Αφηρημένο

Οι ασθενείς με γονίδιο ALK αναδιατάξεις συχνά προφανή δραματική αποκρίσεις σε crizotinib, έναν αναστολέα ALK. Η ακριβής ταυτοποίηση των ασθενών με ALK-θετικά μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι απαραίτητη για την κλινική εφαρμογή της θεραπείας με ALK-στόχο. Ωστόσο, η αξιολόγηση

EML4-ALK

αναδιάταξη στο NSCLC παραμένει πρόκληση στην καθημερινή πράξη παθολογία. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να συγκριθεί η διαγνωστική ακρίβεια της FISH, ανοσοϊστοχημεία (IHC), και σε πραγματικό χρόνο ποσοτική RT-PCR (QPCR) μεθοδολογίες για την ανίχνευση του

EML4-ALK

αναδιάταξη στον NSCLC και να εκτιμήσει ανοσοϊστοχημεία ως εργαλείο προ-διαλογής. Σε αυτή τη μελέτη, ένα σύνολο 473 εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα NSCLC από χειρουργικές εκτομές και βιοψίες αναλύθηκαν με IHC με αντίσωμα ALK.

ALK

αναδιάταξη επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με FISH και QPCR. έκφραση πρωτεΐνης ALK ανιχνεύθηκε σε είκοσι ασθενείς (20/473, 4,2%). Από τις 20 ALK-θετικό περιπτώσεις με IHC, 15 περιπτώσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω ως

ALK

αναδιάταξη με FISH και 5 περιπτώσεις δεν ήταν ερμηνεύσιμο. Επίσης, αξιολογήσαμε 13 από τις 20 IHC-θετικούς ιστούς από QPCR σε πρόσθετες για τα ψάρια, και διαπίστωσε ότι 9 περιπτώσεις ήταν θετικές και 2 περιπτώσεις ήταν διφορούμενα, ενώ 2 περιπτώσεις ήταν αρνητικές, αν και ήταν θετικά τόσο από IHC και FISH. Η κατάσταση ALK ήταν σύμφωνη σε 5 από 8 περιπτώσεις που ήταν ερμηνεύσιμα με τρεις μεθόδους. Επιπλέον, κανένα από τα 110 IHC-αρνητικών περιπτώσεων με αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας έδειξε

ALK

αναδιατάξεις με τη μέθοδο FISH. Ιστολογικά, σχεδόν όλες οι

ALK

-rearranged περιπτώσεις ήταν αδενοκαρκίνωμα, εκτός από το ότι μία περίπτωση ήταν sarcomatoid καρκίνωμα. Ένα στερεό μοτίβο κυττάρων σφραγίδα δακτύλιο ή βλεννώδες μοτίβο ηθμοειδή παρουσιάστηκε τουλάχιστον εστιακά σε όλους τους όγκους ALK-θετικό. Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας πρότεινε ότι

ALK

αναδιάταξη σχετίζεται με την έκφραση της πρωτεΐνης ALK. Η συμβατική δοκιμασία IHC είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για την προ-διαλογή των ασθενών με

ALK

αναδιάταξη στην κλινική πράξη και ένας συνδυασμός των ψαριών και QPCR απαιτείται για την περαιτέρω επιβεβαίωση

Παράθεση:. Zhang YG , Jin ML, Li L, Zhao ΗΥ, Zeng Χ, Jiang L, et al. (2013) Αξιολόγηση του

ALK

Αναδιάταξη στα κινεζικά μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Χρησιμοποιώντας FISH, ανοσοϊστοχημεία, και πραγματικού χρόνου ποσοτική RT- PCR σε ιστούς παραφίνης. PLoS ONE 8 (5): e64821. doi: 10.1371 /journal.pone.0064821

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 23 Νοέμ 2012? Αποδεκτές: 18 Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NO.81050015). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1], [2], παρά τις βελτιώσεις στις μεθόδους ανίχνευσης και θεραπείες. Μεταξύ των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), αντιπροσωπεύοντας περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα, αδενοκαρκίνωμα είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του πνεύμονα σε άνδρες και γυναίκες [2]. Επί του παρόντος, οι προσπάθειες που καταβάλλονται για την ανάπτυξη των μορίων εναντίον συγκεκριμένων στόχων για συγκεκριμένους τύπους όγκων. Με συνεχή βελτίωση στην κατανόηση της μοριακής βάσης του καρκίνου του πνεύμονα, ένας αριθμός στοχευμένων θεραπειών για NSCLC αξιολογούνται ή θα αναπτυχθούν. Οι θεραπείες αυτές περιλαμβάνουν αναστολείς αγγειογένεσης και αναστολείς μεταγωγής σηματοδότησης όπως το επιθηλιακό υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (EGFR) -targeted θεραπείες [3]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των βασικών ογκογονιδίων για καρκίνο του πνεύμονα είναι ένα πολύ σημαντικό βήμα προς την ανάπτυξη νέων παραγόντων μοριακής στόχευσης.

Πρόσφατα, η ενεργοποίηση της κινάσης αναπλαστικού λεμφώματος (ALK) γονίδιο στον καρκίνο του πνεύμονα με σύντηξη προς εχινοδερμάτων μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη που συνδέεται-like4 (EML4) ή άλλους εταίρους γονίδιο (όπως

ΜΟΚ

και

KIF5B

) έχει αναφερθεί [4], [5], [6]. Το γονίδιο ALK χαρακτηρίστηκε αρχικά ως ένας εταίρος συγχώνευσης του ογκογονιδίου ΝΡΜ-ΑΙΚ σε αναπλαστικό λέμφωμα μεγάλων κυττάρων [7], και αναγνωρίζεται πλέον ως το δραστικό συστατικό σε πολλαπλές πρωτεΐνες σύντηξης σε μια ποικιλία καρκίνων [8]. ALK είναι ένας υποδοχέας διαμεμβράνης με δραστηριότητες κινάσης τυροσίνης που ανήκουν στην υπεροικογένεια υποδοχέα παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης, η οποία κωδικοποιείται στο χρωμόσωμα 2 (2p23). Οι διάφορες συνεργάτες σύντηξης του ALK μεσολαβούν ανεξάρτητη από συνδέτη διμερισμού του ALK, με αποτέλεσμα συστατική δραστικότητα κινάσης, και ως εκ τούτου μεταδίδει αντι-αποπτωτική και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σήματα μέσω KRAS και οδών ΡΙ3Κ [8]. Στο NSCLC, ανώμαλη ενεργοποίηση του ALK συμβάλλει στην καρκινογένεση του πνεύμονα αφού συγχωνευμένο με έναν αριθμό άλλων εταίρων γονιδίου, συχνότερα εχινοδερμάτων σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη 4 (

EML4

). EML4 γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 2 (2p21) και αντίστροφα προσανατολισμένη με

ALK

.

EML4-ALK

σύντηξη θα μπορούσε να συμβεί μετά από μια διάσπαση του χρωμοσώματος σε μία μεταβλητή περιοχή και το χρωμόσωμα αναστροφή, δίνοντας αφορμή για διαφορετικές ισομορφές σύντηξης [9].

EML4-ALK

σύντηξης συμβαίνει σε μια αμοιβαία αποκλειστική περιοχή της μόδας με το

EGFR

ή

KRAS

μεταλλάξεις και σχεδόν αποκλειστικά σε αδενοκαρκίνωμα. Η παρουσία του

EML4-ALK

είναι πιο πιθανό να συμβεί σε ασθενείς με ορισμένα δημογραφικά χαρακτηριστικά, όπως η κατάσταση ποτέ δεν το κάπνισμα ή νεότερη ηλικία [10]. Οι περισσότερες μελέτες έχουν ανακαλύψει αυτό γενετικής ανωμαλίας σε ποσοστό 2-5% στο γενικό πληθυσμό των ασθενών με NSCLC [11], [12], [13], [14].

Σε προηγούμενες κλινικές δοκιμές, Crizotinib, ένας διπλός αναστολέας κινάσης ΑΙΚ /MET, δείχθηκε να είναι δραματικά αποτελεσματική σε ασθενείς με NSCLC που φιλοξενούν το γονίδιο ALK αναδιατάξεις [15]. Crizotinib εγκρίθηκε πρόσφατα από την αμερικανική FDA για τη θεραπεία του προχωρημένου

ALK

-θετικό NSCLC προσδιορίζονται με φθορισμό σε in situ υβριδισμού (FISH) [16]. Για να εξασφαλιστεί η ταυτοποίηση των ασθενών που είναι πιθανότερο να ωφεληθούν από Crizotinib, είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη ισχυρών και εύκολα διαγνωστικές μέθοδοι για την ανίχνευση του γονιδίου ALK αναδιάταξη κατά τη διαλογή των ασθενών για θεραπεία με crizotinib. Αν και ALK FISH έχει γίνει το χρυσό πρότυπο για τον εντοπισμό

ALK

αναδιάταξη στο NSCLC, μπορεί να είναι τεχνικά δύσκολη και δαπανηρή. Ως εκ τούτου, άλλες διαγνωστικές μέθοδοι παραμένουν να διερευνηθούν, συμπεριλαμβανομένων ανοσοϊστοχημεία (IHC) και αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης-πολυμεράσης (RT-PCR). RT-PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του RNA για

EML4-ALK

. Είναι επίσης ικανό να πληκτρολογήσετε το

EML4-ALK

παραλλαγή με προσδιορισμό της αλληλουχίας του προϊόντος PCR. Ωστόσο, επειδή αυτή η μέθοδος δεν μπορεί να εντοπίσει νέες ανακατατάξεις που αφορούν προηγουμένως μη

EML4-ALK

παραλλαγές ή άγνωστες εταίρων σύντηξης και η διαδικασία του μπορεί να μολυνθεί εύκολα, ευαισθησία και ειδικότητα της μένει να επικυρωθεί. IHC έχει το πλεονέκτημα ότι είναι ευρέως διαθέσιμα, σχετικά εύκολο να εκτελεί και διατηρεί μορφολογικές πληροφορίες, η οποία επιτρέπει τη σιγουριά αξιολόγηση της παρεκκλίνουσας γονιδίων σε κύτταρα όγκου. Για το λόγο αυτό, ALK IHC φαίνεται κατάλληλο για διαλογή μεγάλης κλίμακας των ασθενών με

ALK

-θετικό NSCLC.

Η μεγάλη πρόκληση για τη χρήση ALK IHC είναι η συχνά χαμηλού επιπέδου έκφραση της ΑΛΚ πρωτεΐνες σύντηξης στο

ALK

-rearranged NSCLC [16], γεγονός που καθιστά αναγκαία την ανάπτυξη πιο ευαίσθητων μεθόδων IHC-βάση. Αρκετές ALK αντισώματα έχουν αναφερθεί σε πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η IHC έχει υψηλή αντιστοιχία με ALK FISH, συμπεριλαμβανομένων μονοκλωνικό αντίσωμα ALK1 από ϋΑΚΟ [17], 5A4 μονοκλωνικό αντίσωμα από Novocastra [18], και D5F3 μονοκλωνικό αντίσωμα που αναπτύχθηκε από Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου [19] . Παρ ‘όλα αυτά, οι μελέτες μεγάλης κλίμακας που απαιτούνται για την επικύρωση περαιτέρω συμφωνία μεταξύ IHC και FISH, καθώς και την ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων αντισώματα με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία για τις πρωτεΐνες σύντηξης ALK θα ήταν πολύ ευπρόσδεκτη.

Σε αυτή τη μελέτη, εξέτασε αναδιάταξη του γονιδίου ALK χρήση ανοσοϊστοχημείας σε NSCLC κλινικά δείγματα, και συσχετίζονται τα αποτελέσματα με εκείνα που λαμβάνονται με FISH και QPCR. Επιπλέον, ερευνήσαμε κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά του NSCLC με γονίδιο ALK αναδιατάξεις. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο τον εντοπισμό χρήσιμων πληροφοριών πρόβλεψη γονιδίου ALK αναδιάταξη και τον καθορισμό μια διαγνωστική διαδικασία που θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί σε καθημερινή πρακτική.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

η μελέτη αυτή έγινε με την έγκριση της Κλινικής Επιτροπής Δεοντολογίας του Πεκίνου Chao-Yang Νοσοκομείο Capital Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Αρχειακό φορμόλη-σταθερής ιστούς παραφίνης ελήφθησαν από 473 ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία της πρωτοπαθούς καρκίνου του πνεύμονα μεταξύ των ετών 2006 και 2011 στο Πεκίνο Chao-Yang Νοσοκομείο Capital Medical University στην Κίνα. Περιπτώσεις επιλέχθηκαν τυχαία μεταξύ των ασθενών που έχουν διαγνωστεί ως NSCLC από ιστολογική εξέταση των δειγμάτων που λαμβάνονται από χειρουργική εκτομή και βιοψία. Κανένας ασθενής δεν είχε υποβληθεί σε χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση και βιοψία. Για όλες τις περιπτώσεις, θα επανεξεταστεί η ηλικία κατά τη διάγνωση, το φύλο, το ιστορικό καπνίσματος, και τη θέση του πρωτοπαθούς όγκου, οι οποίες ελήφθησαν από τα ιατρικά αρχεία. Σύμφωνα με the7th εγχειρίδιο σταδιοποίησης TNM έκδοση για τον καρκίνο του πνεύμονα που δημοσιεύθηκε από AJCC το 2010, όλες οι υποθέσεις επανεξετάστηκαν και ανέβασε. Όλα τα διαθέσιμα διαφάνειες ιστολογία από κάθε περίπτωση επανεκτιμήθηκαν και το ιστολογικό τύπο και το βαθμό διαφοροποίησης επιβεβαιώθηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας κατάταξη των όγκων στους πνεύμονες και τα ERS /ATS /IASLC διεπιστημονική κατάταξη του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [20]. Για κάθε περίπτωση, ο εκπρόσωπος μπλοκ ιστού που περιέχει τα περισσότερα βιώσιμα κύτταρα όγκου επιλέχθηκε από δύο παθολόγους. Το στάδιο της νόσου ήταν μετεγχειρητική παθολογικές στάδιο. Τα IV ασθένειες στάδιο περιλαμβάνονται περιπτώσεις που έλαβαν βιοψίες από ανοικτό πνεύμονα ή βίντεο υποβοηθούμενη θωρακοσκοπική χειρουργική επέμβαση για τη διάγνωση. Τα κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένα συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

ALK Ανίχνευση με ανοσοϊστοχημεία

Για κάθε περίπτωση, ένας εκπρόσωπος φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) μπλοκ ιστών επιλέχθηκε και χωρισμένο σε πάχος 4-μm για ανοσοχρώση. Εν συντομία, μετά αποπαραφινώσεως και επανυδάτωση, τα πλακίδια θερμάνθηκαν για ανάκτηση αντιγόνου σε χύτρα ταχύτητας για 3 λεπτά στους 100 ° C σε 0,01 mol /L ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (ρΗ 9.0). Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση των αντικειμενοφόρων πλακών σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε απόλυτη μεθανόλη για 15 λεπτά, και μη ειδική σύνδεση παρεμποδίστηκε με 10% ορό κατσίκας για 15 λεπτά. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού ALK (Κλώνος SP8? Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, USA) χρησιμοποιήθηκε σαν το πρωτογενές αντίσωμα σε αραίωση 1:100. Μετά από ολονύκτια επώαση με το αντίσωμα ALK στους 4 ° C, τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-κουνελιού, υπεροξειδάση αρμορακίας-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα πολυμερές από την ϋΑΚΟ Envision + ™ System (Dako Corporation). Η ανοσοαντιδραστικότητα οπτικοποιήθηκε με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Dako Corporation, Carpinteria, CA). Τέλος, οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη και συναρμολογείται. Θετική τμήματα ελέγχου από γνωστές περιπτώσεις ALK-θετικά ΑίΟί συμπεριελήφθησαν σε κάθε χρώση παρτίδας. Κανονική ιστό λεμφαδένα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Για κενό έλεγχο, όλα τα βήματα επώασης ήταν πανομοιότυπα εκτός από το ότι το κουνέλι μη άνοσο ορού IgG χρησιμοποιήθηκε αντί για το πρωτογενές αντίσωμα (ΑΛΚ).

Έχουμε καθορίσει τα κριτήρια βαθμολόγησης κατά τη διάρκεια μιας προκαταρκτικής αξιολόγησης χρησιμοποιώντας ένα πολυ-με επικεφαλής μικροσκόπιο, προκειμένου να την επίτευξη συναίνεσης. αποτελέσματα χρώση στη συνέχεια ερμηνεύεται από δύο από τους συντάκτες ανεξάρτητα, χωρίς προηγούμενη γνώση των κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Ασύμφωνα περιπτώσεις εξετάστηκαν και συμφωνηθεί πριν από τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά. Για κάθε δείγμα, αναλύθηκαν τουλάχιστον πέντε πεδία (Χ 400) και πάνω από 500 κύτταρα. Για τους λεκέδες ALK, μόνο κατηγορηματική κυτταροπλασματική χρώση θεωρήθηκε ως θετική αντίδραση. Ο αριθμός των ανοσοθετικών κυττάρων ημιποσοτικά εκτιμήθηκε: δεν υπάρχουν θετικά κύτταρα (-)? & Lt? 50% των κυττάρων του όγκου χρώση θετικό (+)? 50% -75% των κυττάρων του όγκου χρωματίζονται θετικά (++)? & Gt?. 75% των κυττάρων του όγκου χρωματίζονται θετικά (+++) Η ένταση της χρώσης βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα από το 0 έως 3+ (0, αρνητικά? 1+, αδύναμη? 2+, μέτρια? 3+, έντονη), παρομοίως με τα πρωτόκολλα που περιγράφηκαν προηγουμένως [17], [18].

φθορίζουσας in situ υβριδοποίησης (FISH)

FISH έγινε σε παραφίνη-ενσωματωμένες (FFPE) ιστούς φορμόλη σταθερό όγκου χρησιμοποιώντας το Vysis LSI ALK Διπλή χρώμα, Break Εκτός Αναδιάταξη Probe (Abbott Molecular, Abbott Park, Illinois, USA). Το διάλειμμα-εκτός σετ καθετήρα ALK περιλαμβάνει δύο ανιχνευτές DNA επισημαίνονται με Spectrum Orange και Spectrum Πράσινο που αντιστοίχως υβριδοποιούνται με το συγκρότημα 2p23 στις αντίθετες πλευρές πλαισιώνουν το σημείο διακοπής του γονιδίου ALK. Δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 4-μm πάχους τομές από μπλοκ ιστού FFPE αποπαραφινοποιήθηκαν και αφυδατωμένα, στη συνέχεια οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντιδραστήριο Vysis προεπεξεργασίας (Abbott Molecular) και αντέδρασε με διάλυμα πρωτεάσης (Abbott Molecular). Το μίγμα ανιχνευτής διαιρούμενη ALK εφαρμόστηκε σε ολόκληρο ιστό, και ήταν συν-μετουσιώθηκε στους 73 ° C για 3 λεπτά. Οι πλάκες στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύχτα σε υγροποιημένο θάλαμο στους 37 ° C. Μετά την πλύση, οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Τμήματα αναλύθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού εφοδιασμένο με φίλτρο τριπλής-pass (DAPI /Πράσινο /Πορτοκαλί). Μια επαναλαμβανόμενη ανάλυση κάποια δείγματα διεξήχθη λόγω της κακής σήματα υβριδισμού και /ή κακή μορφολογία ιστού. Θετικές και αρνητικές πλάκες ελέγχου συμπεριλήφθηκαν σε κάθε εκτέλεση της δοκιμής FISH.

FISH Ερμηνεία

Σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή, διαφάνειες FISH αξιολογήθηκαν χωρίς γνώση των αποτελεσμάτων IHC για ALK. Οι δύο τεχνικοί αναλύονται κάθε διαφάνεια FISH, σαρώνοντας ολόκληρο το τμήμα του ιστού και σκοράροντας 50 αντιπροσωπευτικά πυρήνες, οι οποίες προσδιορίζονται σαφώς και περιείχε κατηγορηματική σήματα. Πυρήνες που περιέχουν σήματα από ένα μόνο χρώμα δεν πρέπει να αναφερθούν. Τα αποτελέσματα κάθε τεχνικός δεν συνδυάστηκαν μέχρι την ολοκλήρωση της μελέτης για να ελαχιστοποιηθεί οποιαδήποτε προκατάληψη στο σκοράρισμα. Το κύτταρο θεωρήθηκε ως θετικό, όταν ένας πυρήνας είχε τουλάχιστον ένα σετ από σπασμένα χώρια σημάτων, ή είχαν ένα ενιαίο κόκκινο σήμα (διαγράφονται πράσινο σήμα) εκτός από συγχωνευμένο ή /και σπασμένα χώρια σήματα. Η απόσταση ανάμεσα σε δύο ξεχωριστές κόκκινα και πράσινα σήματα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τις δύο φορές από τις μεγαλύτερες μεγέθους σήματος. Τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά εάν περισσότερο από 25 από τις 50 καρκινικών κυττάρων ήταν θετικό, και αρνητική αν λιγότερο από το 5 καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά. Το δείγμα με 5-25 θετικά κύτταρα όγκου θεωρήθηκαν διφορούμενο, και στη συνέχεια αξιολογήθηκε από ένα δεύτερο τεχνικό. Οι πρώτη και δεύτερη ανάγνωση αριθμός των κυττάρων προστέθηκαν μαζί και ένα τοις εκατό υπολογίστηκε από 100 κύτταρα. Εάν η μέση επί τοις εκατό των θετικών κυττάρων ήταν 15% ή περισσότερο, το δείγμα θεωρήθηκε θετικό. Σε αντίθετη περίπτωση, θεωρήθηκε αρνητικό για

ALK

αναδιάταξη.

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (QPCR)

Το συνολικό RNA εξήχθη από φρεσκοκομμένα τομές ιστού FFPE χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen). Εν συντομία, περιοχή του όγκου προσδιορίστηκε μέσω χρώσης με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και ιστών από την περιοχή αυτή σε μη χρωματισμένα τμήματα ήταν ξύνεται για την εξαγωγή RNA. Μετά αποπαραφινώσεως και λύση βήματα, το συνολικό RNA καθαρίστηκε με μία στήλη σπιν RNeasy MinElute. Γονιδιωματικό DNA απομακρύνθηκε με RNase-Free ϋΝάσης Ι (Qiagen). Πριν ενίσχυση RNA, η ακεραιότητα και η καθαρότητα του RNA εκτιμήθηκε με μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης και μέτρηση Α260 /Α280.

σε πραγματικό χρόνο PCR ενίσχυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το AmoyDx ™ EML4-ALK γονιδιακή σύντηξη Detection Kit (Amoy Diagnostics , Xiamen, Κίνα) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, 0,1-5 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας M-MLV ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen). Έξι μικρολίτρα cDNA στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σαν εκμαγείο για μία 25-μΙ αντίδραση για την PCR πραγματικού χρόνου ανίχνευση των μεταγραφών συγχωνεύσεως EML4-ALK χρησιμοποιώντας το EML4-ALK κύριο Αντίδραση Μείγματα και ΑΒΙ 7500 ανακυκλωτή (Applied Biosystems). Η EML4-ALK σύντηξης Gene Detection Kit απασχολεί μυθιστόρημα, ιδιόκτητο εκκινητές για να ενισχυθεί συγκεκριμένα η αλληλουχία του γονιδίου-στόχου με τη συμμετοχή εννέα γνωστές παραλλαγές μεταγραφής σύντηξης EML4-ALK, συμπεριλαμβανομένων Ε13? Α20, Ε6α /β? A20, E20? A20, E15? Α20, Ε14 ? A20, E18? Α20, Ε2? Α20, Ε17? Α20. Η ποσότητα του cDNA στόχος μετρήθηκε μετά από κάθε κύκλο στη φάση συλλογής δεδομένων χρησιμοποιώντας μία νέα φθορίζοντα ανιχνευτή. Η ποιότητα του συντίθεται cDNA επαληθεύτηκε κατά την ίδια πορεία με την ενίσχυση του γονιδίου αναφοράς (β-ακτίνη,

ACTB

). Το γονίδιο σύντηξης EML4-ALK και

ACTB δοκιμασίες

σημάνθηκαν με FAM. Ένας θετικός και αρνητικός μάρτυρας συμπεριλήφθηκε σε κάθε PCR πραγματικού χρόνου λειτουργίας. Όπως ορίζεται από τις οδηγίες του κατασκευαστή, QPCR δοκιμασία γονιδιακών σύντηξης EML4-ALK θεωρήθηκε θετική, εάν το δείγμα Ct τιμή & lt? 30. Για τα αρνητικά δείγματα, σε πραγματικό χρόνο προσδιορισμός RT-PCR επαναλήφθηκαν δύο φορές.

Στατιστικές Αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS για το πρόγραμμα των Windows 13.0 (SPSS Inc., Chicago , IL). Να αναλύσει τις συσχετίσεις μεταξύ των

ALK

κατάσταση και κλινικές-παθολογικές μεταβλητές, χρησιμοποιήσαμε το τεστ χ2 ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher, ανάλογα με την περίπτωση. Οι τιμές πιθανότητας της & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές στις αναλύσεις

Αποτελέσματα

Clinicopathogical Χαρακτηριστικά των Όγκων

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε ένα πάνελ των 473 δειγμάτων NSCLC,. η οποία περιλαμβάνει 375 περιπτώσεις από χειρουργικά όγκους, και 98 περιπτώσεις από βιοψίες. Κανένας ασθενής δεν λάβει χημειοθεραπεία κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Όπως συνοψίζονται στον Πίνακα 1, οι ασθενείς που αποτελείται από 314 (66,4%) άνδρες και 159 (33,6%) γυναίκες με μέση ηλικία 59 έτη (από 21 έως 84 ετών). Ιστολογικά, 341 (72,1%) ήταν αδενοκαρκίνωμα, 112 (23,7%) καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, και 20 (4.2%) άλλων τύπων. Η παθολογική στάδιο ήμουν στο 166 (35,1%), II σε 104 (22%), ΙΙΙ σε 105 (22,2%), και IV σε 98 (20,7%) περιπτώσεις.

ALK πρωτεΐνη έκφρασης από την IHC

Όλες οι ALK-θετικών περιπτώσεων επέδειξε μία διάχυτη και κυτταροπλασματική πρότυπο χρώσης στα καρκινικά κύτταρα, και όχι ανοσοχρώση παρατηρήθηκε σε φυσιολογικό πνεύμονα βρογχικό επιθήλιο, τα κυψελιδικά πνευμονοκύτταρα, κυψελιδικά μακροφάγα, μεσεγχυματικού ιστού, και φλεγμονώδη κύτταρα στους γειτονικούς ιστούς των πνευμόνων (Φιγούρα 1). Είκοσι περιπτώσεις από τις 473 ήταν ALK-θετικό, που αντιπροσωπεύουν το 4,2% του συνόλου των περιπτώσεων που μελετήθηκαν από την IHC, η οποία περιελάμβανε σκορ 3 δει σε 14 περιπτώσεις με κοκκώδη έντονη κυτταροπλασματική χρώση (Σχήμα 1-Α), βαθμολογία από 2 σε 5 περιπτώσεις με μέτρια κυτταροπλασματική χρώση (Σχήμα 1-C), βαθμός 1 σε 1 περίπτωση με ελαφρά κυτταροπλασματική χρώση (Σχήμα 1-Ε) και η βαθμολογία από το 0 σε 453 περιπτώσεις (Σχήμα 1-G). Καμία σημαντική ενδοογκική ετερογένεια παρατηρήθηκε χρώση, αν και τα κύτταρα signet δακτύλιο τείνουν να παρουσιάζουν ασθενέστερη χρώση από τα άλλα κύτταρα, ίσως επειδή κυτταροπλασματική πρωτεΐνη ALK ελαττώθηκε από ένα μεγάλο όγκο υλικού βλέννας. Δεν υπήρχε καμία εμφανής συσχέτιση μεταξύ του γονιδίου ALK αναδιάταξη με FISH και την ένταση της ανοσοχρώσης

Α, C, Ε, Ζ:. ALK ανοσοκηλιδώσεις (αρχική μεγέθυνση χ 200). Α και C: έντονη και μέτρια κυτταροπλασματική χρώσεις (βαθμολογία = 3 και 2 αντίστοιχα), Ε: αδύναμη κυτταροπλασματική χρώσεις (βαθμολογία = 1) και G: καμία χρώση (σκορ 0). Β, D, F και H. ανάλυση FISH για

ALK

χρησιμοποιώντας ALK ανιχνευτή διάλειμμα-εκτός dual-χρώμα. Β, D και F sigals δείχνουν FISH στους όγκους ALK-αναδιατάσσονται, και η αναλογία των κυττάρων με ALK θετικά μηνύματα ήταν 49% (49/100), 38% (38/100), 56% (28/50), αντίστοιχα . Αναδιατάσσεται

ALK

(Β, D και F) υποδεικνύεται από διαχωρισμό του κόκκινου και του πράσινου σήματα ή ενιαίο κόκκινο signals.H δείχνει sigals FISH σε ένα μη-αναδιατάσσονται όγκου. η αναλογία των κυττάρων με ΑΙΚ θετικά σήματα ήταν 3% (3/100). Μη αναδιατάσσονται

ALK

(H) δείχνει σύντηξης ή δίπλα κόκκινα και πράσινα σήματα.

Η

ALK Αναδιάταξη Εκτίμηση με FISH

ALK αναδιάταξη αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας FISH σε 110 IHC-αρνητικών περιπτώσεων με adenocacinoma ιστολογίας και 20 IHC-θετικών περιπτώσεων. Μεταξύ των 20 IHC-θετικές περιπτώσεις, 15 περιπτώσεις επιβεβαιώθηκαν ως

ALK

αναδιάταξη με ALK FISH, 5 περιπτώσεις που δεν ήταν ερμηνεύσιμο, λόγω των τεχνικών αντικείμενα, όπως η απώλεια σήματος που ενδεχομένως προέκυψαν από ακατάλληλη στερέωση ή απώλεια όγκου ιστός. Κανένα από τα 110 IHC-αρνητικών περιπτώσεων έδειξε

ALK

αναδιάταξη με FISH. Αντιπροσωπευτικά εικόνες ΑΙΚ FISH φαίνεται στο Σχήμα 1-Β, D, F, Η Υπήρχαν δύο θετικές

ALK

αναδιάταξη μοτίβα. Η μία ήταν η διάσπαση χώρια (BA) μοτίβο με ένα ή δύο ξεχωριστά κόκκινο και πράσινο σήματα, και ένα άλλο απομονώθηκε κόκκινο περίγραμμα σήματος χωρίς αντίστοιχα πράσινο σήμα. Οι ALK FISH-αρνητικών περιπτώσεων έδειξε δύο σήματα σύντηξης ή κοντά από τα κόκκινα και πράσινα σήματα.

Συσχέτιση μεταξύ ALK IHC και FISH

Στην παρούσα μελέτη, 130 περιπτώσεις αναλύθηκαν τόσο από την IHC και τα ψάρια. Συμφωνία μεταξύ IHC και FISH παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Με την εξέταση 5 περιπτώσεις από ψάρια δεν ήταν ερμηνεύσιμο, η ευαισθησία και η ειδικότητα της IHC στις 125 περιπτώσεις, σε comparision με FISH, ήταν 100% και 100%, αντίστοιχα. Έτσι, η μελέτη αυτή έδειξε ότι υπήρχε υψηλή αντιστοιχία στην εκτίμηση της

ALK

αναδιάταξη μεταξύ IHC και FISH.

Η

EML4-ALK σύντηξης γονιδίων από QPCR

Στη συνέχεια εξετάστηκαν 13 IHC-θετικών κρουσμάτων από QPCR. Τα γονίδια σύντηξης EML4-ALK ανιχνεύθηκαν σε 9 από τις 13 περιπτώσεις. Θα περιλαμβάνονται

EML4-ALK

παραλλαγή 1, 2, 3 με εξόνιο 13 του

EML4

, εξόνιο 20 του

EML4

, και το εξόνιο 6a /b του

EML4

λιωμένο στο εξώνιο 20 του

ALK

, αντίστοιχα. Υπήρχαν 2 περιπτώσεις στις οποίες τα γονίδια σύντηξης EML4-ALK δεν ανιχνεύθηκαν με QPCR, αλλά

ALK

αναδιατάξεις ανιχνεύτηκαν με FISH. Επιπλέον, το θετικό αποτέλεσμα για

EML4-ALK

σε 2 περιπτώσεις, δεν θα μπορούσε να επαναληφθεί στο επαναλαμβανόμενες αναλύσεις. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε μία περίπτωση, ALK FISH ήταν κατατοπιστική για

ALK

αναδιάταξη, αλλά η υπόθεση αναφέρθηκε θετικά από QPCR. Αυτό θα μπορούσε πιθανώς να οφείλεται στην ανεπάρκεια των κυττάρων του όγκου. Σε αυτό το δείγμα, συνολικά 30 πυρήνες κυττάρων εκπρόσωπος του όγκου μετρήθηκαν, και μόνο δύο καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά.

κλινικοπαθολογική Χαρακτηριστικά του ALK-θετικούς ασθενείς

Ένα σύνολο 473 εκτομή και βιοψία NSCLC εξετάστηκαν δείγματα. έκφραση πρωτεΐνης ALK αξιολογήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις με IHC.

EML4-ALK

μετατοπίσεις και /ή

ALK

ανακατατάξεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω σε όλα τα ALK-ανοσοθετικού περιπτώσεις με FISH ή /και QPCR. Η σχέση μεταξύ του

ALK

αναδιάταξη και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον Πίνακα 3.

ALK

αναδιάταξη ανιχνεύθηκε σε 20 από 473 περιπτώσεις NSCLC. Από τα 20 ALK-θετικές περιπτώσεις, 19 (95%) ήταν αδενοκαρκινώματα, και 1 ήταν sarcomatoid καρκίνωμα το οποίο είχε ένα σημαντικό κύτταρο άτρακτο και συστατικό γιγαντοκυτταρική. Histomorphologically, όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, η

ALK

-rearranged αδενοκαρκινώματα πνεύμονα συχνά έδειξε στερεά μορφή κυττάρων σφραγιστικό δαχτυλίδι. Ένα στερεό πρότυπο κύτταρο σφραγιστικά δακτύλιος ή βλεννώδες μοτίβο ηθμοειδή παρουσιάστηκε τουλάχιστον εστιακά σε όλους τους όγκους ALK-θετικό (Σχήμα 2). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, ALK-θετικοί ασθενείς παρουσίασαν στατιστική διαφορά στην ηλικία (ρ = 0,003) και παθολογικές στάδιο (p = 0,024), σε σύγκριση με τους ασθενείς -αρνητική ALK. Οι ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα ALK-θετικό ήταν νεότεροι κατά τη διάγνωση και είχε ένα ανώτερο στάδιο, συνήθως στο στάδιο IV. Δεν αξιόλογη σχέση αποδείχθηκε μεταξύ ALK αναδιάταξη και είτε η ιστορία του φύλου ή του καπνίσματος του ασθενούς.

Έδειξαν μοτίβο στερεών κυττάρων σφραγίδα δακτύλιο (Α), μια δομή ηθμοειδή (BD), και άφθονη εξωκυττάρια βλέννα (C).

η

Συζήτηση

Αν και το γονίδιο σύντηξης EML4-ALK είναι μια μικρή γενετική ανωμαλία στο NSCLC [21], [22], η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του πνεύμονα αυξάνεται σε πολλές χώρες, ο απόλυτος αριθμός των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα που φέρει το γονίδιο σύντηξης EML4-ALK δεν είναι ασήμαντο. Crizotinib, ένας διπλός αναστολέας τυροσινικής κινάσης ΚΟΑ /ALK έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική για τη θεραπεία ασθενών με ALK-θετικό NSCLC. Με βάση την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της, crizotinib εγκρίθηκε πρόσφατα από το FDA των ΗΠΑ για τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένο ALK-θετικό NSCLC. Ωστόσο, η συχνότητα εμφάνισης της

ALK

αναδιάταξη είναι σχετικά χαμηλή, που κυμαίνονται από 2 έως 5%. Ακόμη και όταν ένας εμπλουτισμένος πληθυσμός των ασθενών με NSCLC επιλέγονται με βάση την προγνωστική κλινικά χαρακτηριστικά τους, όπως η νεαρότερη ηλικία, την κατάσταση της μη καπνιστές, και το αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας, είναι δύσκολο να προσδιοριστούν τα υποσύνολα ALK-θετικών όγκων. Ως εκ τούτου, η αποτελεσματική εξέταση για ασθενείς με

ALK

-rearranged NSCLC είναι ένα κρίσιμο ζήτημα στην κλινική πράξη.

Το ALK δοκιμασία FISH διάλειμμα-εκτός έχει υπηρετήσει ως Dignostic δοκιμή σύντροφος για την ίδρυση ALK θετικότητας κλινικές δοκιμές crizotinib [15]. Στη θεωρία, ALK FISH είναι ικανή να ανιχνεύσει οποιαδήποτε αναδιάταξη συμμετοχή

ALK

, ανεξάρτητα από τους εταίρους σύντηξης ή το

EML4-ALK

παραλλαγές, σε FFPE ιστού που αποτελεί την πιο κοινή μέθοδος για την επεξεργασία και την αποθήκευση δειγμάτων όγκου. Ωστόσο, από την τεχνολογική και οικονομική προοπτική, FISH για την ρουτίνα ανίχνευσης μεγάλης κλίμακας

ALK

αναδιάταξη στον NSCLC εξακολουθεί να είναι προκλητική. Είναι επείγον να αναπτυχθούν και να επικυρωθούν πιο αποδοτικές μεθόδους για την ανίχνευση αυτή τη γενετική ανωμαλία. Οι τρέχουσες διαγνωστικές προσεγγίσεις για την ανίχνευση

ALK

αναδιάταξη περιλαμβάνουν ανοσοϊστοχημεία (IHC), FISH και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) -με βάση μεθόδους. Ωστόσο, επαρκείς λεπτομέρειες για την κατάλληλη σύγκριση με τα ψάρια είναι σήμερα λείπουν.

IHC είναι μια γρήγορη και οικονομική μέθοδος προτιμάται από τους παθολόγους για τη συνήθη διάγνωση. Μπορεί να πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε μια ποικιλία ιστολογίας και κυτταρολογίας δείγματα. Αν και η ανοσοϊστοχημική τεχνική δεν ανιχνεύουν άμεσα το ίδιο το γονίδιο σύντηξης ALK, με βάση την παρατήρηση ότι ALK δεν είναι ανιχνεύσιμη σε οποιαδήποτε φυσιολογικούς ιστούς εκτός από τον εγκέφαλο [23], ALK-ανοσοαντιδραστικότητα σχετίζεται με υπερέκφραση του γονιδίου, λόγω της δραστηριότητα αλλαγμένη υποκινητή που είναι ιδιαίτερα χαρακτηριστικό της

ALK

αναστροφή. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ορισμένα εμπορικώς διαθέσιμα αντισώματα ALK έχουν σχετικά χαμηλότερη ευαισθησία στην ανίχνευση ALK με IHC, πιθανώς λόγω ασθενούς μεταγραφική δραστηριότητα της περιοχής του υποκινητή-ενισχυτή του

EML4

που κινεί την έκφραση του EML4-ALK. Το αντίσωμα D5F3 (Cell Technology σηματοδότηση) είναι ένα από τα πιο ελπιδοφόρα αντισώματα για την ανίχνευση

ALK

αναδιάταξη σε NSCLC [19]. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες εξακολουθούν να απαιτούνται για την επικύρωση συμφωνία μεταξύ IHC και FISH σε μεγαλύτερες σειρές δειγμάτων

Στην παρούσα μελέτη, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα (Κλώνος SP8? Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, USA)., εκείνο που χρησιμοποιείται συνήθως, καλά δοκιμασμένο ALK αντίσωμα στην ίδια αραίωση όπως χρησιμοποιείται στην ΑίΟί, κάνοντας χρήση του πιο πρακτικό από ένα εργαστήριο προοπτική διαγνωστικής. Αυτό το αντίσωμα αναγνωρίζει μια ανθρώπινη πρωτεΐνη p80, που προσδιορίζονται ως υβρίδιο γονιδίου ALK και το γονίδιο nucleophosmin (NPM) που προκύπτει από την t (2? 5) (Ρ23? Q35) μετατόπιση βρίσκονται στο 30-50% των μεγάλων λεμφωμάτων κυττάρων CD30 +. Αναγνωρίζει επίσης την πρωτεΐνη ALK πλήρους μήκους. Η μέθοδός μας IHC βασίζεται σε τυποποιημένη μέθοδο IHC για τη συνήθη πρακτική παθολογία. Εμείς παρατεταμένη αντιγόνο ανάκτηση ώρα και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε αντίσωμα 4 ° C για την ενίσχυση της ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Η ALK-θετικό ρυθμό σε περιπτώσεις NSCLC μας (20/473, 4,2%) ήταν συγκρίσιμο με το ποσοστό της EML4-ALK μεταγραφή σύντηξης που αναφέρθηκαν σε προηγούμενες μελέτες (2-5%). Όλα τα ALK-θετικών περιπτώσεων NSCLC από την IHC έδειξε γονιδιακή αναδιάταξη ALK με FISH ή /και QPCR. Από την άλλη πλευρά, ανάμεσα σε 473 περιπτώσεις NSCLC, επιλέξαμε τυχαία 110 IHC-neagative περιπτώσεις με αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας να αξιολογήσει

ALK

αναδιάταξη με FISH, και διαπίστωσε ότι δεν υπήρχαν περιπτώσεις όπου

ALK

γονιδιακή αναδιάταξη ανιχνεύθηκε. Σε αντίθεση με μια προηγούμενη μελέτη [6], η δοκιμή IHC με αντίσωμα SP8 έδειξαν υψηλότερη ειδικότητα και ευαισθησία στη μελέτη μας. Η χρώση ALK παρείχε ένα πολύ καθαρό, εύκολα ερμηνεύσιμο ανοσολογική αντίδραση χωρίς να διαταραχθεί χρώση υπόβαθρο στις θετικές περιπτώσεις. Αυτή η διαφορά πιθανώς προέκυψε από τη διαφορετική διαδικασία IHC όπως ανάκτηση αντιγόνου και επώαση αντισώματος, ή προέκυψαν από τις διακυμάνσεις στην επεξεργασία των ιστών σε διαφορετικά εργαστήρια. Τα αποτελέσματά μας απέμενε να επιβεβαιωθεί σε μελέτες lager ομάδα.

RT-PCR του cDNA που έχει μια ευρέως εφαρμογή της στρατηγικής ελέγχου για το γονίδιο ALK αναδιατάξεις. Με ανάλυση αλληλουχίας του προϊόντος PCR, η ειδική EML4-ALK παραλλαγών που εκφράζεται μπορεί να προσδιοριστεί. Ωστόσο, τα νέα συνεργάτες σύντηξης ALK δεν θα ανιχνευθούν με τέτοιες τεχνικές. Σε πρόσφατες μελέτες, η RT-PCR με βάση την ανίχνευση του

ALK

αναδιάταξη έχει σε μεγάλο βαθμό περιορίζεται σε φρέσκο ​​ή κατεψυγμένο ιστό. Σε σύγκριση με multiplex RT-PCR, QPCR εμφανίζεται μια απολύτως κατάλληλη μέθοδος για την άμεση αναγνώριση της παραλλαγής και της ανίχνευσης του επιπέδου έκφρασης της σύντηξης, λόγω του χαμηλού κόστους της και γρήγορο χρόνο ολοκλήρωσης. RT-PCR με βάση την ανίχνευση του

ALK

αναδιάταξη στους ιστούς FFPE απαιτεί βελτιστοποίηση του σχεδιασμού ανάλυσης και μένει να αξιολογηθεί σε μεγάλες μελέτες κοόρτης. Στη μελέτη μας, πραγματοποιήσαμε QPCR σε ιστούς FFPE από 13 ALK-θετικών περιπτώσεων από την IHC. 2 περιπτώσεις ήταν αρνητικές για

EML4-ALK

από QPCR, αλλά θετική για

ALK

ρύθμιση με FISH. Προφανώς, υπήρχαν μυθιστόρημα συνεργάτες σύντηξης ALK ή νέων

EML4-ALK

παραλλαγή, ενώ ο σχεδιασμός δοκιμασία μας συμμετέχουν μόνο εννέα γνωστούς

EML4-ALK

παραλλαγές. Αυτό παρέμεινε να επικυρώνονται με προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδίου. Σε επιπλέον, η υποβάθμιση του RNA σε τεμάχια ιστού FFPE μπορεί επίσης να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Στη μελέτη μας, όλοι οι δοκιμαστεί μπλοκ ιστού FFPE ήταν 7-45 μηνών-παλιά, όταν εκτελέστηκε το έργο εντοπισμού μας. ποιότητα του RNA και η απουσία μόλυνσης με γονιδιωματικό DNA ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης φορμαλδεϋδης-αγαρόζης. Έχουμε ποσοτικοποιείται επίσης το επίπεδο του β-ακτίνης ως το ενδογενές ελέγχου ποιότητας RNA. Η απαιτούμενη ποιοτικός έλεγχος συμπεριλαμβανομένου ενός ελέγχου χωρίς πρότυπο, γνωστό ALK-θετικός και αρνητικός μάρτυρας, πραγματοποιήθηκε καθ ‘όλη τη διαδικασία. Τα αποτελέσματά μας απέδειξαν QPCR σε ιστούς FFPE δεν ήταν αρκετά αποτελεσματική ως μέθοδος ανίχνευσης σόλα, αλλά παρέμεινε χρήσιμο για τον προσδιορισμό της εμπλεκόμενων παραλλαγή σύντηξης όταν το κατεψυγμένο υλικό δεν είναι διαθέσιμο.

Πραγματοποιήσαμε FISH, η οποία θεωρείται ως η τρέχουσα