Abstract

Πολυάριθμες μεταβολές στις επιγενετικό μηχανισμοί έχουν περιγραφεί σε διάφορους τύπους όγκων. Σε αναζήτηση νέων βιοδεικτών, μελετήσαμε την έκφραση της Polycomb-ομάδας (PCG) πρωτεΐνες ΕΖΗ2, BMI1 και SUZ12 και συνδέονται τροποποίηση των ιστονών H3K27me3 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Πυρηνική έκφραση πρωτεϊνών PCG και τροποποίηση ιστόνης H3K27me3 ήταν ανοσοϊστοχημικώς (IHC) χρωματίζονται σε μικροσυστοιχία ιστού (ΤΜΑ), συμπεριλαμβανομένων των 247 ιστοί όγκου και 47 φυσιολογικούς ιστούς, και σημείωσε χρησιμοποιώντας το ημι-αυτοματοποιημένο σύστημα Ariol. ιστούς όγκων έδειξαν υψηλότερη έκφραση του ΕΖΗ2 (p = 0.05) και H3K27me3 (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς. Οι αναλύσεις τάση Συνδυασμένη δείκτη έδειξε ότι η αύξηση του αριθμού των σημειωτών που εμφανίζουν υψηλή έκφραση συσχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση. Υψηλή έκφραση και των τεσσάρων δεικτών στη συνδυασμένη δείκτη αναλύσεις συσχετίστηκε με την καλύτερη επιβίωση των ασθενών και τη μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς υποτροπή, με τη συνολική επιβίωση (p = 0.01, HR 0,42 (0,21 – 0,84)), ελεύθερη νόσου επιβίωση (p = 0.007, HR 0,23 (0,08 – 0,67) και της τοπικής υποτροπής επιβίωση χωρίς (p = 0.02, HR 0,30 (0,11 – 0,84)). Συμπερασματικά, βρήκαμε ότι η έκφραση των πρωτεϊνών PCG και H3K27me3 έδειξε προγνωστική αξία στην ομάδα μελέτης μας. Καλύτερα διαστρωμάτωση των ασθενών ελήφθη με συνδυασμό των δεδομένων έκφρασης των βιοδεικτών διερευνηθεί σε σύγκριση με τα επιμέρους δείκτες, υπογραμμίζοντας τη σημασία της διερεύνησης πολλαπλών δεικτών ταυτόχρονα

Παράθεση:. Benard Α, Goossens-Beumer IJ, van Hoesel AQ, .. Horati Η Putter Η Zeestraten ECM, et al (2014) προγνωστική αξία της Polycomb Πρωτεΐνες ΕΖΗ2, BMI1 και SUZ12 και ιστόνης Τροποποίηση H3K27me3 στον καρκίνο του παχέος εντέρου PLoS ONE 9 (9):. e108265 doi: 10.1371 /journal.pone. 0108265

Επιμέλεια: Richard L. Eckert, Πανεπιστήμιο του Maryland School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 του Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 20, Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 22 του Σεπτέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Benard et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

τα Νέα προγνωστική βιοδείκτες δικαιολογημένη στον καρκίνο του παχέος εντέρου, που θα μπορούσαν να βελτιώσουν τις αποφάσεις για την αντιμετώπιση των μεμονωμένων ασθενών εκτός από την τρέχουσα ΤΝΜ (αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον καρκίνο, AJCC [1]) σύστημα σταδιοποίησης , καθώς ακόμη και οι ασθενείς με την ίδια ταξινόμηση ΤΝΜ παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές στην επιβίωση και όγκου υποτροπής των ασθενών [2], [3]. έχουν επιγενετική έχουν ταυτοποιηθεί ως παράγοντες απορυθμισμένη συχνά σε όγκους και είναι ελκυστικοί στόχοι για την έρευνα των βιοδεικτών, λόγω των ρόλων τους στην ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων και δυνητικά αναστρέψιμες φύση τους. Πολυάριθμες αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA, τροποποιήσεις των ιστονών και ένζυμα τροποποίησης τους έχουν περιγραφεί σε διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [4] – [6]. Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώθηκε στην έκφραση του ιστόνης-ένζυμα τροποποίησης του Polycomb-ομάδα (PCG) και συνδέονται τροποποίηση ιστονών τους, trimethylation της λυσίνης 27 επί ιστόνης Η3 (H3K27me3), σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς.

Η PCG πρωτεΐνες δρουν σε μεγάλα σύμπλοκα πολλαπλών πρωτεϊνών, οι λεγόμενες Polycomb κατασταλτικά σύμπλοκα (PRC) 1 και 2 [7]. PCG πρωτεΐνες παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [8], [9], και εμπλέκονται επίσης στην επαγωγή επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [10]. Η ανώμαλη έκφραση αρκετών πρωτεϊνών PCG και οι συσχετίσεις με τα αποτελέσματα των ασθενών έχουν αναφερθεί σε διάφορους καρκίνους. Για παράδειγμα, η έκφραση του BMI1 δαχτυλίδι Polycomb δάχτυλο ογκογονίδιο (BMI1), ένα συστατικό του PRC1 και ένας σημαντικός παράγοντας σε βλαστικά κύτταρα [11], [12], βρέθηκε να συσχετίζεται με τα αποτελέσματα των ασθενών σε διάφορους τύπους καρκίνου [13] – [16]. Enhancer του Zeste ομολόγου 2 (ΕΖΗ2), ένα βασικό πρωτεΐνη στο σύμπλεγμα PRC2, βρέθηκε επίσης να έχουν προγνωστική αξία σε διάφορους τύπους καρκίνου [17] – [20]. SUZ12 Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 υπομονάδας (SUZ12), ένα άλλο βασικό συστατικό του συμπλέγματος PRC2, βρέθηκε να έχει λειτουργίες καρκινογόνο δράση στα διάφορα καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [21] – [23]. Η συνδεδεμένη τροποποίηση ιστόνης H3K27me3 βρέθηκε να εκφράζεται σε υψηλότερα ιστούς όγκων, και να συνδέεται με καλύτερη πρόγνωση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [24] και του καρκίνου του μαστού [19].

Χρήση ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC ) και ημι-αυτοματοποιημένη βαθμολόγηση, μελετήσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών PCG ΕΖΗ2, BMI1 και SUZ12 και συνδέονται ιστόνης τροποποίησή τους H3K27me3 σε μία ομάδα από 247 ΤΝΜ σταδίου I-III ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, σε συσχέτιση με την κλινική έκβαση. Καθώς οι πρωτεΐνες PCG δρουν μαζί στην ίδια τροποποίηση ιστονών, υποθέσαμε ο συνδυασμός και των τεσσάρων δεικτών θα είναι πιο κατατοπιστική σε σχέση με την κλινική έκβαση σε σύγκριση με κάθε ένα από τα επιμέρους δείκτες.

Υλικά και Μέθοδοι

επιλογή των ασθενών

ιστούς όγκων συλλέχθηκαν από μια συνεχόμενη σειρά από 408 ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή του πρωτοπαθούς όγκου τους στο Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Leiden (ΤΕΔΚ) μεταξύ των ετών 1991 και 2001. οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε προεγχειρητική θεραπείας, ο οποίος είχε διμερείς όγκους, ή μια ιστορία του καρκίνου, εκτός από το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα ή

in situ

όγκους, αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις της μελέτης. Επιπλέον, συμπεριλάβαμε μόνο ασθενείς με ιστολογικά αποδεδειγμένο στάδιο TNM ορθοκολικό καρκίνωμα Ι-ΙΙΙ, όπως προσδιορίζεται από έναν έμπειρο παθολόγο. Αυτό οδήγησε σε μια ομάδα μελέτης των 259 ασθενών, με μέση παρακολούθηση 8,6 ετών. Κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένα ήταν διαθέσιμα για όλους τους ασθενείς στην ομάδα μελέτης. Δεδομένα ήταν δεξί λογοκρίνονται όταν οι ασθενείς ήταν ζωντανοί ή χωρίς υποτροπή κατά την τελευταία παρακολούθηση ημερομηνία τους. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Οι πληροφορίες για τα αρχεία των ασθενών ήταν ανώνυμες και de-εντοπίστηκαν πριν από την ανάλυση σύμφωνα με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας ( «Κώδικας για την ορθή Δευτεροβάθμιας χρήση ανθρώπινων ιστών», ολλανδικά Ομοσπονδία Ιατρικών Επιστημονικών Εταιρειών), και εγκρίθηκε από την Ιατρική Επιτροπή Ηθικής του Ιατρικού Κέντρου του Πανεπιστημίου του Leiden (ΤΕΔΚ). Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ (NCI-EORTC) [25].

Η

κατασκευή ιστών μικροσυστοιχιών και ανοσοϊστοχημεία

φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστούς όγκων από κάθε μία από τις ασθενείς στην διαδοχική σειρά των ασθενών με καρκίνο του παχέος (n = 408) συλλέχθηκαν από τα αρχεία παθολογία LUMC και χρησιμοποιούνται για την κατασκευή μιας μικροσειράς ιστού (ΤΜΑ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Τομές 4 μm κόπηκαν από κάθε μπλοκ ΤΜΑ και χρησιμοποιήθηκαν για χρώση IHC. Ιστολογικά φυσιολογικό ορθοκολικό ιστούς, όπως προσδιορίζεται από έναν έμπειρο παθολόγο, από 47 ασθενείς με αντίστοιχη ιστούς όγκων που περιλαμβάνονται σε αυτήν την μελέτη συλλέχθηκαν επίσης και προετοιμάζονται για IHC. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για IHC: αντι-ΕΖΗ2 (612667, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), αντι-BMI1 (ab14389, Abcam, Cambridge, UK), αντι-SUZ12 (ab12073, Abcam) και αντι-H3K27me3 (ab6002, Abcam). Όλα τα αντισώματα έχουν επικυρωθεί για χρήση σε ανοσοϊστοχημεία με στύπωμα Western [27] – [30]. Όλα τα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε προκαθορισμένα βέλτιστα αραιώσεις και IHC διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο IHC [31]. Εν συντομία, η ενδογενής υπεροξειδάση παρεμποδίστηκε με επώαση των τμημάτων σε ένα διάλυμα 0,3% υπεροξειδίου του υδρογόνου (σε PBS) για 20 λεπτά. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των τμημάτων για 10 λεπτά στους 95 ° C σε ένα διάλυμα κιτρικού οξέος (ρΗ 6? ΡΗ χαμηλό στόχο Ανάκτηση Solution, Dako, Glostrup, Denmark) για ΕΖΗ2, ΒΜΙ-1 και H3K27me3 και με θέρμανση των τμημάτων για 10 min στους 95 ° C σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (ρΗ 9? ρΗ Target Ανάκτηση Solution Υψηλή, Dako) για SUZ12. τομές TMA επωάστηκαν με τα αντίστοιχα πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύκτα (16 ώρες). Η χρώση οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα Ανίχνευσης Dako REAL EnVision, υπεροξειδάσης /DAB +, Κουνέλι /ποντίκι (Dako). Οι χρωματισμένες τομές TMA σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 20χ μεγέθυνση σχετικά με το Ariol σύστημα ημι-αυτοματοποιημένο (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Καρκινικών κυττάρων περιοχές (καρκινικούς ιστούς) και επιθήλιο του παχέος εντέρου (σε φυσιολογικούς ιστούς) σημαδεύτηκαν στην οθόνη του υπολογιστή κατά την οπτική επιθεώρηση, ακολουθούμενη από προσεκτική εκπαίδευση του Ariol σύστημα για να προσδιορίσει σωστά θετικά χρωματίζονται και αρνητικών πυρήνων εντός των σημανθέντων περιοχών ιστού, για κάθε μία από οι δείκτες χωριστά. Πυρηνική έκφραση, που ορίζεται ως το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων πυρήνων στην οριοθετημένη περιοχή του κάθε πυρήνα ιστού, στη συνέχεια αξιολογήθηκαν από την Ariol λογισμικού. Αρκετές τυχαία πυρήνες αξιολογήθηκαν για κάθε τμήμα TMA με οπτική επιθεώρηση μετά από την αυτόματη ανάλυση προκειμένου να επαληθεύσει την ορθή ταυτοποίηση των θετικά χρωματισμένων πυρήνων.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα αναλύθηκαν σε συνεννόηση με έναν στατιστικολόγο (HP ) με τη χρήση του SPSS 20.0 για Windows (SPSS Inc, η Chicago, USA). 12 ασθενείς αποκλείστηκαν από τις στατιστικές αναλύσεις, καθώς δεν είναι όλα τα δεδομένα και των τεσσάρων δεικτών ήταν διαθέσιμη για αυτούς τους ασθενείς, με αποτέλεσμα ένα τελικό κοόρτη ασθενών αποτελούνταν από 247 ασθενείς. Καθώς τα ατομικά στοιχεία σήμανσης δεν ήταν κανονικά κατανεμημένες (Shapiro Wilk-test), μη-παραμετρικές Wilcoxon υπογραφεί-rank τεστ εκτελέστηκαν για να εκτιμηθούν οι διαφορές στην πυρηνική έκφραση μεταξύ όγκου και αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς (n = 47) για κάθε ένα από τους δείκτες. υπέγραψε συσχέτισης Spearman rank αναλύει έγιναν για να διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ της πυρηνικής έκφρασης των επιμέρους πρωτεϊνών PCG και τροποποίηση των ιστονών H3K27me3. Cox αναλύσεις τάση αναλογικών κινδύνων έγιναν για μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική επιβίωση αναλύσεις των επιμέρους δεικτών. Συμπαράγοντες που περιλαμβάνονται σε όλες τις πολυμεταβλητών αναλύσεων ηλικία κατά την επέμβαση, το φύλο, ΤΝΜ στάδιο του όγκου (στάδια όγκου Ι-ΙΙΙ), τη θέση του όγκου, το μέγεθος του όγκου, η σταθερότητα μικροδορυφόρων (MSS) κατάσταση. Συμπαράγοντες «όγκου στην παρακολούθηση» και «επικουρική θεραπεία» είχαν εγγραφεί ως εξαρτώμενη από το χρόνο συμπαράγοντες. Η συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως ο χρόνος από τη χειρουργική επέμβαση μέχρι θανάτου (από οποιαδήποτε αιτία). Ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) ορίστηκε ως ο χρόνος από τη χειρουργική επέμβαση μέχρι την εμφάνιση ενός δεύτερου πρωτοπαθή όγκο παχέος εντέρου, τοποπεριοχική υποτροπής ή απομακρυσμένη υποτροπή ή θάνατο από καρκίνο του παχέος εντέρου. Τοπικοπεριοχική υποτροπής επιβίωση χωρίς (LRRFS) ορίστηκε ως ο χρόνος από τη χειρουργική επέμβαση μέχρι την εμφάνιση μίας τοποπεριοχική υποτροπή ή θάνατο από καρκίνο. Distant υποτροπής επιβίωση χωρίς (DRFS) ορίστηκε ως ο χρόνος από τη χειρουργική επέμβαση μέχρι την εμφάνιση ενός μακρινού υποτροπή ή θάνατο από καρκίνο.

Με βάση την ασύμμετρη κατανομή των δεδομένων έκφρασης καθενός από τα επιμέρους δείκτες, η διάμεση έκφραση χρησιμοποιήθηκε για να διαιρεθούν οι ασθενείς σε υψηλή έκφραση (ανωτέρω διάμεσος) και χαμηλή έκφραση (κάτω-διάμεσος) ομάδες. Οι τέσσερις δείκτες στη συνέχεια συνδυάζονται σε μια νέα μεταβλητή, με βάση τον αριθμό των δεικτών που δείχνουν υψηλή πυρηνική έκφραση, με αποτέλεσμα την ακόλουθη ομαδοποίηση: όλα χαμηλή (ομάδα 1), 1 υψηλό (ομάδα 2), 2 υψηλή (ομάδα 3), 3 υψηλή (ομάδα 4) και όλα τα υψηλά (ομάδα 5). Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τους αριθμούς της ομάδας ως κατηγορική μεταβλητή, χρησιμοποιώντας την ομάδα 1 (όλα τα χαμηλά) ως ομάδα αναφοράς. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, αποφασίσαμε να συνδυάσουμε ομάδες ασθενών 2, 3, και 4 σε μία ομάδα ασθενών? όλες οι περαιτέρω στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τρεις ομάδες ασθενών. Εκτός από τις αναλύσεις αναλογικών κινδύνων Cox, αναλύσεις τάσεων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τους αριθμούς ομάδας ως συνεχείς μεταβλητές να αξιολογηθεί η επίδραση των συνδυασμένων δεικτών για την επιβίωση του ασθενούς και επανεμφάνισης του όγκου. Με αποτέλεσμα οι αναλογίες κινδύνου (HR) αντιπροσωπεύουν το HR για κάθε μονάδα αύξησης (αύξηση σε αριθμό ομάδα). Αθροιστικές καμπύλες συχνότητα έγιναν για DFS, LRRFS και DRFS, αντιπροσωπεύοντας ανταγωνιστικών κινδύνων [32]. Καμπύλες Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων ασθενών για το OS. Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις, δύο όψεων p-τιμές ≤0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές, και p-τιμές 0,05 & lt? P≤0.1 θεωρήθηκαν μια τάση

Αποτελέσματα

Η έκφραση σε όγκο. έναντι ζεύγη κανονική του παχέος ιστούς

πυρηνική έκφραση όλων των επιμέρους δεικτών (ΕΖΗ2, BMI1, SUZ12 και H3K27me3) σε ιστούς όγκων σε σχέση με την πυρηνική έκφραση σε ζεύγη κανονική του παχέος ιστούς. Κατά την ανάλυση των διαφορών έκφρασης στην κοόρτη μελέτη στο σύνολό της, μόνο διάμεση έκφραση H3K27me3 και ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ όγκου και φυσιολογικών ιστών (ρ & lt? 0.001 και ρ = 0,05, αντίστοιχα? Σχήμα 1Α). Σε μεμονωμένες όγκους, ωστόσο, όλες οι δείκτες έδειξαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση σε σύγκριση με φυσιολογικά αντίστοιχά τους (Σχήμα 1Β). Επιβίωση αναλύσεις βασίζονται σε παρακάτω- ή παραπάνω διάμεση έκφραση στους φυσιολογικούς ιστούς δεν έδειξε διαφορές στην επιβίωση του ασθενούς ή την υποτροπή του όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) που εμφανίζονται διαφορές στην πυρηνική έκφραση, προσδιορίζεται ως η ποσοστού των θετικά χρωσμένων πυρήνων, μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ιστών (n = 47). Boxplots δείχνουν το διάμεσο και το εύρος της έκφρασης καθενός από τα επιμέρους δεικτών σε κανονική (Ν) και του όγκου (Τ) δείγματα. Τα διάμεσος ποσοστά των θετικών πυρήνων δίνονται για κάθε ένα από τους δείκτες. Ρ-τιμές αντιπροσωπεύουν στατιστικές διαφορές μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων, υπολογίστηκε με Wilcoxon rank test. (Β) Ιστογράμματα δείχνουν τη διαφορά στην έκφραση μεταξύ όγκου και φυσιολογικών ιστών ζεύγη (γ-άξονας) για κάθε ένα από τα επιμέρους ασθενών (χ-άξονας). Οι διαφορές στην έκφραση υπολογίστηκαν ως εξής: έκφραση διαφορά = έκφραση σε ιστό όγκου – έκφραση σε φυσιολογικό ιστό. Αρνητικές τιμές δείχνουν υψηλότερη έκφραση σε φυσιολογικούς ιστούς, οι θετικές τιμές δείχνουν υψηλότερη έκφραση σε ιστούς όγκων.

Η

Ατομική δείκτη αναλύσεις σε ιστούς όγκων

Τα παραδείγματα της αναγνώρισης των θετικών και αρνητικών πυρήνων των κυττάρων του όγκου για κάθε ένα από τα επιμέρους δεικτών από το Ariol συστήματος φαίνεται στο Σχήμα 2. Αναλύσαμε πρώτα εάν η έκφραση της τροποποίησης ιστόνης H3K27me3 συσχετίστηκε με την έκφραση των επιμέρους πρωτεϊνών PCG. Η πυρηνική έκφραση (ποσοστό θετικών πυρήνων) του H3K27me3 πράγματι συσχετίζεται θετικά με την έκφραση του ΕΖΗ2 (ρ & lt? 0.001), BMI1 (ρ & lt? 0.001) και SUZ12 (p = 0.05). Δεν συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης των μεμονωμένων δεικτών και το στάδιο TNM όγκου. Για τις αναλύσεις επιβίωσης, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε χαμηλές και υψηλές ομάδες έκφραση με βάση τη διάμεση τιμή έκφρασης του κάθε ένα από τα επιμέρους δείκτες, όπως δίνεται στο Σχήμα 1Α. Στην επιβίωση αναλύσεις των επιμέρους δεικτών, BMI1 έδειξε ισχυρή συσχετίσεις για την επιβίωση των ασθενών (OS και DFS) και επανεμφάνιση του όγκου (LRRFS και DRFS) και στις δύο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση (Πίνακας 2). ΕΖΗ2 και H3K27me3 έδειξε σημαντικές συσχετίσεις μόνο για DFS. Και για τις τρεις δείκτες (BMI1, ΕΖΗ2 και H3K27me3), υψηλή έκφραση συσχετίστηκε με καλύτερη επιβίωση των ασθενών σε σύγκριση με τους ασθενείς που δείχνουν χαμηλή έκφραση, με ρ-τιμές για DFS ρ = 0.07 (BMI1), ρ = 0.04 (ΕΖΗ2) και p = 0,06 (H3K27me3). SUZ12 δεν έδειξαν διαφορές στην επιβίωση του ασθενούς ή την υποτροπή του όγκου με βάση χαμηλή ή υψηλή έκφραση του δείκτη σε ιστούς όγκων.

Η Ariol επικάλυψη εκπαιδευτής σύστημα εμφανίζει σωστή αναγνώριση των θετικών (υποδεικνύεται από κίτρινες κουκκίδες) και αρνητικό ( μπλε κουκκίδες) πυρήνες σε πυρήνες όγκου. TMA διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας έναν 20χ μεγέθυνση. Εμφανίζεται για όλους τους δείκτες είναι θετικά λεκιασμένα πυρήνες όγκου (

πάνω σειρά

) και αρνητικών πυρήνων όγκου (

κάτω σειρά

). Το Ariol σύστημα εκπαιδεύτηκε για την αναγνώριση των θετικών και αρνητικών κυττάρων για κάθε δείκτη ξεχωριστά.

Η

συνδυασμένη δείκτες

Υποθέσαμε ότι ο συνδυασμός πολλαπλών δεικτών θα οδηγήσει στην καλύτερη διαστρωμάτωση των ασθενών. Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε στατιστικές αναλύσεις σε συνδυασμούς των ενζύμων ιστόνης τροποποιητικά. Αυτές οι αναλύσεις έδειξαν ότι πράγματι το συνδυασμό πολλαπλών δεικτών ως αποτέλεσμα στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων των ασθενών και πιο έντονη αναλογίες κινδύνου, υποδεικνύοντας μία πιο έντονη επίδραση στην επιβίωση των ασθενών. Ο συνδυασμός των ιστονών τροποποιητικά ένζυμα ΕΖΗ2 και BMI1 έδειξαν σημαντικές διαφορές τόσο για την επιβίωση των ασθενών και ελεύθερη υποτροπής επιβίωση, με p = 0,02 (HR = 0,72? 95% CI 0,54 – 0,94) για την DFS και p = 0,012 (HR = 0,71? 95% CI 0,54 – 0,92) για LRRFS στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Συνδυάζοντας ΕΖΗ2 και SUZ12 έδειξαν μια τάση για την DFS στην πολυμεταβλητή ανάλυση, με p = 0,08 (HR = 0,77? 95% CI 0,57 – 1,04). Ο συνδυασμός των BMI1 και SUZ12 έδειξαν σημαντικές διαφορές για την επιβίωση του ασθενούς, με p = 0,02 (HR = 0,76? 95% CI 0,61 – 0,96) για τη συνολική επιβίωση και p = 0,05 (HR = 0,73? 95% CI 0,54 – 1,00).

Επειδή οι τρεις πρωτεΐνες PCG δρουν από κοινού σε συμπλέγματα πολλαπλών πρωτεϊνών για τη ρύθμιση της έκφρασης H3K27me3, υποθέσαμε ότι ο συνδυασμός όλων των δεικτών (BMI1, ΕΖΗ2, SUZ12 και H3K27me3) σε μία μεταβλητή θα οδηγήσει σε ακόμα καλύτερη διαστρωμάτωση των ασθενών. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε πέντε ομάδες με βάση τον αριθμό των δεικτών που δείχνουν υψηλή πυρηνική έκφραση. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα τις ακόλουθες ομάδες ασθενών: όλα τα χαμηλά (ομάδα 1), ένα υψηλό (ομάδα 2), δύο υψηλά (ομάδα 3), τρία υψηλή (ομάδα 4) και όλα τα υψηλά (ομάδα 5). χαρακτηριστικά των ασθενών από τις 5 ομάδες των ασθενών ήταν συμβατά με την ομάδα μελέτης (Πίνακας S1). Πολυμεταβλητή αναλύσεις τάσεων των συνδυασμένων δεικτών, χρησιμοποιώντας τους αριθμούς της ομάδας των ασθενών ως συνεχείς μεταβλητές, έδειξε συνολική αναλογίες κινδύνου από 0,79 έως 0,88 για κάθε επιπλέον δείκτη που δείχνει υψηλό πυρηνική έκφραση σε τόσο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση, που δείχνει καλύτερη επιβίωση των ασθενών και χαμηλότερες πιθανότητες υποτροπής του όγκου για κάθε επιπλέον δείκτη που δείχνει υψηλή έκφραση (Σχήμα 3Α). Όταν οι αριθμοί ομάδα ασθενών είχαν εγγραφεί ως κατηγορικές μεταβλητές, μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε (Εικόνες 3Β και 3C). Γενικώς, αναλογίες κινδύνου για το OS μειώθηκε με την αύξηση αριθμό ομάδας, υποδεικνύοντας μία καλύτερη επιβίωση των ασθενών όταν περισσότεροι δείκτες είχαν υψηλής έκφρασης σε σύγκριση με την «all χαμηλή» ομάδα έκφραση (ομάδα 1). Οι ασθενείς που εμφανίζουν υψηλή έκφραση όλων των δεικτών, το «all υψηλή» ομάδα (ομάδα 5), έδειξε την καλύτερη συνολική επιβίωση (ρ = 0,01, HR = 0,42, 95% CI 0,21 – 0,84) σε σύγκριση με την ομάδα αναφοράς 1, το οποίο έδειξε ότι η συντομότερη επιβίωση. Ομάδες 2, 3 και 4 έδειξαν παρόμοια αναλογίες κινδύνου (Εικόνες 3Β και 3C), η οποία αντικατοπτρίζεται στις καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier που τρέχουν κοντά μεταξύ τους σε σύγκριση με τις καμπύλες επιβίωσης των ομάδων 1 και 5. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να συνδυάσουμε οι τρεις ομάδες ασθενών 2,3 και 4 σε μία ομάδα, που καταλήγουν σε τρεις ομάδες ασθενών (ομάδα 1, οι ομάδες 2-4 και η ομάδα 5). Kaplan-Meier καμπύλες και αθροιστική οικόπεδα συχνότητα εμφάνισης έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών που προκύπτει ομάδες ασθενών για το OS, DFS, LRRFS και μια τάση για DRFS, τα οποία επίσης αντικατοπτρίζεται στα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών (Σχήμα 4). Η καλύτερη επιβίωση των ασθενών και μεγαλύτερες περιόδους χωρίς υποτροπή παρατηρήθηκε για τους ασθενείς που παρουσιάζουν υψηλή έκφραση και των τεσσάρων δεικτών ( «όλα τα υψηλά», ομάδα 5) στα δείγματα των όγκων, με τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών 77% για το OS, 83% για DFS και DRFS, και 86% για LRFS. Ασθενείς σε συνδυασμό ομάδων 2-4 παρουσίασαν μικρότερη OS, DFS και LRFS, με ποσοστά 5-ετή επιβίωση του 67% για το OS και DFS, 69% για LRFS και 72% για DRFS. Οι ασθενείς στην «όλα χαμηλή» ομάδα (ομάδα 1) έδειξαν σημαντικά μικρότερη OS, DFS και LRFS σε σύγκριση με οποιαδήποτε από τις άλλες ομάδες ασθενών, με ποσοστά επιβίωσης 5 ετών 43% για το OS και LRFS, 49% για την DFS και 55% για DRFS. Στο σύνολό τους, τα ποσοστά επιβίωσης 5-ετών ήταν χαμηλότερα όταν περισσότεροι δείκτες έδειξαν χαμηλή έκφραση. Οι αναλογίες κινδύνου τόσο στην μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αντανακλάται επίσης αυτά τα ευρήματα (Πίνακας 3): ομάδα 5 δείχνει τη χαμηλότερη αναλογία κινδύνου σε σύγκριση με την ομάδα αναφοράς 1 (για παράδειγμα, πολυμεταβλητή HR = 0,23 (0,08 έως 0,67) για την DFS). Αυτό δείχνει χαμηλότερο κίνδυνο εκδήλωσης (θάνατος ασθενούς ή τοποπεριοχική επανεμφάνιση του όγκου) για τους ασθενείς στην «όλες τις υψηλής» ομάδα για το OS, DFS και LRFS. Για DRFS, στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μόνο σε μονοδιάστατες αναλύσεις

Οι ομάδες ασθενών έγιναν με βάση τον αριθμό των δεικτών που δείχνουν υψηλή έκφραση:. Όλα χαμηλή (ομάδα 1), ένα υψηλό (ομάδα 2), δύο υψηλής ( ομάδα 3), τρεις υψηλό (ομάδα 4) και όλα τα υψηλά (ομάδα 5). (Α) μονοπαραγοντική και πολυμεταβλητή τάση παλινδρόμησης Cox αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση συνδυασμένων ομάδων δείκτη ως συνεχείς μεταβλητές. Οι αναλογίες κινδύνου ανά μονάδα αύξησης καθεμία από τις ομάδες ασθενών απεικονίσθηκαν (Β) και απαριθμούνται (C) τόσο για την μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική τάση παλινδρόμησης Cox αναλύσεις χρησιμοποιώντας τις συνδυασμένες ομάδες δείκτη ως κατηγορικές μεταβλητές. Οι αριθμοί των ασθενών στις επιμέρους ομάδες ασθενών ήταν: Ομάδα 1 (n = 28), η ομάδα 2 (n = 59), η ομάδα 3 (η = 55), ομάδα 4 (η = 74) και ομάδα 5 (n = 31) .

Η

σε συνδυασμό δείκτη (ΕΖΗ2, BMI1, SUZ12 και H3K27me3) ομάδες έκφρασης χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες ασθενών: ομάδα 1, ομάδες 2-4 και η ομάδα 5. οι αριθμοί των ασθενών στις επιμέρους ομάδες ασθενών ήταν: ομάδα 1 (n = 28), η ομάδα 2 (n = 59), η ομάδα 3 (η = 55), ομάδα 4 (η = 74) και ομάδα 5 (n = 31). Καμπύλες κατά Kaplan-Meier έγιναν για τη συνολική επιβίωση (Α) και αθροιστικές καμπύλες συχνότητα εμφανίζονται για την επιβίωση ελεύθερη νόσου (Β), τοποπεριοχική επιβίωσης χωρίς υποτροπή (C) και μακρινό επιβίωσης χωρίς υποτροπή (D). Τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών που δίνονται για κάθε ομάδα ασθενών. Παρακάτω πίνακες τις καμπύλες δείχνουν οι αριθμοί σε κίνδυνο (#) ανά ομάδα για τα διαφορετικά χρονικά σημεία.

Η

Συζήτηση

Εκτός από τις γονιδιακές μεταλλάξεις, παρεκκλίνουσα πρότυπα έκφρασης των επιγενετικών οι ρυθμιστές έχουν αναγνωριστεί ως ζωτικής σημασίας γεγονότα στην ογκογόνο διαδικασία, με αποτέλεσμα εμφανείς μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση. Αλλαγές στην έκφραση αυτών των επιγενετικών ρυθμιστών περιλαμβάνουν μεθυλοτρανσφεράσες DNA και επακόλουθη αλλαγές στο προφίλ μεθυλίωσης του DNA, και τα ένζυμα ιστόνης τροποποιητικά και προκύπτουσες μεταβολές στο αντίστοιχες τροποποιήσεις των ιστονών τους. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την έκφραση τριών πρωτεϊνών PCG (ΕΖΗ2, BMI1 και SUZ12) και συνδέονται τροποποίηση ιστονών H3K27me3 σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς. Η ανώμαλη έκφραση του καθενός από αυτά τα ένζυμα ιστόνης τροποποίησης, και της τροποποίησης ιστόνης H3K27me3, έχει υποδειχθεί να συμβάλει στην ογκογένεση σε διάφορους τύπους καρκίνου και έχει συσχετιστεί με αποτέλεσμα ασθενή [11] – [24]. Μελέτες σε βιβλιογραφία δείχνουν αντικρουόμενα αποτελέσματα σχετικά με την προγνωστική αξία των πρωτεϊνών ομάδας Polycomb στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Για παράδειγμα, η έκφραση υψηλού ΕΖΗ2 έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε μία σειρά από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο από τον Wang

κ.ά.

. [33], ενώ υψηλή έκφραση ΕΖΗ2 βρέθηκε να σχετίζεται με την καλύτερη ελεύθερη υποτροπής επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (αλλά όχι σε ασθενείς με καρκίνο του ορθού) με Fluge

κ.ά.

. [34]. Επιπλέον, η υψηλή έκφραση του BMI1 βρέθηκε να συσχετίζεται με καλή πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού σε μια μελέτη από Pietersen

κ.ά.

. [35], ενώ η υψηλή BMI1 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε μια μελέτη από Du

et al

. [36]. Σε κοόρτης μελέτη μας, τα δεδομένα επιβίωσης για τις επιμέρους δείκτες έδειξαν ότι η υψηλή έκφραση όλων των δεικτών συσχετίστηκε με καλύτερη επιβίωση των ασθενών και πλέον χωρίς υποτροπή περιόδους, σε σύγκριση με τους ασθενείς που δείχνουν χαμηλή έκφραση. Τα αποτελέσματα που βρέθηκαν σε αυτή τη μελέτη αντιστοιχούν σε προηγούμενα ευρήματα μας ότι η υψηλή έκφραση της H3K27me3 συσχετίστηκε με καλύτερη επιβίωση των ασθενών σε πρωκτικές όγκους [4]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η υψηλή έκφραση της H3K27me3 όντως σχετίζεται με καλύτερη επιβίωση των ασθενών και πλέον χωρίς υποτροπή περιόδους. Όπως δείξαμε ότι η έκφραση των πρωτεϊνών PCG είχε άμεση σχέση με την έκφραση του H3K27me3, περιμέναμε ένα παρόμοιο συσχετισμό της έκφρασης των πρωτεϊνών PCG με την κλινική έκβαση, η οποία επιβεβαιώθηκε πράγματι από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο. Υψηλά επίπεδα H3K27me3, εξαιτίας παρεκκλίνουσα έκφραση των πρωτεϊνών PCG, θα μπορούσε να αποτραπεί η ανώμαλη έκφραση των ογκογονιδίων, η ενεργοποίηση των αλληλουχιών ρετρομεταθετόνιου (όπως LINE-1?) [4], και να οδηγήσει σε άλλες (ΕΡΙ) γονιδιωματικά γεγονότα που προάγουν την επιθετικότητα του όγκου.

Εκτός από τα επιμέρους δείκτες, οι συνδυασμοί των πρωτεϊνών PCG σε συσχέτιση με τα αποτελέσματα των ασθενών έχουν μελετηθεί από διάφορες ερευνητικές ομάδες. Για παράδειγμα, η συν-έκφραση της ΕΖΗ2 και BMI1 αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορους καρκίνους [37] – [39]. Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του ΕΖΗ2 και BMI1 αναφέρθηκαν να έχουν διαφορετικές επιδράσεις στην πρόγνωση των ασθενών σε καρκίνο μαστού [35], και βρέθηκε να έχει καμία προγνωστική αξία σε καρκίνωμα ουροθηλίου της ουροδόχου κύστης [40]. Σε παχέος ομάδα μελέτης του καρκίνου μας, όλοι οι συνδυασμοί των ενζύμων ιστόνης τροποποίησης έδειξε προγνωστική αξία. Προκειμένου να λάβει περισσότερες πληροφορίες σχετικά με επιγενετικό μονοπάτια με τους πιθανούς προγνωστική αξία σε καρκίνο του παχέος εντέρου, πραγματοποιήσαμε πολυμεταβλητή επιβίωση αναλύσεις χρησιμοποιώντας δεδομένα σε συνδυασμό έκφραση πολλών πρωτεϊνών PCG (ΕΖΗ2, BMI1 και SUZ12) και συνδέονται ιστόνης τροποποίησή τους H3K27me3. Συνδυάζοντας τις τρεις πρωτεΐνες PCG και συνδέονται τροποποίηση ιστονών τους είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά καλύτερη διαστρωμάτωση των ομάδων ασθενών σε σύγκριση με τις επιμέρους δείκτες. Σε αναλύσεις συνδυασμένο δείκτη, η καλύτερη επιβίωση των ασθενών και μεγαλύτερες περιόδους χωρίς υποτροπή παρατηρήθηκε για τους ασθενείς που παρουσιάζουν υψηλή έκφραση και των τεσσάρων δεικτών ( «all υψηλή») στα δείγματα των όγκων. Οι ασθενείς στην «όλα χαμηλή» ομάδα έδειξε σημαντικά μικρότερη OS, DFS και LRFS σε σύγκριση με οποιαδήποτε από τις άλλες ομάδες ασθενών. Τα αποτελέσματα του συνδυασμένου δείκτη αναλύσεις υπογραμμίζουν τη συνεργασία αυτών των τριών ενζύμων σε συγκροτήματα PCG, και έτσι παρέχουν μια καλύτερη διαστρωμάτωση του κινδύνου των ασθενών.

Εκτός από τους ρόλους της ΕΖΗ2, BMI1 και SUZ12 στην επιγενετική ρύθμιση της χρωματίνης δομή και την έκφραση του γονιδίου, η άμεση ρύθμιση της λειτουργίας της πρωτεΐνης έχει περιγραφεί για ΕΖΗ2 και BMI1, συμπεριλαμβανομένων φωσφορυλίωση πρωτεϊνών και ουβικιτινίωση. Ένα κυτοσολικό ΕΖΗ2 και SUZ12 σύμπλοκο που περιέχει μεθυλοτρανσφεράση έχει συνδεθεί με ακτίνη πολυμερισμού, μια σημαντική διαδικασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [41]. Μετακινούνται του συμπλόκου που περιέχει ΕΖΗ2 και SUZ12 μεταξύ διαφορετικών κυτταρικών διαμερισμάτων μπορεί να εξηγήσει την ασθενή κυτοσολικό χρώση παρατηρήθηκε για ΕΖΗ2 και SUZ12 εκτός από την ισχυρή πυρηνική χρώση για αυτούς τους δείκτες, σε σύγκριση με την αυστηρή πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε για BMI1. Μια άλλη πρωτεΐνη μη-ιστόνης μεθυλίωση από ΕΖΗ2 είναι καρδιακή μεταγραφικός παράγοντας GATA4. Η μεθυλίωση μειώνει μεταγραφική δραστηριότητα, οδηγώντας σε αναστολή της σωστής καρδιακής ανάπτυξης [42]. Αυτά τα παραδείγματα δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση αυτών των πρωτεϊνών PCG επιρροές βασικές διαδικασίες όπως η γονιδιακή μεταγραφή και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την προώθηση του μετασχηματισμού των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα.

Εν κατακλείδι, δείξαμε ότι συνδυασμένη έκφραση των πρωτεϊνών PCG ΕΖΗ2, BMI1 και SUZ12 και συνδέονται τροποποίηση των ιστονών τους H3K27me3 έχει προγνωστική αξία του παχέος ομάδα μελέτης του καρκίνου μας. έκφραση Συνδυασμένη δείκτης είχε σαν αποτέλεσμα καλύτερη διαστρωμάτωση των ασθενών σε σύγκριση με τα επιμέρους δείκτες και ως εκ τούτου παρέχει περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τους ρόλους αυτών των επιγενετικών πρωτεϊνών και -modifications σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Άλλοι συνδυασμοί των επιγενετικών μηχανισμών θα πρέπει να διερευνηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου να διαλευκάνουν περαιτέρω την υποκείμενη βιολογία σε επιμέρους όγκους. Αυτό θα προωθήσει την αναζήτηση νέων βιολογικών δεικτών που πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κλινικό περιβάλλον, προκειμένου να χαρακτηρίσει καλύτερα τους ασθενείς για θεραπεία.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

χαρακτηριστικά των ασθενών όλων των ομάδων ασθενών που χρησιμοποιούνται σε αναλύσεις συνδυασμένου δείκτη. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται για όλες τις ομάδες ασθενών, όπως χρησιμοποιείται στο συνδυασμένο σήμανσης αναλύσεις. Οι ομάδες των ασθενών παρουσιάζουν συγκρίσιμα χαρακτηριστικά των ασθενών στην πλήρη κοόρτη μελέτη 247 ασθενών (Πίνακας 1). P-τιμές αντιπροσωπεύουν το τεστ Jonckheere-Terpstra χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει εάν τα δείγματα προέρχονται από την ίδια κατανομή. Για τη μεταβλητή «μέγεθος του όγκου», μια μονόδρομη δοκιμή ANOVA πραγματοποιήθηκε για τη δοκιμή για στατιστικές διαφορές μεταξύ των ομάδων ασθενών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0108265.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε CM Janssen για την παροχή μας με τα τμήματα μικροσυστοιχίες ιστού που χρησιμοποιείται για ανοσοϊστοχημεία.