Αφηρημένο

Σκοπός

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι αρκετές διαιτητικές πολυφαινόλες μπορεί να ασκήσει chemopreventive δράση τους μέσω επιγενετικών τροποποιήσεων. Η κουρκουμίνη είναι ένα από τα πιο ευρέως μελετηθεί διαιτητικές χημειοπροληπτική παράγοντες για την πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου, ωστόσο, τα αποτελέσματά της επί επιγενετικές μεταβολές, ιδιαίτερα μεθυλίωσης του DNA, παραμένουν ασαφείς. Χρησιμοποιώντας συστηματικές προσεγγίσεις γονιδιώματος σε επίπεδο, έχουμε ως στόχο να αποσαφηνιστεί η επίδραση της κουρκουμίνης επί μεθυλίωσης του DNA μεταβολές στα ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της κουρκουμίνης επί μεθυλίωσης του DNA, τρία κυτταρικές γραμμές CRC, HCT116, ΗΤ29 και RKO, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη. 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-CDR) και τριχοστατίνη Α επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες για τις αλλαγές μεθυλίωσης του DNA, αντίστοιχα. κατάσταση μεθυλίωσης του LINE-1 επαναληπτικών στοιχείων, μικροσυστοιχίες μεθυλίωση προαγωγού DNA και συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση παγκόσμιες αλλαγές μεθυλιώσεως και γονιδιακή έκφραση. Η επικύρωση πραγματοποιείται με τη χρησιμοποίηση ανεξάρτητων μικροσυστοιχίες, ποσοτική Pyrosequencing διθειώδες, και qPCR.

Αποτελέσματα

Όπως αναμενόταν, γονιδιώματος σε επίπεδο μικροσυστοιχίες μεθυλίωσης αποκάλυψε σημαντικές υπομεθυλίωσης του DNA σε 5-αζα-ΟϋΚ-κατεργασμένα κύτταρα (μέση β-τιμές 0,12), ωστόσο, μη σημαντικές αλλαγές στο μέσο β-τιμές παρατηρήθηκαν σε κύτταρα κουρκουμίνη φάρμακο. Σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα, κουρκουμίνη επαγόμενη DNA αλλαγές μεθυλίωσης συνέβη σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε αντίθεση με την γενικευμένη, μη ειδική παγκόσμια υπομεθυλίωση παρατηρήθηκε με 5-αζα-CdR, θεραπεία κουρκουμίνη ως αποτέλεσμα αλλαγές μεθυλίωσης σε επιλεγμένα, μερικώς μεθυλιωμένες θέσεις, αντί του πλήρως-μεθυλιωμένου CpG θέσεις. μεθυλίωση του DNA μεταβολές αυτές υποστηρίζονται από αντίστοιχες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση τόσο σε πάνω και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια σε διάφορες CRC κυτταρικές σειρές.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας παρέχει προηγουμένως μη αναγνωρισμένα στοιχεία για την κουρκουμίνη μεσολάβηση DNA μεταβολές μεθυλίωσης ως δυνητικός μηχανισμός χημειοπρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε αντίθεση με μη ειδική παγκόσμια υπομεθυλίωση που επάγεται από 5-αζα-CdR, κουρκουμίνη μεταβολές που προκαλούνται από μεθυλίωση συνέβη μόνο σε ένα υποσύνολο των μερικώς μεθυλιωμένης γονίδια, που παρέχει πρόσθετη μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με την ισχυρή chemopreventive επίδραση αυτής της διαιτητικής nutraceutical.

Παράθεση: Link A, Μπαλαγκέρ F, Shen Υ, Lozano JJ, Leung H-CE, Boland CR, et al. (2013) Η κουρκουμίνη διαμορφώνει μεθυλίωσης του DNA στα κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (2): e57709. doi: 10.1371 /journal.pone.0057709

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα

Ελήφθη: 22 Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 25 Ιανουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Σύνδεσμος et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις R01 CA72851 και CA129286 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, καθώς και κονδύλια από το Ινστιτούτο Ερευνών Baylor. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ajay Goel υπηρετεί σήμερα ως ένα κύριο μέλος του διοικητικού συμβουλίου για PLoS ONE, όμως, αυτό δεν κάνει δεν μεταβάλλουν την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου παγκοσμίως, είναι υπεύθυνη για περίπου 10% της συνολικής θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο [1]. Περίπου 3-5% όλων των CRCs οφείλονται σε κληρονομήσει γενετικές ανωμαλίες και έως 25% των ασθενών μπορεί να έχουν κάποιο βαθμό familiality για αυτήν την ασθένεια, αλλά η πλειοψηφία των CRCs συμβαίνουν σε ένα σποραδικό τρόπο υπό την απουσία τεκμηριωμένης οικογενειακό ιστορικό. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι εκτός από την γενετική φαινοτύπους αστάθεια όπως χρωμοσωμική και αστάθεια μικροδορυφόρου, επιγενετικές μεταβολές που περιλαμβάνουν μεταβολές της μεθυλίωσης DNA, τροποποιήσεις των ιστονών και μεταβολές στην έκφραση miRNA, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη του CRC [2] – [ ,,,0],4].

σε αντίθεση με γενετικά ελαττώματα, επιγενετικές μεταβολές είναι πιο δυναμική και μπορεί να επηρεαστεί από τη γήρανση, περιβαλλοντικές, τον τρόπο ζωής και διατροφικών παραγόντων, τα οποία πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του πάνω από τα δύο τρίτα όλων των ανθρώπινων καρκίνων [5] – [7]. Η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA αποτελείται από δύο εστιακά

υπερμεθυλίωση

του προαγωγού CpG νησίδων που έχει ως αποτέλεσμα την μεταγραφική αποσιώπηση γονιδίων, και την παγκόσμια

υπομεθυλίωση

του DNA που διευκολύνει χρωμοσωμική αστάθεια και ανευπλοειδία, και είναι ένα από τα πολύ εκτεταμένα επιγενετικό γεγονότα στον καρκίνο [8] – [11]. Επιπλέον, δεδομένου ότι η μεθυλίωση του DNA αλλαγές είναι δυνητικά αναστρέψιμη, και συχνά προηγούνται γενετικά συμβάντα κατά τη διάρκεια πολλαπλών βημάτων του παχέος καρκινογένεση, παρέχουν μια συναρπαστική και πολλά υποσχόμενη ευκαιρία για την πρόληψη και τη θεραπεία [12] του καρκίνου -. [17]

Βάσει αυτής της έννοιας , επιγενετική θεραπεία εξετάζεται επί του παρόντος, με στόχο την πρόληψη των καρκινικών κυττάρων από την απόκτηση παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA και βοηθώντας να αποκατασταθεί η «κανονική» μοτίβα μεθυλίωσης του DNA και την έκφραση του γονιδίου σε κρίσιμα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. Κατά συνέπεια, νουκλεοσιδικά ανάλογα όπως 5-αζακυτιδίνη και 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-CDR) έχουν ταυτοποιηθεί ως ισχυροί αναστολείς DNA μεθυλ τρανσφεράσης (DNMT). Ενσωμάτωση αυτών των αναλόγων νουκλεοσιδών απευθείας στο DNA κατά την αντιγραφή, καθώς και proteosomal αποικοδόμηση του ενζύμου που καταλύει DNMT1

de novo

υπερμεθυλίωση αποτελεί δύο βασικά μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για τις δραστηριότητές τους απομεθυλίωσης [18] – [20]. Υπάρχει μια αυξανόμενη συνειδητοποίηση ότι αντιστροφή προτύπων μεθυλίωσης παρεκκλίνουσα DNA σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι αποτελεσματική για τη θεραπεία και την πρόληψη [21] της. Αρκετά τέτοια ανάλογα νουκλεοσιδίου σήμερα διερευνώνται για τη θεραπεία αιματολογικών κακοηθειών και βρίσκονται σε κλινικές δοκιμές πρώιμου σταδίου για άλλα στερεά κακοήθειες? Δυστυχώς, η ευρεία χρησιμότητα αυτών των παραγόντων έχει παρεμποδιστεί από την τοξικότητα και τις δυσμενείς παρενέργειες. Επιπλέον, η μη-ειδικότητα που επιτρέπει την παγκόσμια υπομεθυλίωση του ακόμη και πλήρως μεθυλιωμένου γονίδια και τα αποτελέσματα σε χρωμοσωμική αστάθεια περιορίζει τη χρήση αυτών των ενώσεων ως πιθανοί παράγοντες προφύλαξης [8], [10]. Σε μια προσπάθεια να αναζητήσουν εναλλακτικές χημειοπροληπτικές στρατηγικές, πολλά φυτοχημικά έχουν αναδειχθεί ως δυνητικά ισχυρή επιλογές λόγω της έλλειψης σημαντικής προφίλ τοξικότητας [22]. Επιπλέον, τα δεδομένα δείχνουν ότι διαταραχές στις διατροφικές θρεπτικά συστατικά, όπως το φυλλικό οξύ και το σελήνιο μπορεί να επηρεάσει μεθυλίωσης του DNA, και τα δύο

in vitro

και

in vivo

, ως αποτέλεσμα της αναστολής της έκφρασης πρωτείνης DNMT1 και ενζυματική δραστηριότητα [23]. Διαιτητικά πολυφαινόλες, όπως (-) – επιγαλλοκατεχίνη-3-gallate (EGCG) από πράσινο τσάι και genistein από σόγια, έχουν επίσης δειχθεί ότι αναστέλλουν δραστικότητα DNMT σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές [24], [25]. ανασταλτική δράση DNMT συνδέεται με απομεθυλίωση και επαναδραστηριοποίηση πολλών μεθυλίωσης-σιωπήσουν γονίδια όπως

p16, RARβ, MGMT, MLH1, BTG3

και

GSTP1

σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή chemopreventive αποτέλεσμα λόγω επιγενετικές τροποποίηση που προκαλούνται από αυτά τα διαιτητικά φυτικών [25], [26]. Ωστόσο, η μεταβλητή αποτελεσματικότητα απομεθυλίωσης των πολυφαινολών παραμένει λίγο κατανοητή επειδή οι περισσότεροι δημοσιευμένες μελέτες έχουν αναφέρει στοιχεία για μόνο χούφτα γονιδίων, και πολλές από αυτές τις επιγενετικές επιδράσεις δεν ήταν αναπαραγώγιμα σε ανεξάρτητες μελέτες [27], [28].

η κουρκουμίνη (diferuloylmethane), μια φυσική ένωση που προέρχεται από την κουρκούμη μπαχαρικών (

Curcuma longa

), έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία διαφόρων φλεγμονωδών νόσων στην παραδοσιακή ινδική και κινεζική συστήματα της ιατρικής. Τις τελευταίες δεκαετίες, μια εκτεταμένη και σε βάθος σώμα δημοσιευμένη επιστημονική βιβλιογραφία έχει αποκαλύψει ότι οι χημειοπροληπτική επιδράσεις της κουρκουμίνης που προκαλούνται από μια ποικιλία μοριακών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης της με διάφορους παράγοντες μεταγραφής, ένζυμα και ρυθμιστικές πρωτεΐνες που παίζουν ένα κεντρικό ρόλο στην βασικές διεργασίες σχετίζονται με τον καρκίνο, όπως φλεγμονή, πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη μετανάστευση, την αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση [22]. Αποδεικτικά στοιχεία για την αποτελεσματικότητα της κουρκουμίνης ως αντικαρκινικό ή χημειοπροληπτικές παράγοντας έχει συνταχθεί από εκατοντάδες μελέτες που έγιναν σε συστήματα κυτταρικής καλλιέργειας, ζωικά μοντέλα και ανθρώπους [29]. Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν αρχίσει να αναγνωρίζουν επίδραση κουρκουμίνη στην διαμόρφωση επιγενετικές διεργασίες σε καρκινικά κύτταρα, στα οποία η κουρκουμίνη έχει δειχθεί ότι είναι ένας ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης (ΗΑΤ) αναστολέα [30], [31], καθώς επίσης και μια πιθανή αναστολέας DNMT1, η οποία οδηγεί σε υπομεθυλίωση διαφόρων γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων RARβ2 σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα [32] – [34]. Ωστόσο, ο ρόλος της κουρκουμίνης ως ένωση υπομεθυλίωσης του DNA δεν έχει αξιολογηθεί συστηματικά από ακόμα, και το δυναμικό απομεθυλίωσης του δεν έχει επιτυχώς αναπαραχθεί στο σύνολό του και σε άλλες μελέτες [32], [33].

Σύμφωνα με , στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη και συστηματική ανάλυση για να διερευνηθεί η επίδραση της κουρκουμίνης στην μεθυλίωσης του DNA στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Γονιδίωμα-ευρύ μεθυλίωσης του DNA αναλύσεων και προφίλ έκφρασης ταυτόχρονη γονιδίου έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες σε κυτταρικές σειρές CRC αντιμετωπίζονται με βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες θεραπεία κουρκουμίνη. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι η κουρκουμίνη διαμορφώνει μεθυλίωσης του DNA μεταβολές στα καρκινικά κύτταρα? Επιπλέον, τέτοιες αλλαγές είναι συχνά ενισχύονται με αντίστοιχες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Τέλος, η παροχή νέων στοιχείων, ότι σε αντίθεση με την παγκόσμια υπομεθυλίωση που επάγεται από 5-αζα-CdR, αλλαγές μεθυλίωσης του DNA σχετίζεται με τη θεραπεία κουρκουμίνη συμβαίνουν μόνο σε ένα υποσύνολο πρωτίστως μερικώς μεθυλιωμένη γονιδίων, και σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC, HCT116 (μικροδορυφόρων ασταθής ή MSI), RKO (CpG νησί φαινοτύπου μεθυλίωσης ή CIMP) και ΗΤ29 (μικροδορυφορικού σταθερό ή MSS ), ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΙΜϋΜ (Invitrogen, Rockville MD) υπό κανονικές συνθήκες με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 5% CO

2 στους 37 ° C. Η αυθεντικότητα κυτταρική γραμμή επιβεβαιώθηκε συχνά από ανάλυση διαφόρων γενετικών και επιγενετικών δεικτών κάθε 6-8 μήνες.

Η κουρκουμίνη Θεραπεία

Η κουρκουμίνη (Sigma-Aldrich, ΜΟ, ΗΠΑ) αποθέματα παρασκευάστηκαν με διάλυσή του σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε 10 mM, και μικρές ποσότητες φυλάχθηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της κουρκουμίνης στην μεθυλίωσης του DNA, και οι τρεις κυτταρικές σειρές CRC εκτέθηκαν σε 7,5-10 μΜ κουρκουμίνη για τη βραχυπρόθεσμη (6 ημέρες? STC) ή μακράς διάρκειας (240 ημέρες? LTC) θεραπεία. Φρέσκο ​​μέσο κουρκουμίνη που περιέχει καλλιέργειας αντικαταστάθηκε κάθε δεύτερη μέρα κατά τη διάρκεια της θεραπείας. κυτταρικές γραμμές ελέγχου χωρίς θεραπεία κουρκουμίνη αναπτύχθηκαν με κάθε σετ των θεραπειών για την ίδια διάρκεια.

5-αζα-CdR και TSA θεραπεία

θεραπεία 5-αζα-CdR διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],35]. Εν συντομία, 5-αζα-CdR διαλύθηκε σε PBS (ρΗ 7.5) στους 5 mM και μικρά δείγματα διατηρήθηκαν κατεψυγμένα στους -20 ° C. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία CRC με 2,5 μΜ 5-αζα-CDR (Sigma-Aldrich, ΜΟ, ΗΠΑ) για 24 ώρες, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες. Τριχοστατίνη Α (TSA) διαλύθηκε σε αιθανόλη σε 0.3 μΜ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν εξίσου και μετά από ολονύκτια ανάπτυξη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TSA για 24 ώρες. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση.

Δοκιμασία ΜΤΤ βιωσιμότητα

Οι επιδράσεις της κουρκουμίνης στη βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκαν σε μια δοκιμασία ΜΤΤ, η οποία βασίζεται 3- (4 , 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) πρόσληψη -2,5-διφαινυλτετραζολίου. Τα κύτταρα (2 χ 10

3 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων 24 ώρες πριν από τη θεραπεία κουρκουμίνη. Μετά από 72 ώρες θεραπείας κουρκουμίνη, διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα επωάστηκαν με SDS Ρυθμιστικό (10%) με 0,01 Μ HCl όλη τη νύκτα και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Ανεξάρτητα πειράματα τρεις φορές εις τριπλούν.

βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

αναλύσεις πολλαπλασιασμός των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της χρωματομετρικής Πολλαπλασιασμού Κυττάρων ELISA, κιτ BrdU (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 χ 10

3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κουρκουμίνη για 72 ώρες. δείκτης πολλαπλασιασμού μετρήθηκε με ενσωμάτωση BrdU ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε 3 ανεξάρτητα πειράματα.

ικανότητα επίστρωσης

Για να δοκιμαστεί για ικανότητα επίστρωσης, τα κύτταρα απλώθηκαν σε μια χαμηλή πυκνότητα σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο θεραπείας που περιγράφεται παραπάνω για 12-16 ημέρες μέχρι τα μεμονωμένα κύτταρα που σχηματίζονται ευδιάκριτη αποικίες. Στη συνέχεια τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη και χρωματίζονται με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Μετά την πλύση, οι πλάκες ξηραίνονται στον αέρα και ελήφθησαν ψηφιακές εικόνες. Ανεξάρτητα πειράματα τρεις φορές εις τριπλούν

DNA Extraction, όξινο θειώδες Τροποποίηση και μεθυλίωση Profiling (Infinium Μεθυλίωση Δοκιμασία)

εκχύλιση DNA πραγματοποιήθηκε με την DNeasy Blood & amp.? kit Tissue (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Γονιδιακού DNA ήταν όξινο θειώδες τροποποιημένο (ΕΖ μεθυλίωσης του DNA Gold Kit, Zymo Έρευνας, παρακαλούμε προσθέστε την πόλη /κράτος) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Για να αναλυθεί η επίδραση της κουρκουμίνης επί μεθυλίωσης του DNA, εκτελέσαμε προφίλ του DNA μεθυλίωση χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μεθυλίωσης Infinium με μικροσυστοιχίες HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, San Diego, CA), τα οποία είναι ικανά συγχρόνως την ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης 27.578 μεμονωμένες θέσεις CpG που καλύπτουν πάνω από 14.000 γονίδια [36]. Ολόκληρο ενίσχυση γονιδιώματος, την επισήμανση, υβριδισμού και σάρωσης διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή κατά τη γονιδιωματική πυρήνα εγκατάσταση στο Dan L. Ντάνκαν Cancer Center, Baylor College of Medicine, Houston, TX. κατάσταση μεθυλίωσης μετρήθηκε ως ο λόγος του σήματος από ένα μεθυλιωμένο καθετήρα σε σχέση με τα δύο μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων σήματα ανιχνευτή. αναλογίες μεθυλίωση εξήχθησαν χρησιμοποιώντας τη μεθυλίωση Modules στην Illumina Στεφάνη Studio ακόλουθες μέσες εξομάλυνση, και η ποσοτική β-τιμή κυμαίνεται από 0 (0% μεθυλίωσης) έως 1 (100% μεθυλίωσης). Η p-τιμή αποκοπής για ανιχνεύσιμα σήματα ανιχνευτή ορίστηκε στο 0,05. Για τις αναλύσεις η μεθυλίωση, μια Δβ αξία των ≥0.1 (10% μεθυλίωσης) ορίστηκε ως σημαντική [37].

Ποσοτικές Αναλύσεις μεθυλίωσης

επικυρωμένα δεδομένα μεθυλίωση μικροσυστοιχιών από ανεξάρτητους μόνο γονίδιο /υποστηρικτής ποσοτικές αναλύσεις μεθυλίωσης. Ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του σχεδιασμού δοκιμασία μεθυλίωσης, χρησιμοποιήσαμε είτε θειώδους Pyrosequencing (σύστημα Pyrosequencing PSQ ΕΣ 96Α, Qiagen, Valencia, CA) ή σε πραγματικό χρόνο με βάση qMSP για ποσοτική μεθυλίωση αναλύσεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37], [38]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται και για τις δύο μεθόδους που προβλέπονται στο συμπληρωματικό πίνακα S1.

γονιδιακής έκφρασης Αναλύσεις μικροσυστοιχιών

Παράλληλα με μεθυλίωση προφίλ, πραγματοποιήσαμε γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών αναλύσεις σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και προηγουμένως καθιερωμένο πρωτόκολλο [39]. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Valencia, CA) και ενισχύθηκαν με τη χρήση κιτ TotalPrep RNA Amplification Illumina του. ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την Agilent 2100 Bioanalyzer. Επισημασμένα cRNA υβριδοποιήθηκε όλη τη νύκτα για Ανθρώπινη HT12 V3 chips, πλύθηκαν, και σαρώνεται σε Illumina BeadStation-500. Illumina του BeadStudio έκδοση 3.1 χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει τιμές έντασης σήματος από τις σαρώσεις, αφαιρούμε το υπόβαθρο, και την κλίμακα κάθε μικροσυστοιχιών προς το διάμεσο μέση ένταση για όλα τα δείγματα (ανα-chip ομαλοποίηση). Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ποσοστιαίων με το Lumi R-πακέτο. Πολλαπλών μεταβολών υπολογίστηκαν σε σχέση με τους αντίστοιχους ελέγχους τους όπως περιγράφεται αλλού [35]. Ανάλυση εφευρετικότητα οδού (IPA, εφευρετικότητα Systems, Inc. CA, USA) διεξήχθη για να αξιολογήσει und κατηγοριοποίηση διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε διάφορα λειτουργικά μονοπάτια.

Στατιστικές Αναλύσεις

αναλύθηκαν όλα τα δεδομένα χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 4.0 (San Diego, CA, USA) στατιστικού λογισμικού. Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-τεστ Student. Διαφορές μεταξύ περισσοτέρων των δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ΑΝΟνΑ επαναλαμβανόμενων μετρήσεων και πολλαπλών συγκρίσεων Bonferroni ως

post hoc

δοκιμή. Δύο όψεων p-τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Η κουρκουμίνη Αναστέλλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό στο CRC Γραμμές κυττάρων

Προηγούμενες μελέτες έχουν παράσχει πολλαπλά επίπεδα των αποδείξεων. για τις αντικαρκινικές επιδράσεις της κουρκουμίνης επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, τη μετανάστευση και εισβολή. Για τον προσδιορισμό των αποτελεσματικών και μη τοξικές συγκεντρώσεις κουρκουμίνη στον πίνακα μας κυτταρικών γραμμών CRC (Σχήμα 1Α) που παρουσιάστηκε για πρώτη φορά δοκιμασίες πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές CRC εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της παρούσας διαιτητικής πολυφαινόλης. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC που αντιπροσωπεύουν διακριτές epigenotypes των ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου: HCT116 (μικροδορυφόρων ασταθής – MSI – κυτταρική σειρά καρκίνου οφείλονται σε βλαστική μετάλλαξη στο

MLH1,

αναντιστοιχία γονίδιο επισκευής), RKO (καρκινικό κύτταρο MSI γραμμής που σχετίζονται με

MLH1

υπερμεθυλίωση προαγωγού στο πλαίσιο του φαινοτύπου CpG νησί μεθυλίωση προαγωγού ή CIMP) και ΗΤ29 (μικροδορυφορικού σταθερές ή MSS, κυτταρική σειρά με μεταλλαγμένο

KRAS-

και

p53

γονίδια) [40]. προσδιορισμοί ΜΤΤ και BrdU διεξήχθησαν μετά από αγωγή είτε με κουρκουμίνη (0-20 μΜ) ή DMSO για 72 ώρες (Εικόνα 1Β & amp? 1C, αντίστοιχα). Ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών σειρών CRC επηρεάστηκε εκθετικά με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ενώ συγκεντρώσεις ≥15 μΜ συσχετίστηκαν με την τοξικότητα, οι μέγιστες συγκεντρώσεις αναστολής κατά προσέγγιση το ήμισυ (IC

50) του 7.5 μΜ για HCT116 και 10 μΜ για ΗΤ29 και RKO υπολογίστηκαν βάσει κατόπιν δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας πραγματοποιήθηκαν επίσης σε μια περίοδο 12-14 ημερών (Σχήμα 1 D), η οποία επιβεβαίωσε περαιτέρω την βέλτιστη δόση των 7,5 μΜ για HCT116, και 10 μΜ για κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και RKO, για τα επόμενα πειράματα μεθυλίωσης του DNA.

(Α) Χημική δομή της κουρκουμίνης: (1

E

, 6

E

) -1,7-δις (4-υδροξυ-3-μεθοξυφαινυλ) -1 , 6-επταδιένιο-3,5-διόνη. (Β) ΜΤΤ και (C) δοκιμασίες BrdU διεξήχθησαν για να καθορίσει την καλύτερη αποτελεσματική υπο-τοξική συγκέντρωση της κουρκουμίνης. κύτταρα CRC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κουρκουμίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις για 72 ώρες (τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν). (D) Οι μακροπρόθεσμες αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν σε μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη για 12 έως 16 ημέρες μέχρι διακριτές αποικίες ήταν ορατές. Εκπρόσωπος εικόνες από ένα πείραμα που απεικονίζει τα αποτελέσματα σχηματισμού αποικιών σε ελέγχους (DMSO αγωγή) και η κουρκουμίνη που έλαβαν HCT116, RKO και ΗΤ29 καρκινικά κύτταρα.

Η

Η κουρκουμίνη Προκαλεί απομεθυλίωση Ειδικών CpG Loci στο CRC κύτταρα

Για να αναλύσουν το γονιδίωμα-ευρεία αλλαγές μεθυλίωσης που σχετίζονται με τη θεραπεία κουρκουμίνη, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχίες Infinium με πάνω από 27.000 CpG θέσεις. Πρώτον, αντιμετωπίζονται RKO (ένα θετικό και άκρως μεθυλιωμένα κυτταρική γραμμή CRC CIMP) με 5-αζα-CDR (ένας αναστολέας DNMT) και TSA (ένας ισχυρός αναστολέας HDAC) ως θετικός και αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, μία μόνο ημέρα της θεραπείας με 2.5 μΜ 5-αζα-CdR οδήγησε σε ευρεία απομεθυλίωση χιλιάδων CpG τόπων σε κύτταρα RKO. Αντίθετα, η θεραπεία TSA είχαν ελάχιστη επίδραση στη απομεθυλίωση τοποθεσιών CpG. Οι μέσες β-τιμές σε κύτταρα RKO μειώθηκε από 0,39 να 0,26 μετά από θεραπεία με 5-αζα-CdR, ενώ καμία αλλαγή στην β-τιμές παρατηρήθηκαν με τη θεραπεία με TSA, επιβεβαιώνοντας έτσι την εξειδίκευση του γονιδιώματος σε επίπεδο απομεθυλίωση των διαφόρων χώρων CpG μετά τη θεραπεία με έναν αναστολέα DNMT σε αυτή την πειραματική συνθήκη.

(Α) για το θετικό έλεγχο της υπομεθυλίωσης, εμείς κατεργασμένα κύτταρα RKO με 2,5 μΜ 5-αζα-CDR. Για τον αρνητικό έλεγχο, RKO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,3 μΜ τριχοστατίνη Α (TSA). (Β) Τρεις κυτταρικές γραμμές CRC από διαφορετικές επιγενετικό φαινότυποι υποβλήθηκαν σε αγωγή με αποτελεσματική αντι-πολλαπλασιαστική συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης (HCT116 7,5 μΜ, RKO και ΗΤ29 10 μΜ) για 6 και 240 ημέρες. Σύντομη θεραπεία σχετίστηκε με λίγες αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA, ενώ η μακροχρόνια θεραπεία με κουρκουμίνη οδήγησε σε εκτεταμένες αλλαγές σε CpG μεθυλίωσης. Για να συγκρίνετε το άμεσο αποτέλεσμα της θεραπείας για την κατάσταση μεθυλίωσης Δβ

(βcontrol-βtreatment) τιμές υπολογίστηκαν αναλόγως για κάθε θέση CpG. Η λευκή γραμμή αντιπροσωπεύει την αύξουσα σειρά των μεθυλίωσης των CpG θέσεις στον έλεγχο /γονικές κυτταρικές σειρές. Τελείες αντιπροσωπεύουν την άμεση σύγκριση των ταιριάζουν CpG loci (& gt? 27.500) σε κατεργασμένα κύτταρα

Η

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της κουρκουμίνης στην μεθυλίωσης του DNA χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικά μοντέλα θεραπείας:. Πρώτον, υιοθετήσαμε μια ευρέως χρησιμοποιούμενη βραχυπρόθεσμη θεραπεία των κυττάρων CRC με κουρκουμίνη σε περίοδο 6 ημερών [24]. Δεύτερον, χρησιμοποιήσαμε μακροχρόνια θεραπεία κουρκουμίνη για 240 ημέρες, ένα μοντέλο που πιθανώς καλύτερα μιμείται τη χρήση της κουρκουμίνης σε χημειοπροφυλακτική ρύθμιση στον άνθρωπο, και ένα που υποτίθεται ότι αντιπροσωπεύουν καλύτερα κουρκουμίνη που προκαλείται από επιγενετικές αλλοιώσεις σε κλώνους κυττάρων που έχουν υποστεί και διατηρείται CpG απομεθυλίωση, δεδομένου χαμηλότερη δραστηριότητα κουρκουμίνη σε σύγκριση με εμπορικά διαθέσιμα αναστολείς DNMT. Για να εξετάσει τα αποτελέσματα της κουρκουμίνης σε CpG μεθυλίωσης (Σχήμα 2Β), θα πραγματοποιηθεί παράλληλα συγκρίσεις μεταξύ βραχυπρόθεσμων και μακροπρόθεσμων κουρκουμίνη αντιμετωπίζονται κυτταρικές σειρές CRC. Πρώτον, κατατάσσονται όλα τα 27.000 CpG θέσεις σε αύξουσα σειρά της μεθυλίωσης με βάση την κατάσταση μεθυλίωσης σε γονικές κυτταρικές σειρές (λευκά στίγματα που εμφανίζονται αθροιστικά ως μια γραμμή στο Σχήμα 2), ενώ οι αντίστοιχες αλλαγές μεθυλίωσης του DNA μετά από τόσο βραχυπρόθεσμα όσο και μακροπρόθεσμα η κουρκουμίνη οι θεραπείες εκπροσωπήθηκαν ως κόκκινο και μπλε κουκκίδες, αντίστοιχα. Οι κάθετες αποστάσεις κάθε τελεία από τις «γραμμή απεικονίζει τα αποτελέσματα από τα κύτταρα ελέγχου» αντιπροσωπεύουν το επίπεδο του είτε υπερ- (πάνω από τη λευκή γραμμή) ή υπο-μεθυλίωση (κάτω από τη λευκή γραμμή). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, βραχυχρόνια θεραπεία κουρκουμίνη σχετίστηκε με σχετικά μικρές αλλαγές μεθυλίωσης σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3, με τις αντίστοιχες μέσες αλλαγές β-αξία ως εξής? 0.389 έναντι 0.393 για HCT116, 0.388 έναντι 0.396 για RKO και 0.294 έναντι 0.291 για ΗΤ29. Σε αντίθεση, η μακροχρόνια θεραπεία κουρκουμίνη σχετίστηκε με πιο έντονες μεταβολές μεθυλίωσης σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2Β), αν και η καθαρή μεταβολή β-τιμή δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό (0,399 για HCT116, 0.398 για RKO και 0.275 για ΗΤ29).

η κουρκουμίνη δεν προκάλεσε παγκόσμια μεθυλίωσης του DNA Αλλαγές

για να αξιολογηθεί η επίδραση της κουρκουμίνης στην παγκόσμια μεθυλίωσης του DNA αλλαγές, θα αναπτυχθεί δύο ανεξάρτητες προσεγγίσεις. Πρώτα, αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του LINE-1 στοιχεία, τα οποία χρησιμεύουν ως υποκατάστατοι δείκτες της παγκόσμιας μεθυλίωσης, χρησιμοποιώντας ποσοτική διθειώδους Pyrosequencing [41]. Βρήκαμε ότι μετά από βραχυπρόθεσμες και μακροχρόνια θεραπεία με επίπεδα μεθυλίωσης κουρκουμίνη LINE-1 ήταν συγκρίσιμες με μη κατεργασμένους μάρτυρες, ενώ εκείνες στις 5-αζα-CdR αγωγή κυτταρικές γραμμές έδειξαν σημαντικές μειώσεις στην LINE-1 μεθυλίωσης (Σχήμα 3Α). Δεύτερον, χρησιμοποιώντας τα στοιχεία array μεθυλίωσης Infinium, έχουμε ορατά τα παγκόσμια πρότυπα πυκνότητα θέσεις CpG χρησιμοποιώντας τα οικόπεδα της πυκνότητας. Όπως ήταν αναμενόμενο, 5-αζα-CdR θεραπεία συνδέθηκε με μια σαφή μετατόπιση της γραμμής πυκνότητα μεθυλίωσης προς την μη μεθυλιωμένη κατάσταση, ενώ υπάρχουν προφανείς αλλαγές στα πρότυπα πυκνότητα παγκόσμια μεθυλίωσης βρέθηκαν σε κυτταρικές σειρές CRC θεραπεία με κουρκουμίνη – μια παρατήρηση που είναι συνεπής με αποτελέσματα μεθυλίωσης μας LINE-1 δείχνει την απουσία των παγκόσμιων αλλαγών μεθυλίωσης προκαλείται από κουρκουμίνη (Εικόνα 3Β).

(Α) HCT116, RKO και ΗΤ29 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5-αζα-CdR και η κουρκουμίνη και LINE-1 μεθυλίωσης κατάσταση προσδιορίστηκε με χρήση θειώδους Pyrosequencing. (Β) Για την εκτίμηση των αλλαγών στην παγκόσμια πρότυπα μεθυλίωσης, οικόπεδα πυκνότητας υπολογίστηκαν για τους ελέγχους, 5-αζα-CdR και η κουρκουμίνη που έλαβαν κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες Infinium παγκόσμια μεθυλίωσης. Ενώ 5-αζα-CdR ήταν υπεύθυνος για μια αλλαγή στην CpG μεθυλίωση προς υπομεθυλίωση, πρότυπο μεθυλίωσης των κυττάρων μετά τη θεραπεία κουρκουμίνη παρέμειναν αμετάβλητες. Συντομογραφίες: 5-αζα-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-CdR), βραχυπρόθεσμα κουρκουμίνη θεραπείας (STC), μακρά θεραπεία με κουρκουμίνη (LTC)

Η

Επικύρωση της κουρκουμίνης που προκαλείται μεθυλίωσης του DNA Αλλαγές στο. CRC κυττάρων γραμμές

Όπως περιγράφεται παραπάνω, η μακροχρόνια έκθεση σε κουρκουμίνη συσχετίστηκε με πιο σημαντικές αλλαγές μεθυλίωσης σε σχέση με τις βραχυπρόθεσμες αντιμετωπίζονται κυτταρικές σειρές CRC. Έτσι, για σκοπούς επικύρωσης, μπορούμε να επικεντρώνει το ενδιαφέρον μας για τις επιπτώσεις της μακροχρόνιας θεραπείας κουρκουμίνη χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές στρατηγικές. Πρώτον, πραγματοποιήσαμε μια ανεξάρτητη ανάλυση μεθυλίωσης μικροσυστοιχιών γονιδιώματος-ευρεία (Infinium®) χρησιμοποιώντας συμφωνημένα ανεξάρτητη όξινο θειώδες τροποποιημένα δείγματα DNA από κυτταρικές σειρές κουρκουμίνη και ελέγχου. Όπως περιγράφεται παραπάνω, μια Δβ-τιμή 0,1 (ίσο με το 10% μεθυλίωσης) χρησιμοποιήθηκε ως όριο αποκοπής για διαφορικά μεθυλιωμένα τόπους. Εικόνα 4Α απεικονίζει τον αριθμό των διαφορικά μετουσιωμένο loci μετά από μακροχρόνια κουρκουμίνη θεραπεία που μοιράστηκαν μεταξύ των δύο συνόλων των μικροσυστοιχιών μεθυλίωσης. Συνολικά βρήκαμε ένα υψηλό βαθμό συσχέτισης μεταξύ των δύο πειραμάτων (HCT116-LTC: R

2 = 0,9669, p & lt? 0,0001? RKO-LTC: R

2 = 0,9508, p & lt? 0,0001? ΗΤ29-LTC: R

2 = 0,9089? p & lt? 0,0001? RKO 5-αζα-CdR: R

2 = 0,9569? p & lt? 0,0001? RKO-TSA: R

2 = 0,9484? p & lt? 0,0001). Κατά συνέπεια, επιβεβαιώνεται ότι η μακροχρόνια θεραπεία κουρκουμίνη συνδέθηκε με μεθυλίωση του DNA αλλαγές σε 1436 θέσεις για HCT116, 814 για RKO και 3051 για ΗΤ29 (Σχήμα 4Α). Δεύτερον, επικυρωμένη επιτυχώς αλλαγές μεθυλίωσης σε διάφορα τυχαία επιλεγμένα loci συμπεριλαμβανομένης

KM-ΗΝ-1, PTPRO, WT1

και

GATA4,

χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία qMSP τόσο η κουρκουμίνη και 5-αζα-CdR αντιμετωπίζονται καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Β). Με την εξαίρεση των UCHL-1 (β-τιμή 0-9), όλα επικυρώνονται τόποι είχαν β-τιμή μεταξύ 0,3-0,8.

(Α) για την επικύρωση των αλλαγών στο DNA μεθυλίωση, τα δείγματα εκ νέου -analyzed με μικροσυστοιχία Infinium χρησιμοποιώντας ανεξάρτητα όξινο θειώδες τροποποιημένου γενωμικού DNA. Ο αριθμός αντιπροσωπεύει τον αριθμό των CpG loci που έδειξε CpG αλλαγές μεθυλίωσης με μια Δβ-τιμή ≥0.1 και στα δύο πειράματα. 5-αζα-CdR και TSA κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι επικύρωσης. (Β) Ποσοτική MSP (qMSP) διεξήχθη για να επικυρώσετε τις αλλαγές μεθυλίωσης σε HCT116. Σχετική μεθυλίωση υπολογίστηκε με ομαλοποίηση της κατάστασης μεθυλίωσης της κουρκουμίνης και 5-αζα-CdR κατεργασμένα κύτταρα με τους ελέγχους. (Γ) Το διάγραμμα Venn δείχνει ότι CpG αλλαγές μεθυλίωσης επικαλύπτονται μεταξύ HCT116, RKO και ΗΤ29 μετά την κατεργασία με κουρκουμίνη.

Η

Η κουρκουμίνη που προκαλείται από μεθυλίωση αλλαγές συμβαίνουν σε γονίδια και Κυτταρική Γραμμή-ειδικό τρόπο

επόμενο ερώτημα κατά πόσον η κουρκουμίνη που προκαλείται DNA αλλαγές μεθυλίωσης που παρατηρήθηκε στα πειράματα μας είναι γονίδιο- ή κυτταρική σειρά ειδικών. Λαμβάνοντας υπόψη τις γενετικές και επιγενετικές διαφορές μεταξύ των διαφόρων CRC κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε σε ένα-προς-ένα συγκρίσεων που όλοι οι 3 κυτταρικές σειρές από κοινού σε ποσοστό έως 30% CpG τόπους που κάποιο βαθμό αλλαγές μεθυλίωσης μετά τη θεραπεία κουρκουμίνη. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι μόνο 68 CpG loci ήσαν υπο-μεθυλιωμένα σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3, υποδηλώνοντας γραμμή-ειδικές διαφορές κυττάρων στη μεθυλίωση του DNA που προκαλείται από κουρκουμίνη (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια, θελήσαμε να δούμε αν η κουρκουμίνη που προκαλείται από μεθυλίωση μεταβολές είναι τυχαίες, ή εάν υπάρχει ένα συγκεκριμένο μοτίβο σε αυτό το επιγενετικής τροποποίησης. Για να απαντήσουμε σε αυτό το ερώτημα και πάλι διοργανώνονται μεθυλίωση αποτελέσματα από όλες τις 27.000 τοποθεσίες CpG σε αύξουσα σειρά, και επικαλύπτονται αυτά τα αποτελέσματα με τη μέση μεταβολή Δβ αξίας στα κύτταρα θεραπεία κουρκουμίνη (Σχήμα 5). Εκτός από τα δύο υπο- και υπερ-μεθυλίωση διαφόρων CpG θέσεων που σχετίζονται με τη θεραπεία κουρκουμίνη, παρατηρήσαμε ένα μοναδικό πρότυπο των αλλαγών μεθυλίωσης κουρκουμίνη επαγόμενη που διέφεραν σαφώς από την 5-αζα-CdR ένα σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, ενώ το 5-αζα-CdR επαγόμενη-υπομεθυλίωση ανιχνεύθηκε καθόλου loci CpG, θεραπεία κουρκουμίνη συνδέθηκε κυρίως με μεταβολές μεθυλίωση σε θέσεις CpG που ήταν μερικώς μεθυλιωμένα, μια παρατήρηση η οποία υποστηρίζει ένα γονίδιο-ειδική απομεθυλίωση δυναμικά μεθυλιωμένο CpG θέσεις που είναι στόχοι της κουρκουμίνης που προκαλείται από επιγενετικής τροποποίησης.

Η επικυρωμένη CpG θέσεις των κυτταρικών σειρών διατάχθηκαν σε αύξουσα σειρά. Ο αριθμός αντιπροσωπεύει το μέγεθος και τη θέση της κουρκουμίνης που πλήττονται από CpG θέσεις σε σχέση με τον έλεγχο των κυτταρικών σειρών. Το γκρι καμπύλη αναπαριστά την κατανομή των τόπων CpG σε αύξουσα σειρά. Οι μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις τιμές Δβ

(βcontrol-βtreatment) ταιριάζουν με τα κύτταρα ελέγχου. Η θεραπεία με κουρκουμίνη συνδέθηκε τόσο με υπερ- και υπομεθυλίωση αλλαγές, κυρίως σε μερικώς μεθυλιωμένες θέσεις CpG, ενώ το 5-azaCdR θεραπεία ήταν υπεύθυνη για τη μη επιλεκτική υπομεθυλίωση.

Η

Η κουρκουμίνη που προκαλείται μεθυλίωσης DNA Αλλοιώσεις συνεργάτης με αντίστοιχες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω την βιολογική σημασία των αλλαγών μεθυλίωσης του DNA που προκαλούνται από κουρκουμίνη, αναλύσαμε τα προφίλ της γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές σειρές CRC πριν και μετά από μακροχρόνια θεραπεία κουρκουμίνη. Για την ανάλυση αυτή, πραγματοποιήσαμε συνακόλουθη ανάλυση μεταξύ των αποτελεσμάτων της μεθυλίωσης του γονιδιώματος-ευρεία και τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Στο παρόν, έχουμε επιλέξει όλες τις CpG θέσεις που είχε μια αλλαγή μεθυλίωσης τουλάχιστον 10% (ή Δβ τιμή ± 0,1) και μια αλλαγή έκφραση τουλάχιστον 1,5 φορές μεταξύ του ελέγχου και των κυττάρων αντιμετωπίζεται η κουρκουμίνη. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια, εντοπίσαμε 235 γονίδια σε HCT116, 108 γονίδια σε RKO και 543 σε ΗΤ29 κύτταρα (Σχήμα 6). Εφευρετικότητα Διαδρομή Αναλύσεων (IPA) αποκάλυψε ότι τα γονίδια με αλλαγές έκφρασης ταυτόχρονη μεθυλίωση του DNA και γονίδιο που εμπλέκεται συχνά σε πολλές σημαντικές κυτταρικές ρυθμιστικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των ναρκωτικών ή του μεταβολισμού των λιπιδίων, μοριακή μεταφορά, τη βιολογία του καρκίνου, κυτταρική σηματοδότηση, φλεγμονώδη αντίδραση και του κυτταρικού κύκλου. Λεπτομερείς κατηγορίες τέτοιων γονιδίων σε κύτταρα HCT116 που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι οι μεταβολές που προκαλούνται από μεθυλίωση κουρκουμίνη έχουν άμεσο αντίκτυπο στην μεταγραφή διαφόρων γονιδίων που συμμετέχουν σε σημαντικές βιολογικές διεργασίες που μπορεί να συμβάλει στην κουρκουμίνη μεσολάβηση αντικαρκινικά