Αφηρημένο

Ιστορικό

miR-630 έχει αναφερθεί ότι είναι ένας διαμορφωτής αρκετών μορφών καρκίνου, αλλά ο μηχανισμός με τον οποίο είναι αυτό επηρεάζει ραδιοαντοχή παραμένει άγνωστη. Έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει τη μοριακή λειτουργία του miR-630 και ρυθμιστικό μηχανισμό της σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (CRC)

Μεθοδολογία

Η υπερέκφραση και την απώλεια-του-λειτουργία αναλύσεις των miR-630. Ήταν πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές γραμμές CRC μετρώντας τα επίπεδα της ανάπτυξης και την απόπτωση μετά ιοντική ακτινοβολία (IR). γονίδια-στόχοι ανιχνεύθηκαν μέσω μιας δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης και κηλίδα Western. προσδιορισμός χρωματίνης ανοσοκαθίζηση διεξήχθη για τον προσδιορισμό του μεταγραφικού παράγοντα που ρυθμίζει miR-630, και ένα πείραμα απομεθυλίωση διεξήχθη επίσης.

Αποτελέσματα

miR-630 έκφρασης βρέθηκε να συσχετίζεται θετικά με ραδιοευαισθησία σε κυτταρικές σειρές CRC (

σ

& lt? 0,05). Μετά τη θεραπεία IR, miR-630 απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα? Ωστόσο, το αντίθετο παρατηρήθηκε όταν miR-630 ήταν μειωτικά (

σ

& lt? 0,05). BCL2L2 και TP53RK ταυτοποιήθηκαν ως γονίδια-στόχους του miR-630, και η λειτουργία του miR-630 βρέθηκε να εξαρτάται από αυτά τα δύο γονίδια (

σ

& lt? 0,05). Επιπλέον, τα στοιχεία έδειξαν ότι η CREB ρυθμίζει το επίπεδο του miR-630, και απομεθυλίωση μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα miR-630 (

σ

& lt? 0,05).

Συμπέρασμα

CREB -miR-630-BCL2L2 και TP53RK περιλαμβάνουν ένα νέο καταρράκτη ρύθμιση ραδιοευαισθησία σε κυτταρικές σειρές CRC σηματοδότησης με την επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης και θανάτου

Παράθεση:. Zhang Υ, Yu J, Liu H, Ma W, Yan L, Γουάνγκ J, et al. (2015) Μυθιστόρημα Επιγενετική CREB-miR-630 Σηματοδοσίας Άξονα Ρυθμίζει ραδιοευαισθησία στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (8): e0133870. doi: 10.1371 /journal.pone.0133870

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: May 25, 2015? Αποδεκτές: 3, Ιουλ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το μεγάλο πρόγραμμα της Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα Guangzhou (Νο 201 300 000 087), Ταμείο Έρευνας της Κοινής Ωφέλειας σε βιομηχανία της υγείας της Εθνικής Υγείας και Οικογενειακού Προγραμματισμού Επιτροπή της Κίνας (No.201402015 και Νο 201502039), Εθνικό Key τεχνολογίας Ε & amp? Α Προγράμματος (Αρ 2013BAI05B05) και Key Κλινική Ειδικότητα Πειθαρχία πρόγραμμα κατασκευής

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει. υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα σχετικά κοινό είδος καρκίνου με υψηλό ρυθμό σε όλο τον κόσμο θνησιμότητας [1, 2]. Αν και προεγχειρητική θεραπεία με χημειοακτινοθεραπεία (CRT) σε συνδυασμό με συμβατική χειρουργική επέμβαση βελτιώνει τον τοπικό έλεγχο του CRC και την επιβίωση, μόνο περίπου 70% των ασθενών ανταποκρίνονται σε CRT [3, 4]. Έτσι, η κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην ιοντική ακτινοβολία (IR) αντίσταση της CRC αποτελεί ένα σημαντικό βήμα για τη δημιουργία περαιτέρω αποτελεσματικές θεραπείες.

Τα microRNAs είναι μικρά (18-25 νουκλεοτίδια) μη-κωδικοποίησης RNA που μπορεί να καταστείλει την έκφραση του mRNA μέσω σύνδεσης με συμπληρωματικές αλληλουχίες τους στο 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTRs) [5, 6]. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι miRNAs παίζουν σημαντικούς ρόλους σε διάφορες βιολογικές διεργασίες [7]. Ορισμένες miRNAs όπως miR-135 και miR-200c έχουν βρεθεί να παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ραδιοαντοχή [8, 9]. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε miR-630 ως νέου ρυθμιστής της επαγόμενης σισπλατίνη μη-μικρού κυττάρου καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικό θάνατο [10]. ανάλυσης μικροσυστοιχιών σε μια κλινική έρευνα επιλέξει μια σειρά από 13 miRNAs, συμπεριλαμβανομένων ΜΙΚ 630, η οποία μπορεί να είναι ειδική πρόβλεψης της CRT έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του ορθού [11]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο miR-630 επιρροές ραδιοαντοχή δεν έχει διασαφηνιστεί μέχρι σήμερα. Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να προσδιορίσει τη λειτουργία των miR-630 στο CRC ραδιοευαισθησία και τις δυνατότητες του ρυθμιστή.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων γραμμές LS174T, SW480, HCT116, SW837, HR8348, και ΗΤ29 αγοράστηκαν από την Τράπεζα κυττάρων του Type Culture Collection (Shanghai City, Κίνα). Όλες αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (HyClone, Logan, Utah, USA) σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή κάτω από 5% CO2.

εκχύλιση miRNA και ποσοτική πραγματικού time PCR (qRT-PCR)

ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Foster City, USA) χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση ολικού RNA από καλλιεργημένα κύτταρα. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα 7500 (Applied Biosystems, Foster City, USA) χρησιμοποιώντας μια όλα-σε-ένα miRNA Reverse Transcription Kit (GeneCopoeia, Inc.) και SYBR Green Ανθρώπινο miRNA Assay Kit (GeneCopoeia, Inc.).

τηλέφωνα ακτινοβολία

η ακτινοβόληση έγινε σε μια ιατρική ακτινοβολίας Siemens Meratron Μ2 σε μία δόση των 3 Gy σε θερμοκρασία δωματίου.

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

στο 96 -Λοιπόν πλάκες, 1 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν για 4 ημέρες. Η μέτρηση κυττάρων kit-8 (CCK-8) (BioTech Keygene) δοκιμασία διεξήχθη για να μετρηθεί ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Briefly10 μι CCK-8 διάλυμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για 2 ώρες. Η απορρόφηση κάθε αυλακιού αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας, ορίζεται σε 450 nm.

Caspase 3/6 δραστηριότητα

δοκιμασία

Caspase 3/6 δραστικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κασπάσης 3 και Κασπάσης 6 κιτ δοκιμασίας ( Abcam, USA). ρυθμιστικό λύση των κυττάρων προστέθηκε σε όγκο 50 μL για να επιτυγχάνεται ανάμιξη 1 × 10

6 κύτταρα και επωάζονται τα κύτταρα σε πάγο για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, DEVD-ρ-ΝΑ υπόστρωμα (ή VEID-ρ-ΝΑ) και προστέθηκε ρυθμιστικό αντίδρασης που περιέχει DTT, και το μίγμα επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. Ακολούθως, τα δείγματα μετρήθηκαν στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβολία, με ή χωρίς 3 Gy IR. Τα κύτταρα βάφονται με Annexin V-FITC (Keygene Biotech) και PI (Keygene Biotech). Η απόπτωση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (BD LSRFortessa)

Dual-λουσιφεράσης δοκιμασία και φορέας κατασκευής

TargetScan (https://www.targetscan.org) και η Μιράντα (http:. //Www .microRNA.org) έχουν χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει πιθανούς στόχους miR-630. Η θέση σύνδεσης BCL2L2 (NM_001199839) είχε προβλεφθεί να βρίσκεται στη θέση 995-1002 ενώ TP53RK (NM_033550.3) είχε προβλεφθεί να βρίσκεται στην θέση 455-462 από την θέση μεταγραφικής έναρξης. A 200 bp μακρύ BCL2L2 και TP53RK τμήμα συντέθηκαν είτε με μετάλλαξη ή άγριου τύπου περιοχή σπόρου και κλωνοποιήθηκε στον φορέα psiCHECK-2 (Applied Biosystems, USA). Πέντε νουκλεοτίδια στην περιοχή σπόρο μεταλλάχθηκαν για να ληφθούν BCL2L2 μεταλλαγμένο και αλληλουχίες TP53RK 3′-UTR. Όλες οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, USA). Κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) διαμολύνθηκαν παροδικά με 20 nmol L miR-630 μιμείται ή ελέγχου /. Στη συνέχεια, διεξήχθησαν συν-διαμόλυνση με BCL2L2 και TP53RK εκφράζουν φορέα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Το Dual-LuciferaseTM σύστημα προσδιορισμού Reporter (Promega, Madison, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση λουσιφεράσης δραστηριότητες

Μεταγραφή παράγοντες (ΤΡ) που ρυθμίζει miR-630 είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας Consite (http:. //asp.ii.uib .Δεν: 8090 /cgi-bin /Consite /Consite), TRANSFAC (https://www.gene-regulation.com/pub/databases.html), και DIANA (http: //diana.imis.athena-innovation. gr /DianaTools /index.php). Ακολουθίες του 1000-bp τμήμα του 5′-UTR του miR-630 με την περιοχή μεταλλαγμένες ή σπόρους άγριου τύπου συντέθηκαν και κλωνοποιήθηκε εντός του pGL3-βασικό φορέα (Applied Biosystems, USA). Πέντε νουκλεοτίδια στην περιοχή σπόρο μεταλλάχθηκαν για να ληφθεί η μεταλλαγμένη αλληλουχία. απόκριση cAMP στοιχείο πρόσδεσης (CREB) αλληλουχία που κωδικοποιεί πρωτεΐνη κλωνοποιήθηκε στο φορέα pcDNA3.1 (Applied Biosystems, USA). Κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) παροδικά επιμολυσμένα με τον μεταλλάκτη ή άγριου τύπου 5′-UTR του miR-630 σπάρθηκαν. Στη συνέχεια, διεξήχθη συν-διαμόλυνση με φορέα CREB που εκφράζουν. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και δοκιμασίες δραστικότητας λουσιφεράσης διεξήχθησαν.

κηλίδος Western

δοκιμασία πρωτείνης Bradford DC (Bio-Rad, USA) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η συγκέντρωση των προϊόντων λύσης πρωτεΐνης. Ακολούθως, 20-40 μα πρωτεΐνης επιλύθηκε σε ένα 12% Bis-Tris πηκτή πολυακρυλαμιδίου, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare, Piscataway, Η.Π.Α.) και αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα. Κηλίδες Protein ανοσοχρωματίστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα σε 4 ° C και για 1 ώρα με δευτεροταγή αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου. Amersham ECL Western Blotting Αντιδραστήρια ανίχνευσης (GE Healthcare) χρησιμοποιήθηκαν για την οπτικοποίηση του σήματος πρωτεΐνη.

Η επεξεργασία των κυττάρων με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης

κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων πλάκες την ημέρα 0, στη συνέχεια 5-αζα-CdR (5-αζα- δεοξυκυτιδίνη, Sigma-Aldrich), το οποίο μπορεί να αναστείλει DNA μεθυλοτρανσφεράση, προστέθηκε στα κύτταρα από την ημέρα 1 έως την ημέρα 3. τα κύτταρα μετά συλλέχθηκαν και η αιθανόλη προστέθηκε σε διορθώσετε τα κύτταρα. Έκφραση του miR-630 αναλύθηκε με qRT-PCR.

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία

δοκιμασία ChIP διεξήχθη στην κυτταρική σειρά CRC SW480. Αντι-CREB αντίσωμα (Abcam, USA) με την EpiSeeker ChIP Kit (Abcam, USA) χρησιμοποιήθηκε όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD), με κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Ο ρυθμός αναστολής λήφθηκε ακολουθώντας τον υπολογισμό: (τιμή απορρόφησης του κανένας IR κυττάρων-τιμή απορρόφησης των κυττάρων IR) /τιμή απορρόφησης του κανένας κυττάρων IR. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων αξιολογήθηκαν μέσω t-test 2-tailed, σε συνδυασμό σπουδαστή. SPSS 20.0 για Windows λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Η στατιστική σημαντικότητα συναχθεί εάν

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης του miR-630 μειώθηκαν στα κύτταρα CRC μετά την ακτινοβόληση

Η αρχική επίπεδα ΜΙΚ 630 και πολλαπλασιαστικές δυνατότητες των σειριακών κυτταρικών σειρών CRC ήταν αποφασισμένοι να εξακριβωθεί αν miR-630 μπορεί να επηρεάσει λειτουργικά ιοντική ακτινοευαισθησία. Η εμφανής ανασταλτικό αποτέλεσμα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά ιοντική ακτινοβολία παρατηρήθηκε σε SW837, LS174T, και τα κύτταρα HR8348, το οποίο έδειξε πολύ υψηλή ενδογενή έκφραση miR-630? Αντίθετα, η ασθενής ποσοστά αναστολής παρατηρήθηκαν σε ΗΤ29, SW480, και τα κύτταρα HCT116, που επέδειξε χαμηλή έκφραση miR-630 (Σχήμα 1Α και 1Β). Σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ miR-630 και ραδιοευαισθησία ανιχνεύθηκε σε όλα τα έξι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν.

(Α και Β) Ενδογενής miR-630 έκφρασης και IR-επαγόμενη ρυθμός αναστολής της σειριακής κυτταρικών σειρών CRC (C) ΜΙΚ μείωση 630 επίπεδο μετά την ακτινοβολία σε σύγκριση με το αρχικό τους επίπεδο. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± τυπική απόκλιση (SD). Αστερίσκος υποδεικνύει στατιστικά σημαντικές αλλαγές: * (Ρ & lt? 0,05), ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

Οι κυτταρικές σειρές SW837 και LS174T, η οποία έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης, στη συνέχεια επελέγησαν για ακτινοβόληση. . Η θεραπεία ακτινοβολίας επαναλήφθηκε τρεις φορές, με κάθε θεραπεία που αποτελείται από 3 Gy IR. Βιώσιμα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν για 5 d μετά από ακτινοβόληση, μετά την οποία εξετάστηκε το επίπεδο έκφρασης miR-630 (Σχήμα 1 C). Μια σημαντική μείωση στα επίπεδα miR-630 βρέθηκε μετά την ακτινοβόληση και στις δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με την αρχική τους επίπεδα.

έκτοπη έκφραση του miR-630 ενισχυμένη ιοντική που προκαλείται από ακτινοβολία κυτταροτοξικότητα σε κυτταρικές σειρές CRC

Για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-630 στην διαμόρφωση CRC ακτινοευαισθησία, miR-630 ήταν υπερεκφράζεται σε ΗΤ29 και κύτταρα SW480 χρησιμοποιώντας miR-630 μιμείται. Στη συνέχεια, miR-630-μορφομετατραπέντα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με 3 Gy IR και υποβλήθηκε σε CCK-8 δοκιμασίας μαζί με την ομάδα ελέγχου. Η επιμόλυνση του miR-630 οδήγησε σε σημαντική αύξηση αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά την έκθεση IR σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Εικόνα 2Α) σε SW480 και κύτταρα ΗΤ29. Caspase 3/6 δραστηριότητες του miR-630-μορφομετατραπέντα κύτταρα και τα κύτταρα ελέγχου μετά από 24 ώρες με ή χωρίς 3 Gy IR μετρήθηκαν επίσης.

(Α) miR-630 σημαντικά αυξημένο ρυθμό παρεμπόδισης IR-επαγώμενη (Β και Γ) miR-630 αυξήθηκε έντονα κασπάσης 3 και κασπάσης 6 δραστηριότητες μετά από έκθεση IR (D και E) miR-630 σημαντικά αυξημένο ρυθμό απόπτωσης μετά από έκθεση IR. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± τυπική απόκλιση (SD). Αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικές αλλαγές:. * (Ρ & lt? 0.05), ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

Η κασπάσης 3/6 δραστηριότητες έντονα αυξήθηκε κατά miR-630 μετά από έκθεση IR σε ΗΤ29 και SW480 κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα NC (Σχ 2Β και 2C), υποδηλώνοντας ένα σημαντικό ρόλο για miR-630 σε IR-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της απόπτωσης. Επιπλέον, ο προσδιορισμός της απόπτωσης που απεικονίζεται ότι miR-630 μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικά αυξημένο ρυθμό απόπτωσης στα δύο κύτταρα μετά την ακτινοβολία (Εικ 2Δ και 2Ε). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-630 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα CRC σε IR με την ενίσχυση IR-επαγόμενη απόπτωση και αναστέλλουν την κυτταρική επιβίωση μετά από IR.

Αναστολή των miR-630 οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία IR σε κυτταρικές σειρές CRC

Μια δοκιμασία απώλεια-του-λειτουργία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα SW837 με τη χρήση αναστολέων miR-630. ρυθμός πολλαπλασιασμού ήταν σημαντικά αυξημένη σε SW837 κύτταρα επιμολυσμένα με το miR-630 αναστολέα σε σύγκριση με τον έλεγχο SW837 κύτταρα κατεργασμένα με IR (Σχήμα 3Α). Αναστολή της miR-630 επίσης μειώθηκε σημαντικά κασπάσης 3/6 δραστηριότητες σε κυτταρικές σειρές SW837 μετά από έκθεση IR (Σχήμα 3Β και 3C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απώλεια του miR-630 λειτουργία μειώνει ραδιοευαισθησία των κυτταρικών σειρών CRC.

(Α) Αναστολή της miR-630 μειώθηκε σημαντικά IR επαγόμενη ρυθμός αναστολής (Β και Γ) Αναστολή miR-630 μειώθηκαν έντονα κασπάσης 3 και κασπάσης 6 δραστηριότητες μετά από έκθεση IR. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± τυπική απόκλιση (SD). Αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικές αλλαγές:. * (Ρ & lt? 0.05), ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

TP53RK και BCL2L2 είναι άμεσοι στόχοι του miR-630

Για να διερευνήσουν οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους miR-630 αυξάνει την κυτταρική ευαισθησία στο IR, πιθανούς στόχους του miR-630 αναζητήθηκαν στις βάσεις δεδομένων βιοπληροφορικής μέσω Target-Scan και Μιράντα. Στο 3′-UTR του TP53RK και BCL2L2, πιθανές θέσεις πρόσδεσης του miR-630 είχαν προβλεφθεί (σχήμα 4Α). Για να επιβεβαιωθεί αν miR-630 στοχεύει άμεσα την 3′-UTR των γονιδίων αυτών, κατασκευάσαμε διπλής λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές που φέρουν 200-bp της μεταλλαγμένης ή άγριου τύπου αλληλουχία 3′-UTR, το οποίο περιείχε την προβλεπόμενη miR-630 θέση αναγνώρισης. Μια διπλή-σύστημα αναφοράς της λουσιφεράσης δοκιμασίας στη συνέχεια υιοθετήθηκε για να προσδιοριστεί αν το miR-630 ρυθμίζει την έκφραση των προβλεπόμενων υποψηφίων σε SW480 και κύτταρα SW837. Κανονικοποιημένη ένταση φθορισμού του ανταποκριτή ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε καρκινικά κύτταρα συν-επιμολυσμένα με miR-630 μιμείται και άγριου τύπου 3′-UTR σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αντιθέτως, καμία σημαντική διαφορά ανιχνεύθηκε μεταξύ της ομάδας ελέγχου και τα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με miR-630 μιμείται και μεταλλαγμένων 3′-UTR (Εικόνα 4Β και 4C).

(Α) προβλεπόμενες θέσεις του miR πρόσδεσης -630 στην 3′-UTRs του TP53RK και BCL2L2 (Β και Γ) Ο φθορισμός μειώθηκε σημαντικά στο ΜΙΚ-630 μιμείται και άγριου τύπου ρεπόρτερ διπλής λουσιφεράσης ομάδα πλασμίδιο-επιμολυσμένα, ενώ δεν έδειξε σημαντική αλλαγή στην ΜΙΚ 630 μιμείται και μεταλλαγμένων επίπεδα έκφρασης διπλής λουσιφεράσης πλασμίδιο-επιμολυσμένα ομάδα (D) TP53RK και πρωτεΐνη BCL2L2 μειώθηκε σε miR-630-μορφομετατραπέντα κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± τυπική απόκλιση (SD). Αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικές αλλαγές: * (P & lt? 0.05), ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

Τα παραπάνω αποτελέσματα ήταν επίσης υποστηρίζεται από αναλύσεις κηλίδας Western.. ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης αποκάλυψε μια απότομη μείωση των TP53RK και BCL2L2 του miR-630-επιμολυσμένα ΗΤ29 και κύτταρα SW480 σε σύγκριση με τα κύτταρα αρνητικού ελέγχου (Σχήμα 4D). Συνολικά, τα στοιχεία έδειξαν ότι το miR-630 μπορεί να συνδεθεί άμεσα με το 3′-UTR της TP53RK και BCL2L2 να καταστείλει την έκφραση του γονιδίου.

Εάν το αποτέλεσμα του miR-630 είναι ειδικά, η επίδραση του miR-630 υπερέκφραση θα πρέπει να καταστέλλεται με συν-έκφραση των πρωτεϊνών TP53RK και BCL2L2. Τα πλασμίδια pcDNA3.1 /TP53RK και pcDNA3.1 /BCL2L2, η οποία μπορεί να ανυψώσει συντομία τα επίπεδα TP53RK και BCL2L2, αντίστοιχα, συν-επιμολύνθηκαν με miR-630 μιμείται σε ΗΤ29 και SW480 κυττάρων. Στη συνέχεια, caspase3 /6 δοκιμασίες δραστικότητας διεξήχθησαν. CCK-8 δοκιμασία έδειξε ότι η συν-έκφραση της πρωτεΐνης TP53RK ή BCL2L2 με miR-630 μιμείται μειώθηκε σημαντικά ο ρυθμός αναστολής μετά IR σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Α). Η αλλαγή caspase3 /6 φορές μετά την ακτινοβόληση σε miR-630-επιμολυσμένα SW480 και κύτταρα LS174T μειώθηκαν σημαντικά μετά την επιμόλυνση του pcDNA3.1 /TP53RK και pcDNA3.1 /BCL2L2 (Σχήμα 5Β και 5Γ).

(Α ) TP53RK ή BCL2L2 πρωτεΐνη προκάλεσε μια σημαντικά μειωμένη IR επαγόμενη ρυθμός αναστολής σε miR-630 διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές. (Β και C) ή TP53RK BCL2L2 πρωτεΐνη μείωσε την πτυχή της κασπάσης 3 και κασπάσης 6 δραστηριότητες μετά την έκθεση σε IR miR-630 διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± τυπική απόκλιση (SD). Αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικές αλλαγές: * (P & lt? 0.05), ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

Κατάσταση τηλέφωνα μεθυλίωσης και ο παράγοντας CREB μεταγραφής ρυθμίζουν miR-630 έκφρασης

μεθυλίωσης του DNA μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση των miRNAs [11, 12]. Σε αυτή τη μελέτη, miR-630 έκφραση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω με κατεργασία με 5-αζα-CDR τον ΗΤ29 και SW480 κύτταρα (Σχ 6Α). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι το DNA μεθυλίωση συσχετίζεται στενά με τις αλλαγές στη miR-630 έκφραση κατά την διάρκεια της εξέλιξης CRC.

(Α) 5-αζα-CdR σημαντικά απορυθμίζεται miR-630 έκφρασης (Β) CREB είχε προβλεφθεί να συνδέονται με τον 5′-UTR του miR-630 γονίδιο ξενιστή ARIH1 (C) CREB κατά την δραστηριότητα της λουσιφεράσης προκαλούμενη από την περιοχή ARIH1 προαγωγού και μετάλλαξης των προβλεπόμενων θέσεων σύνδεσης CREB αντιστραφεί επίδραση της (D) ChIP επιβεβαιώθηκε η δέσμευση του CREB με τον υποκινητή ARIH1. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ξεχωριστών προσδιορισμών ± τυπική απόκλιση (SD). Αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικές αλλαγές:. * (Ρ & lt? 0.05), ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

ARIH1, ένα γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που περιέχει το γονίδιο miR-630 στο εξόνιο του, έχει ένα μεγάλο νησί CpG. Αυτό υποδηλώνει ότι η έκφραση του miR-630 εξαρτάται από την ρύθμιση του γονιδίου ARIH1. Τρία διαφορετικά προγράμματα λογισμικού χρησιμοποιούνται για την πρόβλεψη των TFs ρύθμιση miR-630. Τα δεδομένα μας πρότεινε ότι CREB μπορεί να συνδέεται προς το 5′-UTR του ARIH1 (Σχήμα 6Β). Για να καθοριστεί εάν CREB μπορεί να ρυθμίζει το επίπεδο της miR-630, μελετήσαμε την επίδραση του CREB από τον μεταλλαγμένο και υποστηρικτής ARIH1 άγριου τύπου αλληλουχία που περιέχει προβλεπόμενες θέσεις CREB δέσμευσης. Σε SW480 κύτταρα, βρήκαμε ότι η δραστικότητα λουσιφεράσης CREB επαγόμενη μειώθηκε στην ομάδα στην οποία είχε μεταλλαχθεί η περιοχή ARIH1 υποκινητή (Σχήμα 6C). Επιπλέον, αναλύσεις ChIP επιβεβαίωσε ότι CREB μπορεί να συνδεθεί άμεσα με τον υποκινητή ARIH1 (Σχήμα 6D).

Συζήτηση

Παρά αποδεικτικά στοιχεία που εμπλέκουν miR-630 στον καρκίνο, μόνο λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει τη λειτουργία του σε λεπτομέρεια. miR-630 έχει ταυτοποιηθεί ότι επάγει κυτταρικό θάνατο σε καρκίνο του παγκρέατος και να ρυθμίζουν HER-στόχευση ευαισθησία φαρμάκου σε HER2-υπερεκφράζουν κύτταρα καρκίνου του μαστού αν και IGF-1 R [12, 13]. miR-630 αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων αν και Cdc7 κινάσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [14]. Επιπλέον, η αύξηση της σύλληψης του καρκίνου του προστάτη με gefitinib και luteolin εν μέρει προκαλείται από miR-630 [15]. Ωστόσο, το πρότυπο του ρόλου και της έκφρασης του miR-630 στην ραδιοευαισθησία του CRC δεν έχουν απεικονισθεί μέχρι σήμερα.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο μηχανισμός με τον οποίο το miR-630 ρυθμίζει ραδιοευαισθησία των κυτταρικών σειρών CRC. Πρώτον, ανιχνεύθηκαν έκφραση του miR-630 και ραδιοευαισθησία των έξι κυτταρικών γραμμών CRC. Τα αποτελέσματα έδειξαν θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-630 και ακτινοευαισθησία. Επιπλέον, το επίπεδο miR-630 βρέθηκε να είναι σημαντικά μειωμένη μετά από επανειλημμένες IR, αποκαλύπτοντας ότι miR-630 μπορεί να παίζει ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση ραδιοευαισθησία.

Στη συνέχεια, η πιθανή λειτουργία του miR-630 σε απόκριση IR κυτταρικών σειρών CRC εξερευνήθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-630 σε ΗΤ29 και SW480 κυττάρων αυξήθηκε η απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και του θανάτου

in vitro

. Εξάντληση του miR-630 σε κύτταρα SW837 είχε το αντίθετο αποτέλεσμα. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ενδείξεις ότι το miR-630 προωθεί την ραδιοευαισθησία της CRC.

Ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο το miR-630 διαμορφώνει CRC ακτινοευαισθησία ερευνήθηκε περαιτέρω. miR-630 βρέθηκε να ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του BCL2L2 και TP53RK με άμεση στόχευση 3′-UTRs τους. BCL2L2, που ονομάζεται επίσης BCL-W, ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών Bcl-2. Η υπερέκφραση αυτής της πρωτεΐνης έχει παρατηρηθεί σε αρκετές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων CRC [16, 17]. BCL2L2 προωθεί επίσης την επιβίωση των κυττάρων και μειώνει την απόπτωση υπό αποπτωτικό στρες [18, 19]. TP53RK είναι μία κινάση που περιορίζει την απόπτωση μετά μιτωτική στρες [20]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι miR-630 διαμορφώνει ραδιοευαισθησία μέσω ενός καταρράκτη σηματοδότησης που περιλαμβάνει BCL2L2 και TP53RK.

Πρόσφατα, η E2F1-ρυθμιζόμενη ριβονουκλεάση DROSHA έχει βρεθεί για την προώθηση της βιοσύνθεσης miR-630 σε σισπλατίνη εκτεθειμένα καρκινικών κυττάρων [21] . Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα προσδιορισμού λουσιφεράσης έδειξαν ότι CREB μπορεί να συνδέεται προς το 5′-UTR του ARIH1, η οποία είναι το γονίδιο υποδοχής του miR-630, και τη διαγραφή των θέσεων CREB δέσμευσης μπορεί να καταργήσει αυτή τη λειτουργία. Επιπλέον, προσδιορισμός ChIP απέδειξε ότι CREB μπορεί να δεσμεύεται ειδικά στην περιοχή του υποκινητή του miR-630, υποδηλώνοντας ότι η CREB μπορεί να είναι το TF αρμόδιος για την έναρξη miR-630 έκφρασης. CREB είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύεται με το στοιχείο απόκρισης cAMP αλληλουχίας DNA. CREB διαμεσολαβεί τη μεταγραφή του γονιδίου-στόχου μέσω της ενεργοποίησης του σήματος cAMP [22]. Επιπλέον, CREB είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό, την ανάπτυξη, την επιβίωση, τη διαφοροποίηση και πολλών τύπων κυττάρων [23]. Πρόσφατη έρευνα απέδειξε ότι αυτό το CREB-Ser133 αποτελέσματα φωσφορυλίωσης στην καταστολή των αντι-αποπτωτικών γονιδίων, προκαλώντας έτσι τον κυτταρικό θάνατο [24, 25]. Σε αυτή τη μελέτη, η χαμηλή μεθυλίωση του DNA αυξάνει επίσης σημαντικά miR-630 έκφρασης σε κυτταρικές σειρές CRC.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας δείχνει ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι από CREB σε BCL2L2 και TP53RK. Τα παρόντα αποτελέσματα παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τους μηχανισμούς με τους οποίους TFs και miRNAs ρυθμίζουν καρκινικών κυττάρων ραδιοαντοχή. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν επίσης τη θεραπευτική δυνατότητα αυτών των μορίων στη θεραπεία CRC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 δεδομένων. Πρώτες σύνολο δεδομένων είναι στο «Data.zip», τα αρχικά δεδομένα του πειράματος αυτού μπορούν να ληφθούν από το

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133870.s001

(Τ.Κ.)

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε τον Δρ Λι Λιάνγκ για χειρόγραφο αναθεώρηση.