Αφηρημένο

Η ρεσβερατρόλη (RV) είναι ένα φυσικό συστατικό του κόκκινου κρασιού και σταφυλιών που έχει αποδειχθεί ότι είναι μια πιθανή χημειοπροληπτικές και αντικαρκινικό παράγοντα. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αντικαρκινικές και chemopreventive επιπτώσεις RV είναι ελλιπώς κατανοητή. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η αγωγή RV αναστέλλει την κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο όγκος-κατασταλτική επίδραση της χαμηλής δόσης RV δεν συνδέθηκε με οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση της διασπασμένης ΡΑΚΡ και της ενεργοποιημένης κασπάσης-3, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία με RV χαμηλής δόσης μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου μέσω απόπτωσης-ανεξάρτητο μηχανισμό. Μεταγενέστερες μελέτες αποκαλύπτουν ότι η χαμηλή θεραπεία RV δόση επάγει μια σημαντική αύξηση στη γήρανση που σχετίζεται με β-γαλακτοσιδάση (SA-β-gal) χρώση και αυξημένη έκφραση της ρ53 και ρ21 σε κύτταρα NSCLC. Επιπλέον, δείχνουμε ότι RV-επαγόμενη καταστολή της ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα σχετίζεται με μια μείωση στην έκφραση της EF1A. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να ασκήσει RV αντικαρκινικές και chemopreventive αποτελέσματα μέσω της επαγωγής της πρόωρης γήρανσης. Μηχανιστικά, RV-επαγόμενη πρόωρη γήρανση συσχετίζεται με αυξημένη DNA θραύσεων διπλής έλικος (DSBs) και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Η αναστολή της παραγωγής ROS από Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) εξασθενεί DSBs DNA RV-επαγόμενη και την πρόωρη γήρανση. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η θεραπεία RV επάγει σημαντικά (Nox5) έκφραση NAPDH-5 οξειδάσης σε δύο Α549 και Η460 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η RV μπορεί να αυξήσει την παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα μέσω προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης Nox5. Μαζί, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η χαμηλή θεραπεία RV δόση αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα μέσω ενός προηγουμένως παραγνωρισμένη μηχανισμό, δηλαδή την πρόκληση της πρόωρης γήρανση μέσω ROS μεσολάβηση βλάβης του DNA

Παράθεση:. Luo H, Yang Α, Schulte BA , Wargovich MJ, Wang GY (2013) ρεσβερατρόλη προκαλεί πρόωρη γήρανση σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μέσω ROS βλάβη μέσω DNA. PLoS ONE 8 (3): e60065. doi: 10.1371 /journal.pone.0060065

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Νοεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 20 του Φλεβάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Μάρτη του 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ επιχορηγήσεις CA138313 και HL106451 (www.nih.gov). Η εργασία αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από την Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία Θεσμικών Research Grant (# IRG-97-219-08). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα ευθύνεται για περισσότερους θανάτους από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες από το συνδυασμένο θνησιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου, του μαστού και του προστάτη [1]. Ακόμη και με τα νεότερα προηγμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις, το ποσοστό συνολικής επιβίωσης 5 ετών είναι λιγότερο από το 16% και δεν έχει αλλάξει σημαντικά κατά τη διάρκεια πολλών δεκαετιών [1], [2]. Αυτή η κακή πρόγνωση υπογραμμίζει την επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για την πρόληψη και την πιο αποτελεσματική θεραπεία αυτής της θανάσιμης ασθένειας. Τα φυσικά προϊόντα (NPS) που χρησιμοποιούνται ευρέως από τους Αμερικανούς ως συμπληρωματικές και εναλλακτικά φάρμακα (CAM) για την πρόληψη και τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών του ανθρώπου που περιλαμβάνουν καρκίνους [3], [4]. Η χρήση της NPS ως αντικαρκινικοί παράγοντες για τη διαχείριση των ανθρώπινων καρκίνων είναι μια ελκυστική ιδέα, επειδή είναι εύκολα διαθέσιμα και εμφανίζουν μικρή ή καθόλου τοξικότητα [3], [5] – [7]. Η ρεσβερατρόλη (RV) είναι ένα από τέτοια NPs και έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν αντικαρκινικές και τόσο χημειοπροληπτική δυναμικά [3], [8] – [10]. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν χημειοπροληπτική και αντικαρκινικές δράσεις RV δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καθορίσει το ρόλο της πρόωρης γήρανσης σε RV-που προκαλείται από αντικαρκινικά αποτελέσματα στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Κυτταρική γήρανση είναι μια κατάσταση μόνιμης σύλληψη του κυτταρικού κύκλου που μπορεί να προκληθεί από μια ποικιλία τάσεων, συμπεριλαμβανομένων βλάβη στο DNA, βράχυνσης των τελομερών και οξειδωτικού στρες [11] – [13]. Οι δύο κύριες κατηγορίες της κυτταρικής γήρανσης είναι αντιγραφική γήρανση και το στρες που προκαλείται από την πρόωρη γήρανση (SIPS). Πολλαπλασιαστική γήρανση περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Hayflick και Moorhead σε ανθρώπινους ινοβλάστες αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε εκτεταμένη αντιγραφή ως συνέπεια της σειριακής περάσματα καλλιέργειας [14]. Στη συνέχεια, βρέθηκε ότι τα κύτταρα μπορούν να υποστούν επίσης SIPS σε απόκριση σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA, όπως ιονίζουσα ακτινοβολία και αντικαρκινικές χημειοθεραπευτικές [11] – [13], [15]. Τα κύτταρα που υποβάλλονται σε SIPS είναι μορφολογικά δυσδιάκριτες από replicatively γηρασμένα κύτταρα και εμφανίζουν πολλά από τα χαρακτηριστικά που αποδίδονται στην αντιγραφική γήρανση, όπως η αυξημένη σχετίζεται γήρανση β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal) δραστηριότητα και αυξημένη έκφραση ρ53 και ρ21 [11] – [13] [15] – [17]. Αν και βράχυνσης των τελομερών πιστεύεται ότι είναι η κύρια αιτία για την κυτταρική γήρανση, πρόωρη γήρανση μπορεί να συμβεί σε ένα telomerase- και βράχυνσης των τελομερών-ανεξάρτητο μηχανισμό [18], [19]. Γήρανση περιορίζει τη διάρκεια ζωής και την πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων, ως εκ τούτου, η επαγωγή γηρασμού θεωρείται ως ένα σημαντικό μηχανισμό της πρόληψης του καρκίνου [20] – [22]. Το πιο σημαντικό, οι αναδυόμενες απόδειξη έχει αποδείξει ότι η θεραπεία που προκαλείται από γηρασμό είναι ένα κρίσιμο μηχανισμός μέσω του οποίου πολλοί αντικαρκινικοί παράγοντες αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [11], [12], [23]. Είναι ενδιαφέρον, έχει δειχθεί ότι η θεραπεία που προκαλείται από γηρασμό μπορεί να επιτευχθεί σε πολύ χαμηλότερες δόσεις χημειοθεραπείας από εκείνες που απαιτούνται για να επάγει απόπτωση, υποδεικνύοντας ότι οι υψηλές δόσεις αντικαρκινικού παράγοντα μπορεί να προκαλέσει απόπτωση ενώ θεραπείες χαμηλό επίπεδο επάγουν πρωτίστως γήρανση σε καρκινικά κύτταρα [12] . Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές στρατηγικές επαγωγής απόπτωσης, αυτή η προσέγγιση χαμηλής δόσης μπορεί να μειώσει σημαντικά τις παρενέργειες των αντικαρκινικών θεραπειών και έτσι να βελτιώσει την ποιότητα ζωής των ασθενών με καρκίνο. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να καταλάβουμε αν χαμηλή RV δόση μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα μέσω της επαγωγής της πρόωρης γήρανσης.

RV είναι μια μη τοξική ένωση φυσικών πολυφαινολικών βρίσκονται σε αφθονία στα σταφύλια, κόκκινα κρασιά, μουριές και άλλα βρώσιμα φυτά. Πρόσφατες κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η RV είναι καλά ανεκτή και σχετικά ασφαλή για χρήση σε ανθρώπους [5] – [7]. RV έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό μιας ποικιλίας καρκινικών κυττάρων μέσω απενεργοποίησης των διαφόρων οδών κυτταρικής επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένης της οδού ΡΙ3-κινάσης /ΑΚΤ [24]. RV έχει επίσης αποδειχθεί ότι εμφανίζουν δυνητική δραστικότητα χημειοπροληπτικές σε αρκετά μοντέλα όγκου καρκινογόνο προκαλούμενη συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του εντέρου, του ήπατος, του οισοφάγου και του παχέος εντέρου [3], [25], [26]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία RV αναστέλλει την παγκρεατική ανάπτυξη του καρκίνου και ενισχύει τις αντικαρκινικές επιδράσεις της γεμσιταβίνης ενδεχομένως μέσω καταστολής της ενεργοποίησης του ΝΡ-КB και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της κυκλίνης D1, COX-2, ICAM-1, ΜΜΡ-9 και survivin σε ιστούς όγκων [27]. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι RV, σε υψηλές δόσεις, μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων από επαγωγή απόπτωσης [28] – [31], μια σημαντική πρόκληση για τη χρήση αυτού του CAM είναι ότι η συγκέντρωση του RV που απαιτείται για να επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα

in vitro

είναι υπερβολικά μεγάλη για να επιτευχθεί

in vivo

σε κλινικό περιβάλλον [5] – [7], [32]. Δεδομένου ότι η επαγωγή της γήρανση απαιτεί μια πολύ χαμηλότερη συγκέντρωση των αντικαρκινικών παραγόντων και ως εκ τούτου παράγει λιγότερα ανεπιθύμητες παρενέργειες [12], επιδιώξαμε να ερευνήσει εάν η θεραπεία RV χαμηλή δόση θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της επαγωγής της πρόωρης γήρανσης. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η χαμηλή θεραπεία RV δόση οδηγεί σε μια σημαντική αύξηση στη γήρανση που σχετίζεται με β-γαλακτοσιδάση (SA-β-gal) χρώση και αυξημένη έκφραση ρ53 και ρ21 σε κύτταρα NSCLC, υποδηλώνοντας ότι η αντικαρκινική δράση του RV είναι αποδοθεί κατά μεγάλο μέρος στην επαγωγή γηρασμό στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. Μηχανιστικές μελέτες αποκαλύπτουν ότι RV-επαγόμενη γήρανση συνδέεται με αυξημένη DSBs DNA και την παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, τα στοιχεία μας δείχνουν επίσης ότι η αναστολή της παραγωγής ROS από την NAC εξασθενεί DSBs DNA RV-επαγόμενη και πρόωρη γήρανση. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν ότι η χαμηλή θεραπεία RV δόση προκαλεί πρόωρη γήρανση στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα μέσω ROS μεσολάβηση βλάβη του DNA, τα οποία υπογραμμίζουν τη σημαντική συμβολή της επαγωγής γήρανση σε αντικαρκινικά αποτελέσματα RV του.

Αποτελέσματα

RV αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι υψηλότερες δόσεις της θεραπείας RV μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων από επαγωγή απόπτωσης [28] – [31], αλλά ένας μείζονα πρόκληση για αυτή την απόπτωση που προκαλεί στρατηγική είναι ότι η συγκέντρωση που απαιτείται για να επάγει απόπτωση σε κύτταρα όγκου

in vitro

δεν είναι προσβάσιμο

in vivo

[5] – [7], [32]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να καθοριστεί εάν χαμηλή θεραπεία RV δόση επηρεάζει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, θα αντιμετωπίζονται Α549 και Η460 καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με διαφορετικές χαμηλές δόσεις RV (0-50 μΜ) για να εξετάσει αν η θεραπεία RV έχει καμία επίπτωση στον σχηματισμό αποικίας των κυττάρων NSCLC. Δοκιμασίες κλωνογονικότητας επιβίωση έδειξε ότι ακόμη και τόσο χαμηλές όσο 10 μΜ της θεραπείας RV μπορεί να καταστείλει σημαντικά την δραστικότητα σχηματισμού αποικίας του Α549 και Η460 κύτταρα (Σχ. 1Α, 1Β και 1C). Τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι η RV-επαγόμενη καταστολή του σχηματισμού αποικίας συσχετίζεται καλά με τις συγκεντρώσεις του RV, υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία RV αναστέλλει την κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων NSCLC με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

Δοκιμασίες κλωνογονικότητας επιβίωση (Α) δείχνουν ότι ο αριθμός των αποικιών των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από μειώνεται με δόση RV. (Β) Τα αποτελέσματα των κλωνογόνων δοκιμασίες ρυθμίζεται σύμφωνα με την κλωνογόνο επιβίωση των κυττάρων Α549 ελέγχου και εκφράζονται ως% του ελέγχου. (Γ) Τα αποτελέσματα των κλωνογόνων δοκιμασίες ρυθμίζεται σύμφωνα με την κλωνογόνο επιβίωση του ελέγχου Η460 κύτταρα και εκφράζονται ως% του ελέγχου. **

σ

& lt?. 0,01 έναντι του ελέγχου

Η

δόση RV Χαμηλή αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα μέσω απόπτωσης-ανεξάρτητο μηχανισμό

Παρά το γεγονός ότι έχει δείξει ότι υψηλότερες δόσεις (100-200 μΜ) της θεραπείας RV μπορεί να επάγει απόπτωση σε κύτταρα όγκου [28] – [31], ήταν άγνωστο αν χαμηλή δόση RV καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μέσω της επαγωγής της απόπτωσης. Επειδή η ενεργοποιημένη κασπάση-3 και διασπασμένη PARP είναι καλά τεκμηριωμένες μετρήσεις της απόπτωσης [33], [34], ερευνήσαμε αν χαμηλή θεραπεία RV δόση έχει οποιαδήποτε επίδραση στην έκφραση ενεργοποιημένου κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP σε Α549 και Η460 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, Western blotting δεδομένα αποκάλυψαν ότι η θεραπεία RV χαμηλή δόση δεν προκάλεσε οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση της διασπασμένης ΡΑΚΡ και της ενεργοποιημένης κασπάσης-3 σε είτε Α549 ή κύτταρα Η460. Σε αντίθεση, καμπτοθεκίνη (CPT) θεραπεία οδήγησε σε έντονη αύξηση της διασπασμένης ΡΑΚΡ και της ενεργοποιημένης κασπάσης-3 έκφραση σε δύο κύτταρα Α549 και Η460 (Σχ. 2Α και 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η χαμηλή δόση RV αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα μέσω απόπτωσης-ανεξάρτητο μηχανισμό.

(Α) δοκιμασίες κηλίδος Western διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η έκφραση του ενεργοποιημένου κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP σε κύτταρα Α549. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. δοκιμασίες κηλίδας Western (Β) διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η έκφραση του ενεργοποιημένου κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP σε κύτταρα Η460. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

RV επάγει την πρόωρη γήρανση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

Έχει προταθεί ότι η επαγωγή της πρόωρης γήρανση είναι ένας σημαντικός μηχανισμός με τον οποίο ιοντίζουσα ακτινοβολία και πολλά χημειοθεραπευτικά μέσα εξασκούν αντικαρκινικές επιδράσεις τους [11] – [13], [15], [17], [23]. Έτσι, επιδιώξαμε να εξετάσουμε αν χαμηλή θεραπεία RV δόση προκαλεί πρόωρη γήρανση των κυττάρων NSCLC. Επειδή αυξημένη δραστηριότητα SA-β-gal είναι μια καθιερωμένη βιοδείκτη γηρασμού [16], ερευνήσαμε αν χαμηλή θεραπεία RV δόση επάγει την πρόωρη γήρανση σε Α549 και Η460 κύτταρα με χρώση SA-β-gal. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο αριθμός των SA-β-gal θετικά γηρασμένων κυττάρων είναι σημαντικά αυξημένη σε RV-αγωγή έναντι Α549 ελέγχου και Η460 κύτταρα. Επιπλέον, το ποσοστό του SA-β-gal θετικά κύτταρα αυξάνει με τη δόση του RV, υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία RV επάγει την πρόωρη γήρανση στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχ. 3Β και 3C).

χρώση (Α) SA-β-gal αυξήθηκε με δόσεις RV και στα δύο κύτταρα Α549 (άνω πάνελ) και κύτταρα Η460 (κάτω πίνακας). (Β) Το ποσοστό των SA-β-gal θετικά γηρασμένων κυττάρων σε RV-θεραπεία και τον έλεγχο των κυττάρων Α549 παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± SEM. (Γ) Το ποσοστό των SA-β-gal θετικά γηρασμένων κυττάρων σε RV-θεραπεία και τον έλεγχο Η460 κυττάρων παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. (D) δοκιμασίες κηλίδος Western διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η έκφραση της ρ53, ρ21 και EF1A σε κύτταρα Α549. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. δοκιμασίες κηλίδας Western (Ε) διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η έκφραση της ρ53, ρ21 και EF1A σε Η460 κύτταρα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. *,

σ

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου? **

σ

& lt?. 0,001 έναντι του ελέγχου

Η

Θα εξεταστούν επίσης τα επίπεδα έκφρασης της p53 και p21, δύο σημαντικά μόρια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γήρανση [12], [15], [17], [35], σε RV-επεξεργασμένα κύτταρα NSCLC. Western blotting δεδομένα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της ρ53 και ρ21 ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα RV-θεραπεία, σε σύγκριση με το Α549 ελέγχου και τα κύτταρα Η460 (Σχ. 3D και 3Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο μονοπάτι ρ53-ρ21 εμπλέκεται σε RV-επαγόμενη πρόωρη γήρανση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι RV θεραπεία σημαντικά ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση της EF1A σε Α549 και Η460 κύτταρα (Σχ. 3D και 3Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι EF1A μπορεί να παίζει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της RV-επαγόμενη πρόωρη γήρανση σε κύτταρα NSCLC.

θεραπεία RV προκαλεί βλάβες στο DNA και αυξάνει την παραγωγή ROS στον πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

Πολλοί χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και ακτινοβολία σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα μέσω της επαγωγής της βλάβης του DNA. Φωσφορυλιωμένη H2AX (γH2AX) είναι ένα ισχυρό δείκτη του DNA DSBs [36]. Για να καθοριστεί εάν η βλάβη του DNA συμβάλλει στην αντικαρκινικά αποτελέσματα RV-επαγόμενη, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις εστίες γH2AX να εξετάσει αν η θεραπεία RV προκαλεί DSBs DNA στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα αποτελέσματα της θεραπείας RV σε σημαντική αύξηση στο σχηματισμό γH2AX εστιών στα δύο κύτταρα Α549 και Η460 (Σχ. 4Α, 4Β και 4C). Καθώς ο σχηματισμός γH2AX εστιών είναι ένα σημαντικό υποκατάστατο των DSBs του DNA [36], τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν για πρώτη φορά ότι η αντικαρκινική δράση του RV οφείλεται τουλάχιστον εν μέρει στην RV-προκαλούμενη βλάβη του DNA σε κύτταρα NSCLC.

(Α) DSBs DNA προσδιορίστηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού γH2AX όπως περιγράφηκε προηγουμένως (16). Αντιπροσωπευτικά ανοσοφθορισμού εικόνες γH2AX εστίες στο Α549 και Η460 κύτταρα RV-αγωγή που παρουσιάζονται. (Β) Το ποσοστό των γH2AX εστίες θετικών κυττάρων σε κύτταρα Α549 RV-κατεργασία παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± SEM. (Γ) Το ποσοστό των γH2AX εστίες θετικών κυττάρων σε Η460 κύτταρα RV-κατεργασία παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± SEM. (D) Τα επίπεδα των ROS μετρήθηκαν με χρώση DCF-DA και κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία RV. Τα επίπεδα των ROS στα κύτταρα Α549 RV-αγωγή παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τα επίπεδα στα κύτταρα ελέγχου. (Ε) Τα επίπεδα των ROS στα κύτταρα Η460 RV-αντιμετωπίζονται παρουσιάζεται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τα επίπεδα στα κύτταρα ελέγχου. *,

σ

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου? **

σ

& lt?. 0,01 έναντι του ελέγχου

Η

Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι ROS παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη διαμεσολάβηση γονοτοξικό στρες που προκαλείται από βλάβη του DNA [37], [ ,,,0],38]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι μπορεί να προκαλέσει RV DNA DSBs μέσω αυξημένη παραγωγή ROS στα κύτταρα NSCLC. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, ερευνήσαμε εάν η θεραπεία RV έχει καμία επίπτωση στην παραγωγή ROS στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. DCF-DA χρώσης και ρέουν δοκιμασίες κυτταρομετρίας έδειξαν ότι τα επίπεδα των ROS ήταν σημαντικά αυξημένη σε Α549 και Η460 κύτταρα RV-αγωγή σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 4D και 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η RV μπορεί να προκαλέσει καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων πρόωρη γήρανση μέσω ROS μεσολάβηση βλάβη του DNA.

NAC εξασθενεί RV που προκαλείται από βλάβες του DNA και την πρόωρη γήρανση των πνευμόνων καρκινικά κύτταρα

Αν και τα στοιχεία μας έχουν δείξει ότι RV-επαγόμενη βλάβη του DNA σχετίζεται με την αυξημένη παραγωγή ROS στα κύτταρα NSCLC (Εικ. 4), έχει ακόμα να καθοριστεί εάν η αναστολή της παραγωγής ROS, χρησιμοποιώντας τα αντιοξειδωτικά μπορεί να αποτρέψει RV-επαγόμενης βλάβης του DNA και την πρόωρη γήρανση. Για το σκοπό αυτό, έχουμε προ-επωάστηκαν με τα κύτταρα NAC πριν από τη θεραπεία RV να καθορίσει εάν NAC μπορεί να μετριάσει DSBs DNA RV-επαγόμενη και πρόωρη γήρανση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η προθεραπεία με NAC αναστέλλει σημαντικά το σχηματισμό RV-επαγόμενης γH2AX εστιών σε Α549 και Η460 κύτταρα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα χρώσης SA-β-gal δείχνουν ότι το ποσοστό των πρόωρων γηρασμένα κύτταρα RV-επαγόμενη μειώνεται ουσιαστικά σε NAC-κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 5D και 5Ε). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν σθεναρά την υπόθεση ότι RV επάγει καρκίνου πνεύμονος πρόωρη γήρανση μέσω ROS μεσολάβηση βλάβης του DNA.

(Α) DSBs DNA προσδιορίστηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού γH2AX όπως περιγράφηκε προηγουμένως (16). Αντιπροσωπευτικά ανοσοφθορισμού εικόνες γH2AX εστίες στο Α549 και Η460 κύτταρα που παρουσιάζονται. (Β) Αναστολή της ROS από την NAC (5 mM) μειώνει RV (30 μΜ) προκληθείσα γH2AX εστιών στα κύτταρα Α549. (C) Αναστολή της ROS από την NAC (5 mM) μειώνει RV (30 μΜ) προκληθείσα γH2AX εστιών στα κύτταρα Η460. (Δ) Η αναστολή των ROS από NAC εξασθενεί RV που προκαλείται από την πρόωρη γήρανση των κυττάρων Α549. (Ε) Η αναστολή των ROS από NAC εξασθενεί RV που προκαλείται από την πρόωρη γήρανση των κυττάρων Η460. **

σ

& lt? 0,001 έναντι του ελέγχου.

#

σ

& lt?. 0,01 έναντι RV

Η

RV επάγει την έκφραση Nox5 σε πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να καθορίσει τους μηχανισμούς με την οποία RV επάγει παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα. Έχει αναφερθεί ότι αυξημένο ενδοκυτταρικό κυκλικό ΑΜΡ (cAMP) μπορούν να συμβάλλουν στην μιτοχονδριακή συσσώρευση ROS [39]. Είναι ενδιαφέρον, μια πρόσφατη μελέτη από το πάρκο et al. έχει δείξει ότι η θεραπεία RV αυξάνει τα επίπεδα της cAMP σε κύτταρα C2C12 ποντικού [40]. Για να προσδιορίσετε αν RV μεταβάλλει τα επίπεδα cAMP και με τη σειρά του προκαλεί την παραγωγή ROS στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, ανιχνεύσαμε επίπεδα cAMP στα Α549 και Η460 κυττάρων μετά από διαφορετικές κάνει θεραπείας RV. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΕΙΑ θεραπεία RV δεν έχει σημαντική επίδραση στα επίπεδα cAMP σε κύτταρα Α549 (Εικόνα S1A). Ακόμη πιο ενδιαφέρον, τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι RV αναστέλλει τα επίπεδα της cAMP σε Η460 κύτταρα (Σχήμα S1B). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι cAMP μπορεί να μην είναι ένας βασικός παράγοντας στη διαμεσολάβηση RV-επαγόμενη παραγωγή ROS στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Οι οξειδάσες NADPH (Noxs) είναι μια οικογένεια διαμεμβρανικών ενζύμων που παράγουν υπεροξειδίου και άλλα ROS [41] . Για να κατανοήσουμε καλύτερα πώς RV επάγει την παραγωγή ROS στα καρκινικά κύτταρα, ερευνήσαμε εάν η θεραπεία RV έχει καμία επίδραση στην έκφραση Nox1, Nox2, Nox3, Nox4 και Nox5 στα κύτταρα NSCLC. Αποτελέσματα σε πραγματικό χρόνο RT-PCR υποδεικνύει ότι Nox1, 2 και 5 εκφράζεται σε αφθονία στα δύο κύτταρα Α549 και Η460, ενώ Nox 3 και 4 είναι μόλις ανιχνεύσιμη σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα S2). Παραδόξως, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι η θεραπεία αυξάνει την RV επιλεκτικά έκφραση Nox5 στα δύο κύτταρα Α549 και Η460 (Σχ. 6Α και 6C), γεγονός που υποδηλώνει ότι RV-επαγόμενη παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα είναι πιθανόν οφείλεται στην αυξημένη έκφραση Nox5. Δεδομένων των σημαντικών ρόλων των αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως μιτοχονδριακής υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) και θειορεδοξίνη (TXN) στη ρύθμιση ενδοκυτταρικών ROS ισορροπία [42], αποφασίσαμε να προσδιοριστεί αν η θεραπεία RV επηρεάζει την έκφραση του SOD και TXN σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Η πραγματικού χρόνου δεδομένα PCR αποδεικνύουν ότι η θεραπεία RV προκαλεί μόνο μια μέτρια αύξηση (λιγότερο από 2 φορές) στην έκφραση SOD2 σε κύτταρα Α549, αλλά δεν έχει καμία επίδραση στην έκφραση του SOD1, SOD2 και TXN mRNAs σε κύτταρα Η460 (Σχ. 6Β και 6D). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι RV μπορεί να επάγουν την παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα μέσω up-ρύθμιση της έκφρασης Nox5.

(Α) Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 50 μΜ του RV ή DMSO ως έλεγχος του οχήματος. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την αγωγή RV, τα επίπεδα έκφρασης του Nox1, Nox2, και Nox5 mRNAs προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του SOD1, SOD2 και TXN σε κύτταρα Α549 προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. (Γ) Τα επίπεδα έκφρασης του Nox1, Nox2, και Nox5 σε κύτταρα Η460 παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής (μέση τιμή ± SEM). (Δ) Τα επίπεδα έκφρασης του SOD1, SOD2 και TXN στα κύτταρα Η460 παρουσιάζονται. **

σ

& lt?. 0,001 έναντι του ελέγχου

Η

Συζήτηση

Κυτταρική γήρανση είναι μια κατάσταση μόνιμης σύλληψη του κυτταρικού κύκλου που μπορεί να προκληθεί από μια ποικιλία των τάσεων συμπεριλαμβανομένων των βλαβών του DNA, βράχυνσης των τελομερών και το οξειδωτικό στρες. Γήρανση περιορίζει τη διάρκεια ζωής και την πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων, ως εκ τούτου, η επαγωγή γηρασμού θεωρείται ως ένα σημαντικό μηχανισμό της πρόληψης του καρκίνου [20] – [22]. Το πιο σημαντικό, αυξανόμενες ενδείξεις απέδειξε ότι η θεραπεία που προκαλείται από γηρασμό είναι ένα κρίσιμο μηχανισμός δράσης για πολλούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και θεραπεία ακτινοβολίας [11], [12], [15], [17], [23]. Ωστόσο, η συμβολή της επαγωγής γηρασμού σε αντικαρκινικούς RV και chemopreventive επιδράσεις δεν έχει διευκρινισθεί καλά. Εδώ παρέχουμε πειραματικά δεδομένα που καταδεικνύουν ότι η χαμηλή θεραπεία RV δόση αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μέσω απόπτωσης-ανεξάρτητο μηχανισμό. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι RV μπορεί να ασκήσει αντικαρκινικές και chemopreventive δραστηριότητες μέσω της επαγωγής γήρανση σε καρκινικά κύτταρα. Συνεπής με τις παρατηρήσεις μας, Rusin et al. Αναφέρεται επίσης ότι η θεραπεία RV επάγει γήρανση φαινότυπο σε καρκινικά κύτταρα [43]. Αυτό είναι ένα σημαντικό εύρημα επειδή η επαγωγή της γήρανση, σε αντίθεση με την απόπτωση, απαιτεί πολύ μικρότερη συγκέντρωση του RV, γεγονός που υποδηλώνει RV μπορούσε να είναι χρήσιμη κλινικά. Επιπλέον, οι μελέτες αυτές υπογραμμίζουν τη σημασία της επαγωγής γήρανση στη διαμεσολάβηση χημειοπροληπτικές RV και αντικαρκινικές ιδιότητες.

Έχει καθιερωμένη ότι η επαγωγή της βλάβης του DNA είναι ένας κεντρικός μηχανισμός μέσω του οποίου πολλοί αντικαρκινικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων ιονίζουσα ακτινοβολία σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα [13], [15], [38], [44]. Από τους διάφορους τύπους βλάβης του DNA, το DNA DSBs είναι οι πιο κυτταροτοξικά λόγω της μεγάλης δυνατότητά τους να προκαλούν κυτταρικό θάνατο και /ή διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Έτσι, η αυξημένη ικανότητα του DNA αποκατάστασης των ζημιών σε καρκινικά κύτταρα πιστεύεται ότι είναι ένας σημαντικός συνεισφέρων στη θεραπεία αντίστασης κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου [45]. Είναι ενδιαφέρον, έχει αποδειχθεί ότι πολλοί παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA, όπως ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA με τη μεσολάβηση πρόωρη γήρανση στα καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι θεραπευτικοί παράγοντες μπορεί να ασκήσει αντικαρκινικές επιδράσεις τους μέσω DNA βλάβη μεσολάβηση πρόωρη γήρανση [13], [ ,,,0],15]. Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα μας έδειξαν ότι RV επάγει την πρόωρη γήρανση στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, ήταν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, αν βλάβη του DNA εμπλέκεται σε RV-προκαλούμενη γήρανση σε κύτταρα όγκου. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι γH2AX εστίες, ένα σημαντικό υποκατάστατο του DNA DSBs, ήταν σημαντικά αυξημένη σε RV-επεξεργασμένα κύτταρα NSCLC, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το DNA βλάβη που προκαλείται από την πρόωρη γήρανση μπορεί να συνεισφέρει στα αντικαρκινικές δράσεις της RV. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας, βρέθηκε ότι μπορεί να επάγει RV διαλείμματα πλασμιδιακό DNA με την παρουσία του Cu (II) και υπό οξειδωτικές συνθήκες [46]. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι θεραπεία RV χαμηλή δόση καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μέσω DNA βλάβη που προκαλείται από την πρόωρη γήρανση.

Η ενεργοποίηση της οδού ρ53-ρ21 από βλάβη του DNA έχει δειχθεί ότι είναι ένα κρίσιμο μηχανισμός υποκείμενων SIPS [12], [15], [17], [18]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι RV-επαγόμενη πρόωρη γήρανση συνδέεται με αυξημένη έκφραση της ρ53 και ρ21 σε κύτταρα NSCLC, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού ρ53-ρ21 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση RV-προκαλούμενη γήρανση στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Το πιο σημαντικό, διαπιστώθηκε επίσης ότι RV-επαγόμενη γηρασμό συσχετίζεται καλά με μια σημαντική μείωση της έκφρασης EF1A σε Α549 και Η460 κύτταρα. Αυτά τα νέα ευρήματα δείχνουν, για πρώτη φορά, ότι τα κάτω ρύθμιση EF1A εμπλέκεται σε RV-επαγόμενη πρόωρη γήρανση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, μια πρόσφατη μελέτη έχει προτείνει ότι μειωμένη έκφραση του EF1A είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης της πρόωρης γήρανση [47]. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες θα χρειαστούν για να καθορίσει τον ακριβή ρόλο της EF1A στη διαμόρφωση RV που προκαλείται πρόωρη γήρανση σε καρκινικά κύτταρα.

Πολλοί αντικαρκινικών παραγόντων και της ιοντίζουσας ακτινοβολίας καταστρέφουν τα καρκινικά κύτταρα σε μεγάλο βαθμό μέσω της παραγωγής των ROS [48]. Επιπλέον, η αυξημένη ROS μπορεί να προκαλέσει οξειδωτική βλάβη του DNA και να προκαλέσει DSBs DNA, οδηγώντας έτσι σε πρόωρη γήρανση [37]. Για τον προσδιορισμό του ρόλου των ROS στο RV που προκαλείται πρόωρη γήρανση στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, ερευνήσαμε τα επίπεδα των ROS σε RV-θεραπεία Α549 και Η460 κύτταρα χρησιμοποιώντας βαφή και κυτταρομετρία ροής δοκιμασίες DCF-DA. Τα δεδομένα δείχνουν ότι RV-επαγόμενη γήρανση συνδέεται με αυξημένη παραγωγή ROS και DNA DSBs στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να προκαλέσει RV πρόωρη γήρανση στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα μέσω ROS μεσολάβηση βλάβης του DNA. Η σημαντική συμβολή των ROS στο RV που προκαλείται από βλάβες του DNA και την πρόωρη γήρανση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τις παρατηρήσεις ότι η αναστολή της παραγωγής ROS από NAC εξασθενεί RV που προκαλείται από βλάβη στο DNA και γήρανση των κυττάρων NSCLC. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, ένα προ-οξειδωτικό αποτέλεσμα των RV παρατηρήθηκε επίσης σε U937 κύτταρα λευχαιμίας και χαρακτηρίζεται από την εξάντληση της GSH και την αύξηση της παραγωγής ROS [49]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες με Hadi και συνεργάτες έδειξαν επίσης ότι RV θα μπορούσε να αυξήσει την παραγωγή ROS και ROS προκαλούμενη βλάβη του DNA σε ανθρώπινα περιφερικά λεμφοκύτταρα [50], [51]. Μαζί, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η χαμηλή δόση RV αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μέσω της επαγωγής του γηρασμού μέσω ROS μεσολάβηση βλάβης του DNA.

Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχουν αποδείξεις ότι RV μπορεί να λειτουργήσει ως καθαριστής ROS σε φυσιολογικά κύτταρα για την προστασία από τις ιονίζουσες ακτινοβολίες που προκαλείται από οξειδωτικό στρες και τραυματισμό ιστού [52], υποδηλώνοντας ότι η RV μπορεί να έχει διαφορετικές επιδράσεις επί της παραγωγής ROS σε κανονικά έναντι καρκινικών κυττάρων. Δεδομένου ότι παρεκκλίνουσα συστήματα οξειδοαναγωγής παρατηρούνται συχνά σε πολλά κύτταρα όγκου [48], [53], [54], είναι πιθανό ότι RV μπορεί επιλεκτικά καταστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με μικρή ή καθόλου τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα οφείλεται στην απόκλιση οξειδοαναγωγής τους κατάσταση. Σε συμφωνία με αυτή την υπόθεση, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η θεραπεία RV δεν έχει σημαντική επίδραση στην έκφραση του SOD1, SOD2 και TXN σε Η460 καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων, αν και αναφέρθηκε ότι RV θα μπορούσε να προκαλέσει μια σημαντική (πάνω από 6 φορές) αύξηση της έκφραση SOD2 σε φυσιολογικά κύτταρα [55]. Το πιο σημαντικό, οι μελέτες μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι RV αυξάνει εκλεκτικά την έκφραση σε κύτταρα Nox5 NSCLC, υποδηλώνοντας ότι η RV μπορεί να προκαλέσει παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα μέσω προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης Nox5.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η ρεσβερατρόλη (Trans-3, 4 ‘, 5-trihydroxystilnene) και όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) και άλλα μέσα καλλιέργειας ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Κουνέλι αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ρ53 και αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό EF1A αντίσωμα κουνελιού αγοράστηκαν από Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). Ποντικού αντι-ανθρώπινης ρ21 μονοκλωνικό αντίσωμα λήφθηκε από την Santa Cruz Biotechnology. Το μονοκλωνικό αντίσωμα β-ακτίνης αγοράστηκε από τη Sigma. Ένα κιτ χρώσης γήρανση σχετιζόμενη β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal) αγοράστηκε από την Cell Signaling. Το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-φωσφο-ιστόνης Η2ΑΧ ποντικού (γH2AX) αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ). αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ και SuperScript III σύστημα σύνθεσης πρώτου-περίπτερο αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Κυκλική κιτ AMP (cAMP) ΕΠΕ αγοράστηκε από την Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Ανθρώπινο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυτταρικές σειρές Α549 και Η460 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη και 100 μg /ml, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen). κύτταρα Η460 αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη και 100 μg /ml, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen).

κλωνογονιδιακή επιβίωση δοκιμασία

Δοκιμασίες κλωνογονικότητας ήταν εκτελείται για τον προσδιορισμό των επιδράσεων της θεραπείας RV στην ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων NSCLC. Εν συντομία, Α549 και Η460 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα υπό την παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του RV ή DMSO ως έλεγχος του οχήματος σε 60 mm πιάτα για 10 έως 12 ημέρες για να επιτρέψει τις αποικίες κυττάρων σχηματισμού. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma) σε μεθανόλη για 30 λεπτά. Ο αριθμός των αποικιών (≥50 κύτταρα) βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο.

Γήρανση σχετίζεται με β-γαλακτοσιδάση (SA-β-gal) χρώση

Σε situ χρώση των ΑΕ-β-gal διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ χρώσης γήρανση β-γαλακτοσιδάσης (Cell Signaling) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56].

κηλίδωση Western ανάλυση

Α549 και Η460 κύτταρα υπέστησαν κατεργασία με διαφορετικές δόσεις του RV ή DMSO ως έλεγχος. Σύνολο κυτταρικές πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως κυττάρων (Cell Signaling) συμπληρωμένο με ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεϊνάσης (Sigma). Ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56]. Εν συντομία, πενήντα μικρογραμμάρια δειγμάτων πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν επί 10% πηκτών Mini-Protean TGX (Bio-Rad) και μεταφέρθηκαν σε 0.2 μΜ μεμβράνη PVDF (Millipore). Τα στυπώματα φράχθηκαν με 5% άπαχο γάλα για 1-2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια διερευνήθηκε με πρωτεύοντα αντισώματα και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από εκτεταμένη πλύση με TBS-Τ, τα στυπώματα επωάστηκαν με κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ζώνες της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με χρήση ECL Plus Western Blotting Σύστημα Ανίχνευσης (GE Healthcare Life Science).

ανοσοφθορισμού μικροσκοπική ανάλυση γH2AX εστιών

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου 4-καλά όλη τη νύχτα και την επόμενη μέρα σε επεξεργασία με RV ή DMSO (έλεγχος οχήματος). Στο τέλος της επιθυμητής θεραπείες φορές, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη παραφορμαλδεϋδη 4% επί 10 λεπτά και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 /PBS επί πάγου επί 10 λεπτά.