Αφηρημένο

Στόχοι

υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (EGFR) (TKIs) έχουν δείξει δραματική κλινικά οφέλη σε προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC)? Ωστόσο, η αντίσταση παραμένει ένα σοβαρό πρόβλημα στην κλινική πράξη. Η παρούσα μελέτη ανέλυσε mTOR που σχετίζονται με τις διαφορές σηματοδότησης-διόδου μεταξύ των EGFR ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών NSCLC κυτταρικές σειρές και διερευνήθηκε η δυνατότητα στόχευσης mTOR με ειδικό αναστολέα mTOR στην EGFR ΤΚΙ κύτταρα ανθεκτικά NSCLC.

Μέθοδοι

Έχουμε επιλέξει τέσσερις διαφορετικούς τύπους EGFR ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC: PC9, PC9GR, H1650 και H1975 κυττάρων ως μοντέλα για την ανίχνευση του mTOR που σχετίζονται με τις διαφορές σηματοδότησης-μονοπάτι με κηλίδα western και ανοσοκατακρήμνισης και αξιολόγησε την αντι-πολλαπλασιαστική δράση και κυτταρικού κύκλου σύλληψη ku-0063794 με τη μέθοδο ΜΤΤ και κυτταρομετρία ροής.

Αποτελέσματα

στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ότι mTORC2 που σχετίζονται Akt Ser473-FOXO1 μονοπατιού σηματοδότησης σε ένα βασικό κατάσταση ήταν ιδιαίτερα ενεργοποιούνται σε ανθεκτικά κύτταρα.

In vitro

mTORC1 και mTORC2 δοκιμασίες κινάσης δραστηριότητες έδειξαν ότι EGFR ΤΚΙ-ανθεκτική κυτταρικές σειρές NSCLC είχαν υψηλότερη δραστικότητα κινάσης mTORC2, ενώ τα ευαίσθητα κύτταρα είχαν υψηλότερη δραστικότητα κινάσης mTORC1 στην βασική κατάσταση. Η ATP-ανταγωνιστικός αναστολέας mTOR ku-0063794 έδειξε δραματική αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις και τη σύλληψη του κύκλου G1-κυττάρων σε τόσο ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα. Ku-0063794 στο IC

50 συγκέντρωση ανέστειλε αποτελεσματικά τόσο τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του mTOR και p70S6K? το τελευταίο είναι ένα υπόστρωμα mTORC1 και δεν ρυθμίζουν προς τα πάνω Akt φωσφορυλίωση Ser473 που θα επάγεται από ραπαμυκίνη και είχε ως αποτέλεσμα μερική αναστολή της φωσφορυλίωσης FOXO1. Παρατηρήσαμε επίσης ότι EGFR ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κλινικά δείγματα NSCLC όγκου είχαν υψηλότερη συνολική και φωσφορυλιωμένη επίπεδα έκφρασης p70S6K.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν mTORC2 που σχετίζονται με σηματοδότηση-μονοπάτι ήταν υπερδραστηριοποιημένο σε EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα και στόχευση mTOR με ειδικούς αναστολείς mTOR είναι πιθανώς μια καλή στρατηγική για ασθενείς με EGFR μεταλλαγμένο NSCLC που αναπτύσσουν EGFR αντίσταση ΤΚΙ? οι δυνητικοί ειδικοί ρόλοι των mTORC2 σε EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC ήταν ακόμα άγνωστη και πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω

Παράθεση:. Φέι SJ, Zhang XC, Dong S, Cheng H, Zhang YF, Huang L, et al . (2013) Στόχευση mTOR να υπερνικήσει υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα τυροσίνης κινάσης αναστολέα Αντίσταση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 8 (7): e69104. doi: 10.1371 /journal.pone.0069104

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: 5 Ιούνη 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 του Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Φέι et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 30772531 και Νο 81071699, www.nsfc.gov.cn), Guangdong κοινωνική ανάπτυξη των σχεδίων σχεδίου επιστήμης και της τεχνολογίας (αριθ: 2011A030400010, www.gdstc.gov .cn /). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έλαβαν Gefitinib από AstraZeneca για την in vitro πειράματα στο εργαστήριό τους. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μονοπατιού σηματοδότησης παίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα [1]. EGFR αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙδ) gefitinib και erlotinib είναι αποτελεσματική κλινική θεραπείες για ασθενείς με προχωρημένο NSCLC που έχουν EGFR-ενεργοποιημένα μεταλλάξεις, σε σύγκριση με το πρότυπο πρώτης γραμμής κυτταροτοξική χημειοθεραπεία [2] – [4]. Ωστόσο, παρά τις δραματικές πλεονεκτήματα του EGFR TKIs, όλους αυτούς τους ασθενείς αναπόφευκτα αναπτύσσουν αντίσταση σε gefitinib και erlotinib, συνήθως 6-12 μήνες μετά την έναρξη της θεραπείας ΤΚΙ [5]. Αρκετοί μηχανισμοί, συμπεριλαμβανομένης μιας μετάλλαξης Τ790Μ στο EGFR, ενίσχυση ΜΕΤ, και η υπερέκφραση του αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF), επάγουν επίκτητη αντίσταση σε αναστρέψιμη EGFR-TKIs για NSCLC με μεταλλάξεις του EGFR που ενεργοποιεί [6] – [8]. Ένα μέσο αντιμετώπισης της αντίστασης ΤΚΙ εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση στην κλινική πράξη. Σε γενικές γραμμές, οι στρατηγικές για να ξεπεράσει την αντίσταση εξετάσει το μηχανισμό αντίστασης ίδιο [7], [9], [10], ενώ μια εναλλακτική στρατηγική είναι να εντοπίσει νέα μόρια ή μηχανισμούς που ξεπεραστεί η αντίσταση, όπως mTOR.

mTOR είναι μια συντηρημένη κινάση σερίνης /θρεονίνης που εμφανίζεται σε mTORC1 και σύμπλοκα mTORC2 [11]. Ενσωματώνει σήματα από αυξητικούς παράγοντες, παροχή θρεπτικών συστατικών, και την κατάσταση της ενέργειας για την ενεργοποίηση της κυτταρικής ανάπτυξης, και υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους [12]. Ως εκ τούτου, οι μελέτες που στοχεύουν mTOR για τη θεραπεία του καρκίνου έχουν λάβει προσοχή τα τελευταία χρόνια. Ωστόσο, η κλινική απόκριση σε ραπαμυκίνη και τα ανάλογά της είναι αδύναμες [13]. Πολλές μελέτες έχουν καταδείξει τους μηχανισμούς της κακής ανταπόκρισης της τόσο

in vitro

και

in vivo

[14] – [16]. προηγούμενη έκθεση μας έδειξαν επίσης ότι όλες οι κυτταρικές σειρές NSCLC στο εργαστήριο μας είναι ανθεκτικά σε RAD001 (ένα ανάλογο ραπαμυκίνης) [17]. Στην πραγματικότητα, η ραπαμυκίνη μόνο μερικώς αναστέλλει τις λειτουργίες mTORC1 και αντί επάγει φωσφορυλίωση της Akt Ser473 [16] και δεν αναστέλλει mTORC2 καθόλου [18]. Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι mTORC2 ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση και την οργάνωση του κυτταροσκελετού με τη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης των υποστρωμάτων του, Akt υδρόφοβο μοτίβο (HM) ιστοσελίδα (Ser473) και χώρο ΡΚΟα HM (ser657) [19], [20]. δραστηριότητα αυξάνεται mTORC2 κινάσης σε μερικούς όγκους? έτσι, η στόχευση mTORC2 θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό [21] – [23]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι mTORC2 παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό και ότι η στόχευση του mTOR με ειδικούς αναστολείς mTOR θα παράγουν καλύτερα αποτελέσματα κατά του όγκου μετά ΤΚΙ-επίκτητη αντίσταση.

Αναλύσαμε πρώτα διαφορές στην mTOR- συνδέονται μονοπάτια σηματοδότησης μεταξύ EGFR ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC σε μία βασική κατάσταση

in vitro

. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκαν mTORC1 και mTORC2 κινάσης δραστηριότητες

in vitro

. Τέλος, αξιολογήσαμε την αντι-πολλαπλασιαστική εφέ και του κυτταρικού κύκλου σύλληψη ku-0063794 και ανέλυσε την έκφραση της ολικής και φωσφορυλιωμένης p70S6K σε δείγματα όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και Regents

Ku-0063794 (TOCRIS, Minneapolis, MN, USA) και καθαρό gefitinib, ευγενική προσφορά από την AstraZeneca, παρασκευάστηκαν σε DMSO και αραιώνεται με μέσο καλλιέργειας πριν από τη χρήση. mTOR (# 2983), π-mTOR (# 2971), Rictor (# 2114 και # 5379), Raptor (# 2280 και # 5382), Akt (# 9272), σ-Akt Ser473 (# 4060), π-p70S6K (# 9208), π-4EBP1 (# 9459), FOXO1 (# 2880) και p-FOXO1 (# 9461) αντισώματα για την κηλίδα western και ανοσοκατακρήμνισης ήταν όλοι αγοράζονται από CST (Beverly, MA, USA). p70S6K (# ab47504) και ρ-p70S6K (# ab60947) αντισωμάτων για western blot και ανοσοϊστοχημεία αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA). Ανενεργό Akt1 /PKB1 (# 14-279) και 4Ε-BP1 (# 10022-H07E) αγοράστηκαν από την Millipore (Bedford, MA, USA) και σινο Βιολογική (Πεκίνο, Κίνα), αντίστοιχα.

τηλέφωνα Γραμμές

Το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα κυτταρικών σειρών PC9, H1650, H1975 και (ATCC, Manassas, VA, USA) ευγενώς από το Δρ Tony Mok, κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. κύτταρα PC9 φιλοξενούν ένα EGFR εξόνιο διαγραφή 19-πλαίσιο και είναι πολύ ευαίσθητα σε EGFR ΤΚΙ. κύτταρα H1650 φιλοξενούν ένα EGFR εξόνιο διαγραφή 19-πλαίσιο και είναι ανθεκτικά σε EGFR ΤΚΙ. κύτταρα H1975 φέρουν τη μετάλλαξη του EGFR L858R-T790M και είναι ανθεκτικά σε EGFR ΤΚΙ. PC9GR επίκτητη αντοχή gefitinib από τη χρόνια έκθεση των κυττάρων PC9 σε μέσο με αυξανόμενες συγκεντρώσεις gefitinib. Εν συντομία, τα κύτταρα PC9 εκτέθηκαν σε 10 ηΜ gefitinib σε μέσο που περιέχει 10% FBS, και η συγκέντρωση αυξήθηκε με σταδιακό τρόπο. Τα κύτταρα που ήταν σε θέση να αυξηθεί σε 1 μΜ gefitinib ελήφθησαν 6 μήνες μετά την αρχική έκθεση.

Western Blot Ανάλυση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 25 εκατοστά

2 φιάλες καλλιέργειας χωρίς φάρμακα και συγκομισθεί στην λογαριθμική φάση ανάπτυξης για την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Τα κύτταρα λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 1 χ PMSF και 1 × φωσφατάση αναστολέα κοκτέιλ. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία δικινχονινικού οξέος. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το ενισχυμένης χημιφωταύγειας κιτ (Thermo, Rockford, IL, USA).

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων της πρωτεΐνης, φιλμ σαρώθηκαν και αναλύθηκαν με λογισμικό labwork. Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια σύγκριση προς κύτταρο PC9.

Ανοσοκαταβύθιση και κινάση Δοκιμασίες

Cells

στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης υπέστησαν λύση σε 0.5 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (40 mM Hepes ρΗ 7,5, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 × φωσφατάση αναστολέα κοκτέιλ, 1 × άνευ ΕϋΤΑ αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ που περιείχε 0,3% [w /v] CHAPS) [24]. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα. Ένα κλάσμα 10 μΙ ακινητοποιημένου συζυγούς χάντρα με την υποδεικνυόμενη αντίσωμα προστέθηκε και επωάστηκε με περιστροφή για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν τέσσερεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα CHAPS λύσης και μία φορά με το ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης Rictor-mTOR (25 mM Hepes ρΗ 7,5, 100 mM οξικού καλίου, 1 mM MgCl

2). Τα ανοσοϊζήματα επωάστηκαν σε τελικό όγκο 15 μΐ για 20 λεπτά στους 37 ° C σε Rictor-mTOR ρυθμιστικό κινάσης που περιέχει 500 ng ανενεργό Akt1 /PKB1 ή 4E-ΒΡ1 παρουσία ΑΤΡ για την αντίδραση κινάσης. Η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 200 μΙ παγωμένου ρυθμιστικού αραίωσης ενζύμου (20 mM MOPS, ρΗ 7,0, 1 mM EDTA, 0.01% [w /v] Brij 35, 5% γλυκερίνη, 0,1% 2-μερκαπτοαιθανόλη και 1 mg /ml BSA). Μετά από μια σύντομη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε από το συζυγές χάντρα Sepharose και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Τα ανοσοϊζήματα μετουσιώνεται και αναλύθηκαν με SDS-PAGE, και τα πήγματα βάφτηκαν με ένα κιτ χρώσης αργύρου.

Αξιολόγηση των αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μέσω της δοκιμασίας ΜΤΤ, σύμφωνα με η μέθοδος Mosmann και Carmichael [25], [26], και ιδρύθηκε γραμμικότητα μεταξύ των αριθμών των κυττάρων και τιμές οπτικής πυκνότητας. Η αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα της θεραπείας μονοθεραπείας αξιολογήθηκε σε ενιαίο μονοστιβάδες, με κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων. Ο αριθμός των κυττάρων ανά φρεάτιο ήταν 2.000 PC9, 2000 PC9GR, 1200 H1650, και 3000 H1975 κυττάρων. Το IC

50 τιμή ήταν η συγκέντρωση που προκύπτει σε 50% αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μετά από έκθεση 72-hr στο φάρμακο σε σύγκριση με εκείνη σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων Διανομής Κύκλου

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 ανά φρεάτιο και αφέθηκε να κατακαθίσει όλη νύχτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 72 ώρες με ku-0063794 στο IC

50 συγκέντρωση. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν. Τα κύτταρα στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με στάγδην προσθήκη 70% παγωμένης αιθανόλης, αποθηκεύονται σε PBS, και μετά επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (180 μg /ml) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

Ασθενείς με NSCLC

όγκου δείγματα από gefitinib ή σε ασθενείς erlotinib έλαβαν ελήφθησαν από Guangdong Γενικό Νοσοκομείο (Guangzhou, Κίνα). Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Guangdong Γενικό Νοσοκομείο. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Η παρουσία της μετάλλαξης EGFR σε κάθε δείγμα επιβεβαιώθηκε από το εξόνιο-ειδική ενίσχυση (εξόνια 18-21), που ακολουθείται από την άμεση αλληλούχιση ή την ενίσχυση του συστήματος πυρίμαχο μετάλλαξη Scorpion [27]. MET ενίσχυση αναλύθηκε με ποσοτική σχέση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο [28].

p70S6K Ανοσοϊστοχημική

Η ανοσοϊστοχημεία για το σύνολο και φωσφορυλιωμένη p70S6K διεξήχθη σε θετικά φορτισμένα γυάλινα πλακίδια που περιέχουν 5-μm τμήματα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη ιστού. Πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν, ακολουθούμενη από επανυδάτωση με σειριακά μειούμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης, και στη συνέχεια βυθίζεται σε 3% Η

2O

2 να αναστέλλουν την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Μετά ανάκτηση αντιγόνου σε 1 mM EDTA ρυθμιστικό, ρΗ 8,0, οι τομές ιστών επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (TBST /5% φυσιολογικό ορό κατσίκας) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:100 εντός αραιωτικού αντισώματος. Το σύστημα ανίχνευσης Envision χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη Harris, αφυδατωμένα, και να τοποθετηθεί μόνιμα.

Αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημική χρώση

Όλα τα πλακίδια αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παθολόγους που αγνοούσαν τις περιπτώσεις. Περιπτώσεις με χρώση σε δεν βρήκαμε σημαντική σύλληψη του κύκλου G1-κυττάρων, αν και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναστάλθηκε σε H1975 κύτταρα με ku-0063794 οποία ίσως οφείλεται κυρίως σε άλλες μορφές κυτταρικού θανάτου, όπως απόπτωση ή αυτοφαγία. Οι δείκτες απόπτωσης ή /και αυτοφαγία θα διερευνηθεί περαιτέρω στο μέλλον (Σχήμα 3Β.)? οι ακόλουθες αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της στόχευσης mTOR έδειξε ότι ku-0063794, όχι μόνο ανέστειλε επίπεδα φωσφορυλίωσης p70S6K, αλλά επίσης τα επίπεδα μερικώς ανέστειλε FOXO1 φωσφορυλίωση και δεν ρυθμίζουν προς τα πάνω Akt επίπεδα φωσφορυλίωσης Ser473 (Εικ. 4). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας και εκείνων που προέρχονται από προηγούμενη έκθεση [46] προτείνουν ότι η έλλειψη μια αύξηση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης Akt Ser473 μπορεί να οφείλεται στην αναστολή της mTORC2? προωθώντας έτσι αντικαρκινική δράση. Στην πραγματικότητα, οι δυνητικοί ειδικοί ρόλοι των mTORC2 σε EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC ήταν ακόμη άγνωστη και θα πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω στις επόμενες μελέτες. Επιπλέον, βρήκαμε ότι EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα είχαν υψηλότερα Akt φωσφορυλίωση Ser473. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, Akt αναστολέα perifosine έχουν δείξει καλύτερα αντιπολλαπλασιαστικές δράσεις σε υποτροπή /Μακροσφαιριναιμία Πυρίμαχα του Waldenstrom [47] και Jeong et al ανέφεραν επίσης ότι ο αναστολέας Akt και αναστολέα mTORC1 συνεργικά αυξημένη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα NSCLC [48]. Όλα αυτά δείχνουν ότι οι αναστολείς Akt μπορεί να είναι μια άλλη καλή εναλλακτική θεραπεία για ΤΚΙ αναίσθητη όγκους. Αξιολογήσαμε επίσης την έκφραση της ολικής και φωσφορυλιωμένης p70S6K σε κλινικές ιστούς EGFR ΤΚΙ-ευαίσθητο και ανθεκτικών αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα όγκου και διαπίστωσε ότι p70S6K μπορεί να είναι ένας καλός δείκτης για την επιλογή των ασθενών για τους οποίους Ku-0063794 θεραπεία είναι κατάλληλη.