Αφηρημένο

Ο καρκίνος και οι θεραπείες μπορεί να προκαλέσουν γνωστικές διαταραχές σε ασθενείς με καρκίνο, και η αιτιώδης συνάφεια μεταξύ της χημειοθεραπείας και γνωστικές δυσλειτουργίες ήταν πρόσφατα επικυρωμένη σε ζωικά μοντέλα. Νέα καρκίνου στοχευμένες θεραπείες έχουν γίνει ευρέως χρησιμοποιούνται, και τις επιπτώσεις τους στις λειτουργίες και την ποιότητα της ζωής του εγκεφάλου πρέπει να διερευνηθεί. Αξιολογήσαμε την επίδραση του everolimus, ένας αντικαρκινικός παράγοντας που στοχεύει το μονοπάτι mTOR, στις γνωστικές λειτουργίες, εγκεφαλικό μεταβολισμό, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ιππόκαμπου /αγγειακών πυκνότητα σε ποντίκια. Ενήλικες ποντικοί έλαβαν everolimus ημερησίως για 2 εβδομάδες, και συμπεριφορικές εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν από 1 εβδομάδα μετά την τελευταία θεραπεία. ποντίκια Το everolimus αγωγή επέδειξαν μία σημαντική μείωση στην αύξηση του σωματικού βάρους από την τελευταία ημέρα της περιόδου αγωγής.

Ex vivo

ανάλυση έδειξε μεταβληθεί δραστηριότητα της οξειδάσης του κυτοχρώματος σε επιλεκτική εγκεφαλική περιοχές που εμπλέκονται στο ενεργειακό ισοζύγιο, την πρόσληψη τροφής, ανταμοιβή, τη μάθηση και τη διαμόρφωση της μνήμης, τη ρύθμιση του κύκλου ύπνου /αφύπνισης και διέγερσης. Όπως η χημειοθεραπεία, everolimus δεν μετέβαλε τη συναισθηματική αντιδραστικότητα, τη μάθηση και τη μνήμη παραστάσεις, αλλά σε αντίθεση με τη χημειοθεραπεία, δεν επηρέασε συμπεριφοράς ευελιξίας ή με την αντιδραστικότητα προς το νεωτερισμό.

In vivo

ιππόκαμπου νευρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αγγειακή πυκνότητα ήταν επίσης αμετάβλητη μετά από θεραπείες everolimus. Συμπερασματικά, δύο εβδομάδες καθημερινής αγωγής everolimus με την κλινική δόση δεν προκαλούν μεταβολή των γνωστικών επιδόσεων αξιολογήθηκε σε hippocampal- και προμετωπιαίο φλοιό εξαρτώμενη εργασίες που θα διατηρείται σε μία έως τέσσερις εβδομάδες μετά το τέλος της θεραπείας ολοκλήρωση. Ωστόσο, η οξεία θεραπεία everolimus προκάλεσε επιλεκτικές τροποποιήσεις CO χωρίς να αλλάζει η κινάση mTOR τελεστή p70S6 στην εγκεφαλική περιοχές που εμπλέκονται στη συμπεριφορά σίτισης και /ή ο κύκλος ύπνου /αφύπνισης, τουλάχιστον εν μέρει, υπό τον έλεγχο του μοναχικό πυρήνα και την parasubthalamic περιοχή του υποθαλάμου. Έτσι, αυτή η περιοχή μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα βασικό στόχο για το everolimus-μεσολάβηση περιφερική τροποποιήσεις, η οποία έχει προηγουμένως συνδέονται με συμπτώματα όπως απώλεια βάρους και κόπωση

Παράθεση:. Dubois Μ, Le Joncour V, Tonon MC, Anouar Υ , Προυστ F, Morin F, et al. (2014) Η αξιολόγηση του αντίκτυπου του Cancer Therapy Το everolimus στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα σε ποντίκια. PLoS ONE 9 (12): e113533. doi: 10.1371 /journal.pone.0113533

Επιμέλεια: David L. McCormick, IIT Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Απρ 2014? Αποδεκτές: 24η Οκτωβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 Δεκέμβρη, 2014

Copyright: © 2014 Dubois et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το πανεπιστήμιο της Roue, Inserm και το κέντρο Baclesse που λαμβάνουν επιχορήγηση από την Novartis (Novartis) 071160-001141-05. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν την ακόλουθη σύγκρουση: Η επιχορήγηση για το baclesse Κέντρο της Caen, Γαλλία, η Novartis (Novartis- 071160-31 001141-05) ήταν μια γενική εκπαιδευτική επιχορήγηση και χρησιμοποιήθηκε για να υποστηρίξει μια θέση-doc οδηγεί την έρευνα για το everolimus. Επιπλέον, οι συγγραφείς έλαβαν everolimus και το μικρογαλάκτωμα μέσω ενός MTA με Novartis. Pr Φλωρεντία Joly είναι μέλος μιας από διαβούλευση επιστημονικού συμβουλίου της Novartis. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Αν και η εμφάνιση ισχυρών αντικαρκινικών παραγόντων έχει βελτιωθεί η επιβίωση του ασθενούς, υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία ότι τόσο τον καρκίνο και τις θεραπείες του μπορεί να προκαλέσουν γνωστικές δυσλειτουργίες που επηρεάζουν την καθημερινή ποιότητα της ζωής. Οι ασθενείς που λαμβάνουν προσοχή έκθεση σε χημειοθεραπεία και μετατροπές συγκέντρωση, οπτική και λεκτική ελλείμματα μνήμης, καθώς και επιβράδυνση της επεξεργασίας ψυχοκινητικής (που αναφέρονται ως «chemofog» ή «chemobrain») που μπορεί να παραμείνουν για αρκετά χρόνια μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας [1]. Τα τελευταία χρόνια, παράγοντες στόχοι έχουν όλο και περισσότερο χρησιμοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου, και τις προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι ορισμένα από αυτά μπορεί να διεισδύσει το φράγμα αίματος-εγκεφάλου και δρουν απευθείας στον εγκέφαλο, που επηρεάζει την εγκεφαλική αγγειογένεση και λειτουργούσα [2]. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, η χορήγηση της bevacizumab σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου και του sunitinib σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του νεφρού οδήγησε σε αρκετές αναφερθεί περιπτώσεις οπίσθιας λευκοεγκεφαλοπάθειας [3], [4]. Επιπλέον, μια ανεξήγητη κόπωση ή αδυναμία, που συνδέεται με στοχευμένες θεραπείες για τον καρκίνο, που δεν μπορούν να εξουδετερωθούν από ανάπαυσης ή ύπνου μπορεί να επηρεάσει σοβαρά τόσο τη γνωστική λειτουργία και την ποιότητα της ζωής [5].

Η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάση (PI3K ) /ΑΚΤ /στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) καταρράκτη σηματοδότησης είναι ένα βασικό μοριακός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου [6]. Τα συστατικά σηματοδότηση mTOR εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε αρκετές περιοχές του εγκεφάλου [7], [8], και η οδός mTOR είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε διάφορες νευροβιολογικές διεργασίες, που περιλαμβάνουν την ανάπτυξη νευριτών [9], την αναγέννηση νευραξόνων [10], μυελίνωση [11], και τον κυτταρικό μεταβολισμό [12]. Ειδικότερα, mTOR έχει δειχθεί ότι είναι ένας κεντρικός ρυθμιστής της κυτταρικής ανάπτυξης και ελέγχεται από ένα μεγάλο αριθμό σημάτων, συμπεριλαμβανομένων θρεπτικών συστατικών, όπως η γλυκόζη και τα αμινοξέα, και αυξητικούς παράγοντες όπως ινσουλίνη και IGF-1. ενεργοποίηση mTOR διεγείρει επίσης τη σύνθεση πρωτεϊνών και κυτταρική υπερτροφία σε διάφορα κύτταρα και όργανα. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του mTOR συμμετέχει σε ιππόκαμπου συναπτική πλαστικότητα και τις διαδικασίες μάθησης και μνήμης

μέσω

πρωτεΐνη σύνθεσης [13]. Για παράδειγμα, η αναστολή της δραστικότητας του mTOR με ραπαμυκίνη έχει δειχθεί να εμποδίσει ανασταλτική αποφυγή μακροπρόθεσμη μνήμη [14] και να βλάψει την ακοή [15], ο φόβος [16], [17], και ενοποίηση χωρικής μνήμης [18]. Επιπλέον, γενετικές ανωμαλίες στο Ras /Εγκ /PI3K /mTOR οδών σηματοδότησης μπορεί να αιτιολογικά συνδέεται με αρκετές ανθρώπινες γενετικές διαταραχές που ταξινομούνται ως νευρο-καρδιο-προσώπου-δερματικές και hamartoma σύνδρομα, και ως εκ τούτου μπορεί να είναι υπεύθυνη για γνωστικές διαταραχές [19]. Έτσι, μπορεί να προταθεί ότι η μακροχρόνια χορήγηση αναστολέων του mTOR που συμβαίνουν στη θεραπεία του καρκίνου θα μπορούσαν να επηρεάσουν τις λειτουργίες του εγκεφάλου που εμπλέκονται στη γνωστική λειτουργία ή /και τον μεταβολισμό.

Το everolimus (Afinitor, Novartis, Basel, Ελβετία), ένας από του στόματος χορηγούμενη παράγωγο ραπαμυκίνης, άμεσα αναστέλλει τη δραστικότητα της κινάσης του συμπλέγματος αρπακτικών /mTOR (mTORC1)

μέσω

δέσμευση στην ΡΚΒΡ-12 και σχηματίζοντας έτσι ένα σύμπλοκο με ανασταλτική mTOR [20]. Αυτό το είδος του αναστολέα mTOR χαρακτηρίζεται καλά για αντι-νεοπλασματικές ιδιότητες,

δηλαδή

επάγει μείωση της αύξησης των κυττάρων του όγκου, τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

[ ,,,0],21] – [23]. Ωστόσο, η γενική παρενέργειες, συμπεριλαμβανομένων κόπωσης, οίδημα, εξασθένιση, πυρεξία, φλεγμονή του βλεννογόνου, ανορεξία, μειωμένο βάρος και τον πόνο έχουν αναφερθεί [24] – [27]. Πιο συγκεκριμένα, το κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) παρενέργειες συμπεριλαμβανομένου του πονοκεφάλου /ημικρανίας ή δυσγευσία, έχουν επίσης περιγραφεί [26].

Ο στόχος της μελέτης ήταν να αξιολογήσει το δυναμικό γνωστική λειτουργία-βλάβη ενδέχεται να προκληθεί από στοχευμένες θεραπείες, όπως το everolimus, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο συμπεριφοράς επικυρωθεί το ποντίκι [28]. Αποκτήσαμε ιδιαίτερα προσοχή στη δόση που χρησιμοποιείται προκειμένου να είναι όσο το δυνατόν περισσότερο στις συνθήκες του ασθενούς θεραπεία του καρκίνου. Πράγματι, με βάση τις φαρμακοκινητικές /δυναμικές μελέτες [29] – [31], η πιο προσαρμοσμένη και υπέδειξε δόση στην προηγμένη θετικούς ορμονικούς υποδοχείς, HER2-αρνητικό καρκίνο του μαστού, προηγμένη νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος προέλευσης, προχωρημένο καρκίνωμα νεφρών, νεφρική angiomyolipoma με οζώδους σκλήρυνσης (TSC) είναι 10 mg /ημερησίως, αλλά στην περίπτωση της τοξικότητας, η προτεινόμενη δόση είναι 5 mg /ημερησίως. Επίσης, ένας αριθμός μελετών έχουν διεξαχθεί σε μοντέλα ζώων με την παρούσα /ημερήσια χορήγηση 5 mg [22], [32], [33] και μελέτες έδειξαν ότι αυτή η δόση everolimus είναι στοματικά δραστικός σε ποντικούς και ότι σταθερή κατάσταση επιτεύχθηκε μέσα σε δύο εβδομάδες με ημερήσια χορήγηση [22]. Αυτή 5 mg /kg /d πρόγραμμα φαίνεται να είναι η ελάχιστη συγκέντρωση για την μέγιστη αποτελεσματική δόση χωρίς εμφανή τοξικότητα.

Οι πιθανές μακροχρόνιες επιδράσεις της θεραπείας everolimus σε ποντίκια γνωστική λειτουργία και νευροβιολογικές διεργασίες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας hippocampal- και μετωπιαίο φλοιό που εξαρτώνται από τα καθήκοντα της συμπεριφοράς και του ιππόκαμπου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ή αγγειακή πυκνότητα θέση αντίστοιχα. οξείες επιπτώσεις της στην δραστηριότητα νευρικών κυττάρων διερευνήθηκε

ex vivo μέσω

αξιολόγηση της δραστηριότητας της οξειδάσης του κυτοχρώματος περιφερειακή εγκεφάλου.

Υλικό και Μέθοδοι

Ζώα και ηθική δηλώσεις

Male C57BL /6J Rj ποντίκια (Janvier, Le Genest Αγίου Isle, Γαλλία) ηλικίας 7 εβδομάδων στεγάστηκαν υπό ελεγχόμενες πρότυπες συνθήκες περιβάλλοντος: 22 ± 1 ° C? 5 ζώα ανά κλουβί? 12 ώρες /12 ώρες σκοτάδι κύκλο φωτός /(φως στις: 00:00)? νερού και τροφίμων που διατίθενται

κατά βούληση

. Κατά την περίοδο 2-εβδομάδων προσαρμογή, τα ζώα διακινήθηκαν ημερησίως για την παρακολούθηση του βάρους. χορήγησης Η θεραπεία ξεκίνησε όταν τα ποντίκια ήταν ηλικίας 9 εβδομάδων. Οι ποντικοί ζυγίζονταν καθημερινά από την ημέρα του 1ου θεραπεία κατάποση με την 36η ημέρα μετά την τελευταία χορήγηση. Το βάρος των ζώων πριν από την 1η ένεση (D0) χρησιμοποιήθηκε ως τιμή βάσης για τον υπολογισμό του κέρδους βάρους σε όλο το πείραμα. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τη γαλλική επιτροπή δεοντολογίας, καθώς και τις κατευθυντήριες γραμμές της οδηγίας του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου 2010/63 /ΕΕ και το Συμβούλιο για την προστασία των ζώων που χρησιμοποιούνται για επιστημονικούς σκοπούς. Το έργο αυτό εγκρίθηκε από την CENOMEXA «Comité d’Ethique Νορμανδία en την ύλη d’πειραματισμό Animale» στο πλαίσιο της Εθνικής Επιτροπής για τα πειράματα σε ζώα, και έλαβε την ακόλουθη σειρά N /12.11.12 /35 /11-17. χειρισμοί των ζώων πραγματοποιήθηκαν υπό την επίβλεψη ενός εγκεκριμένου ερευνητή (H. Castel?. άδειας το 76.98 από το Ministère de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche)

χορήγηση φαρμάκων

.

Ένα μικρογαλάκτωμα του everolimus τυποποιούνται σε 2% (w /v), που παρέχονται από την Novartis (Rueil-Malmaison, Γαλλία), διαλύθηκε σε 0,9% NaCl και χορηγούνται καθημερινά από του στόματος καθετηριασμό (5 mL /kg)

μέσω

μια βελόνα τροφοδοσίας (Fine Science Tools, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) στα 5 mg /kg για 14 συνεχόμενες ημέρες [34].

δραστηριότητα κυτοχρώματος οξειδάσης και το μεταβολισμό του εγκεφάλου

Τα ποντίκια που έλαβαν όχημα (

n

= 8) ή everolimus (

n

= 9) κατά τη διάρκεια 2 εβδομάδων αμέσως ευθανασία μετά την τελευταία ημέρα της θεραπείας για να μελετήσει δραστηριότητα οξειδάσης κυτοχρώματος σε διάφορες εγκεφαλικές περιοχές. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο, αποκεφαλίστηκαν, και οι εγκέφαλοι τους αφαιρέθηκαν ταχέως 24 ώρες μετά την τελευταία ημέρα της θεραπείας, καταψύχθηκαν σε 2-μεθυλοβουτάνιο (Sigma-Aldrich, San-Quentin Fallavier, Γαλλία) στους -30 ° C και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κρυοστάτης τμήματα, το καθένα πάχους 30 μm, κόπηκαν από το βρέγμα +3,20 mm έως -6,48 mm και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι την επεξεργασία. Για κάθε ζώο, ελήφθησαν 8 παρτίδες των 41 συνεχόμενων φέτες, όπως σε ένα slide 2 τμήματα που χωρίζονται από 240 μm.

Όλες οι φέτες εγκεφάλου μιας παρτίδας ανά ζώο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ταυτόχρονα υπό τις ίδιες συνθήκες. Το πρωτόκολλο προσαρμόστηκε από προηγούμενες δημοσιεύσεις [35], [36]. Οι τομές επωάζονται στο σκοτάδι (37 ° C, 50 λεπτά) σε 0,1 Μ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 120 mg άλογο-καρδιά κυτόχρωμα c, 24 g σακχαρόζη, 300 mg DAB-4-HCl, και 108 mg καταλάση ( Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Γαλλία) ανά 540 ml. Οι φέτες πλύθηκαν (5 λεπτά) με κρύο ρυθμιστικό διάλυμα (10% σακχαρόζη σε PBS), εμβαπτίζεται για 30 λεπτά σε φορμόλη /ρυθμιστικό διάλυμα 10%, και πλύθηκε δύο φορές (5 λεπτά) σε ρυθμιστικό διάλυμα πριν από την αφυδάτωση. Οι τομές στη συνέχεια να καλύψει-γλίστρησε με Eukitt (VWR International, Στρασβούργο, Γαλλία) και εξετάζεται μικροσκοπικά.

Το προϊόν της ιστοχημική αντίδραση (οξειδωμένο DAB) ήταν ορατά με οπτικό μικροσκόπιο. Σε κάθε περιοχή ενδιαφέροντος, ένταση χρώσης του μετρήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση με τη βοήθεια ενός σταθμού εργασίας ανάλυσης εικόνας υποβοηθούμενη από υπολογιστή (SAMBA Technologies, Meylan, Γαλλία) [37]. Για κάθε περιοχή μελέτης, χρησιμοποιήθηκαν τουλάχιστον 2 φέτες ανά ζώο, ανάλογα με το μήκος προσθιοπίσθια της περιοχής, με μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν σε διμερές επίπεδο, όταν είναι δυνατόν. Το υπόβαθρο αφαιρέθηκε για κάθε διαφάνεια. Οι διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές που εντοπίστηκαν μέσω των [38] άτλαντα του εγκεφάλου του ποντικιού Franklin και Παξινός.

Συμπεριφορική δοκιμές

Συνολικά, 14 ποντίκια έλαβαν θεραπεία everolimus και 12 ποντίκια έλαβαν διαλύτη μόνο (όχημα ομάδα) κατά τη διάρκεια 2 εβδομάδων. Συμπεριφορική δοκιμασία άρχισε 7 ημέρες μετά την τελευταία χορήγηση της θεραπείας και διήρκεσε 23 ημέρες (σχ. S3A). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν 13:00 – 18:00, κατά την έναρξη της ενεργού φάσης των ζώων.

Γνωστική λειτουργίες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το λαβύρινθο νερού Morris, στο οποίο τα ποντίκια που απαιτείται για να ξεφύγει από μια λεκάνη νερό με την εύρεση μια πλατφόρμα που τοποθετούνται στο κοινό [39]. Ένα κυλινδρικό δοχείο (διάμετρος 93 cm, ύψος 45 cm) πληρώθηκε με νερό (που διατηρείται στους 23 ± 1 ° C) σε ένα ύψος 40 cm, από αδιαφανές με λευκό, αδρανές, υδατικό ακρυλικό γαλάκτωμα (Accusol ΕΠ 301, Απόψεις, Γαλλία ). Η δεξαμενή τοποθετήθηκε σε ένα φωτιζόμενο δωμάτιο (50 lux στο κεντρικό επιφάνεια της πισίνας) με συνθήματα extra-λαβύρινθο στους τοίχους. Ο λαβύρινθος νερού χωρίστηκε σε τέσσερα εικονικά τεταρτημόρια: βορειο-δυτικά (ΒΔ), βόρειο-ανατολικά, νοτιοανατολικά και νοτιοδυτικά, και των ζώων συμπεριφορές παρακολουθούνται βίντεο. Την ημέρα 1, τα ζώα εξοικειώθηκαν με την πισίνα και τα κίνητρα και οπτικο-κινητικές τους ικανότητες αξιολογούνται. Μια πλατφόρμα διαφυγής (διάμετρος 9,7 cm) τοποθετήθηκε στο κέντρο της δεξαμενής, οι αναδυόμενες 1 cm πάνω από την επιφάνεια του νερού και με μια μικρή μαύρη μπάλα καθορίζεται σε αυτήν, προκειμένου να διευκολυνθεί η προβολή του από την πλευρά των ζώων. Οι ποντικοί τοποθετήθηκαν πάνω στην πλατφόρμα για 20 δευτερόλεπτα. Αμέσως μετά, την 1η συνεδρία περιλαμβάνει τέσσερις μελέτες διάρκειας 60 δευτερολέπτων (μεταξύ δοκιμή διάστημα: 30 λεπτά). Τα ζώα τοποθετήθηκαν, κοιτάζοντας τον τοίχο, σε 1 από 4 θέσεις εκκίνησης (βόρεια, νότια, ανατολικά ή δυτικά) και αφήνεται να κολυμπήσουν στην ορατή πλατφόρμα για μέγιστο χρονικό διάστημα 60 δευτερολέπτων. Τα ποντίκια δεν βρίσκει την πλατφόρμα τοποθετήθηκαν με το χέρι πάνω του για 20 δευτερόλεπτα. Τις ημέρες 2-5, ικανότητες χωρικής μάθησης αξιολογήθηκαν σε μία φάση εκπαίδευσης του 4 ημερήσιες δοκιμές, τα μέγιστα 60 δευτερολέπτων το καθένα, στην οποία η πλατφόρμα διαφυγής τοποθετήθηκε στο τεταρτημόριο NW, βυθισμένο 1 cm κάτω από την επιφάνεια του νερού. 2 ώρες μετά την τελική δίκη του την τελευταία ημέρα της περιόδου άσκησης, μια δοκιμή ανιχνευτή διεξήχθη αφαιρώντας την πλατφόρμα και επιτρέποντας ζώα να κολυμπήσουν για 60 δευτερόλεπτα, με το χρόνο που δαπανάται στο παρελθόν σωστό τεταρτημόριο (ΒΔ) μετριέται. Χωρική ικανότητες μνήμης αξιολογήθηκαν σε ανάκτηση φάση κατά την ημέρα 10, χρησιμοποιώντας μια μόνο συνεδρία των 4 δοκιμών κάτω από τις ίδιες συνθήκες όπως στη φάση της κατάρτισης. Μαθαίνοντας πλαστικότητα αξιολογήθηκε σε μια φάση μεταφοράς πάνω από 4 διαδοχικές ημέρες (4 δοκιμές /ημέρα, κατ ‘ανώτατο όριο 60 δευτερολέπτων το καθένα) με καθημερινή αλλαγή του κρυφό σημείο πλατφόρμα. Απόσταση πέρασε και να ξεφύγουν λανθάνουσα μετρήθηκαν.

πολλαπλασιασμό των κυττάρων ιπποκάμπου, αγγειακή πυκνότητα και φωσφορυλιωμένο p70S6 κινάσης ανοσοσήμανση

5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) -επισημασμένο κύτταρα εντός και εκτός της ζώνης subgranular του ιππόκαμπου (SGZ) μετρήθηκαν. Να επισημαίνουν κύτταρα ενηλίκων που δημιουργείται στην οδοντωτή έλικα του ιππόκαμπου, 6 ενέσεις ενδοπεριτοναϊκή (50 mg /kg) του BrdU (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Γαλλία) χορηγήθηκαν κατά τη διάρκεια των τελευταίων ημερών της περιόδου θεραπείας σε μη ποντίκια υποβάλλονται σε συμπεριφορική αξιολόγηση (Σχ. S3C). Η επόμενη ημέρα της τελευταίας καθετήρα, και 3 ώρες μετά την ένεση με BrdU, οι ποντικοί αναισθητοποιούνται χρησιμοποιώντας ισοφλουορανίου, αποκεφαλίστηκε, ο δε εγκέφαλός τους αφαιρούνται γρήγορα, καταψύχονται σε 2-μεθυλοβουτάνιο (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Γαλλία) στους -30 ° C και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Οι εγκέφαλοι κόπηκαν με κρυοστάτη σε σειριακή στεφανιαίες τομές (πάχους 20 μm) από το πρόσθιο μέρος του ραχιαίου ιππόκαμπου (προσθιοπίσθια, 1,20 mm από το βρέγμα -1,44 mm). Κάθε 12η τομή, το καθένα που χωρίζονται από 240 μm, τοποθετήθηκε σε πλακίδια επικαλυμμένα με ζελατίνη-χρώμιο στυπτηρία και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι την επεξεργασία.

Έξι ιππόκαμπου τμήματα από κάθε ένα από 4 ζώα ανά ομάδα βάφτηκαν ταυτόχρονα για οπτικοποίηση BrdU. φέτες εγκεφάλου μονιμοποιήθηκαν (4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS, πλύθηκαν 3 × 5 λεπτά, με PBS ρΗ 7,4, και επωάστηκαν (2Ν HCl? 45 ° C? 45 λεπτά) για να μετουσιωθούν DNA τμήματα κατόπιν πλύθηκαν (PBS, 3 χ 5 λεπτά). , επωάστηκαν για 1 ώρα σε διάλυμα φραγμού περιέχον δύο παρα δέκα φυσιολογικό ορό γαϊδάρου, 1% αλβουμίνη βόειου ορού και 0.3% Triton Χ-100 (VWR International, Στρασβούργο, Γαλλία) σε PBS, και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι πρόβατα -BrdU ανοσοσφαιρίνης G. (IgG? Abcam, Παρίσι, Γαλλία) σε 1:400 σε διάλυμα αποκλεισμού Ακολούθως, τα τμήματα πλύθηκαν (PBS, 4 × 5 λεπτά) και επωάστηκαν (2 ώρες, θερμοκρασία δωματίου) με Alexa 488-συζευγμένο γαϊδάρου αντι -Πρόβατα IgG (Invitrogen, Βουλώνη-Μπιλανκούρ, Γαλλία) σε 1:400 σε PBS. ξεπλύθηκε τομές κάλυμμα γλίστρησε με Mowiol. οι τομές εξετάστηκαν σε Nikon Eclipse E600 μικροσκόπιο (Nikon μέσο, ​​Champigny-sur-Marne, Γαλλία) διασυνδεθεί με το λογισμικό Mercator (ExploraNova, Λα Ροσέλ, Γαλλία). Μια τροποποιημένη αμερόληπτη στερεολογικές μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει BrdU-θετικά κύτταρα στο SGZ της οδοντωτής έλικας και στην περιοχή έξω από το SGZ [40], [41]. Ο αριθμός των χρωσμένων κυττάρων σε 6 τμήματα μετρήθηκε σε διμερές, και, καθώς κάθε 12η τομή χρησιμοποιήθηκε, ο αριθμός αυτός πολλαπλασιάζεται με 12. Όλες οι μετρήσεις έγιναν από έναν ερευνητή τυφλωμένο στην ομάδα θεραπείας.

Για διερεύνηση ιπποκάμπου πυκνότητα αγγειακή κόγχη, τομές εγκεφάλου μονιμοποιήθηκαν, πλύθηκαν, και επωάστηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω. Το πρωτογενές αντίσωμα ήταν κουνελιού αντι-IQGAP1 (Η-109) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Tebu-bio, Le-Perray-en-Yvelines, Γαλλία) αραιωμένο 1:400 σε διάλυμα αποκλεισμού, και το δευτερεύον αντίσωμα ήταν Alexa 488 συζευγμένο γαϊδάρου αντι-κουνελιού IgG σε 1:400 σε PBS. Οι τομές επιχρωματίστηκαν με DAPI πυρηνικό δείκτη (1 μg /mL). Ανοσοφθορισμός παρατηρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό και IQGAP1 σημασμένο δομών στην SGZ αξιολογούνται σε 3 τμήματα που χωρίζονται από 240 μm (μεταξύ Bregma -1,68 mm και -2,16 mm).

Για να διερευνηθούν οι ενεργές μορφές (φωσφορυλιωμένη) του p70S6 κινάση (ρ-p70S6K), τομές του εγκεφάλου του οχήματος και ποντίκια everolimus αγωγή σταθεροποιήθηκαν, πλύθηκαν, και η έκφραση ρ-p70S6K μετρήθηκε με τη βοήθεια του αντι-ρ-p70S6K πρωτογενές αντίσωμα (Abcam ab60948, Παρίσι, Γαλλία) αραιωμένο 1:200 σε διάλυμα αποκλεισμού, και το δευτερεύον αντίσωμα ήταν Alexa 488-συζευγμένο γαϊδάρου αντι-κουνελιού IgG σε 1:400 εντός διαλύματος αποκλεισμού. P-p70S6K-σημασμένο δομές αξιολογήθηκαν σε 2 ή 3 τμήματα που χωρίζονται από 240 μm (μεταξύ Bregma -0,98 mm και -1,70 mm για τόξο, Re, Rh, submed, VM? Μεταξύ -1,22 mm και -1,94 mm για EP, Ect και PRH?. μεταξύ -2,06 χιλιοστών και -2,54 χιλιοστών για pSTH) με Nikon Eclipse E600 μικροσκόπιο (Nikon μέσο, ​​Champigny-sur-Marne, Γαλλία) σε διεπαφή με το λογισμικό απεικόνισης ΝΑΚ-Στοιχεία

Πολιτισμός των νευρικών βλαστικών κύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα

Για νευρικών βλαστικών κυττάρων (NSC) του πολιτισμού, του εγκεφάλου από C57BL /6J Rj νεογέννητα ποντίκια πλύθηκαν σε θρυψίνη. Το κυτταρικό εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 100 g για 4 λεπτά, και τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο χωρίς ορό. Αυτό το μέσο συνίστατο από Neurobasal (100 ml, Gibco, Saint-Aubin, Γαλλία) συμπληρωμένο με 5 mM ρυθμιστικού HEPES (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), 1 mL Β27 και 1 mL Ν2 συμπλήρωμα ανάπτυξης (Gibco), 20 μί επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (20 ng /mL? Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), 10 μι βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (10 ng /mL? Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), και 7,32 ηπαρίνη μι (Sigma- Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Γαλλία) και προστέθηκε με 33 mM γλυκόζης. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 100 βιώσιμων κυττάρων ανά μικρολίτρο σε αυτό το μέσο και καλλιεργήθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2-95% αέρα υγροποιημένο επωαστή. Την ημέρα 7, καλά αναπτυγμένο νευροσφαίρες συλλέχθηκαν και πέψη σε θρυψίνη επί 10 λεπτά στους 37 ° C. Δευτερογενής νευρόσφαιρες (Ρ

1) και αργότερα περάσματα δημιουργήθηκαν με μηχανικές και ενζυματική διάσπαση του πρωτογενούς νευροσφαιρίων. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία του οχήματος ή everolimus για 24 έως 48 ώρες. Χρησιμοποιώντας ένα 4 × στόχος μιας Nikon (Nikon Eclipse TS100, Kingston, England) ανεστραμμένο μικροσκόπιο, μετρήσαμε τη μέση διάμετρο 20 τυχαία επιλεγμένα νευροσφαιρία ανά εκβάθυνση ( . 001) από την 17rd ημέρα μετά την εισαγωγή του αναστολέα mTOR, και συνέχισε να ζυγίζουν λιγότερο σε όλη την ακόλουθη πειραματική περίοδο (LSD post hoc

σ

. 001.

η

Οι βραχυπρόθεσμες επιπτώσεις του everolimus στην εγκεφαλική δραστηριότητα οξειδάσης του κυτοχρώματος και p70S6 κινάσης phosphotylated μορφή

για να αξιολογηθεί ο αντίκτυπος του αναστολέα mTOR στο μεταβολισμό των εγκεφαλικών κυττάρων, μια ιστοχημική ανάλυση αποκαλύπτοντας δραστηριότητα οξειδάσης κυτοχρώματος έχει πραγματοποιηθεί σε φέτες εγκεφάλου ελέγχου και ποντίκια με αγωγή (Πίνακας 1). Στα ποντίκια everolimus αγωγή, 4 ημέρες μετά το τέλος της περιόδου θεραπείας, μια σημαντική μείωση (

ρ

& lt? 0,05) δραστικότητας οξειδάσης κυτοχρώματος ήταν παρούσα στο κέλυφος του επικλινή πυρήνα (t

13 = 2.52), το prelimbic φλοιό (t

15 = 2,20), η πλευρική προοπτική περιοχή (t

14 = 2.33) και ο κινητήρας πυρήνα του τριδύμου (t

13 = 2.38). Επιπλέον, η θεραπεία everolimus οδήγησε σε αυξημένη μεταβολική δραστηριότητα στην ectorhinal φλοιό (t

14 = -2,61), ο πυρήνας entopeduncular (t

13 = -2,27), ο parasubthalamic πυρήνα του υποθαλάμου (t

14 = -2.91), το μοναχικό πυρήνα (t

13 = -2,49), καθώς και στις θαλαμικών reuniens (t

14 = -2,48), ρομβοειδή (t

14 = -2,31), submedius (t

14 = -2,30) και μεσοκοιλιακό (t

14 = -2,56) πυρήνες (όλα

ρ

& lt? 0,05) (Σχ 2Α και Πίνακας 1).. Προκειμένου να ερευνηθεί η δυνατότητα άμεσης ή έμμεσης αναστολής του mTOR σε αυτές τις περιοχές του εγκεφάλου, η δραστηριότητα ενός καθοδικός τελεστής της οδού mTOR εκτιμήθηκε με ανοσοχρωματισμένη επίπεδα της κινάσης φωσφο-p70S6 (ρ-p70S6K) σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου που εμφανίζει ή όχι CO μεταβολικές αλλαγές. Η θεραπεία δεν τροποποίησε σημαντικά την p70S6K-θετική σήμανση στο ectorhinal φλοιό, entopeduncular πυρήνα, reuniens, ρομβοειδή, μεσοκοιλιακό και submedial θαλαμικών πυρήνων και την parasubthalamic πυρήνα που εμφανίζουν τροποποιημένες δραστηριότητες CO, καθώς και σε perirhinal φλοιό και τοξοειδές υποθαλάμου πυρήνας δεν δείχνει αλλαγές στην δραστηριότητες CO (Σχ. 2Β και C).

(α) δραστηριότητα CO σε επιλεκτικό φορέα και everolimus αγωγή περιοχές του εγκεφάλου ποντικών. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της φωσφο-ρ70δ6Κ (p-p70S6K) ανοσοϊστοχημικής στο φλοιό, entopeduncular πυρήνα, θάλαμο και τον υποθάλαμο του οχήματος ή ποντίκια everolimus-θεραπεία. (Γ) μέσο ποσοστό της Ρ-p70S6K-επισημασμένο επιφάνεια (κανονικοποιημένη σε όχημα) (+ SEM) στις διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου. Arc: τοξοειδή πυρήνα? Ect: ectorhinal φλοιό? ΕΡ: entopeduncular πυρήνα? PRH: perirhinal φλοιό? PSTH: parasubthalamic πυρήνα? Re: reuniens του θαλάμου πυρήνα? Rh: ρομβοειδή του θαλάμου πυρήνα? Submed: submedial του θαλάμου πυρήνα? VM:. Μεσοκοιλιακό του θαλάμου nuleus

Η

Δεν συναισθηματικές και γνωστικές μεταβολές μετά τη θεραπεία everolimus

συναισθηματική συμπεριφορά

Επτά ημέρες μετά το τέλος της περιόδου θεραπείας. , το ποσοστό των εισόδων των ανοιχτών βραχιόνων στο ανυψωμένου συν λαβυρίνθου (Βλέπε Υλικά και Μέθοδοι S1) δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των 2 ομάδων θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει ότι everolimus δεν επηρέασε το άγχος-όπως συμπεριφορά (t

24 = 1.66,

σ

& gt? 0,05? Εικ. S1 Α). Στην δοκιμασία εξαναγκασμένης κολύμβησης, η διάρκεια ακινησίας δεν ήταν στατιστικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων, υποδηλώνοντας ότι everolimus δεν μετέβαλαν καταθλιπτική συμπεριφορά τύπου (t

24 = 0.65,

σ

& gt? 0,05? Σχ. S1B ).

Χωρική μάθηση και τη μνήμη.

Κατά τη διάρκεια της φάσης εξοικείωσης της δοκιμής λαβύρινθο νερού Morris, ταχύτητα κολύμβησης (t

24 = -0,69,

σ

& gt ? 0,05? δεν φαίνεται), η απόσταση πέρασε (t

24 = 0.49,

σ

& gt? 0,05? δεν φαίνεται) και χρόνος που απαιτείται για να βρείτε το αναδειχθεί πλατφόρμας (t

24 = 0,93 ,

σ

& gt? 0,05? Εικ. 3Α) δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά από τη θεραπεία, δείχνοντας ότι τα κίνητρα και οπτικο-κινητικές ικανότητα δεν επηρεάστηκαν από το everolimus. Κατά τη φάση της εξαγοράς, το everolimus δεν αλλοιώνουν τις επιδόσεις χωρική μάθηση 15 ημέρες μετά το τέλος της περιόδου θεραπείας, όπως η λανθάνουσα κατάσταση διαφυγής (F

1,24 = 0,94,

σ

& gt? 0,05? Εικ . 3Β) και η απόσταση πέρασε (F

1,24 = 0,32,

σ

& gt? 0,05? Σχ. 3C) δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων. Παραστάσεις βελτιώθηκε σημαντικά, καθώς επαναλήφθηκε η δοκιμή (ξεφύγει λανθάνουσα F

3,72 = 18,38,

σ

& lt? 0.001 και εξ αποστάσεως διέσχισε F

3,72 = 19,51,

p

& lt? .001). Κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανιχνευτή, όλα τα ποντίκια που περνούσαν σημαντικά περισσότερο χρόνο στο παρελθόν σωστό τεταρτημόριο από ότι είχε προβλεφθεί από την τύχη (όχημα: X

2

11 = 117,67,

σ

& gt? .001? Everolimus: X

2

13 = 231,80,

σ

& lt? .001? Εικ. 3D). Κατά τη διάρκεια της ανάκτησης φάσης, το everolimus αγωγή ποντικούς δεν εμφανίζει δυσλειτουργία χωρική απόδοση της μνήμης, ως λανθάνουσα κατάσταση διαφυγής τους (t

24 = 0.49,

σ

& gt? 0,05? Σχ. 3Β) και την απόσταση πέρασε ( t

24 = 0.40,

σ

& gt? 0,05? Σχ. 3C) δεν διέφεραν σημαντικά από αυτές των ποντικών οχήματος

(Α) Κίνητρα και οπτικο-κινητικές ικανότητες μετά. όχημα ή θεραπεία everolimus (Student

t

δοκιμής,

σ

& gt? .05). (Β και Γ) Κατά την κατάρτιση και την ανάκτηση (R) φάσεις, η λανθάνουσα κατάσταση (Β) και την απόσταση πέρασε (C) μετά από όχημα ή θεραπεία everolimus (φαινόμενο ANOVA, Ημέρα ***

σ

& lt? .001) . (Δ) Κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανιχνευτή, ο χρόνος που δαπανάται από τα ζώα και των δύο ομάδων στο τεταρτημόριο όπου η πλατφόρμα βρίσκεται στη φάση της κατάρτισης (χ

2, ***

σ

& lt? .001

vs

ευκαιρία). Κατά τη διάρκεια της φάσης μεταφοράς, να ξεφύγουν λανθάνουσα (Ε), η απόσταση πέρασε (F), και την ταχύτητα κολύμβησης (G) με φορέα ή everolimus αγωγή ποντίκια (φαινόμενο ANOVA, Θεραπεία *

σ

& lt? .05, Δίκη επίδραση ***

σ

& lt? .001 ακολουθείται από LSD post hoc

##

σ

& lt? .01). (H) Κατά την 1η ημέρα της φάσης μεταβίβασης, ο χρόνος που δαπανάται στο παρελθόν σωστή βορειοδυτικό τεταρτημόριο μετά από όχημα ή το everolimus θεραπεία (Student

t

δοκιμής,

σ

& gt? .05). Τα δεδομένα είναι μέσα + SEM

Η

Κατά τη διάρκεια της φάσης μεταφοράς της δοκιμής λαβύρινθο νερού Morris, τα ζώα βελτίωσε τις επιδόσεις τους στις μελέτες (latency διαφυγής:. F

3,72 = 9,76,

p

& lt? .001? απόσταση διέσχισε F

3,72 = 14,99,

σ

& lt? 0.001?. Σχήματα 3Ε και 3F). Μαθαίνοντας πλαστικότητα, αξιολογούνται από την καθημερινή μεταβολή της θέσης της πλατφόρμας, δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία? ξεφύγουν λανθάνουσα κατάσταση πριν από την εύρεση η κρυμμένη πλατφόρμα ήταν παρόμοια μεταξύ των ομάδων (F

1,24 = 3,36,

σ

& gt? 0,05? Σχ. 3Ε). Ωστόσο, η απόσταση που διασχίζεται από το everolimus αγωγή ποντικούς ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τα ποντίκια όχημα (F

1,24 = 6,08,

ρ

& lt? 0,05? Εικ. 3F). αξιολόγηση ANOVA αποκάλυψε μια σημαντική θεραπεία × αλληλεπίδραση δίκη όσον αφορά την ταχύτητα κολύμβησης (F

3,72 = 3,69,

σ

& lt? .05). LSD post hoc αναλύσεις έδειξαν ότι το everolimus-ποντίκια με αγωγή κολύμπησε πιο γρήγορα από ό, τι τα ποντίκια οχήματος κατά τη διάρκεια του πρώτου και του τρίτου δοκιμές (

σ

& lt? 0,01? Σχ. 3G). Κατά τη διάρκεια της ημέρας 1 της φάσης μεταβίβασης, everolimus δεν μετέβαλε το χρόνο που δαπανάται στο τεταρτημόριο που ήταν σωστή κατά τη φάση της κατάρτισης (t

24 = -0,39,

σ

& gt? 0,05? Σχ. 3Η ), γεγονός που υποδηλώνει την απουσία της συμπεριφοράς εμμονή.

αυθόρμητη δραστηριότητα και τη μνήμη αναγνώρισης.

το everolimus δεν μετέβαλαν την αυθόρμητη κινητική και κάθετες δραστηριότητες. Η απόσταση πέρασε και ο αριθμός κλίνει δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων θεραπείας (t

24 = 0.63,

σ

& gt? .05 Και t

24 = 0.39,

p