Abstract

Τρισδιάστατο καλλιέργειες (3D) των καρκινικών κυττάρων που αναπτύσσονται σε λαμινίνη-πλούσιος-εξωκυττάριας μήτρας (lrECM) θεωρείται ότι αντανακλά ανθρώπινους όγκους πιο ρεαλιστική σε σύγκριση με κύτταρα που αναπτύχθηκαν ως μονοστιβάδα σε πλαστικά. Εδώ, ερευνήσαμε συστηματικά τον αντίκτυπο της ECM στο φαινότυπο, γονιδιακή έκφραση, EGFR σηματοδότηση μονοπατιού, και στην αναστολή του EGFR σε κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται συνήθως για καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). LrECM on-top (3D) δοκιμασίες καλλιέργειας έγιναν με τις κυτταρικές γραμμές CRC SW-480, ΗΤ-29, DLD-1, LOVO, Caco-2, COLO-205 και COLO-206F. Μορφολογία του lrECM καλλιεργούμενων κυτταρικών γραμμών CRC προσδιορίστηκε με αντίθεση φάσης και συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού laser σάρωσης. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάσθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία, επεμβατική ικανότητα των κυτταρικών γραμμών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμους Boyden, και των μεταναστευτικών δράση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία φράχτη. Διαφορική γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε στο μεταγραφικό επίπεδο από την πλατφόρμα συστοιχία Agilent. EGFR ανεστάλη με τη χρήση του ειδικού αναστολέα μικρού μορίου AG1478. Ένα συγκεκριμένο πρότυπο ανάπτυξης σφαιροειδές παρατηρήθηκε για όλες τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε CRC. DLD-1, ΗΤ-29 και SW-480 και Caco-2 παρουσίασαν μια σαφή σχηματισμό στερεών καρκινικών κυττάρων, ενώ LOVO, Colo-205 και COLO-206F χαρακτηρίζονταν από το σχηματισμό των σταφυλιών-όπως δομές. Αν και η εμφάνιση μιας μορφολογίας σφαιροειδούς δεν συσχετίζονται με μια αλλοιωμένη μεταναστευτικά, επεμβατική, ή πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυτταρικών γραμμών CRC, η γονιδιακή έκφραση ήταν σαφώς μεταβληθεί σε κύτταρα αναπτύσσονται σε lrECM σε σύγκριση με 2D καλλιέργειες. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κυτταρικές σειρές άγριου τύπου KRAS, η αναστολή του EGFR ήταν λιγότερο αποτελεσματική σε lrECM (3D) καλλιέργειες σε σύγκριση με καλλιέργειες 2D κυττάρων. Έτσι, συγκρίνοντας τα δύο μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας 3D 2D και, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την επίδραση του ECM στην ανάπτυξη του καρκίνου. Σε σύγκριση με τα συμβατικά καλλιέργεια 2D κυττάρων, η (3D) μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας lrECM προσφέρει την ευκαιρία να ερευνήσει μόνιμες κυτταρικές σειρές CRC υπό περισσότερο φυσιολογικές συνθήκες, δηλαδή στο πλαίσιο των μοριακών θεραπευτικών στόχων και φαρμακολογική αναστολή τους

Citation.: Luca AC, Mersch S, Deenen R, Schmidt S, Messner Ι, Schäfer KL, et al. (2013) Επίδραση του 3D μικροπεριβάλλον στο φαινότυπο, Gene Expression, και EGFR Αναστολή του Καρκίνου του παχέος Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 8 (3): e59689. doi: 10.1371 /journal.pone.0059689

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 29 Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 17 του Φεβρουαρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 26, Μαρτίου του 2013

Copyright: © 2013 Luca et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από την Forschungskommission της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Ντίσελντορφ (41/09 με AK και 24/10 στο KLS), ο Rudolf Bartling-Stiftung (ΙΙ /98 έως NHS) και με επιχορηγήσεις από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB . 728) και η NRW απόφοιτος του σχολείου «BioStruct» (τόσο για RPP) Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. η συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Μόνιμη καρκινικές κυτταρικές σειρές μπορούν να παρέχουν μια σχεδόν απεριόριστη προσφορά των κυττάρων με αρκετά παρόμοια γονότυπους και φαινοτύπους [1] και είναι ουσιαστικά η μόνη επιλογή για μηχανιστικές μελέτες των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων υπό ελεγχόμενες συνθήκες [2], [3]. Κατά συνέπεια, ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως

in vitro

μοντέλα για ανθρώπινο καρκίνο. Ένα παράδειγμα για μια επιτυχημένη και καλά σημειωθεί περιοχή εφαρμογής υπήρξε η ανακάλυψη, ανάπτυξη και δοκιμή του καρκίνου φάρμακα [3]. Παρ ‘όλα αυτά, ανάλογα με την επιστημονική ζήτημα υπάρχουν επίσης προφανείς περιορισμούς στη μελέτη αλλαγές σε καρκινικά κύτταρα που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου αφού οι περισσότεροι μόνιμοι καρκινικές κυτταρικές γραμμές αποδείχθηκε από προχωρημένους καρκίνους με προοδευμένη γονότυπους [1]. Ωστόσο, ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που περιορίζουν την τιμή των καρκινικών κυτταρικών σειρών ως μοντέλο για ανθρώπινο καρκίνο οφείλεται στην πιο κοινή μέθοδος για την καλλιέργεια κυττάρων γραμμές

in vitro

, δηλαδή ως ομοτυπική μονοστιβάδα επί πλαστικών υποστρωμάτων (2D ). Ότι οι πρωτογενείς καρκίνους και μεταστάσεις είναι πολύπλοκες ετερότυπη τρισδιάστατες δομές ενσωματωμένα σε διακριτές μικροπεριβάλλοντα οργάνου-ειδική, είναι γνωστό ότι τα κύτταρα που έχουν καλλιεργηθεί ως κλασική καλλιέργειες 2D χάνουν πολλά από τα χαρακτηριστικά της τους

in vivo

ομολόγους [ ,,,0],4]. Επιπλέον, σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση μπορεί να μεταβληθεί τεχνητά [5].

Ένα κοινό χαρακτηριστικό όλων των κανονικών και κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων είναι ότι αυτά είναι φυσιολογικώς σε στενή επαφή με την εξωκυτταρική μήτρα (ECM) . Η ECM, που αποτελείται από ινώδεις πρωτεΐνες και γλυκοζαμινογλυκάνες, περιβάλλει τα επιθηλιακά κύτταρα στο εξωκυττάριο χώρο και αποτελεί βασική μεμβράνη τους. Η ECM παρέχει όχι μόνο τη σωματική δύναμη του οργανωμένου επιθηλιακά κύτταρα [6], [7], αλλά επίσης σημαντικό κλειδί βιοχημικές δομές και σήματα για την πολικότητα και την ανάπτυξη [7], [8]. Ένα απλό σύστημα για

in vitro

μοντελοποίηση ECM είναι ένα παρασκεύασμα διαλυτοποιημένα βασικής μεμβράνης που εξάγονται από το Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) σάρκωμα ποντικού, ένας όγκος πλούσιο σε πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας που περιλαμβάνουν λαμινίνη, κολλαγόνο IV, πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαρίνης και εντακτίνη /εντακτίνης [9] – [18]. Λόγω της μοριακής σύνθεσης της, ιδιαίτερα υψηλή περιεκτικότητα σε λαμινίνη του, θεωρείται ότι είναι ένα κατάλληλο υποκατάστατο για την βασική μεμβράνη. Εάν τα επιθηλιακά κύτταρα καλλιεργούνται εντός αυτού του λαμινίνη πλούσια εξωκυτταρική μήτρα (lrECM), μεγαλώνουν ως τρισδιάστατες δομές [15], [16], [19]. Πρωτοποριακή εργασία της ομάδας Bissell και άλλοι – γίνονται κυρίως σε πρωτογενή κύτταρα του μαστού και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές σειρές – αποδεικνύεται δραματική μορφολογικές και βιοχημικές διαφορές μεταξύ φυσιολογικών και κακοήθων κυττάρων που αναπτύσσονται 2D σε πλαστικά υποστρώματα και 3D στο lrECM, αντίστοιχα [6], [20 ], [21]. Από κλινική άποψη, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι lrECM (3D) καλλιέργεια – ως μοντέλο πλησιέστερα προς το

in vivo

κατάσταση – μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικές αποκρίσεις σε μοριακές θεραπείες, όπως φαίνεται πρόσφατα για τον καρκίνο του μαστού κύτταρο γραμμές [22], [23], [24]. Παραδόξως, lrECM (3D) καλλιέργειες είναι ακόμη σπάνια χρησιμοποιούνται σε πειράματα με κυτταρικές σειρές καρκίνου και μόνο λίγες μελέτες αναλύονται συστηματικά τα αποτελέσματα των lrECM καλλιέργειες σε μόνιμες κυτταρικές σειρές που παρέχει βασικές πληροφορίες σχετικά με αυτά τα μοντέλα. Μέχρι στιγμής, όπως συστηματικές αναλύσεις της lrECM πολιτισμών επικεντρώθηκε κυρίως στην φαινοτυπική χαρακτηρισμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού που καλλιεργούνται υπό την lrECM 3D

vs.

2D συνθήκες.

Εδώ, επεκτείναμε τη λειτουργική κατανόηση της οι επιδράσεις της διαφορικής lrECM (3D)

vs.

2D συνθήκες ανάπτυξης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Διερευνήθηκε συστηματικά τον αντίκτυπο των lrECM για φαινοτύπου των κυττάρων και τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε κοινώς χρησιμοποιούμενη κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι κυτταρικές σειρές CRC εμφανίζουν διαφορετικούς τύπους μορφολογικά σφαιροειδές όταν καλλιεργούνται σε lrECM. Αν και σφαιροειδές μορφολογία των γραμμών CRC δεν συσχετίζονται με μια αλλοιωμένη αποδημητικά, επεμβατική ή πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων, κυτταρικές σειρές που καλλιεργούνται υπό lrECM (3D) συνθήκες παρουσίασαν

per se

μια διαταραχή του πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τον έλεγχο 2D πολιτισμούς. Επιπλέον, η έκφραση του γονιδίου ήταν σαφώς μεταβληθεί σε κυτταρικές σειρές CRC όταν καλλιεργηθεί υπό lrECM /3D συνθήκες. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα της φαρμακολογικής αναστολής EGFR ήταν μειωμένη σε κύτταρα CRC αναπτύσσονται σε lrECM σε σύγκριση με 2D καλλιέργειες. Έτσι, η 3D μικροπεριβάλλον έχει σημαντική επίδραση στην κυτταρική φαινότυπο και φαρμακολογική ευαισθησία των κυτταρικών σειρών CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

LOVO λήφθηκε από η Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων (ECACC, Salisbury, UK), Colo-205 από την American Type Culture Collection (ATCC, LGC Πρότυπα GmbH, Wesel, Γερμανία), Caco-2, Colo-206F, DLD-1, ΗΤ-29 και SW-480 από το Κέντρο γερμανική πόρων Βιολογικών υλικών (DSMZ, Braunschweig, Γερμανία). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας ιστού εντός μέσου RPMI 1640+ GlutaMAX ™ -Ι (Gibco /Invitrogen, Darmstadt, Germany) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco /Invitrogen,). Τα κύτταρα καλλιεργούνται είτε σε πλαστικό καλλιέργειας ιστού (2D) (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany) ή 3D εντός αυξητικού παράγοντα μειωμένη λαμινίνη πλούσια εξωκυτταρική μήτρα (lrECM 3D) on-top καλλιέργειες με εμβολιασμό κυττάρων πάνω σε ένα λεπτό πηκτώματος εκχύλισμα Engelbreth-Holm-Swarm όγκου (BIOCOAT Matrigel Υπόγειο μεμβράνης, παράγοντα ανάπτυξης μειώνεται, BD Biosciences, Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στη δοκιμασία Matrigel on-top σε πυκνότητα 1,8 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων. Σφαίρες καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες πριν από την ανάκτηση από Matrigel. Για τις μελέτες μορφολογία, σφαίρες καλλιεργήθηκαν μέχρι 10 ημέρες. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε δεύτερη ημέρα σε 3D καλλιέργειες. 3D-σφαίρες ανακτήθηκαν από το υπόγειο μεμβράνης Matrigel με απομάκρυνση του μέσου από την καλλιέργεια Matrigel κυττάρων και επώαση σε 400 μΙ /φρεάτιο δισπάση (BD Biosciences, Χαϊδελβέργη, Γερμανία), προθερμασμένο στους 37 ° C, για 2 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2. Η ενεργοποίηση του δισπάση διεκόπη με 10 mM EDTA σε 1 × PBS. Σφαίρες φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν με 1 χ PBS. 2D καλλιεργημένα κύτταρα επίσης πλύθηκαν με PBS και αποξέστηκαν του δίσκου καλλιέργειας. Για την απομόνωση πρωτεΐνης 3D σφαίρες ανακτήθηκαν από Matrigel με επώαση με 5 mM EDTA σε PBS για 30 λεπτά επί πάγου που ακολουθείται από τρία στάδια πλύσης με PBS.

KRAS και BRAF Mutation Ανάλυση

Τυπική αλληλουχίας κύκλου διεξήχθη για να (επαν) αξιολογηθεί η

KRAS

και

BRAF

κατάσταση μετάλλαξης των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου γραμμές (Πίνακας 1). Τα εξόνια 2, 3 και 4 του

KRAS

αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτιδικά εναύσματα: 5′- AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 ‘και 5′-AAAGAATGGTCCTGCACCAG-3′ για το εξόνιο 2, 5’-GGATTCCTACAGGAAGCAAGT-3 ‘και 5 «-GGCAAATACACAAAGAAAGC-3 ‘για το εξόνιο 3 και 5′- AGACACAAAACAGGCTCAGGA-3′ και 5’-AAGAAGCAATGCCCTCTCAA-3 ‘για το εξόνιο 4. για

BRAF

την ενίσχυση του εξωνίου 15 εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας πρόσθιο εκκινητή 5′ – TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής 5′-AGCCTCAATTCTTACCATCCA-3’. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η αντίστροφη εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA των

KRAS

εξόνιο 2 και 4, εμπρός εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για

KRAS

εξόνιο 3 και BRAF εξόνιο 15, αντίστοιχα [25].

STR ανάλυση

προς DNA ανάλυση STR αποτυπωμάτων απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Qiagen αίματος και ιστού Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις κατασκευές διδασκαλίας. Γονιδιωματικό DNA (1 ng) ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους genRES® MPX-2 και genRES® ΜΡΧ-3 πολλαπλή PCR συστήματα (Serac GmbH, Bad Homburg, Γερμανία) για τη δημιουργία 9 και 12 διαφορετικές αλληλουχίες δείκτη STR. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε τριχοειδή sequencer ΑΒΙ 310 και allelotyped από το λογισμικό «genotyper V3.1» (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [26].

Βιωσιμότητας Κυττάρων, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση Δοκιμασίες

η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Ενώ τα κύτταρα απλώθηκαν απευθείας σε πλαστικά πιάτα ιστού για 2D καλλιέργειες, 3D καλλιέργειες παρασκευάστηκαν με επίστρωση των κυττάρων σε ένα λεπτό στρώμα Matrigel. Μετά από μια περίοδο επώασης για 48 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2, 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) (Sigma-Aldrich, Αμβούργο, Γερμανία) προστέθηκε στα μέσα για 4 ώρες πριν στερέωση όλη τη νύκτα με διάλυμα ΜΤΤ διακοπή που περιέχει 10% SDS, 5% 1-βουτανόλη και 0,01 Μ HCI. Μείωση του ΜΤΤ προς φορμαζάνη μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας ένα Tecan ανατολή απομακρυσμένο αναγνώστη (Tecan Group Ltd., Maennedorf, Αυστρία).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που αναπτύσσονται σε συνθήκες καλλιέργειας 2D ή 3D ποσοτικοποιήθηκε με 5-Βρωμο- 2-δεοξυουρακίλη (BrdU) την ενσωμάτωση με τη χρήση του 5-βρωμο-20-δεοξυ-ουριδίνη επισήμανσης και ανίχνευσης Kit Ι (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Μετά από μια περίοδο επώασης για 48 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2 μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 1 ώρα στους 37 ° C και 5% CO

2 με μέσα σήμανσης BrdU. 3D σφαίρες ανακτήθηκαν από Matrigel με επώαση με 5 mM EDTA σε PBS για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε 1 χ PBS και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 400 rpm. Τα ανακτημένα σφαιροειδή επιστρώθηκαν σε γυάλινες πλάκες και ξηραίνονται όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Μέχρι 200 ​​κύτταρα μετρήθηκαν σε πέντε διαφορετικά πεδία ανά παρασκεύασμα χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Axio Πεδίο φθορισμού (Zeiss, Jena, Germany). Ο αριθμός των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων υπολογίστηκε ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των ϋΑΡΙ-θετικών κυττάρων ανά πεδίο (τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία ανά καλυπτρίδα). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε ως ο λόγος μεταξύ του αριθμού των ϋΑΡΙ-θετικών κυττάρων με κατακερματισμένο πυρήνες, που είναι γνωστή ως μορφολογικά χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης, και όλα τα κύτταρα ϋΑΡΙ-θετική.

φράχτη Δοκιμασία (Δοκιμασία Μετανάστευσης)

Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης 7,5 × 10

3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα φράκτη 16 χιλιοστά (Aix Scientifics®, Άαχεν της Γερμανίας). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS έως ότου επιτεύχθηκε συρροή και η περίφραξη απομακρύνθηκε. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για τέσσερις ημέρες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με διάλυμα χρώσης haemalaun της Mayer. Διάμετροι χρωματισμένο μονοστιβάδες κυττάρων αξιολογήθηκαν σε mm χρησιμοποιώντας τον Doc Σύστημα Versa Imaging (BioRad, Μόναχο, Γερμανία). Για να γίνει διάκριση μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης των κυττάρων, προ-πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 1% FBS ή 10% FBS.

Εισβολή Δοκιμασία

δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας BD Biocoat Matrigel ™ ™ εισβολή Επιμελητηρίου (BD Biosciences), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι μεμβράνες στερεώθηκαν σε γυάλινες πλάκες και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα εντός καθορισμένου κεντρική περιοχή της μεμβράνης μετρήθηκαν.

Drug Θεραπεία και Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

υποδοχέα EGF αναστέλλεται από αναστολέα κινάσης τυροσίνης τυρφοστίνης AG1478 (Sigma Aldrich). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 6 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με AG1478 σε μια τελική συγκέντρωση 20 μΜ, 10 μΜ, 5 μΜ, 2,5 μΜ, 1 μΜ ή 0,1 μΜ για 48 ώρες και 96 ώρες σε συστήματα κυτταρικής καλλιέργειας 2D και 3D. DMSO /μεθανόλη σε ισομοριακές συγκεντρώσεις σε συγκεντρώσεις AG1478 διατελέσει ελέγχου του οχήματος. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φαρμακευτική αγωγή μετρήθηκε εκτελώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ όπως περιγράφηκε παραπάνω.

Ολικό RNA Εκχύλιση και cDNA Synthesis

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με οδηγίες του κατασκευαστή. RNA αραιώθηκε σε 50-80 μΙ νουκλεάσης ελεύθερη και αποστειρωμένο νερό. Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε φασματοφωτομετρικώς στα 260 nm και την ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την Agilent 2100 Bioanalyzer. Για τη σύνθεση cDNA, αντίστροφη μεταγραφή (RT) εκτελέστηκε σε τελικό όγκο 20 μΐ με τη χρήση αραιωμένος 1:10 ολίγο (dT) εκκινητή (Invitrogen), 2 μg RNA, και 4 U transcriptor ανάστροφης μεταγραφάσης σε 5 × ρυθμιστικό RT (Roche , Mannheim, Germany).

Real Time PCR

Αστάρια και σύμφωνα με ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το Universal ProbeLibrary Δοκιμασία Κέντρο σχεδιασμού (ProbeFinder έκδοση 2.45, η Roche Applied Science). Εκκινητές όλα συντίθενται από MWG-Biotech, Ebersberg, Γερμανία (Πίνακας S1). cDNA αραιώθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 1 ng /μl. Για την PCR, 2 μΙ οϋΝΑ εκμαγείο (ή νερό ως αρνητικός έλεγχος) αναμίχθηκαν με 12,5 μΐ γρήγορης εκκίνησης Taq Man Probe κύριο μίγμα (Roche), 0.25 μΐ από κάθε προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή (20 μΜ έκαστο) και 0.25 ανιχνευτή μΙ (Universal ProbeLibrary Σετ ανθρώπινη, Roche). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν. Για την κανονικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων στόχων, χρησιμοποιήσαμε αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH) ως το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς. Ποσοτική πραγματικού χρόνου-PCR (qPCR) εκτελέστηκε στην DyadDisciple χρωμο 4 (BioRad) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθήθηκε από 40 κύκλους που το καθένα περιλαμβάνει μετουσίωση επί 15 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, ανόπτηση και επέκταση για 1 min στους 60 ° C. Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCT μέθοδο [27].

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης πρωτεΐνη Pb1 (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1% Nonident Ρ40 (Sigma) συμπληρωμένο με ένα δισκίο φωσφατάσης αναστολέα δισκία κοκτέιλ και κοκτέιλ PhosSTOP Φωσφατάση Αναστολέας (αμφότερα Roche). οι διαλυτές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 ° C και 12.000 σαλ. δείγματα που περιείχαν 40 μg του Διευκρινίζεται λύματα πρωτεΐνη ανά λωρίδα διαχωρίστηκαν ηλεκτροφορητικά σε πηκτώματα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντι-ΕΟΡ αντισώματος του υποδοχέα. (κλώνος C74B9? Cell Signaling, Denver, ΜΑ, USA). όλη τη νύκτα στους 4 ° C για ανίχνευση ΑΚΤ1 μονοκλωνικού κουνελιού αντι-φωσφο ΑΚΤ1 αντίσωμα (Ser473) (κλώνος 193H12? Cell Signaling) και αντι-ΑΚΤ1 μονοκλωνικού αντισώματος κουνελιού (κλώνος C73H10? Cell Signaling). χρησιμοποιήθηκαν ΜΑΡΚ ρ44 /42 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο ρ44 μονοκλωνικό κουνέλι /42 ΜΑΡΚ (Thr202 /Tyr204) αντίσωμα (κλώνος 20G11? Cell Signaling) και αντι-ρ44 /42 ΜΑΡΚ μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Κλώνος 137F5? Cell Signaling). Ανίχνευση ΜΕΚ1 /2 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό κουνελιού αντι-φωσφο ΜΕΚ1 /2 (Ser217 /221) αντίσωμα (Cell Signaling) και /αντίσωμα 2 μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-ΜΕΚ1 (Κλώνος 47E6? Cell Signaling). Για τους μη-φωσφο (ενεργό) β-κατενίνης (Ser33 /37 /Thr41) χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κλώνος D13A1 (Cell Signaling) και για το σύνολο της β-κατενίνης κλώνος μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού D10A8 (Cell Signaling). Βήτα-ακτίνη ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ποντικού μονοκλωνικό αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Κλώνος AC-15? Sigma). Δευτερογενής αντίσωμα αντι-κουνελιού (Cell Signaling) ή αντίσωμα αντι-ποντικού (Sigma) που συνδέεται με ραφανιδική υπεροξειδάση επωάσθηκαν για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύεται με τη χρήση του κιτ ανοσοποιητικού-Star ™ Western C ™ (BioRad) χρησιμοποιώντας Versa Doc Σύστημα Απεικόνισης (BioRad).

Ομοεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

τα ανακτημένα σφαιροειδή επιστρώθηκαν σε γυάλινα πλακίδια, ξηραίνονται όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου και αποθηκεύονται στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Τα πλακίδια επανυδατώθηκαν σε 1 × PBS και μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη μεθανόλη /ακετόνη (1:01) για 20 λεπτά στους -20 ° C ακολουθούμενο από δύο στάδια έκπλυσης σε 1 × PBS κάθε επί 5 λεπτά. Ο αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε σε ρυθμιστικό ανοσοφθορισμό περιέχει 4% αλβουμίνη βόειου ορού και 0,05% σαπωνίνη σε PBS για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η χρώση έγινε σε PBS που περιέχει 1% BSA και 0,05% σαπωνίνη για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Mouse μονοκλωνικό αντι-ΕρΟΑΜ αντίσωμα BerEp4 (Dako, Αμβούργο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 2 μg /ml. MOPC (Sigma) χρησίμευσε ως έλεγχος ισοτύπου και επωάστηκε σε μία συγκέντρωση 2 μg /ml. Στη συνέχεια, τα δείγματα πλύθηκαν τρεις φορές με 1 χ PBS. Δευτερογενής αντίσωμα, Alexa Fluor® 488 γίδινη αντι-ποντικού IgG (Invitrogen), επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε συγκέντρωση 10 μg /ml, που ακολουθήθηκε από δύο στάδια πλυσίματος το καθένα για 5 λεπτά. Τα κύτταρα αντίθετα με 0,1 μg /ml ϋΑΡΙ (Sigma) σε 1 × PBS για 4 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και τοποθετείται με διάλυμα VECTASHIELD® (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας LSM 510-Meta ομοεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss, Jena, Germany) εξοπλισμένο με ένα 40 × /1.3 αντικειμενικό φακό και διέγερσης μήκη κύματος 364 nm και 488 nm. Ομοεστιακή εικόνες που εμφανίζονται είναι μόνο οπτικό διαφάνειες πάχους 0,5 μm.

Η κατάταξη των σφαιροειδή

Σε μια προηγούμενη εργασία της ομάδας Bissell [2] δείχθηκε ότι η μόνιμη καρκίνου του μαστού κυτταρικές σειρές που καλλιεργήθηκαν στην τυποποιημένη lrECM on-top δοκιμασίας, που αναπτύχθηκε από την ομάδα αυτή, που σχηματίζεται σφαιροειδή, που επέδειξε χαρακτηριστική ανάπτυξη μοτίβα όπως αποκαλύπτεται με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης ή ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ. Το σφαιροειδές μορφολογία κατατάσσονται σε τέσσερις διαφορετικές ομάδες ορατή, όπως περιγράφεται από τον Kenny

et al

[2]:. «Γύρο», «μάζα», «σταφύλι-όπως» και «αστεροειδής». Ο τύπος «στρογγυλές» σχηματίζει αποικίες πάνω από τις γέλες χαρακτηρίζονται από πυρήνες που οργανώνονται τακτικά γύρω από το κέντρο της αποικίας. Οι κυτταρικές σειρές «μάζα» τύπου σχηματίζουν αποικίες που μπορεί επίσης να έχει γύρο αποικία περιγράφει κατά μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, αλλά έχουν συμπληρώθηκε κέντρα και αποδιοργανωμένη πυρήνες. Τα σφαιροειδή «σταφυλιού όπως« εμφανίζεται χαλαρό κυττάρου-κυττάρου επαφές με ένα τυπικό σταφύλι-όπως μορφολογία. σφαιροειδή «Αστεροειδή» χαρακτηρίζονταν από μια επεμβατική φαινότυπο με τις προβλέψεις αστεροειδής εισβολή το τζελ [2]. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το σύστημα για την ταξινόμηση των CRC σφαιροειδή κυτταρική σειρά

Gene Expression Αναλύσεις:. Agilent Αναλύσεις Array

Σύνολο παρασκευασμάτων RNA αναλύθηκαν για την ακεραιότητα του RNA από Agilent 2100 Bioanalyzer. Όλα τα δείγματα σε αυτή τη μελέτη παρουσίασαν κοινή υψηλής ποιότητας RNA Ακεραιότητα Numbers (Rins) του 10. Το RNA ποσοτικοποιήθηκε με τη φωτομετρική μέθοδο Nanodrop. Σύνθεση του cDNA και την επακόλουθη φθορίζουσα επισήμανση των cRNA πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (One-Color Microarray-Based Ανάλυση Gene Expression, Low Input Quick Amp Labeling, Vers 6,5?. Agilent Technologies). Εν συντομία, 100 ng ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA, που ακολουθείται από

in vitro

μεταγραφή και ενσωμάτωση του Cy3 σημασμένων νουκλεοτιδίων σε νεοσυντιθέμενη cRNA. Μετά τον κατακερματισμό, την ένδειξη cRNA υποβλήθηκε σε υβριδισμό σε Agilent Ανθρωπίνων 8 × 60 K υψηλής πυκνότητας μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων. αναλύσεις των δεδομένων έγιναν με το λογισμικό GeneSpring GX (Vers 10.5?. Agilent Technologies). Σηματοδοτούν κατανομές έντασης σε όλη δείγματα ομαλοποιήθηκαν από quantile εξομάλυνση. δεδομένα εισόδου προ-επεξεργασίας συνήφθη από την αρχική τιμή μετατροπής με τη διάμεση τιμή όλων των δειγμάτων. Μετά την ομαδοποίηση των δειγμάτων σύμφωνα με την κατάσταση του πολιτισμού (lrECM 3D

vs.

Πολιτισμό 2D, 24

vs. Τετάρτη 25 δείγματα, αντίστοιχα) μια δεδομένη μεταγραφή έπρεπε να εκφράζονται σε τουλάχιστον 75% των δειγμάτων σε οποιαδήποτε από τις δύο ή και τις δύο ομάδες να αναλυθούν περαιτέρω. Ανιχνεύσιμη γονιδιακής έκφρασης πάνω από το υπόβαθρο με αυτόν τον τρόπο χαρακτηρίζεται από «Παρόν» σημαίες σύμφωνα με τις τυπικές ρυθμίσεις GeneSpring για Agilent μικροσυστοιχίες. διαφορική γονιδιακή έκφραση ήταν στατιστικά προσδιορίστηκε με Mann-Whitney-U-test. Με αποτέλεσμα

P

-τιμές διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές σύμφωνα με Benjamini-Hochberg. Μεταγραφές που δείχνει ένα διορθωμένο

P

διορθ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκαν ότι εκφράζονται διαφορικά. αναλύσεις ιεραρχική σύμπλεγμα είτε πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα ή για μεταγραφές, αντίστοιχα, με τη χρήση του Μανχάταν μετρήσεις απόστασης και πλήρη σύνδεση.

Στατιστικά

Όλα τα πειράματα έγιναν ανεξάρτητα εις τριπλούν εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Συσχέτιση μεταξύ σφαιροειδές μορφολογία και την πηγή κυτταρική σειρά (πρωτογενής όγκος

vs.

Μετάσταση) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher (πρίσματος 5, Λογισμικό Γράφημα pad, Inc. La Jolla, CA, USA). Οι διαφορές στην βιωσιμότητα των κυττάρων μετράται με απορρόφηση χρωστικής στα 540 nm, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και στην έκφραση των γονιδίων που μετράται με RT-PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας είτε ένα αντιστοιχισμένο t-test ή το μη παραμετρικό δίπλευρη Mann-Whitney-U-test. Ένα

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε για να δείξει στατιστική σημαντικότητα. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με Prism 5 (Γράφημα Λογισμικό pad, Inc.).

Αποτελέσματα

CRC τηλέφωνα Γραμμές Έκθεμα δύο διαφορετικοί τύποι μορφολογική σφαιροειδές όταν καλλιεργούνται σε lrECM

Πρώτα, ελέγξαμε κατά πόσο οι κυτταρικές σειρές CRC αναπτύσσονται σε lrECM εμφανίσετε μια συγκεκριμένη μορφολογία που μπορούν να ταξινομηθούν σύμφωνα με τις τέσσερις κατηγορίες που περιγράφονται από τον Kenny

et al

[2]. Χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό on-top Όλες οι κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε CRC σχηματίζονται σφαιροειδή όγκου μέσα σε δύο ημέρες. Μέσα σε τρεις μέρες τα σφαιροειδή αναπτύξει μια συγκεκριμένη μορφολογία, η οποία ήταν να αναπαραχθεί σε τουλάχιστον δέκα ανεξάρτητα πειράματα. Ενώ σφαιροειδή αργά αυξάνεται σε μέγεθος, αυτή η μορφολογία ήταν σταθερή μέχρι και 10 ημέρες καλλιέργειας. Πλέον πειράματα παρατήρηση δεν έγιναν. Μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών, τρία διαφορετικά πρότυπα ανάπτυξης παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Σχήμα 1Α): «Στρογγυλό», «μάζα» και «σταφύλι-όπως». Ειδικότερα, Caco-2 είχε χαρακτηριστεί ως «γύρο», ΗΤ-29, DLD-1, και SW-480 ως «μάζα» και LOVO, Colo-206F και COLO-205 ως «σταφυλιών όπως».

μορφολογία Α) η ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών CRC καλλιεργείται υπό 2D (άνω πάνελ) και σχετικά με-top συνθήκες δοκιμασίας lrECM 3D (κάτω πίνακας). Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 3D κατάσταση είτε παρουσιάζουν ένα στρογγυλό (Caco-2), μάζα (DLD-1, ΗΤ-29, SW-480) ή μια σταφύλι-όπως μορφολογία (COLO 205, COLO-206F, LOVO) σε εικόνες αντίθεσης φάσης. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. Β) μικροσκοπία φθορισμού Ομοεστιακή σάρωση με λέιζερ εικόνες της CRC σφαιροειδή. Τα σφαιροειδή αναπτύχθηκαν σε lrECM 3D μικροπεριβάλλοντα για επτά ημέρες. Μετά την απομόνωση, ο μεμβρανώδης πρωτεΐνη EpCAM (πράσινο) χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας Alexa Fluor® 488 κατσίκας αντι-ποντικού IgG. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). μπαρ κλίμακα 10 μm.

Η

Για την αύξηση της χωρικής ανάλυσης και μορφολογική εμφάνιση των διαφόρων 3D σφαιροειδή, εκτελέσαμε ομοεστιακό μικροσκόπιο των κυττάρων από τον εντοπισμό του επιθηλιακού μορίου κυτταρικής προσκόλλησης EpCAM και νουκλεϊκών χρώση με DAPI (Σχήμα 1Β). Κατά συνέπεια, Caco-2 σφαιροειδή εμφανίζεται σαφώς αποδιοργανωμένη πυρήνες και μια συνολική συμπαγή κατασκευή με κέντρα αποικία εμφανίζεται σημαντικά πυκνά συμπληρώθηκε, που ταξινομήθηκαν εκ νέου ως «μάζα». Σε όλες τις άλλες κυτταρικές σειρές συνεστιακή απεικόνιση επικυρώνονται αρχική τους κατάταξη με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι κυτταρικές σειρές με αρκετά διαφορετικές 2D μορφολογίες (δηλαδή COLO-205 και LOVO) παρουσίασαν παρόμοιες μορφολογίες σε lrECM και

αντίστροφα

.

σφαιροειδές Μορφολογία δεν συσχετίζεται με το Μεταναστευτικό, τα χωροκατακτητικά ή πολλαπλασιαστική ικανότητα της CRC γραμμές κυττάρων

Αφού ορίσαμε τις δύο αποκλίνουσες μορφολογίες σφαιροειδές lrECM καλλιεργημένων κυτταρικών σειρών CRC, δηλαδή «μάζα» ή «σταφύλι-όπως», μας ενδιαφέρει αν αυτή η παρατήρηση σχετίζεται με διαφορετικούς κυτταρική ιδιότητες όσον αφορά ένα αλλαγμένο κακοήθους δυναμικού. Στο πλαίσιο αυτό, αξίζει να σημειωθεί ότι όλες οι διερευνηθεί κυτταρικές σειρές CRC με «σταφύλι-όπως το» μορφολογία που προέρχονται από μεταστατικά κύτταρα, ενώ όλοι οι κυτταρικές σειρές CRC με «μάζα» σφαιροειδείς μορφολογία καθιερώθηκαν από πρωτογενή ιστό του όγκου (Fishers ακριβής δοκιμή, ρ = 0,028) (Πίνακας 1).

Κατ ‘αρχάς, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ των κυττάρων της «μάζα» φαινότυπο σύγκριση με τα κύτταρα του «σταφυλιού που μοιάζει με» φαινοτύπου έγινε φανερό. Είναι ενδιαφέρον ότι, κατά τη σύγκριση της βιωσιμότητας, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων που αναπτύσσονται σε δύο διαστάσεις πάνω σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού (2D) με την δοκιμασία lrECM 3D on-top, βρήκαμε μια σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό υπό lrECM 3D συνθήκες (Σχήμα 2Α και Β ). Σε αντίθεση, καμία διαφορά έγινε φανερό όταν ποσοτικοποίηση αποπτωτικών κυττάρων σε 2D και συστήματα καλλιέργειας lrECM 3D (Σχήμα 2 C).

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό 2D ή 3D συνθήκες. Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε 48 ώρες αργότερα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση απορρόφηση στα 540 nm ± SD του τριπλούν. Λευκές ράβδοι αντιπροσωπεύουν κύτταρα καλλιεργούνται σε πλαστικό (2D)? μαύρες μπάρες κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε lrECM (3D). Δύο ουρά

P

-τιμές υπολογίστηκαν με το τεστ Mann-Whitney-U (** δείχνει ένα

P

-τιμή & lt? 0.001? Ns = μη σημαντικό). Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με τον υπολογισμό του ποσοστού των κυττάρων με ενσωμάτωση BrdU και το συνολικό αριθμό των ϋΑΡΙ-θετικών κυττάρων ανά πεδίο (τουλάχιστον τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία ανά καλυπτρίδα). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από τρεις επαναλήψεις. Λευκές ράβδοι αντιπροσωπεύουν κύτταρα καλλιεργούνται σε πλαστικό (2D)? μαύρες μπάρες κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε lrECM (3D). Δύο ουρά

P

-τιμές υπολογίστηκαν με το paired t-test (* υποδηλώνει μια

P

-τιμή & lt? 0,05? Ns = μη σημαντικό). Γ) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε ως ο λόγος της ϋΑΡΙ-θετικών κυττάρων με κατακερματισμένο πυρήνες και όλα τα κύτταρα ϋΑΡΙ-θετική. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από τρία replicates.White ράβδοι αντιπροσωπεύουν κύτταρα που καλλιεργήθηκαν επί πλαστικών (2D)? μαύρες μπάρες κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε lrECM (3D). Δύο-ουρά

P

-τιμές υπολογίστηκαν από το paired t-test (ns = μη σημαντική). Δ) Η μετανάστευση των κυτταρικών σειρών CRC ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό φράχτη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Λευκές ράβδοι αντιπροσωπεύουν κυτταρικές σειρές που ταξινομούνται ως μάζα τύπου? μαύρες μπάρες το σταφύλι-όπως τάξης.

Η

Σύμφωνα με τους μορφολογικούς τύπους που παρατηρήθηκαν σε lrECM 3D πολιτισμούς, διερευνήσαμε το μεταναστευτικό και επεμβατική ικανότητα των κυτταρικών σειρών CRC. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία φράχτη για να εξερευνήσετε τη μετανάστευση και μια δοκιμασία θαλάμου Boyden επικαλυμμένα με Matrigel να ποσοτικοποιήσει την εισβολή, τα πειράματα αυτά δεν αποκάλυψε προφανείς διαφορές όσον αφορά το μεταναστευτικό ή επεμβατική ικανότητα κατά τη σύγκριση της «μάζας» και «σταφύλι-όπως το» κυτταρικές σειρές CRC (Σχήμα 2D και Πίνακας 2). Έτσι, ένας συσχετισμός μεταξύ της εισβολής και τον τύπο μορφολογικές δεν έγινε εμφανής.

Η

γονιδιακή έκφραση μεταβάλλεται σε lrECM 3D «On-top» Καλλιεργείται CRC κύτταρα

Η παρατήρηση ότι κυτταρικές σειρές CRC όχι μόνο αποτελούν τυπικό σφαιροειδή στο lrECM 3D, αλλά και εμφανίζουν μειωμένο πολλαπλασιασμό σε lrECM, προτείνει μια γενική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων μεταξύ 2D και 3D lrECM πολιτισμούς. Για την ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων κατά τη σύγκριση των 2D και 3D lrECM καλλιεργημένα κύτταρα, διερευνήσαμε την μεταγραφικό των κυττάρων που αναπτύσσονται κάτω από 2D και 3D lrECM συνθήκες με τη χρήση της Agilent Ανθρώπινα 8 × 60 K High Density πλατφόρμα Oligonucleotide Microarray. Ως εκ τούτου, τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα στα οποία SW-480, ΗΤ-29, DLD-1, LOVO, Caco-2, COLO-205 και COLO-206F κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό 2D ή 3D lrECM συνθήκες, αντίστοιχα. Συνολικά, 49 δείγματα από 7 διαφορετικές κυτταρικές γραμμές αναλύθηκαν, 25 λαμβάνεται από 2D και 24 από lrECM 3D καλλιέργειες. Πρώτον, πραγματοποιήσαμε μια ιεραρχική ανάλυση συστάδων των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν κάτω από 2D ή 3D lrECM συνθήκες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, κάθε κυτταρική γραμμή εμφάνισε ένα χαρακτηριστικό προφίλ μεταγραφικό, ανεξάρτητα από τη μέθοδο κυτταρικής καλλιέργειας. Ωστόσο, εκτός από το ΗΤ-29 και LOVO, μέσα σε κάθε συστάδα κυτταρική γραμμή, η 2D σε σχέση με τις συνθήκες καλλιέργειας lrECM 3D σαφώς διαχωρισμένα, υποδεικνύοντας διαφορετικά νομοθετικά γονιδίων μεταξύ 2D και 3D lrECM πολιτισμούς. Μετέπειτα ανάλυση αποκάλυψε ότι 225 γονίδια εκφράστηκαν σε σημαντικά διαφορετικά επίπεδα όταν συγκρίνεται κύτταρα διατηρούνται σε 2D και 3D lrECM καλλιέργειες (Σχήμα 3Β). ανάλυση Pathway χρησιμοποιώντας GeneSpring GX 10,5 λογισμικό εντόπισε 14 διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια που είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν μεταξύ τους.