκου του καρκίνου μπορεί να αναστέλλουν σημαντικά LPS επαγόμενη από την ωρίμανση του προέρχεται από μονοκύτταρα ΑΧ. Επιπλέον, η θεραπεία των DCs με TCM πριν από LPS διέγερση αύξησε σημαντικά την παραγωγή της IL-10, έναν αντι-φλεγμονώδη κυτοκίνη που αναστέλλει μια απόκριση Th1 [24], ενώ μειώνεται η έκκριση της IL-12p70, μία προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη που απαιτούνται για την Th1 αποκρίσεις: α φαινότυπος DC που σχετίζονται με την ανοχή. Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι CCL2, CXCL1 και CXCL5 εκφράστηκαν σε υψηλά επίπεδα στο TCM σε σύγκριση με τον VEGF, και προσδιορίζεται εάν αυτές οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές θα μπορούσαν να μεταβάλουν τη λειτουργία της ΑΧ. VEGF συμπεριλήφθηκε στις αναλύσεις μας όπως είχε προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλει την ωρίμανση των DC [8], [22]. Η προσθήκη ανασυνδυασμένου VEGF να iDCs είχε ανασταλτική επίδραση στην επαγόμενη από LPS προς τα πάνω ρύθμιση του CD80 και CD54, ενώ προσθέτει ανασυνδυασμένο CXCL1 να iDCs μειωμένη έκφραση HLA-DR μετά από αγωγή με LPS.

Ωστόσο, η θεραπεία των iDCs με ανθρώπινη ανασυνδυασμένη CCL2, CXCL1, CXCL5 ή VEGF, σε δόσεις, σύμφωνα με άλλες μελέτες [13], [22], [25], [26], είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκκρισης IL-12p70 σε LPS διέγερση. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι φλεγμονωδών μεσολαβητών που υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του όγκου μειώνουν την ικανότητα των τοπικών DCs να εκκρίνουν IL-12ρ70 και έτσι την επαγωγή μιας αποτελεσματικής αντίδρασης κατά του όγκου.

Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί σε μία μελέτη που διερεύνησε την επίδραση του ρυθμισμένα μέσα που λαμβάνονται από το παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή BxPC-3 (BxCM), όπου DC διαφοροποίηση και ωρίμανση ανεστάλη με BxCM. Η μελέτη έδειξε ότι BxCM μείωσε την έκφραση του CD83, CD1a, CD1c, CD80 και CD86 από ΑΧ ως απάντηση στην TNFα. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, αυτή η μελέτη βρήκε μια σημαντική αύξηση των IL-10 και μία μείωση σε IL-12p70 παραγωγή σε απόκριση σε διέγερση με ΤΝΡα μετά τη θεραπεία BxCM [27]. Ωστόσο, η θεραπεία των DCs με υπερκείμενο από RCC-10 (νεφρικά κύτταρα καρκίνωμα), είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση στην έκφραση δεικτών ωρίμανσης, αλλά δεν επηρέασε παραγωγή IL-10 σε απόκριση προς διέγερση με TNFa, ΙΡΝα και πολυ I: C [22]. Αυτές οι μελέτες, μαζί με τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ, δείχνουν ότι πολλοί τύποι όγκων εκκρίνουν φλεγμονώδεις μεσολαβητές που μπορούν να αναστείλουν τη λειτουργικότητα των DCs? αλλά αυτό είναι πιθανό να υπάρξει μεταβολή στη φλεγμονώδη περιβάλλον και η προκύπτουσα επίδραση επί της λειτουργίας DC ανάλογα με τον τύπο του όγκου και το στάδιο. Ενώ θα ήταν ενδιαφέρον να αξιολογήσει και να απομονώσουν τα πραγματικά επίπεδα της DC διείσδυση στον ιστό της καλλιέργειας του όγκου, αυτό δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί λόγω του περιορισμού του μεγέθους εκφύτευμα ιστού που λάβαμε από τη χειρουργική επέμβαση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NCM δεν επηρεάζει σημαντικά την ωρίμανση των DC ή έκκριση κυτοκινών, υποδηλώνοντας ότι το φυσιολογικό γειτονικό ιστό μπορεί να έχουν λειτουργική ανοσία. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη ενός ανοσοκατασταλτική δράση πεδίο.

VEGF έχει καθιερωθεί ως ένα σημαντικό παράγοντα που συμβάλλει στην ανάπτυξη των όγκων με την πρόκληση αγγειογένεσης. Ο VEGF είναι ένας θεραπευτικός στόχος σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, όπου η εξανθρωπισμένη αντι-νΕΟΡ mAb, Bevacizumab (Avastin) χρησιμοποιείται. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο VEGF αναστέλλει την ωρίμανση των DC και η ικανότητά DCs να ενεργοποιεί Τ κύτταρα [5], [8], [22]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι ο VEGF αναστέλλει την έκφραση του CD80 και CD54, αλλά όχι CD86 ή HLA-DR, τα δεδομένα συμφωνούν με Alfaro

et al.

[22]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ΑΧ αγωγή VEGF που εκκρίνεται σημαντικά μειωμένα επίπεδα της IL-12p70 σε απόκριση σε LPS? ένα εύρημα που δεν έχει τεκμηριωθεί προηγουμένως. Η χρήση των LPS να ωριμάσουν τα δενδριτικά κύτταρα, σε σχέση με το κοκτέιλ ωρίμανσης που αποτελείται από TNFα, ΙΡΝα και πολυ I: C χρησιμοποιείται από Alfaro

et al

θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές που παρατηρούνται στην επίδραση της VEGF στην ωρίμανση των DC και IL. -12p70 έκκριση. Η ανακάλυψή μας ότι ο VEGF διέγερση των DCs δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων και έκκριση κυτοκίνης είναι συνεπής με Alfaro

et al.

, ωστόσο βρήκαν μια ανασταλτική δράση του VEGF όταν είναι παρόν στο στάδιο διαφοροποίησης της ανάπτυξης DC, υποδεικνύοντας ότι διαφοροποιημένη ΑΧ μπορεί να είναι λιγότερο δεκτικές στις επιδράσεις του VEGF [22]. Η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι οι ασθενείς καρκίνου του παχέος εντέρου μας εκφύτευμα ιστού που εκκρίνεται υψηλά επίπεδα CCL2, CXCL1 και CXCL5, σε σύγκριση με VEGF. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα CCL2, CXCL1 και CXCL5 στο TCM συσχετίζεται με την έκφραση του CD83 σε TCM θεραπεία ΑΧ. Αυτή είναι η πρώτη φορά που έχει παρατηρηθεί αυτή η συσχέτιση, και προτείνει ότι οι ασθενείς με υψηλότερα επίπεδα CCL2, CXCL1 ή CXCL5 μπορεί να έχουν αυξημένα επίπεδα CD83 σε ΑΧ. CD83 είναι πολύ σημαντική για παρθένα Τ-κυττάρων και την ενεργοποίηση των κυττάρων Β [28], [29], ωστόσο βρήκαμε επίσης ότι η αυξημένη έκφραση του CD83 επί DCs σε επεξεργασία με TCM συσχετίζεται με μειωμένη IL-12p70 έκκριση από TCM αγωγή ΑΧ. Έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι ενώ διαφορετικά ερεθίσματα ίσως ώριμη DCs σε παρόμοια επίπεδα, με παρόμοια έκφραση του CD83, CD80 και CD86, το προφίλ των κυτοκινών που εκκρίνουν διαφέρουν? ερεθίσματα όπως IFN-γ μπορεί να οδηγήσει σε IL-12 που εκκρίνουν CD83 + DCs που διεγείρουν αποκρίσεις Th1 ενώ άλλα ερεθίσματα, όπως αποτέλεσμα της προσταγλανδίνης Ε2 σε CD83 + DCs τα οποία εκκρίνουν καμία IL-12, αλλά αποτελεσματικά προωθήσει μια απόκριση Th2 [30].

Ενώ έχει αναφερθεί ότι CCL2, CXCL1 και CXCL5 είναι σημαντικά για την ανάπτυξη του όγκου, τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση [31], [32], η επίδραση αυτών των χημειοκινών σε DCs δεν έχει προηγουμένως τεκμηριωθεί. CCL2, τα επίπεδα CXCL1 και CXCL5 στο TCM συσχετίζεται αντιστρόφως με IL-12p70 έκκριση, αυτή είναι η πρώτη φορά που έχει παρατηρηθεί αυτή η συσχέτιση, και προτείνει ότι με την αύξηση των επιπέδων της CCL2, CXCL1 και CXCL5 στο TCM, IL-12p70 έκκριση από ΑΧ είναι μειωμένος. CCL2 είναι ένα χημειοελκτικό για μονοκύτταρα, μνήμη Τ-κύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα [26], [31]. CCL2 έχει επίσης προηγουμένως αναφερθεί ότι επάγει την αγγειογένεση [17], η οποία είναι σημαντική για την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση. Και οι δύο προ- και αντι-όγκου αποτελέσματα των CCL2 έχουν παρατηρηθεί μέσω της επίδρασής της σε μονοκύτταρα και μακροφάγα [31], ενώ εδώ δείχνουμε ότι CCL2 μπορεί επίσης να επηρεάσει την αντι-όγκου ανοσοαπόκριση επηρεάζοντας την ικανότητα των DC να εκκρίνουν IL-12p70 αλλά όχι άλλες κυτοκίνες συμπεριλαμβανομένων IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8 ή ΤΝΡ-α σε απόκριση προς LPS διέγερση. Σε αντίθεση, η Braun

et al.

Έχουν δείξει προηγουμένως ότι CCL2 μπορούν να αναστείλουν την IL-12p70 παραγωγή από μονοκύτταρα και αυτό είναι τοξίνη κοκκύτη ευαίσθητο, αλλά δεν παρατήρησαν αυτό μείωση στην έκκριση της IL-12p70 από δενδριτικά κύτταρα σε επεξεργασία με είτε SAC + ΙΡΝγ ή CD40L + ΙΡΝγ [33]. Εναλλακτικά, Omata

et al.

Βρέθηκε DCs διαφοροποιείται από μονοκύτταρα παρουσία CCL2 εμφάνισαν μειωμένη ικανότητα να εκκρίνουν IL-12ρ70 μετά από διέγερση με CD40 συνδετήρα, μια επίδραση που δεν ευαίσθητα στην τοξίνη του κοκκύτη. Αυτοί οι συγγραφείς ανέφεραν καμία επίδραση της CCL2 στην διαφοροποίηση ή την ωρίμανση των DC. [34]. Ως εκ τούτου, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο CCL2 ασκεί την επίδρασή της στις ΑΧ μένει να διευκρινιστεί πλήρως.

Ενώ η επίδραση της CXCL1 και CXCL5 στην DC ωρίμανση και την έκκριση κυτοκινών δεν έχει διερευνηθεί προηγουμένως, γνωστή η λειτουργία τους είναι να προσελκύσουν και να ενεργοποιήσει τα ουδετερόφιλα [14], [15], η οποία με τη σειρά τους έχουν ενοχοποιηθεί με την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου, αγγειογένεση και μετάσταση [35]. Από ΑΧ εκφράζουν CXCR2 [19], το οποίο είναι ο υποδοχέας για CXCL1 και CXCL5, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι CXCL1 και CXCL5 θα μπορούσε να έχει επίδραση στη λειτουργία DC. Οι χημειοκίνες όπως CCL2, CXCL1 και CXCL5 σηματοδοτούν μέσω υποδοχέων που συνδέονται με G-πρωτεΐνη, οι οποίες ελέγχουν ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP και τα αυξημένα επίπεδα cAMP συσχετίζεται με μειωμένη παραγωγή IL-12 [36]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο αυτές οι χημειοκίνες μειώνουν την έκκριση IL-12p70 από την ΑΧ δεν είναι γνωστή, και θα είναι αντικείμενο μελλοντικών ερευνών μας.

Είναι ενδιαφέρον CXCL1 και VEGF έχουν ένα πρόσθετο ανασταλτική επίδραση στην έκκριση της IL-12p70. Δρουν επί διαφορετικών υποδοχέων που έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι είναι παρούσα στην DCs [7], [19], επομένως θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν διαφορετικές οδούς σηματοδότησης ταυτόχρονα, ή θα μπορούσαν να ενεργοποιούν το ίδιο μονοπάτι πιο αποτελεσματικά. Ο VEGF έχει δειχθεί ότι ενισχύει φωσφο-ERK1 & amp? ERK2 σε ΑΧ και αυτό το μονοπάτι αρνητικά ρυθμίζει μονοκύτταρα που προέρχονται DC ωρίμανση [7], [37]. Ποια οδών σηματοδότησης ενεργοποιούνται από CXCL1 μέσω CXCR2 σε δενδριτικά κύτταρα είναι ακόμη άγνωστη, ωστόσο μελέτες σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, όπως τα καρκινικά κύτταρα, δείχνουν ότι CXCR2 σηματοδότηση μπορεί να ενεργοποιήσει το ΝΡ-κΒ, STAT3 και τα μονοπάτια ERK [38], [39] , [40]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ποικιλία πιθανών μηχανισμών με τους οποίους συνδετήρες CXCR2 μπορεί να αναστείλει την έκκριση της IL-12p70 με DCs. Ωστόσο, το ανοσοποιητικό καταστρέφουν είτε αυτών των κυτοκινών μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με εξουδετερωτικά αντισώματα δεν ανέστρεψε το ανασταλτικό αποτέλεσμα του TCM. Αυτό αποδεικνύει ότι είναι πιθανόν πολλούς διαφορετικούς παράγοντες που δρουν από κοινού ότι η αιτία αναστολής DC. Αυτό είναι συνεπές με την προηγούμενη έρευνα που δείχνει ότι ο αποκλεισμός ενός μόνο παράγοντα, VEGF σε υπερκείμενα RCC-10 κύτταρα δεν έχουν σημαντική επίδραση στην ενεργοποίηση DC [22].

Παρατηρήσαμε ότι CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF δεν αποκλείουν DC ωρίμανση, ούτε επηρεάζουν τη μετανάστευση DC ή τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων. Σε αντίθεση με ΑΧ θεραπεία με TCM, τα επιμέρους φλεγμονωδών μεσολαβητών δεν ενισχύουν την IL-10, ωστόσο όλοι αναστέλλεται η έκκριση της IL-12p70? ένα αποτέλεσμα που δεν είχαν προηγουμένως δείξει για CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF. Οι ιστοί εκφύτευμα όγκου εκκρίνουν πολλούς διαφορετικούς διαλυτούς παράγοντες, και δεν είναι πολύ εκπληκτικό ότι μερικές απομονωμένες παράγοντες από μόνοι τους δεν έχουν ένα αποτέλεσμα συγκρίσιμο με TCM. Είναι πολύ πιθανό ότι οι πολλοί διαφορετικοί παράγοντες που εκκρίνονται στο TCM από την πράξη εκφύτευμα όγκου μαζί στην αναστολή DC ωρίμανση και λειτουργία. Ωστόσο, η ικανότητα των CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF να μειώσει σημαντικά IL-12p70 παραγωγής από ΑΧ είναι σημαντική, καθώς αυτό μπορεί ενδεχομένως να οδηγήσει σε μειωμένο αντι-όγκου απόκριση Th1

in vivo

.

Εν κατακλείδι βρήκαμε ότι TCM αναστέλλει την ωρίμανση των DC, και επάγει την IL-10, ενώ αναστέλλει την IL-12p70 εκκρίσεις από ΑΧ. Το TCM συστατικά CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF φαίνεται να παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης μέσω αναστολής της έκκρισης της IL-12p70 από DCs, πιθανώς για την προστασία του όγκου από μία ισχυρή ανοσολογική απόκριση εναντίον της. Επιπλέον, CXCL1 και VEGF δρουν από κοινού για την αναστολή της έκκρισης της IL-12p70 από DCs. Ακόμα κι αν CCL2, CXCL1, CXCL5 και VEGF είναι παρόντες στο TCM σε υψηλά επίπεδα, δεν είναι τα κύρια συστατικά του TCM που επηρεάζουν την ωρίμανση των DC και λειτουργία. Εν κατακλείδι, έχουμε καταδείξει τη σημασία του όγκου ρυθμισμένα μέσα στη ρύθμιση της λειτουργίας των δενδριτικών κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, ωστόσο οι υποκείμενοι μηχανισμοί πρέπει να διευκρινιστεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Ex vivo όγκου καλλιέργεια μοσχεύματος

Όλα ιστού που ελήφθησαν με την ενημέρωσε γραπτή συναίνεση του ασθενούς, καθώς και το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αγίου Βικεντίου του.

χειρουργικά ιστό του παχέος όγκου του καρκίνου ( n = 21) και φυσιολογικού ιστού (& gt? 10 εκατοστών από τον όγκο? n = 5) λήφθηκε από ασθενείς από το Κέντρο εκφύτευμα ιστού βιο-bank παχέος νόσου στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο St. Vincent, το Δουβλίνο (12 άνδρες, 9 γυναίκες, διάμεσος ηλικίας 67, 1 Στάδιο ΙΙ, 5 Στάδιο ΙΙΙ, 15 Στάδιο IV καρκίνο του παχέος εντέρου). Εμφυτευθέντος ιστού κόπηκε σε τουλάχιστον 4 ίσου μεγέθους κομμάτια περίπου 5 mm

3 και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, τα εκφυτευτεί ιστοί όγκου καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες (σε πλάκες 24 φρεατίων) σε 2 mL RPMI 1640 που περιέχει 100 U /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, 4 μg /mL Fungizone, 30 μg /mL γενταμυκίνη (Invitrogen? Carlsbad , California) και συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen). Μετά από 72 ώρες σε καλλιέργεια, όγκου κλιματισμός Media (TCM) και φυσιολογικά ρυθμισμένα μέσα (NCM) συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για αναλύσεις.

απομόνωση δενδριτικών κυττάρων και του πολιτισμού

Ανθρώπινα ανώριμα δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από μονοκύτταρα (iDCs) δημιουργήθηκαν από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) που λαμβάνονται από φλεγμονώδη παρασκευάσματα παλτό (Εθνικό Κέντρο αίματος, St. James Hospital, Δουβλίνο). Τα μονοκύτταρα απομονώθηκαν με θετική επιλογή χρησιμοποιώντας CD14-μαγνητικά σφαιρίδια (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) και σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /mL σε πλάκες 6 φρεατίων εντός 3 ml RPMI 1640 που περιέχει 100 U /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, 4 μg /mL Fungizone και συμπληρωμένο με 10% που ορίζεται Hyclone εμβρυϊκό ορό βοοειδούς (Thermo Fisher Scientific, Waltham, μΑ, ΗΠΑ), ανθρώπινο παράγοντα αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων-διέγερσης (GM-CSF? 50 ng /mL, Immunotools, Friesoythe, Γερμανία), και ανθρώπινο IL-4 (70 ng /mL? Immunotools). Τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν την ημέρα 3 με την αντικατάσταση ενός δεύτερου του μέσου και προσθέτοντας φρέσκο ​​κυτοκίνες. Την ημέρα 6 τα κύτταρα παρουσίασαν ένα ανώριμο φαινότυπο DC (CD14

-, CD11c

+, CD86

-, CD54

χαμηλή, CD83

-, CD80

– και HLA- DR

χαμηλή).

Η διέγερση των μονοκυττάρων που προέρχονται DC

Πρόσφατα απομονωμένα iDC απλώθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 1 × 10

5 κύτταρα /200 μl σε RPMI 1640 μέσα συμπληρωμένα με 10% που ορίζεται Hyclone FBS (Thermo Fisher Scientific), και διεγέρθηκαν με 1 σε 2, 1 σε 4 και αραίωση 1 προς 10 του όγκου Ρυθμισμένα μέσα (TCM) από 4 καλλιεργημένα έκφυτο ιστών για 4 ώρες πριν από την προσθήκη 1 μg /mL

Escherichia coli

λιποπολυσακχαρίτη (LPS? Alexis Biochemicals, Lausen, Ελβετία) για να καθορίσει την καλύτερη δόση του TCM. Ακολούθως DCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα TCM 1 σε 2 αραίωση του συνόλου των 21 ασθενών έκφυτο ιστών για 4 ώρες πριν από την προσθήκη 1 μg /mL LPS. Επιπλέον, DCs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μια αραίωση 1 σε 2 από NCM 5 ασθενούς ιστών εκφυτεύματος για 4 ώρες πριν προστεθεί 1 μg /ml LPS. Σε ξεχωριστά πειράματα 1 × 10

5 iDC /200 media μΙ υπέστησαν κατεργασία με ανθρώπινη ανασυνδυασμένη 50 ng /mL CCL2 (MCP-1), 100 ng /mL CXCL1 (ΟΚΟα), 100 ng /mL CXCL5 (ΕΝΑ-78)