Αφηρημένο

Rhizoma Παρίδης σαπωνίνες (ΚΔΕ), μια φυσική ένωση που καθαρίζεται από Rhizoma Παρίδης, έχει βρεθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου in vitro και σε ζωικά μοντέλα καρκίνου. Ωστόσο, τα αποτελέσματά της για τον καρκίνο του οισοφάγου παραμένουν ανεξερεύνητα. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθούν οι επιδράσεις του RPS στην ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο αρουραίου καρκίνου του οισοφάγου και του μοριακού μηχανισμού που διέπει τις επιδράσεις. Ένα μοντέλο αρουραίου του καρκίνου του οισοφάγου ιδρύθηκε με υποδόρια ένεση

N

-nitrosomethylbenzylamine (ΝΜΒΑ, 1 mg /kg) για 10 εβδομάδες. RPS (350 mg /kg ή 100 mg /kg) χορηγήθηκε από του στόματος καθετηριασμό μία φορά την ημέρα για 24 εβδομάδες αρχίζοντας την πρώτη ένεση ΝΜΒΑ. RPS μείωσε σημαντικά το μέγεθος και τον αριθμό των όγκων στον οισοφάγο αρουραίων που εκτίθενται σε ΝΜΒΑ και ανέστειλε τη βιωσιμότητα, τη μετανάστευση, και η εισβολή του οισοφάγου καρκινικών κυττάρων EC9706 και KYSE150 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (όλα

P

& lt? 0,01 ). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι κυτταρικού κύκλου που επάγεται RPS απόπτωση και G2 /M σύλληψης στις οισοφάγου καρκινικά κύτταρα. Η έκφραση του κυκλοοξυγενασών-2 (COX-2) και Κυκλίνη D1 σε αρουραίους οισοφάγου ιστούς και τα κύτταρα καρκίνου του οισοφάγου μειώθηκαν επίσης σημαντικά με RPS (όλα

P

& lt? 0,01). Σταθερά, RPS επίσης μείωσε σημαντικά την απελευθέρωση της προσταγλανδίνης Ε2, ένα προς τα κάτω μόριο του COX-2, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0,01). Η μελέτη μας δείχνει ότι RPS αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του οισοφάγου, με την προώθηση της απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου σύλληψη και την αναστολή της οδού της COX-2. RPS μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό παράγοντα για τον καρκίνο του οισοφάγου

Παράθεση:. Γιαν S, Tian S, Kang Ε, Xia Υ, Li C, Chen Q, et al. (2015) Rhizoma Παρίδης σαπωνίνες καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων σε ένα μοντέλο αρουραίων του

Ν

-Nitrosomethylbenzylamine-Induced καρκίνο του οισοφάγου από ανασταλτικός κυκλοοξυγενάσες-2 Διαδρομή. PLoS ONE 10 (7): e0131560. doi: 10.1371 /journal.pone.0131560

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 8 Γενάρη του 2015? Αποδεκτές: 27η Μάη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουλίου, 2015

Copyright: © 2015 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα τα μέσα τα δικαιολογητικά αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. SY υποστηρίχθηκε από το 2010 Tianjin Επιστήμης και Τεχνολογίας σχέδιο έργου της Κίνας (10JCYBJC15100) ZL υποστηρίχθηκε από και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30973383 https://www.nsfc.gov.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του οισοφάγου είναι η έκτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως και ο τέταρτος στην Κίνα [1, 2]. Το 2009, η συχνότητα εμφάνισης της νόσου στην Κίνα ήταν 22,14 /100.000 και έφθασε ακόμη υψηλότερο από 100 /100.000, σε ορισμένους τομείς, όπως Cixian στην επαρχία Hebei [2, 3]. Παρά το γεγονός ότι το ποσοστό θνησιμότητας από καρκίνο του οισοφάγου μειώθηκε κατά τα τελευταία 30 χρόνια οφείλεται στη βελτίωση της οικονομίας και τις αλλαγές του τρόπου ζωής, καρκίνο του οισοφάγου παραμένει διαδεδομένη σε αγροτική περιοχή της Κίνας και στην κινεζική ανδρών [2, 3]. Η χειρουργική επέμβαση είναι η κύρια θεραπεία για τον καρκίνο του οισοφάγου. Πολυτροπικών θεραπεία με εισαγωγική χημειοθεραπεία ή συνδυασμό χημειοραδιοθεραπεία ακολουθείται από χειρουργική επέμβαση έχει επίσης προταθεί για τοπικά προχωρημένο καρκίνο του οισοφάγου [4]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα των ασθενών παραμένουν φτωχοί και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι ακόμη λιγότερο από το 25% [1, 4]. Έτσι, αποτελεσματικές θεραπείες για τον καρκίνο του οισοφάγου έχουν επείγουσα ανάγκη.

Θεραπευτικά οφέλη της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής για τη θεραπεία του καρκίνου έχουν αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο πρόσφατα [5]. Rhizoma Παρίδης σαπωνίνες (RPS), ένα φυσικό προϊόν που καθαρίζεται από το συνήθως χρησιμοποιούμενο παραδοσιακή κινεζική φαρμακευτικό φυτό Rhizoma Παρίδης, έχει δειχθεί ότι αναστέλλει όχι μόνο ηπατική ίνωση και κίρρωση αλλά επίσης καταστέλλουν την ανάπτυξη πολλών τύπων καρκίνου σε ζωικά μοντέλα και καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, των ωοθηκών, του ήπατος, και του καρκίνου του τραχήλου [6-19]. Εκτός από την αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου, RPS μειώνει επίσης σημαντικά την μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων και κυττάρων μελανώματος Β16 [8, 11, 19]. Επιπλέον, Man et al. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η χορήγηση του συνδυασμού με RPS κυκλοφωσφαμίδη, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό παράγοντα, μπορεί να μειώσει την τοξικότητα της κυκλοφωσφαμίδης σε ένα μοντέλο ποντικού για καρκίνο του ήπατος [14]. Xiao et al. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι RPS ανέστειλε αγγειογένεση σε ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος καρκίνου των ωοθηκών [11].

Ο μοριακός μηχανισμός στηρίζεται RPS μεσολάβηση αντικαρκινικές επιδράσεις έχουν επίσης διερευνηθεί εκτενώς. Τα αποτελέσματα από μελέτες σε διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων δείχνουν σταθερά ότι RPS διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα με την ενεργοποίηση τόσο της κασπάσης-εξαρτώμενη και κασπάσης-ανεξάρτητη αποπτωτικών οδών και αναστέλλει τη μετανάστευση και εισβολή καταστέλλοντας την ενζυματική δραστηριότητα και πρωτεΐνη έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (ΜΜΡ ) όπως ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 [6-19]. Ο άνθρωπος et al. χρησιμοποίησαν μια μέθοδο /φασματομετρία μάζας αέριας χρωματογραφίας για να συγκρίνουν το μεταβολικό προφίλ του ποντικών που φέρουν ηπατοκαρκινώματος έναντι υγιών ποντικών, και βρήκαν ότι η χορήγηση RPS αυξημένα επίπεδα λιπιδίων και γλυκερικό αλλά μειωμένα επίπεδα της γλυκόζης στο αίμα των ποντικών με ηπατοκαρκινώματος ενώ ασκείται αντίθετα αποτελέσματα επί αυτών των μεταβολικών υποστρωμάτων σε υγιή ποντίκια, υποδηλώνοντας ότι η ΚΔΕ θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του καρκίνου μπλοκάροντας ενεργειακού εφοδιασμού σε καρκινικά κύτταρα [15].

Αν ΚΔΕ έχει δοκιμαστεί σε πολλούς τύπους καρκίνου, τα αποτελέσματά της για τον καρκίνο του οισοφάγου παραμένουν άγνωστα. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να καλύψει αυτό το κενό γνώσης. Εδώ, εξετάσαμε τις επιδράσεις της ΚΔΕ για την ανάπτυξη καρκίνου σε ένα μοντέλο αρουραίου

Ν

-nitrosomethylbenzylamine που προκαλείται από τον καρκίνο του οισοφάγου και διερευνήθηκε περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό που διέπει τις συνέπειες που χρησιμοποιούν ανθρώπινα καρκίνο του οισοφάγου κυτταρικές σειρές EC9706 και KYSE150.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τη συντήρηση και τα πειράματα σε ζώα είναι σε αυστηρή συμφωνία με την πολιτική της Επιτροπής Θεσμικών ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Nankai Νοσοκομείο . Η IACUC έχει εγκρίνει τη μελέτη αυτή. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των αρουραίων.

Χημικά

Ν-nitrosomethylbenzylamine (ΝΜΒΑ) συντέθηκε στο Tianjin Ινστιτούτο Φαρμακευτικής Έρευνας (Tianjian, Κίνα). Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). ΝΜΒΑ (150 mg) διαλύθηκε σε 10 μL DMSO και στη συνέχεια αραιώνεται με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό (0,9% NaCl) σε συγκέντρωση 0,5 mg /mL για ένεση. Rhizoma ΠΑΡΙΔΗΣ σαπωνίνες (RPS), η οποία επίσης ονομάζεται ως polyphyllin και Chonglou σαπωνίνη, εξήχθη από Rhizoma Παρίδης (αριθμός πρωτοκόλλου: 1.007.017) και διαλύθηκε σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό σε συγκέντρωση 20 mg /mL. Εν συντομία, 50 g Chonglou σκόνης αναμίχθηκε με 400 mL 75% αιθανόλης σε μια φιάλη του ενός λίτρου με στρογγυλό πυθμένα. Το μίγμα επωάστηκε σε υδατόλουτρο 90 ° C για 2 ώρες για την εκχύλιση RPS. Το διάλυμα συλλέχθηκε. Η διαδικασία εκχύλισης επαναλήφθηκε 2 ακόμη φορές με φρέσκα 75% αιθανόλη κάθε φορά. Το διάλυμα από κάθε εκχύλιση ήταν πισίνα μαζί, διηθείται και συμπυκνώνεται αφαιρώντας εντελώς αιθανόλης χρησιμοποιώντας ένα κενό για ταχύτητα εξάτμισης. Το συμπυκνωμένο χωρίς αιθανόλη διάλυμα RPS μεταφέρθηκε σε πιάτο εξάτμιση και τελείως αποξηραμένα σε ισχύ με επώαση του πιάτου εξάτμιση σε λουτρό C νερό 100 °. Η ξηρή δύναμη RPS χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη.

Ζώα

Οι αρσενικοί αρουραίοι F344 (5 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Animal Πείραμα Κέντρο της Ακαδημίας Στρατιωτικής Ιατρικής Επιστήμης (Πεκίνο, Κίνα) . Οι αρουραίοι (5 ανά κλουβί) στεγάστηκαν σε ένα καθαρό δωμάτιο με απεριόριστη πρόσβαση σε τυπική τροφή τρωκτικών και νερό. Οι αρουραίοι κρατήθηκαν σε ένα /σκότους 12 h 12 h φως για 2 εβδομάδες πριν χρησιμοποιηθεί σε πειράματα. Όλοι οι αρουραίοι ζυγίστηκαν δύο φορές την εβδομάδα κατά τη διάρκεια του πειράματος.

μοντέλο αρουραίων του ΝΜΒΑ επαγόμενης καρκίνο του οισοφάγου και RPS χορήγηση

Αρσενικοί αρουραίοι F344 χωρίστηκαν τυχαία στις ακόλουθες 3 ομάδες (η = 10 ανά ομάδα): ομάδα υγιών μαρτύρων στην οποία οι αρουραίοι εγχύθηκαν υποδορίως με φυσιολογικό ορό που περιέχει την ίδια ποσότητα DMSO με εκείνη που χρησιμοποιείται για τους αρουραίους που εκτίθενται σε ΝΜΒΑ? ομάδα ΝΜΒΑ στην οποία οι αρουραίοι εγχύθηκαν υποδορίως με ΝΜΒΑ στο 1 mg /kg? ομάδα ΝΜΒΑ + RPS στην οποία οι αρουραίοι εγχύθηκαν υποδορίως με ΝΜΒΑ στο 1 mg /kg και χορηγούνται από το στόμα με RPS. Ο πειραματικός σχεδιασμός για τη δημιουργία του μοντέλου αρουραίου και χορήγηση RPS απεικονίζονται στο Σχήμα 1. Εν συντομία, οι αρουραίοι σε ΝΜΒΑ και ΝΜΒΑ + RPS ομάδες εγχύθηκαν υποδορίως με 1 mg /kg ΝΜΒΑ 5 φορές την εβδομάδα για 5 εβδομάδες και στη συνέχεια με ένα μειωμένο συχνότητα στο 1 mg /kg ΝΜΒΑ μία φορά την εβδομάδα για άλλες 5 εβδομάδες. Rat σωματικού βάρους καταγράφηκε δύο φορές την εβδομάδα για 14 εβδομάδες. Δύο ποντίκια στην ομάδα ΝΜΒΑ + RPS έχασαν τη ζωή τους κατά την εβδομάδα 10 και την εβδομάδα-15, αντίστοιχα, λόγω της κακώς διαχείριση RPS στον αεραγωγό. Όλα τα άλλα ζώα επιβίωσαν και θυσιάστηκαν στο τέλος των 24 εβδομάδων μέσω χορήγησης του ένυδρη χλωράλη (3 ml /kg). Οισοφάγος αποκόπηκε και εξετάστηκε υπό μικροσκόπιο φωτός. Όγκοι μεγαλύτερο από 1 mm σε διάμετρο μετρήθηκαν. Ο όγκος των βλαβών που υπολογίζεται με τον κανονικό τύπο: όγκος = μήκος Χ πλάτος Χ ύψος Χ 0,52. Μέρος του οισοφάγου ιστών μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμόλης 10% και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για την H & amp? Χρώση Ε, τα υπόλοιπα των ιστών καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για άλλες πείραμα, όπως στύπωμα Western. RPS στα 350 mg /kg ή 100 mg /kg χορηγήθηκε από το στόμα μία φορά ημερησίως καθετηριασμό για 24 εβδομάδες αρχίζοντας από την πρώτη ένεση του ΝΜΒΑ.

A. Μια σχηματική αναπαράσταση του πειραματικού πρωτοκόλλου. Τα κενά βέλη δείχνουν υποδόρια ένεση φυσιολογικού ορού. Τα συμπαγή βέλη δείχνουν υποδόρια ένεση ΝΜΒΑ. Η σκιασμένη περιοχή αντιπροσωπεύει στόματος χορήγηση RPS. B. Ο χημικός τύπος του ΚΔΕ. Το γράμμα «R» δηλώνει ότι οι διαφορετικές λειτουργικές ομάδες μπορεί να είναι σε αυτή τη θέση, με αποτέλεσμα σε διαφορετικούς τύπους ΚΔΕ με διάφορες μοριακές δομές.

Η

Η ιστολογική εξέταση του οισοφάγου

ιστού

Δύο παθολόγους από το Τμήμα Παθολογίας Nankai Νοσοκομείο, οι οποίοι δεν γνώριζαν για τη χορήγηση της θεραπείας, εξέτασε τις οισοφάγου ιστούς και καταμέτρηση του αριθμού των θηλωμάτων και καρκινωμάτων σε κάθε ομάδα.

κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο καρκίνο του οισοφάγου κυττάρων γραμμή EC9706 ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από Tianjin Lung Cancer Institute, Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο Γενικό Νοσοκομείο. κύτταρα EC9706 είχαν αρχικά αγοραστεί από την ATCC (Βιρτζίνια, ΗΠΑ). Η άλλη ανθρώπινη οισοφαγικό καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο κυτταρική σειρά KYSE150 ήταν ένα δώρο από τον Dr. Yutaka Shimada, που ιδρύθηκε αυτό το κυτταρική σειρά στο Τμήμα Χειρουργικής και Χειρουργικής Βασικές Επιστήμες, Πτυχιούχος της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Κιότο, Ιαπωνία [20]. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% FCS (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Thermo Scientific , Rockford, IL, USA) στους 37 ° C σε 5% CO

2.

κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ -2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου] (ΜΤΤ) αναγωγής χρωστικής (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα /100 μL /φρεάτιο που ακολουθείται από επώαση 24 ωρών. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με RPS σε 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 40, ή 60 μg /ml για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, 20 μί ΜΤΤ (5 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες. Τα μέσα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν και οι σκοτεινές μπλε κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 150 μL DMSO. Η απορρόφηση στα 550 nm μετρήθηκε σε αναγνώστη μικροπλακός (Corning Costar, Coming, ΝΥ, USA). Η απορρόφηση υποβάθρου στα 690 nm αφαιρέθηκε από όλες τις αναγνώσεις. Το ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας σε σχέση με τους μάρτυρες χωρίς RPS υπολογίστηκε. Κάθε συγκέντρωση ελέγχθηκε με 6 επαναλήψεις σε κάθε πείραμα, και το πείραμα επαναλήφθηκε ανεξάρτητα τουλάχιστον 3 φορές.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων μέχρι συρροή. Πέντε γρατσουνιές (ένα ανά φρεάτιο) για κάθε συγκέντρωση του RPS στη συνέχεια υποβλήθηκε στο συρρέουσα μονοστιβάδα χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας. Μετά πλύση δύο φορές με PBS, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού με RPS σε 0, 3,25, 7,5, ή 15 μg /mL για EC9706 κύτταρα ή στα 0, 5, 10, ή 20 μg /mL για KYSE150 για 24 ώρες . Τα τραύματα φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα αντίθεσης φάσης ανεστραμμένο μικροσκόπιο και μετρήθηκε το πλάτος της πληγής. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές.

Transwell δοκιμασία εισβολής

προσδιορισμοί κυττάρων εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας transwells 24 φρεατίων (μέγεθος πόρων 8 μm, Corning, ΜΑ, USA) επικαλύφθηκαν με matrigel ( 1 mg /mL, BD Sciences, CA, USA). Τα κύτταρα (5 χ 10

4 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε άνω θαλάμους των φρεατίων σε 200 μλ μέσου χωρίς ορό που περιέχει RPS σε 0, 5, 10, ή 20 μg /mL. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 750 μΙ RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FCS. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια του θαλάμου απομακρύνθηκαν με swaps βαμβάκι και τα κύτταρα από την άλλη πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa. Τα κύτταρα διεισδύσει στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Συνολικά 5 τομείς από κάθε φίλτρου επιλέχθηκαν τυχαία και χρησιμοποιήθηκε ο μέσος αριθμός των κυττάρων από τα 5 πεδία. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές.

Η απόπτωση και κυτταρικό κύκλο ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RPS σε 0, 5, 10, ή 20 μg /mL για 24 ώρες. Τα μέσα στη συνέχεια αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει RPS ή τον έλεγχο του. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες. Για την αξιολόγηση της απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου, μέσα καλλιέργειας συλλέχθηκαν την συγκομιδή επιπλέοντα κύτταρα. Τα προσκολλημένα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με θρυψίνη. Τα αρθεί κύτταρα και τα κύτταρα στα μέσα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (1000 χ g, 5 λεπτά). Τα σφαιρίδια του κυττάρου πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επανα-εναιωρήθηκαν σε 250 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Πέντε μΐ αννεξίνης V-FITC και 10 μL ΡΙ προστέθηκαν στο κυτταρικό εναιώρημα. Κάθε δείγμα στη συνέχεια ήπια αναμίχθηκαν και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε σκοτάδι. Μετά την επώαση, 200 μΙ PBS προστέθηκε σε κάθε δείγμα. Τα δείγματα διηθήθηκαν μέσω φίλτρων 300-mesh και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε ροή BD FACS Calibur κυτταρόμετρο. Η απόπτωση και κυτταρικό κύκλο αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. κύτταρα EC9706 μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με RPS σε 0, 7,5, ή 15 μg /mL για 24 ώρες. KYSE150 κύτταρα επεξεργάστηκαν με RPS σε 0, 10, ή 20 μg /mL για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και κατόπιν υπέστησαν λύση σε RIPA ρυθμιστικό (Wuhan Boster Company, Wuhan, Κίνα) που περιέχει 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο. Οισοφάγου ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 12, 000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα υπερκείμενα και το προϊόν λύσης κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Kang Wei Shi Ji Company, Beijing, Κίνα). Ίσες ποσότητες εκχυλίσματος πρωτεΐνης (30 μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBST (10 mmol /L Tris, ρΗ 8,0, 165 mmol /L NaCl, 0.05% Tween 20). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι αρουραίου β-ακτίνης (Boster Company, Κίνα? Αραίωση 1: 200 σε 1 χ TBST), COX-2 (Cell Signaling Technology, USA? Αραίωση 1: 1000 σε 1 χ TBST), ή CyclinD1 (Cell Signaling Technology, USA? 1: 1000 αραίωση σε 1 χ TBST) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν εκτεταμένα, που ακολουθείται από επώαση με ένα αντι-κουνελιού IgG κατσίκας συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Cell Signaling Technology, USA) σε αραίωση 1: 5000 για 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Σημασμένες πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ένα ενισχυμένο μέθοδο χημειοφωταύγειας (Millipore Corporation, Billerica, USA). Για την ποσοτικοποίηση, οι εντάσεις των σημάτων πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν με Ποσότητα ένα σύστημα (Bio-Rad, Hercules, USA). Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές.

Η προσταγλανδίνη Ε2 (PGE2) ELISA

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων σε ορό -δωρεάν μέσα που περιέχουν RPS σε 0, 5, 10, ή 20 μg /mL για 24 ώρες. Υπερκείμενο κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 12, 000 rpm για 10 λεπτά και συλλέχθηκε το υπερκείμενο. Το επίπεδο της PGE2 στο υπερκείμενο ελεύθερο κυττάρων προσδιορίστηκε με κιτ ELISA σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή (Cusabio, Wuhan, Κίνα). Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) και αναλύθηκαν με τη χρήση του στατιστικού λογισμικού ανάλυσης SPSS11.5. Σύγκριση αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA.

P

τιμές ήταν 2 όψεων και

P

& lt? 0,01 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

RPS ανέστειλε την ανάπτυξη των όγκων του καρκίνου του οισοφάγου σε αρουραίους

ανάπτυξη όγκων Όλα τα 10 ποντίκια επέζησαν 10 εβδομάδων έκθεσης ΝΜΒΑ και ένεση ΝΜΒΑ δραματικά επαγόμενη στον οισοφάγο των αρουραίων. Η επιφάνεια του οισοφάγου στους αρουραίους που εκτίθενται σε ΝΜΒΑ καλύφθηκε με αλλοιώσεις όγκου με διάφορα μεγέθη (Εικόνα 2Α). RPS σε 350mg /kg μείωσε σημαντικά τον αριθμό (3,5 ± 1,58 έναντι 1,4 ± 1,11,

P

& lt? 0,01, Σχήμα 2Α και 2Β) και το μέσο μέγεθος των όγκων (17,71 ± 9,16 mm

3 vs 6.47 ± 5,86 χιλιοστών

3

P

& lt? 0.01, Σχήμα 2Α και 2Γ) στο οισοφάγο. Ιστοπαθολογική εξέταση του οισοφαγικού ιστών αποκάλυψε ότι η έκθεση ΝΜΒΑ οδήγησε σε πλακώδη επιθηλιακά υπερπλασία (Σχήμα 2Α) και τον αριθμό των θηλωμάτων και καρκινωμάτων της ομάδας ΝΜΒΑ ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες της ομάδας ΝΜΒΑ + RPS αν και οι διαφορές μεταξύ των 2 ομάδων δεν ήταν στατιστικώς σημαντικές (Σχήμα 2D). RPS χαμηλή δόση (100 mg /kg) δεν επηρέασε το μέγεθος του όγκου (ομάδα έκθεσης ΝΜΒΑ: 15,0 ± 11,9 χιλιοστά

3 εναντίον ομάδας ΝΜΒΑ + RPS: 17,6 ± 9,9 χιλιοστά

3

P

& gt? 0,05) και ο αριθμός των όγκων (ΝΜΒΑ ομάδα έκθεσης: 3.5 ± 1.0 vs. ομάδα ΝΜΒΑ + RPS: 3.3 ± 1.6,

P

& gt? 0,05) στους αρουραίους που εκτίθενται σε ΝΜΒΑ

Ένα. Οι φωτογραφίες και τα H & amp? Ε χρώση του οισοφάγου ιστούς αρουραίων από υγιή ελέγχου, ΝΜΒΑ, ή ομάδα ΝΜΒΑ + RPS. Αρσενικοί αρουραίοι F344 (η = 10 ανά ομάδα) εγχύθηκαν υποδορίως με αλατούχο διάλυμα που περιέχει DMSO (υγιή ομάδα ελέγχου), ΝΜΒΑ σε 1mg kg (ομάδα ΝΜΒΑ) /, ή ΝΜΒΑ συν στόματος χορήγηση RPS στα 350 mg /kg (ομάδα ΝΜΒΑ + RPS ). Οισοφάγος αποκόπηκε, φωτογραφήθηκε και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Μέρος του οισοφάγου ιστών μονιμοποιήθηκε σε διάλυμα φορμόλης 10% και χρωματίστηκαν με Η &? Ε. B. RPS μείωσε σημαντικά τον αριθμό των όγκων σε οισοφάγου. Όγκοι μεγαλύτερο από 1 χιλιοστό σε διάμετρο μετρήθηκαν, n = 10. Γ RPS μειώθηκε σημαντικά το μέγεθος του όγκου. Ο όγκος των βλαβών που υπολογίζεται με τον κανονικό τύπο: όγκος = μήκος Χ πλάτος Χ ύψος Χ 0.52, n = 10. D. RPS μείωσε τον αριθμό των θηλωμάτων και του καρκινώματος. Δύο παθολόγους, οι οποίοι δεν γνώριζαν για τη χορήγηση της θεραπείας, εξετάστηκε το είδος και τον αριθμό των όγκων. Ο μέσος αριθμός των θηλωμάτων και του καρκινώματος παρουσιάζεται, n = 10. * αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας ΝΜΒΑ vs υγιή ομάδα ελέγχου,

P

& lt? 0.01. # Αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας ΝΜΒΑ + RPS vs ομάδα ΝΜΒΑ,

P

& lt? 0.01.

Η

RPS αναστέλλεται η βιωσιμότητα, τη μετανάστευση και την εισβολή του οισοφάγου καρκινικών κυττάρων

Για να διερευνήσουν το μοριακό μηχανισμό που διέπουν RPS-μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του οισοφάγου, εξετάσαμε για πρώτη φορά τα αποτελέσματα του RPS για τη συμπεριφορά των οισοφαγικών καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία RPS ανέστειλε σημαντικά την βιωσιμότητα, τη μετανάστευση, και η εισβολή του οισοφάγου καρκινικών κυττάρων EC9706 και KYSE150 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3,

P

& lt? 0,01).

ΈΝΑ. RPS ανέστειλε την βιωσιμότητα του οισοφάγου καρκινικών κυττάρων. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RPS σε 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 40, ή 60 μg /mL για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 μι του ΜΤΤ ( 5mg /mL) για 4 ώρες. Η απορρόφηση στα 550 nm μετρήθηκε σε αναγνώστη μικροπλάκας. Το ποσοστό της βιωσιμότητας σε σχέση με τους ελέγχους χωρίς RPS υπολογίστηκε. Κάθε συγκέντρωση ελέγχθηκε με 6 επαναλήψεις σε κάθε πείραμα, η = 3. Β RPS μείωσε την εισβολή του οισοφάγου καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο θάλαμο transwell (5 χ 10

4 /θάλαμος, μέγεθος πόρου 8 μm και επικαλυφθούν με 1 mg /ml matrigel) που περιέχουν μέσα χωρίς ορό με RPS σε 0, 5, 10, ή 20 μg /mL σε ο άνω θάλαμος και μέσο RPMI-1640 + 10% FCS στους κατώτερους θαλάμους για 48 ώρες. Τα κύτταρα διεισδύσει στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. Συνολικά 5 τομείς από κάθε θάλαμο επιλέχθηκαν τυχαία και χρησιμοποιήθηκε ο μέσος αριθμός των κυττάρων από τα 5 πεδία, η = 3. * και # αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά στα 5, 10, και 20 μg /mL του RPS σε σύγκριση με 0 μg /mL του ΚΔΕ στο κελί και KYSE150 κύτταρα EC9706, αντίστοιχα,

P

& lt? 0.01. Γ Εικόνες επούλωση των κυττάρων EC9706, 20 x τραύματος. Δ Εικόνες επούλωση των KYSE150 κυττάρων, 20 x τραύματος. Ε RPS μείωσε την μετανάστευση των κυττάρων EC9706. ΣΤ RPS μείωσε τη μετανάστευση των KYSE150 κυττάρων. Ένα σύνολο 5 γρατζουνιές χρησιμοποιήθηκαν για κάθε συγκέντρωση του RPS. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εντός μέσου χωρίς ορό με RPS σε 0, 3,25, 7,5, ή 15 μg /mL για EC9706 κύτταρα ή στα 0, 5, 10, ή 20 μg /mL για KYSE150 για 24 ώρες. Τα τραύματα φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα αντίθεσης φάσης ανεστραμμένο μικροσκόπιο, και το κλείσιμο ποσοστό χάσμα υπολογίστηκε ως (πλάτος στο 0h -Πλάτος στα 24 n) /πλάτος στο 0h * 100%, η = 3. * αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ RPS σε συγκεκριμένες συγκέντρωση vs 0 μg /mL,

P

& lt? 0.01.

Η

RPS επαγόμενη απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο σύλληψης σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα

RPS-μεσολάβηση αναστολή της βιωσιμότητας, της μετανάστευσης, και την εισβολή πρότεινε ότι ΚΔΕ θα μπορούσε να παρέμβει στις κυτταρικού κύκλου της απόπτωσης και οισοφαγικής καρκινικά κύτταρα. Πράγματι, η ροή μας κυτταρομετρία αποτελέσματα κατέδειξαν ότι RPS σε συγκέντρωση 10 μg /mL ή υψηλότερη αύξησε σημαντικά το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε τόσο EC9706 και KYSE150 κύτταρα (Σχ 4,

P

& lt? 0,01). Σταθερά, RPS στην ίδια συγκέντρωση σημαντικά αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G2 (Σχήμα 5,

P

& lt? 0,01), υποδηλώνοντας ότι η αγωγή RPS επάγουν G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του οισοφάγου. Η αναλογία των κυττάρων EC9706 στη φάση S δεν επηρεάστηκε σημαντικά από την RPS, ενώ RPS μείωσε το ποσοστό των KYSE150 κυττάρων σε φάση S με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι η κυτταρική ανάπτυξη KYSE 150 ανεστάλη με RPS (Σχήμα 5). Επιπλέον, η έκφραση της κυκλίνης D1 στα οισοφάγου καρκινικά κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη με κατεργασία RPS (Σχήμα 6Α). Επίσης εξετάσαμε την έκφραση Κυκλίνη D1 στα οισοφάγου ιστούς των αρουραίων. Σε σύγκριση με υγιή ελέγχου, ΝΜΒΑ έκθεση δραματικά επαγόμενη Κυκλίνη D1 έκφραση στον ιστό οισοφάγου? ενώ η χορήγηση RPS μείωσε σημαντικά το ΝΜΒΑ επαγόμενη υπερ-έκφραση της κυκλίνης D1 (Σχήμα 6Β και 6C,

P

& lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω ότι RPS παρεμβαίνει σε κυτταρικό κύκλο στα οισοφάγου καρκινικά κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RPS σε 0, 5, 10, ή 20 μg /mL για 24 ώρες. Τόσο τα προσκολλημένα κύτταρα και τα επιπλέοντα κύτταρα στα μέσα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 1000 g για 5 λεπτά. Κύτταρα από επωάστηκαν με 5 μL Annexin V-FITC και 10 μL ΡΙ για 15 λεπτά σε σκοτάδι, αραιωμένο σε 200 μL PBS, και αναλύθηκαν σε ροή BD FACS Calibur κυτταρόμετρο. Η απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo, n = 3.

Η

Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση απόπτωση επίσης αναλύθηκαν για κυτταρικό κύκλο με χρήση του λογισμικού FlowJo, η = 3. * και # αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά σε 5, 10, και 20 μg /mL του RPS σε σύγκριση με 0 μg /mL του RPS σε EC9706 κυττάρων και KYSE150 κύτταρα, αντίστοιχα,

P

& lt? 0.01.

Η

Α. RPS μείωσε την έκφραση της COX-2 και κυκλίνη D1 σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα. EC9706 κύτταρα επεξεργάστηκαν με RPS σε 0, 7,5, ή 15 μg /mL για 24 ώρες. KYSE150 κύτταρα επεξεργάστηκαν με RPS σε 0, 10, ή 20 μg /ml για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συγκομιδή και λύθηκαν. εκχυλίσματος πρωτεΐνης (30 μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με κουνελιού αντι αρουραίου β-ακτίνης, COX-2, ή κυκλίνη D1. Εκπρόσωπος εικόνες παρουσιάστηκαν. B. RPS μείωσε την έκφραση της COX-2 και κυκλίνη D1 σε οισοφαγικό ιστούς. Οισοφάγου ιστοί από αρουραίους ομογενοποιούνται και εκχύλισμα πρωτεΐνης (30 μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με αντίσωμα κουνελιού αντι αρουραίου β-ακτίνης, COX-2, ή κυκλίνη D1. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται. Γ Πυκνότητας ανάλυση της δυτικής κηλίδα στο Β Μέσες τιμές των 5 αρουραίων παρουσιάζονται, n = 5. * αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας ΝΜΒΑ vs υγιή ομάδα ελέγχου,

P

& lt? 0.01. # Αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας ΝΜΒΑ + RPS vs ομάδα ΝΜΒΑ,

P

& lt? 0.01. Δ RPS μείωσε την απελευθέρωση της PGE2 από οισοφάγου καρκινικά κύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εντός μέσου χωρίς ορό που περιέχουν 0, 5, 10, ή 20 μg /mL RPS για 24 ώρες. Τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 12, 000 rpm για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Το επίπεδο της PGE2 στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε με κιτ ELISA σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή, η = 3. * και # αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά στα 5, 10, και 20 μg /mL του RPS σε σύγκριση με 0 μg /mL του RPS στο κελί και KYSE150 κύτταρα EC9706, αντίστοιχα,

P

& lt? 0.01.

Η

RPS κατασταλεί έκφραση κυκλοοξυγενασών-2 και προσταγλανδίνης Ε2 απελευθέρωση στα οισοφάγου καρκινικά κύτταρα

COX-2 διαταραχή μονοπάτι έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο στο πεπτικό σύστημα [21]. Έτσι, ελέγξαμε εάν RPS θα μπορούσαν να επηρεάσουν την COX-2 μονοπατιού σε καρκίνο του οισοφάγου. Τα αποτελέσματά μας στύπωμα Western αποδεικνύουν ότι η χορήγηση RPS μείωσε σημαντικά την έκφραση της COX-2 στα κύτταρα καρκίνου του οισοφάγου EC9706 και KYSE150 (Σχήμα 6Α). έκθεση ΝΜΒΑ αυξήθηκε σημαντικά έκφραση της COX-2 στις οισοφάγου ιστούς του αρουραίου, ενώ χορήγηση RPS μειώθηκε σημαντικά ΝΜΒΑ μεσολάβηση της COX-2 υπερέκφραση (Σχήμα 6Β και 6C,

P

& lt? 0,01). Σταθερά, η απελευθέρωση της PGE2, κατάντη μόριο του COX-2, επίσης κάτω-ρυθμίζονται από RPS με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στα καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα (Σχ 6D,

P

& lt? 0,01). Όλα τα αρχικά δεδομένα που εμφανίζονται στον Πίνακα S1.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ΚΔΕ σημαντικά κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο αρουραίου ΝΜΒΑ που προκαλείται από καρκίνο του οισοφάγου και ανέστειλε τη βιωσιμότητα, τη μετανάστευση , και εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του οισοφάγου EC9706 και KYSE150. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα ευρήματα σε άλλους τύπους καρκίνου, υποστηρίζοντας περαιτέρω τις αντικαρκινικές επιδράσεις του ΚΔΕ [6-19]. Η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι RPS επαγόμενη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του οισοφάγου. RPS έχει βρεθεί να ρυθμίζουν την έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως δραστική κασπάση-3, δραστική κασπάση-9, και Bax στα καρκινικά κύτταρα μη μικρού κυττάρου πνεύμονα, ξενομοσχεύματα ηπάτωμα, τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, και των κυττάρων Hela, υποδεικνύοντας ότι RPS επάγουν απόπτωση με μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι [7, 12, 13, 17, 18].

Εκτός από την επαγωγή της απόπτωσης, βρήκαμε επίσης RPS προκαλείται G2 του κυτταρικού κύκλου /M συλλήψεως οισοφάγου καρκινικά κύτταρα. Σταθερά, Xiao et al. ανέφεραν ότι RPS προωθούνται δραματική G2 /M φάση σύλληψης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 [13], και Jiang et al. απέδειξε ότι η επαγόμενη RPS G2 /M σύλληψης σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [7]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε περαιτέρω την έκφραση της κυκλίνης D1, μια πρωτεΐνη που παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρικό κύκλο, και βρήκαμε ότι η έκθεση ΝΜΒΑ διέγειρε αξιοσημείωτα έκφραση κυκλίνης ϋ1 οισοφαγικό ιστό αρουραίου και RPS μείωσε σημαντικά την υπερ-έκφραση της κυκλίνης ϋ1 τόσο οισοφάγου ιστών και καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν περαιτέρω ότι RPS αναστέλλει ανάπτυξη όγκου με επαγωγή της απόπτωσης και την προώθηση του κυτταρικού κύκλου G2 /M σύλληψης σε καρκινικά κύτταρα.

Ο ρόλος της COX-2 μονοπατιού στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου είναι γνωστή. Υπερ-έκφραση της COX-2 και οι προσταγλανδίνες συνδέονται με την ανάπτυξη των διαφόρων τύπων καρκίνου, και τα επίπεδα έκφρασής τους αντιπροσωπεύουν την επιθετικότητα της εξέλιξης του καρκίνου [21]. Στην ανθρώπινη καρκίνο του οισοφάγου, με την ένδειξη υπερ-έκφραση της COX-2 έχει παρατηρηθεί σε οισοφαγικό πλακώδες επιθήλιο αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς [22]. Ο ρόλος της COX-2 μονοπατιού σε καρκίνο του οισοφάγου υποστηρίζεται επίσης από επιδημιολογικές και προκλινικές μελέτες που αποδεικνύουν ότι οι αναστολείς COX-2 μειώνουν τον κίνδυνο καρκίνου του οισοφάγου [23]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι ΝΜΒΑ διεγείρεται δραματικά την έκφραση της COX-2 στο οισοφαγικό ιστό των αρουραίων και RPS μείωσε σημαντικά την ΝΜΒΑ μεσολάβηση της COX-2 υπερ-έκφραση. RPS επίσης μείωσε σημαντικά την COX-2 έκφρασης και την απελευθέρωση PGE2 από καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα EC9706 και KYSE150. Έτσι, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι RPS μπορεί να είναι ένα αναστολέας της COX-2.

Αν και αυξανόμενος αριθμός μελετών σε κύτταρα γραμμές και ζωικό μοντέλο των διαφόρων τύπων καρκίνου καταδεικνύουν σαφώς την αντι-καρκίνου και άλλες ευεργετικές επιδράσεις του RPS τέτοιων η μείωση της τοξικότητας των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, δεν θα πρέπει να αγνοηθεί η επίδραση της τοξικότητας και νευροφαρμακολογική πλευρά του RPS. Liu et al. ανέφερε ότι μια εφάπαξ από του στόματος χορήγηση ΚΔΕ ασκείται αρνητικές επιπτώσεις στη γενική συμπεριφορά και τη θνησιμότητα σε ποντίκια με μια

LD

50

αξία των 2182,4 mg /kg σε ποντίκια [24]. Επιπλέον, έδειξε επίσης ότι RPS στις συγκεντρώσεις των 100, 250, και 500 mg /kg κατέστειλε σημαντικά τη γαστρική κένωση, αλλά δεν επηρέασε την εντερική διέλευση σε ποντικούς [24]. Η

LD

50 αξία των ΚΔΕ για τους αρουραίους είναι ακόμα άγνωστη. Η δόση των 350 mg /kg ΚΔΕ σε αυτή τη μελέτη, η οποία είναι 16% του

LD

50 αξία για τα ποντίκια, φάνηκε να είναι ασφαλές για τους αρουραίους. Εκτός από το ότι 2 αρουραίοι στην ομάδα ΝΜΒΑ + RPS πέθανε λόγω χορήγηση κακώς RPS μέσα στον αεραγωγό, όλοι οι άλλοι αρουραίοι στην ομάδα επέζησε. Δεν προφανείς επιπτώσεις τοξικότητας παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας. Θα δοκιμάσει χαμηλότερη δόση του RPS, για παράδειγμα 200mg /kg, σε μοντέλο αρουραίου του καρκίνου του οισοφάγου και την εξέταση της τοξικότητας του RPS σε αρουραίους στο μέλλον μελέτη.